Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

1CEA, DSV, IG, Genoscope, 2CNRS-UMR8030, Évry, France, 3Université d'Évry Val d'Essonne, 4Massachusetts General Hospital Cancer Center
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi tabanlı nicel Proteomikte için hızlı, ucuz bir stratejidir. Burada, hemen hemen her tür örnek uygulanabilir Redi yaklaşım kullanılarak protein karışımlarının hazırlanması ve analizi için güçlü bir yöntem ortaya koymaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tolonen, A. C., Haas, W. Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling. J. Vis. Exp. (89), e51416, doi:10.3791/51416 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi kullanılarak örnekler arasında protein ekspresyon farklılıkları ölçmek için bir yöntemdir. Redi etiketleme her bir serbest amin için iki metil grubu eklemek için düzenli olarak (ışık) veya formaldehid ve sodyum siyanoborohidrid döteryumlanmış (ağır) formları kullanılarak gerçekleştirilir. Burada Redi etiketleme ve kompleks protein karışımları kantitatif karşılaştırılması için sağlam bir protokol göstermektedir. Karşılaştırma için Protein örnekleri hafif ya da ağır metil etiketler, karıştırılmış ve LC-MS/MS ile ko-analiz ya da taşımak için etiketli peptidler içine sindirilir. Bağıl protein bolluğu tam MS spektrumları elde oluşturucu peptidin ağır ve hafif olarak işaretlenmiş versiyonlarının iyon kromatogram tepe alanlarının karşılaştırılması ile nicelendirilir. Burada tarif edilen yöntem örnek ters-fazlı, katı faz ekstraksiyonu ile hazırlama, peptidlerin üzerinde kolon Redi etiketleme, bazik pH rev tarafından peptid içerir fraksiyonasyonersed faz (BPRP) kromatografi ve StageTip peptid saflaştırma. Biz kararlı izotop birleşme için diğer yöntemlere göre Redi etiketleme avantajları ve sınırlamaları tartışmak. Biz örnek hemen hemen her tür protein zengindi karşılaştırmak için, hızlı, ucuz ve doğru yöntem olarak Redi etiketleme kullanarak yeni uygulamalarını vurgulayın.

Introduction

Karmaşık numuneler arasında birçok proteinin konsantrasyonu farklılıklarını ölçme proteomikteki merkezi bir sorundur. Giderek, bu farklı izotopik etiketler, her numune proteinlerin etiketleme örnekleri birleştirilmesi ve konsantrasyon farkları ölçmek için kütle spektrometresi kullanılarak yapılmaktadır. Çeşitli yöntemler, protein ve peptid kararlı izotopik etiketleme için vardır. ICAT 3, 4 iTRAQ ve indirgeme dimetilasyonu 5 protein ekstraksiyonu ve sindirim sonra izotop etiketleri ekleme ise 15 N etiketleme 1 ve SILAC 2, in vivo olarak metabolik izotopik etiketler tanıtmak. Bu yöntemler arasında, indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) numune hemen hemen her tür protein konsantrasyonu farklılıkları ölçmek için ucuz, tekrarlanabilir bir yöntem olarak popülerlik kazanıyor.

Redi etiketleme düşürülür bir Schiff bazı oluşturmak üzere formaldehit ile reaksiyona sokulmasını içerir peptidlerisiyanoborohidrit. Bu reaksiyon, N-termini ve lisin yan zincirleri ve monomethylates N-terminal prolinler on serbest amino grupları dimethylates. Burada açıklanan protokol döteryumlu formaldehit ve siyanoborohidrit (Şekil 1) kullanılarak bir "ağır" etiketli doğal izotopik dağıtım ve örnek 2 hidrojen atomuna sahip reaktifler kullanılarak bir "ışık" etiketi ile örnek 1 'de peptidler metile. Işık ve bir kütle spektrometresi kullanılarak, iki form arasında ayırt etmek için kullanılır ağır biçimleri arasında, 6,0377 Da'lık bir kütle farkı, bir peptit sonuçlarına her dimetile amino grubudur. Özel olarak, nispi bolluk peptid ışığın MS1 ​​ekstre iyon kromatogram alanlarında oranında (MS1 alan doruk olan oranı) ve her bir peptit iyon çifti için ağır bir versiyonu olarak nicelendirilir. Bir proteinin nispi bolluk, proteinin tüm peptidler arasında orta MS1 tepe alanı oranı olarak hesaplanır. Bu yazıda, davranış için sağlam bir protokol açıklarters-faz peptid katı faz ekstraksiyonu, kolon Redi etiketleme, peptid fraksiyonasyon bazik pH fazı (BPRP) kromatografi tersine ve StageTips kullanarak peptid karışımları saflaştırılmasını (Şekil 2) içerir LC-MS/MS ile Redi etiketleme deneyleri ing . Biz kantitatif Proteomikte için Redi etiketleme kullanmanın avantajları ve sınırlamaları tartışmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Bu yöntem daha önce 12 tarif edilmiştir.

1.. Protein İzolasyonu

Tercihen, French pres, boncuk dayak veya sonikasyon gibi fiziksel yöntemlerle, yokedici hücreler tarafından hücre protein 1 mg hazırlayın. Enzim kütle spektrometresi ölçümleri bulandırabilir çünkü lizozim-aracılı hücre parçalanmasını önlemek.

Proteinlerin 2. TCA Yağış

Proteinlerini çöktürmek için 10 dakika süre ile buz üzerinde 4 hacim protein ve soğuk 1 hacim trikloroasetik asit (TCA) ilave edin. Santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 12,000 x g ve supernatant çıkarın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 12,000 xg'de buz soğukluğunda aseton ve santrifüj 1 ml pelletini Süpernatantı ve 15 dakika boyunca pelet kurumaya bankta tüp ters. -80 ° C'de saklayın protein granül

3.. Doğasını Proteinler ve disülfıt bağlarını azaltır

Reproteinler askıya 500 ul denatürasyon ve indirgeme tamponu içinde ~ 2 mg / ml (50 mM HEPES pH 8.5, 5 mM DTT, 4 M üre ya da 3 ya da% SDS) için. İsteğe bağlı olarak, tampon maddesi içinde bir proteaz inhibitörü içerir. Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile 56 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin proteinleri.

4. Aklylate Ücretsiz Sülfhidril Gruplar geri dönüşü olmayan disülfit bağ oluşumu bozacak

Taze su içinde 0.3 M iodoasetamid hazırlayın. DİKKAT! Iodoacetamide son derece zehirlidir. 500 ul protein için 25 ul 0.3 M iodoasetamid (15 mM nihai konsantrasyon) ilave edin ve oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. 300 mM DTT (5 mM DTT nihai konsantrasyon) ve 10 ul kadar iyodoasetamid eklenerek söndürülür. -80 ° C'de saklayın alkile proteinleri

5.. Protein Sindirim

TCA proteinleri çökeltmek (aşama 2'de tarif edildiği gibi) ve 50 mM HEPES (pH 8.2), 1 ml, 1 M üre içinde tekrar süspansiyon. Lisil endoprotein bir stok solüsyonu hazırlayın2 ug / ul 'lik bir konsantrasyonda ve protein solüsyonuna 5 ul ekle suda ase (Lys-C). Oda sıcaklığında 16 saat boyunca karışımın inkübe edin. Nihai Lys-C konsantrasyonu, 10 ng / ml ve protein-to-lysC oranı (a / a) 1/200 ile 1/50 olduğu olduğundan emin olun. , 50 mM asetik asit, 40 ul içinde 20 ug tripsin dizileme gradlı yeniden süspanse Lys-C ile sindirilmiş 5 ul (10 ug tripsin) ekleyin ve 37 ° C de 6 saat inkübe Tripsin için kullanıldığı gibi Lys-C için aynı proteaz konsantrasyon ve proteaz-to-protein oranları kullanın.

6.. Ters-faz peptid Ekstraksiyon

  1. % 0.5 'lik bir nihai konsantrasyona (pH ≈ 2), trifluoroasetik asit (TFA) eklenmesi ile peptidleri asitlendirilir. Bir ekstre manifolduna Bir C 18 sütunu takın. Peptidlerin yükleme ve elüsyon dışında tüm adımlar için mümkün olan en yüksek akış hızı kullanın.
  2. 6 ml asetonitril (ACN) ile ıslak kolon. 6 ml% 80 ACN,% 0.1 TFA ile kolondan yıkanır, daha sonra 6 ml% 0.1 TFA ile dengeye getirin. Izin vermeyinadımlar arasında kuru çalıştırmak için sütun.
  3. Vakum basıncı durdurmak ve yaklaşık olarak 1 ml / dk 'lık bir akış hızında kolona 500 ug peptidlerin yükleyin. Peptidler, kolon, yeniden vakum bağlanmıştır ve sonra, (0.09 M sitrik asit, 0.23 M Na 2 HPO 4, pH 5.5), sitrik asit tamponu, 3 ml ile, 6 ml% 0.1 TFA ile yıkayınız sonra.
    Not: Yüksek miktarda etiketli peptid edilebilir, ancak bağlama kapasitesi C18 kolon, en azından örnek kaybını önlemek için peptid miktarına göre iki kat daha yüksek olması gerekir.

7. On-kolonu İndirgemeli dimetilasyonu tarafından Peptit Etiketleme (Redi Etiketleme)

Hidrojen siyanür Etiketleme işlemi sırasında düşük bir konsantrasyonda serbest olarak kimyasal bir başlık altında bu adımı gerçekleştirin.

  1. Peptid serbest aminler metillenmesi "hafif" ve "ağır" Redi tampon 12 ml hazırlayın. Işık Redi tamponu% 0.8 formaldehit ve inci hidrojeni taşıyan 0.12 M sodyumsiyanoborhidrid oluşursitrik asit tampon maddesi içinde EIR doğal izotopik dağılımları. Ağır Redi tamponu% 0.8 döteryumlu formaldehit ve sitrik asit tampon maddesi içinde 0.12 M döteryumlu sodyum siyanoborohidrid oluşur.
  2. 1 ml / dakika akış hızında, peptid ihtiva eden sütunlar 10 ml hafif ya da ağır Redi tampon ya da eklenmesi ile peptidleri ihtiva eden bir sütun inkübe edin ve tam etiketleme sağlamak için tekrarlayın. Yıkama 6 ml% 0.1 TFA ile kolon ve daha sonra 1 ml% 0.5 asetik asit ile.
  3. Vakum durdurmak ve yaklaşık olarak 0.5 ml / dk 'lık bir akış oranı kullanılarak, daha sonra 1 ml% 80 ACN ile% 0.5 asetik asit 1 ml% 40 ACN,% 0.5 asetik asit ile ilk işaretli peptidlerin elüsyonu. Eğer istenirse, ağır ve hafif örnekler karıştırma önce kütle spektrometresi ile bireysel örneklerin etiketleme verimliliği ölçmek ("Temsilci Sonuçları" bakın). Kütle spektrometresi ile belirlenebilir 1:1 ağır ve hafif-etiketli peptid örnekleri karıştırın.

Temel pH Ters Faz (BPRP) kromatografi <8. Ayrı Peptide Karışım/ P>

Temel pH bağımsız bir şekilde, proteom kapsamını arttırmak için LC-MS/MS ile analiz edilir çok sayıda kısmın içine peptid karışımını ayırmak için aşama (BPRP) kromatografisi.

  1. 10 mM amonyum bikarbonat (pH 8) içinde artan ACN konsantrasyon gradyanı uygulanarak bir C18-HPLC kolonu üzerinde peptit karışımının fraksiyonlanması. 5 dakika için% 5 (v / v) ACN ile başlayın, 60 dakika içinde,% 35 ACN artması ve daha sonra 1 dakika içinde% 90 ACN. 9 dakika boyunca yeniden dengeye sütun için% 5 ACN indirgeme önce, 4 dakika boyunca% 90 ACN saklayın. 96 oyuklu bir plaka (H12 için A1) eşit hacimde 96 fraksiyonları toplayın. Peptidler kolonu (burada tarif edilen koşullar için 10-70 dakika) kapalı elüsyon ise 220 nm'de bir UV detektör kullanılarak fraksiyonasyon izleyin.
  2. Kuyu A2, C2, E2, ve G2 (fraksiyon A2) için ve buna bağlı olarak için, kuyular, B1, D1, F1 ve H1 (fraksiyon B1) için, kuyu A1, C1, E1 ve G1 (fraksiyon A1) ikinci kısımları birleştiriniz Geri kalan kısımlar. Solvent çıkarınbir vakum santrifüj kullanılarak t. Fraksiyonlardan peptitler tekrar A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 ve B12 1 M urea/0.5% TFA 130 ul ve aşama 9'da tarif edildiği gibi StageTips kullanılarak arındırmak. Mağazası fraksiyonlar B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, ve -20 ° C de A12

9. Stop and Go Ekstraksiyon tarafından Arındırmak peptidler (StageTips)

1.07 mm iç çapı (ID) ile iki C18 diskler ile 200 ul pipet uçları ambalaj ile C18-StageTip 7 microcolumns hazırlayın. Eppendorf tüpleri içine Sahne ipuçları koydu. 130 | il metanol, daha sonra 130 ul% 80 ACN,% 0.5 asetik asit ile ipuçları yıkamak için, bir mikro santrifüj kullanın. 130 ul% 0.1 TFA ile StageTips dengelenmesi. StageTips peptit karışımı aktarın ve 40 ul,% 0.5 asetik asit, daha sonra 40 ul% 0.1 TFA, daha sonra 130 ul% 0.1 TFA ile yıkayın. 20 ul% 40 ACN,% 0.5 asetik asit, daha sonra 20 ul% 80 ACN,% 0.5 asetik asit ile ilk Peptidlerin elüsyonu. Kombine eluatlar and vakumla süzme ile kuru.

10. Microcapillary LC-MS/MS

  1. , Yaklaşık 1 ug / ul 'lik bir konsantrasyona 1-5 ul,% 5 formik asit,% 5 ACN peptitler çözülür. On ~ 1 ug peptidler gidermek bir 100 um x C18-ters 0.125% formik asit içinde% 6-22 ACN gradyanı ile faz HPLC kolonu ~ 300 nl / dk 'lık bir akış oranında, 75 veya 100 dakikalık bir süre içinde tatbik 20 cm.
  2. Bir LTQ Orbitrap Velos 12 veya kütle spektrometresi, yüksek çözünürlük ve yüksek kütle doğruluğu sağlayarak benzer sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi platformunu kullanarak peptidler tanımlayın. Orbitrap analizörü edinilen tam bir MS tarama (60.000 çözünürlük) ile veri-bağımlı modunda kütle spektrometresi çalıştırın. Tam MS spektrum tespit 20 en bol bulunan iyonlar için lineer iyon kapanı MS / MS spektrumunu üretir. MS / MS için 1 x 10 tam MS için 6 ve 2000 için otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefleri ayarlayın. 1000 msn maksimum iyon birikimi kez ayarlayabilirsinizMS ve MS / MS için 150 msn için. 20-60 sn MS / MS uzak seçimden parçalanmış peptid öncüsü iyonları dışlamak.

11. MS / MS Veri Toplama

Bu parametreleri (Tablo 1) kullanılarak bu SEQUEST 8 gibi bir algoritma ile bir teorik veritabanı MS / MS spektrumları RAW dosyaları karşılaştırarak peptidler tanımlamak.

Tablo 1. Peptit Veritabanı Arama Parametreleri.

Genel Parametreler kadar 2 ile tam triptik sindirim bölünmelere kaçırdı
25 ppm öncül iyon tolerans
1.0 Da fragman iyonu tolerans
Statik Değişiklikler Sistein, carboxyamidomethylation üzerinde 57,02146 Da
Lisin ve peptid N-terminalinde on 28,03130 Da, hafif dimetilasyonu etiket
Dinamik Değişiklikler Metiyonin, oksidasyonu üzerindeki 15,99491 Da
Lisin ve peptid N-terminalinde, ağır dimetilasyonu etikette 6,03766 Da
  1. Fiili ve ters yönlerde açık okuma çerçevelerinin bir veri tabanı kullanılarak bu tür hedef yem 9 strateji olarak bir yöntem ile,% 1 yanlış keşif oranına filtre peptidler.

12. Peptide Kantitasyonu

Hesaplayın MS1 ağır ve hafif çiftlerinin alanlar iyon kromatogramları (MS1 pik alanları) ekstre edilmiş ve peptid sinyal-gürültü (S / N) oranları 10. Peptid çiftleri içerir yalnızca onların ortalama sinyal-noise oranı beş üzerindedir. Aynı peptid (MS1 tepe alanı oranı) ağır ve hafif versiyonlarının MS1 ​​pik alanlarının oranı olarak, iki örnekteki nispi bir peptidin bolluk ölçmek. Proteinin tüm peptidler için ortalama MS1 tepe alanı oranı olarak görece protein zengindi hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz Saccharomyces cerevisiae kullanılarak doğruluk, kesinlik ve Redi etiketleme tekrarlanabilirliği değerlendirildi ve Clostridium tüm hücre lizatlarını phytofermentans. Önce C bir karışımı Redi etiketleme verimliliği sayılabilir selüloz (ağır etiketli, H) ve glukoz (açık etiketli, L) kültürler protein lizatları phytofermentans. Bir% 1 peptit yanlış keşif orana süzüldü, bu örnek, bir% 98 verimle Redi etiketleme 11194 benzersiz peptid dizilerini ihtiva etmiştir. Kesirlenmemiş S. cerevisiae protein lisatı benzer şekilde, H ya da L reaktifleri ile işaretlenmiş çeşitli oranlarda karıştırıldı ve analiz edildi. Protein ifadesi farkları () 2 (orta MS1 tepe alanlarının log) yeniden üretilebilir, H ve L örnekleri oranları (Şekil 3) karıştırılması, geniş bir aralığında karıştırıldı hangi oranlarını göstermektedir. Özel olarak, proteinlerin% 99 kat-değişimi 1:1 oranında karıştırılmış numune için 1.6 kat daha düşük olarak ölçülmüştür. Içindeproteinlerin% 99 1:1 'lik bir karışımından daha uzak mesafede standart sapma bir artış gösteren, beklenen oranın 3.8 kat içindeydi 01:10 ve 10:01 örnekleri,. Redi etiketleme Clostridium phytofermentans proteomun uygulanmıştır zaman, glikoz (Şekil 4A) üzerinde büyüyen suret kültürleri için 2 kat seviyelerde ölçülür% 94 proteinleri ile 2,000 'den fazla proteinler sayılabilir. Protein. S, kültürlerin çift çiftleri için değişiklik (selüloz karşı glikoz) de son derece (R2 = 0.82) korelasyon, (Şekil 4B) katlama cerevisiae karşılaştırmalar (Şekil 3), tek bir kültür ve böylece Redi dayalı kantitatif proteomiks teknik tekrarlanabilirlik göstermektedir. C. phytofermentans ölçümleri (Şekil 4A, B) ifade farklılıklar ölçüm hatası ve kültürler arasındaki biyolojik varyasyon hem temsil böylece kültürleri çoğaltmak karşılaştırın. Birlikte, bu deneyments Redi proteomiks karmaşık örnekler arasında protein ekspresyon farklılıkları ölçmek için doğru ve tekrarlanabilir bir yöntem olduğunu desteklemektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Serbest aminlerin dimethylate için ağır ve hafif reaktif maddeler kullanılarak peptidlerin indirgeyici dimetilasyonu. Hafif reaktifleri karşı ağır Etiketleme aynı peptid serbest amin başına 6,0377 Da kütle kayması vardır. Burada gösterilen peptid N-terminalinde ve lisin yan zincir üzerindeki iki etiketlenir. Referans 11 uyarlanmıştır görüntü. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Oklarla yukarıda indirgeyici dimetilasyonu tarafından kantitatif proteomik protokol Şekil 2.. Bakış. Kırmızı rakamlar protokolü açıklanan adımlara karşılık gelmektedir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Saccharomyces cerevisiae bütün hücre lizatları kullanılarak Redi etiketleme Şekil 3.. Değerlendirilmesi. 10L, 1H: 5L, 1H: 2L, 1H: 1 litre, 2H: 1 litre, 5H: Tek bir kültürden örnekler ağır (H) ve ışık çeşitli oranlarda karıştırıldı (L) reaktifler, (1 H ya ile etiketlenmiş 1L ve 10H: 1 L), ve H ve L numuneleri arasındaki farklar protein Geçmiş 2 medyan MS1 tepe alan oranlarındaki (2 H / L oranının giriş) olarak ölçüldü. Tüm verileri üzerinden doğrusal bir trend çizgisinin R 2 değeripuanları 0.96 (siyah çizgi) idi; Pearson korelasyon 0.98 oldu. Güven sınırları (kırmızı çizgi) veri noktalarının% 95, her numune için bulunmuştur, içinde eğilim hattından mutlak dikey mesafeyi gösterir. Referans 12 uyarlanmıştır görüntü. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4,. Niceleme Redi-etiketli Clostridium farklı karbon kaynaklarının büyüyen kültürlerden gelen proteinleri phytofermentans. Bir suret glikoz kültüre bir glikoz kültürüyle, hemiselüloz kültür ve bir selüloz kültürde A) Protein ifadesi. Glikoz-glukoz (% 94), glukoz-yarı selüloz (% 80) ve glucos: iki kat seviyelerde ifade edilen proteinlerin fraksiyonue-selüloz (% 49). B) selüloz kültürler karşı glikoz için protein ifadesindeki değişiklikler kıvrım yüksek korelasyon vardır (R2 = 0.82) kültürlerin çift çiftleri için tekrarlanır. Referans 12 uyarlanmıştır. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yüksek ucuz etiketleme reaktifleri (reaktif numune başına 1 dolardan daha az maliyeti), hızlı reaksiyon hızı (~ 10 dk), yan ürünlerin yokluğu: Birkaç puan nicel Proteomikte için cazip bir yöntem indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) kullanılarak peptidlerin kararlı izotop etiketleme yapmak tekrarlanabilirliği (Şekil 3, 4), sabit reaksiyon ürünleri, bir proteaz kullanma yeteneği ve işaretli peptidlerin yüksek iyonlaşma verim. Bir sentetik ortam üzerinde spesifik amino asit oksotrofilerinin veya büyüme suşlar ya da hücre hatları gerektirmez, çünkü Redi ile kimyasal etiketleme metabolik etiketleme için avantajlıdır göredir. Bu nedenle, Redi birkaç mutant suş diğerleri arasında 15, 13 ve 14, insan kök hücreleri mevcut olduğu için yeni mikrop 12 de dahil olmak üzere protein örneğinin hemen hemen her türlü uygulanabilir.

Redi etiketleme bir sınırlaması ot göreli örnekleri multiplex için daha düşük bir yetenekgibi (örneğin, iTRAQ veya TMT), bunun için şu anda en fazla 8 örnekleri olabilir isobaric etiketleme gibi onun yöntemleri aynı anda 16 sayılabilir. Burada açıklandığı gibi bir yöntem, iki farklı şekilde etiketlenmiş numunelerin niceliksel karşılaştırılmasına olanak sağlamaktadır. Formaldehit ve siyanoborohidrid ilave izotopik kombinasyonları Da 17, en az 4 ile farklılık gösterir ve Redi etiketleme son 5 çoğaltılmış çok katlı örnekleri 18 uzatıldı 3 etiket kadar üretmek için kullanılabilir. Redi etiketleme başka meydan ters-faz kromatografi kullanılarak zaman döteryumlu peptidler hafif olanlar önce biraz Zehir olmasıdır. Bu "döteryum etkisi" kontrol etmek için, peptit ölçümü yerine her zaman bir taramadan yoğunluklarının tüm ayıklanır iyon kromatogram (MS1 pik alanı) dayalı olmalıdır.

Burada anlatılan Redi proteomiks protokol azaltma dimetil etiketleme ilk tanımlanmasından bu yana yapılan sayısız iyileştirmeler içerir 11,15,17kütle spektrometrisi 5 için peptitlerin. Biz bir "on sütun" etiketleme yüksek peptid miktarları ve etiketleme verimliliği örnek karıştırma önce kontrol edilebilir izin yöntemi, ancak "Çözümü" ve "online" etiketleme yöntemleri yanı sıra 19 var nitelendirdi. Proteom miktar ek olarak, Redi etiketleme izoform belirlenmesi için 20 uygulanmaktadır ve bu fosforilasyon 11,18 asetilasyon 21, 22 ve glikosilasyon gibi çeviri-sonrası tadilat analiz etmek için başka yöntemleri ile kombine edilebilir. Çünkü, çok yönlülüğü ve ucuz, nicel kimya, Redi etiketleme giderek yeni ve heyecan verici bir şekilde kantitatif Proteomikte uygulanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını ya da diğer ilgi çatışmalarını beyan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T9159 protein precipitation
Acetone Sigma-Aldrich 650501 protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 71736 denature, reduce protein
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045 denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43816 denature, reduce, alkylate protein
Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail Roche 4693124001 denature, reduce protein
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 alkylate protein
HEPES Sigma-Aldrich H7523 resuspend, extract, label protein
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 resuspend protein
Lysyl Endoprotease Wako Chemicals 129-02541 protein digestion
Sequencing grade trypsin Promega V5111 protein digestion
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 protein digestion
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537 Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges Waters WAT054960 Reversed-phase peptide extraction
Extraction manifold Waters WAT200609 Reversed-phase peptide extraction
Acetonitrile Sigma-Aldrich 14261 various
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549 “light” peptide labeling
Cyanoborohydride Sigma-Aldrich 71435 “light” peptide labeling
Deuterated formaldehyde Sigma-Aldrich 492620 “heavy” peptide labeling
Sodium cyanoborodeuteride CDN isotopes D-1797 “heavy” peptide labeling
MES Sigma-Aldrich M3671 peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) Agilent 770450-902 basic pH reversed-phase chromatography
Formic acid Sigma-Aldrich 399388 various
C18 Empore Disks 3M 14-386-3  STAGE tips
Methanol Sigma-Aldrich 494437 STAGE tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74, (7), 1650-1657 (2002).
  2. Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1, (5), 376-386 (2002).
  3. Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17, (10), 994-999 (1999).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3, (12), 1154-1169 (2004).
  5. Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75, (24), 6843-6852 (2003).
  6. Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7, (3), 1036-1045 (2008).
  7. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75, (3), 663-670 (2003).
  8. Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5, (11), 976-989 (1994).
  9. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4, (3), 207-214 (2007).
  10. Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7, (11), 4756-4765 (2008).
  11. Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). (2013).
  12. Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
  13. Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74, (6), 1300-1313 (2009).
  14. Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
  15. Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404, (4), 991-1009 (2012).
  16. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84, (17), 7469-7478 (2012).
  17. Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8, (22), 4624-4632 (2008).
  18. Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). (2014).
  19. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4, (4), 484-494 (2009).
  20. She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12, (3), 369-379 (2012).
  21. Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12, (7), 3277-3287 (2013).
  22. Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84, (20), 8452-8456 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics