Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

Chemistry

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Summary

Rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos por dimetilação redutora (rotulagem Redi) é uma estratégia rápida e barata para proteômica precisos baseados em espectrometria de massa quantitativos. Aqui demonstramos um método robusto para a preparação e análise de misturas de proteínas, utilizando a abordagem de Redi que pode ser aplicado a quase todos os tipos de amostra.

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Tolonen, A. C., Haas, W. Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling. J. Vis. Exp. (89), e51416, doi:10.3791/51416 (2014).

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Abstract

Rotulagem isótopo estável de péptidos por dimetilação redutiva (marcação Redi) é um método para quantificar com precisão as diferenças entre as amostras de expressão de proteínas utilizando espectrometria de massa. Rotulagem Redi é realizada usando regular (luz) ou deuterados formas (pesados) de formaldeído e sódio cianoborohidreto para adicionar dois grupos metil para cada amina livre. Aqui demonstramos um protocolo robusto para a rotulagem Redi e comparação quantitativa de misturas complexas de proteínas. As amostras de proteínas para comparação são digeridas em péptidos, rotuladas para transportar a luz ou etiquetas de metilo pesados, misturados, e co-analisados ​​por LC-MS/MS. Abundância relativa de proteína são quantificados por comparação de áreas de pico do cromatograma de iões de versões marcadas pesadas e leves do péptido constituinte extraído da MS espectro completo. O método descrito aqui inclui a preparação de amostras por extração em fase sólida de fase reversa, Redi rotulagem na coluna de peptídeos, peptídeos fracionamento por rev básico pHfase ersed (BPRP) cromatografia, e StageTip purificação peptídica. Discutimos vantagens e limitações de rotulagem Redi em relação a outros métodos de incorporação de isótopos estáveis. Destacamos novas aplicações usando rotulagem Redi como um método rápido, barato e preciso para comparar a abundância de proteínas em quase qualquer tipo de amostra.

Introduction

Medindo diferenças de concentração de muitas proteínas entre as amostras complexas é um desafio central em proteômica. Cada vez mais, isso é feito através da marcação de proteínas de cada uma das amostras com diferentes marcações isotópicas, combinando as amostras, e por espectrometria de massa para quantificar as diferenças de concentração. Existem vários métodos para a marcação isotópica estável de proteínas e peptídeos. 15N rotulagem 1 e 2 SILAC introduzir marcadores isotópicos metabolicamente in vivo, ao passo que iCAT 3, iTRAQ 4, e redução dimetilação 5 adicionar tags de isótopos estáveis ​​após a extracção de proteína e de digestão. Entre esses métodos, dimetilação redutora (rotulagem Redi) está ganhando popularidade como um método barato e reprodutível para quantificar as diferenças de concentração de proteínas em quase qualquer tipo de amostra.

Rotulagem Redi envolve péptidos que reagem com o formaldeído, para formar uma base de Schiff, a qual é então reduzidapor cianoborohidreto. Esta reacção dimethylates grupos amino livres no terminal N e cadeias laterais de lisina e monomethylates prolinas N-terminais. O protocolo aqui descrito metila péptidos em amostra 1 com um rótulo de "luz" usando reagentes com átomos de hidrogénio na sua distribuição isotópica natural e a amostra 2, com um rótulo "pesada" usando formaldeído deuterado e cianoborohidreto (Figura 1). Cada grupo amino dimetilado sobre um péptido resulta numa diferença de massa de 6,0377 Da entre luz e formas, pesados, que são utilizados para distinguir entre as duas formas, utilizando um espectrómetro de massa. Especificamente, as abundâncias relativas de péptidos são quantificadas como a razão entre as áreas de cromatogramas de iões MS1 extraídos (MS1 razão de área de pico) da luz e da versão pesada para cada par de iões de péptidos. A abundância relativa de uma proteína é calculada como a razão da área do pico MS1 média entre todos os péptidos da proteína. Neste relatório, nós descrevemos um protocolo robusto para condutaing Redi experiências de marcação por LC-MS/MS, que inclui o péptido de extracção de fase reversa em fase sólida, marcação Redi na coluna, o péptido de fraccionamento por pH básico de fase reversa (BPRP) cromatografia, e purificação de misturas de péptidos utilizando StageTips (Figura 2) . Discutimos vantagens e limitações do uso de rotulagem Redi para proteômica quantitativa.

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Protocol

NOTA: Este método foi descrito anteriormente 12.

1. Isolamento de Proteínas

Prepare 1 mg de proteína celular por lise das células, de preferência, por meio de métodos físicos, tais como a prensa francesa, grânulo batimento, ou de ultra-sons. Evitar a lise celular mediada por lisozima porque a enzima irá confundir medições de espectrometria de massa.

2. Precipitação de TCA de Proteínas

Adicionar 1 volume de ácido tricloroacético (TCA) a proteína de 4 volumes e frio em gelo durante 10 min para precipitar as proteínas. Centrifugar a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 1 ml de acetona gelada e centrifugar a 12000 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e inverter o tubo no banco para secar o sedimento durante 15 minutos. Peletes de proteína Armazenar a -80 ° C.

3. Desnaturar proteínas e Reduzir dissulfeto Bonds

Resuspender as proteínas para ~ 2 mg / ml em 500 ul de tampão de desnaturação e de redução (ou ureia 4 M ou 3% de SDS em 50 mM de HEPES pH 8,5, 5 mM de DTT). Opcionalmente, incluem um inibidor da protease no buffer. Incubar as proteínas durante 30 minutos a 56 ° C, seguido de 10 min à temperatura ambiente.

4. Aklylate grupos livres Sulfidrila para interromper irreversivelmente Formação Dissulfeto de Bond

Prepare fresco 0,3 M iodoacetamide na água. ATENÇÃO! Iodoacetamida é altamente tóxico. Adicionar 25 ul de 0,3 M iodoacetamida (15 mM de concentração final) a 500 ul de proteína e incubar durante 20 min no escuro à temperatura ambiente. Extingue-se por adição de iodoacetamida 10 ul de 300 mM DTT (5 mM de concentração final de DTT). Armazenar proteínas alquiladas a -80 ° C.

5. Digestão de proteínas

TCA precipitar as proteínas (tal como descrito na etapa 2) e ressuspender em 1 ml de HEPES 50 mM (pH 8,2), 1 M de ureia. Prepare uma solução estoque de Lisil endoproteinase (Lys-C) em água a uma concentração de 2 mg / mL e adicionam-se 5 ul da solução de proteína. Incubar a mistura durante 16 horas à temperatura ambiente. Assegurar a concentração final Lys-C é de 10 ng / mL e a relação de proteína para LysC (w / w) é de 1/50 a 1/200. Ressuspender 20 ug de tripsina de grau de sequenciação em 40 ul de 50 mM de ácido acético, adicionam-se 5 uL (10 ug de tripsina) a Lis-C digest, e incubar durante 6 horas a 37 ° C. Usar a mesma concentração de protease e os rácios de protease-proteína para Lis-C, tal como utilizado para a tripsina.

6. De fase inversa Peptide Extracção

  1. Acidifica-se péptidos por adição de ácido trifluoroacético (TFA) até uma concentração final de 0,5% (pH ≈ 2). Anexar uma coluna C18 de um colector de extração. Utilize a maior taxa de fluxo possível para todos os passos excepto a carga e eluição dos peptídeos.
  2. Wet coluna com 6 ml de acetonitrila (ACN). Lavar coluna com 6 ml de 80% de ACN, 0,1% de TFA, em seguida equilibrar-se com 6 ml de TFA a 0,1%. Não permita que ocoluna para secar entre as etapas.
  3. Pare a pressão de vácuo e carregar 500 ug de péptidos para a coluna a uma taxa de fluxo de aproximadamente 1 ml / min. Uma vez que os péptidos se ligaram à coluna, a reinicialização vácuo e lavar com 6 mL de TFA a 0,1%, em seguida com 3 ml de tampão de ácido cítrico (ácido cítrico 0,09 M, 0,23 M de Na 2 HPO 4, pH 5,5).
    Nota: os valores mais elevados de péptidos podem ser marcados, mas a coluna C18 capacidade de ligação deve ser pelo menos duas vezes maior do que a quantidade de péptido para evitar a perda de amostra.

7. On-coluna Peptide Labeling por redutora dimetilação (Redi Labeling)

Execute esta etapa sob um capuz químico como cianeto de hidrogênio é liberado em baixa concentração durante o processo de rotulagem.

  1. Prepare 12 ml de "leves" e "pesados" buffers REDI de metilato aminas peptídeo livres. Tampão Redi Luz consiste de 0,8% de formaldeído e 0,12 M cianoborohidreto de sódio levando hidrogênios em poeir distribuições isotópicas naturais em tampão de ácido cítrico. Tampão Redi pesada consiste em 0,8% de formaldeído deuterado e 0,12 M deuterado cianoborohidreto de sódio em tampão de ácido cítrico.
  2. Incubar coluna contendo peptídeos por adição de 10 ml ou de luz ou de tampão Redi pesada para as colunas contendo péptidos em taxa de fluxo de 1 ml / min e repetir a assegurar a rotulagem completa. Lavar a coluna com 6 ml de TFA a 0,1% e, em seguida, com ácido acético a 1 ml de 0,5%.
  3. Pare vácuo e eluir péptidos marcados em primeiro lugar com 1 mL de 40% de ACN, 0,5% de ácido acético, em seguida com 1 mL de 80% de ACN, 0,5% de ácido acético, utilizando uma taxa de fluxo de aproximadamente 0,5 ml / min. Se desejar, medir a eficiência de marcação de amostras individuais por espectrometria de massa antes de misturar amostras leves e pesados ​​(ver "Os resultados representativos"). Misturar 01:01 amostras de péptidos pesados ​​e etiquetados-luz para ser quantificada por espectrometria de massa.

8. Mistura Peptide separado por pH básico invertida Fase cromatografia (BPRP) </ P>

PH básico de fase reversa (BPRP) cromatografia para separar a mistura de péptidos em várias fracções, que são analisadas de forma independente por LC-MS/MS para aumentar a cobertura do proteoma.

  1. Fraccionar a mistura de péptidos numa coluna C18 de HPLC através da aplicação de um gradiente de concentração crescente de ACN em 10 mM de bicarbonato de amónio (pH 8). Comece com 5% (v / v) de ACN durante 5 minutos, para aumentar a 35% de ACN em 60 min, e em seguida a 90% de ACN em 1 min. Reter a ACN 90% durante 4 minutos antes de reduzir o ACN a 5% para re-equilibrar a coluna durante 9 min. Recolha 96 fracções de igual volume de uma placa de 96 poços (de A1 a H12). Monitorar a fraccionamento utilizando um detector de UV a 220 nm, enquanto que os péptidos são eluição da coluna (10-70 min para as condições aqui descritas).
  2. Combine frações de poços A1, C1, E1 e G1 (fração A1), a partir de poços B1, D1, F1 e H1 (fração B1), a partir de poços A2, C2, E2 e G2 (fração A2) e, consequentemente, para a demais frações. Remover o solvent usando uma centrífuga de vácuo. Ressuspender a partir de fracções de péptidos de A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11, B12 e em 130 ul de 1 M urea/0.5% TFA e purificar usando StageTips como descrito no passo 9. Loja frações B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, A12 e à temperatura de -20 º C.

9. Purify Peptídeos por parar e ir Extraction (StageTips)

Prepare C18-7 StageTip microcolunas embalando 200 dicas mL pipeta com duas C18 discos com um diâmetro interno (ID) de 1,07 mm. Coloque Dicas Stage em tubos Eppendorf. Use uma microcentrífuga para lavar dicas com 130 mL de metanol, em seguida, 130 ul de 80% ACN, ácido acético 0,5%. Equilibrar StageTips com 130 mL TFA 0,1%. Transferir a mistura de péptidos de StageTips e lava-se com 130 ul de 0,1% de TFA, em seguida, 40 ul de 0,1% de TFA, em seguida, 40 ul de ácido acético a 0,5%. Eluir péptidos primeiro com 20 ul de 40% ACN, 0,5% de ácido acético, em seguida, 20 ul de 80% ACN, 0,5% de ácido acético. Combine um eluatosnd seco por filtração sob vácuo.

10. Microcapilares LC-MS/MS

  1. Dissolve-se os péptidos em 1-5 mL de ácido fórmico a 5%, 5% de ACN a uma concentração de aproximadamente 1 mg / mL. Resolver ~ 1 ug péptidos sobre uma 100 um × 20 cm, C18-invertidos coluna de HPLC de fase com um gradiente de 6-22% de ACN em ácido fórmico a 0,125% aplicados sobre 75 ou 100 min a uma taxa de fluxo de ~ 300 nl / min.
  2. Identificar peptídeos usando um LTQ Orbitrap Velos 12 ou plataforma semelhante cromatografia líquida-espectrometria de massa com um espectrômetro de massa fornecendo alta resolução e precisão de massa de alta. Operar o espectrômetro de massa no modo dependente de dados com uma completa varredura MS (resolução de 60.000) adquirido no analisador Orbitrap. Gerar ion trap linear espectros MS / MS para as 20 mais abundantes iões detectados no espectro de MS completa. Definir controle de ganho automático (AGC) metas para 1 x 10 6 para o pleno MS e 2.000 para MS / MS. Definir máximas vezes acúmulo de íons de 1.000 mspara MS e 150 ms para MS / MS. Excluir íons peptídeo precursor fragmentadas de uma maior seleção de MS / MS para 20-60 seg.

11. MS / MS de Aquisição de Dados

Identificar peptídeos comparando espectros MS / MS arquivos RAW para um banco de dados teóricos com um algoritmo como SEQUEST 8 usando esses parâmetros (Tabela 1).

Tabela 1. Peptídeo de banco de dados da pesquisa Parâmetros.

Parâmetros Gerais digestão totalmente tryptic com até 2 perdeu clivagens
Tolerância íon precursor ppm 25
1.0 tolerância íon fragmento Da
Modificações estáticos Da 57,02146 em cisteína, carboxyamidomethylation
Da 28,03130 em lisina e o péptido N-terminal, a etiqueta dimetilação luz
Modificações dinâmicas Da 15,99491 em metionina, a oxidação
6,03766 Da em lisina e o péptido N-terminal, a etiqueta dimetilação pesado
  1. Filtrar péptidos a uma taxa de detecção falso 1% com um método tal como a estratégia de 9-alvo chamariz utilizando uma base de dados de estruturas de leitura abertas nas orientações efectivos e invertidas.

12. Peptide Quantificação

Calcular as áreas de pares pesados ​​e leves de MS1 extraído íon cromatogramas (áreas de pico MS1) e peptídeo sinal-ruído (S / N) proporções 10. Incluir pares de peptídeos somente quando sua média de sinal-noiproporção se for superior a cinco. Quantificar a abundância relativa de um peptídeo das duas amostras como a razão entre as áreas dos picos de MS1 versões pesadas e leves do mesmo péptido (razão de área de pico MS1). Calcular as abundâncias relativas de proteína como a razão da área do pico MS1 mediana para todos os péptidos da proteína.

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Representative Results

Avaliou-se a exatidão, precisão e reprodutibilidade de rotulagem Redi usando Saccharomyces cerevisiae e Clostridium phytofermentans lisados ​​de células inteiras. Primeiro, quantificou o Redi eficiência de marcação de uma mistura de C. phytofermentans lisados ​​de proteína a partir de celulose (pesado marcado, H) e glicose (rótulo de luz, L) culturas. Quando filtrada para uma taxa de falsa descoberta peptídeo 1%, esta amostra continha 11.194 sequências de peptídeos exclusivos com um 98% de eficiência de marcação Redi. Não fracionada S. cerevisiae lisado de proteína foi similarmente marcado com H ou L reagentes, misturado em várias proporções, e analisados. Diferenças de expressão de proteínas (log 2 (áreas dos picos médios MS1)) reproducibly refletir as proporções em que foram misturadas as amostras H e L em uma ampla gama de relações de mistura (Figura 3). Especificamente, a dobra de troca de 99% das proteínas foram medidos como sendo menor do que 1,6 vezes para as 01:01 amostras misturadas. Emas 01:10 e 10:01 amostras, 99% de proteínas estavam dentro de 3,8 vezes a esperada razão, mostrando um aumento do desvio padrão de uma maior distância a partir de uma mistura de 1:1. Quando marcação Redi foi aplicada ao Clostridium phytofermentans proteoma, quantificou mais de 2000 proteínas com proteínas de 94% dentro dos níveis medidos de 2 vezes para culturas réplica de crescimento em glucose (Figura 4A). Proteína dobrar mudanças para pares duplicados de culturas (glicose contra celulose) também foram altamente correlacionados (r 2 = 0,82), (Figura 4B). S. comparações cerevisiae (Figura 3) são de uma única cultura e, assim, mostrar a reprodutibilidade técnica da proteômica quantitativos baseados Redi. C. medições phytofermentans (Figuras 4A, B) comparar replicar culturas tão diferenças de expressão representam tanto erro de medição e variação biológica entre as culturas. Juntas, essas experiênciasmentos apoiar essa Redi proteômica é um método preciso e reprodutível para quantificar as diferenças de expressão de proteínas entre as amostras complexas.

Figura 1
Figura 1. Dimetilação redutora de peptídeos utilizando reagentes leves e pesados ​​para dimethylate aminas livres. O mesmo peptídeo marcado com pesado contra os reagentes de luz tem uma massa 6,0377 mudança Da por amina livre. O péptido aqui apresentado é marcado tanto no terminal-N e em uma cadeia lateral de lisina. Imagem adaptada de Referência 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Geral de protocolo para proteômica quantitativa por dimetilação redutora. Números vermelhos acima setas correspondem aos passos descritos no protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Avaliação de marcação Redi utilizando Saccharomyces cerevisiae lisatos de células inteiras. Amostras de uma única cultura foram marcadas com tanto pesada (H) e leve (L) reagentes, misturados em diferentes proporções (1H: 10L, 1H: 5L, 1H: 2D, 1H: 1L, 2H: 1L, 5H: 1D e 10H: 1D), e as diferenças entre as amostras de proteínas H e L foram quantificados como relações log 2 mediana das áreas dos picos MS1 (log 2 relação H / L). O valor de R 2 de uma linha de tendência linear através de todos os dadospontos foi de 0,96 (linha preta); a correlação de Pearson foi de 0,98. Os limites de confiança (linhas vermelhas) mostram a distância perpendicular a partir da linha absoluta tendência na qual 95% dos pontos de dados foram encontradas para cada amostra. Imagem adaptada de Referência 12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Quantificação da Redi-rotulado Clostridium phytofermentans proteínas a partir de culturas em crescimento de diferentes fontes de carbono. A) A expressão de proteínas numa cultura de glicose em relação a uma cultura de glicose repetição, uma cultura de hemicelulose, celulose e uma cultura. A fracção de proteínas expressas em níveis dupla: glucose-glucose (94%), glucose-hemicelulose (80%), e glucose-celulose (49%). B) Dobrar as alterações na expressão de proteína de glucose em função culturas de celulose são altamente correlacionadas (r 2 = 0,82) para os pares de duplicados de culturas. Imagens Adaptado da referência 12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Vários pontos tornar a rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos usando um método atraente para proteômica quantitativa dimetilação redutora (rotulagem Redi): reagentes baratos de rotulagem (reagentes custam menos de US $ 1 por amostra), a taxa de reação rápida (~ 10 min), ausência de produtos secundários, altas reprodutibilidade (Figuras 3, 4), produtos de reacção estáveis, capacidade de usar qualquer protease, e alta eficiência de ionização de peptídeos identificados. Marcação química por Redi também é vantajoso em relação à marcação metabólica, uma vez que não necessita de estirpes ou linhas celulares com auxotrophies de aminoácidos específicos ou crescimento num meio sintético. Como tal, Redi pode ser aplicado a praticamente qualquer tipo de amostra de proteína, incluindo novos micróbios 12 em que algumas estirpes mutantes estão disponíveis 13 e 14 de células estaminais humanas, entre outros 15.

A limitação de rotulagem Redi é uma habilidade menor para multiplex amostras em relação ao otos métodos tais como a rotulagem isobárica (por exemplo, iTRAQ ou TMT), para os quais actualmente até 8 amostras podem ser quantificadas simultaneamente, 16. O método aqui descrito permite a comparação quantitativa das duas amostras diferencialmente marcadas. Combinações isotópicos adicionais de formaldeído e cianoborohidreto pode ser usado para produzir até três etiquetas que diferem em pelo menos 17 4 Da e rotulagem Redi foi recentemente alargado a 5 amostras multiplexadas 18. Um outro desafio de rotulagem Redi é que os péptidos deuterado eluem ligeiramente antes leves pelo uso de cromatografia em fase reversa. Para controlar este "efeito de deutério", peptídeo quantificação deve sempre ser baseado em todo o cromatograma de íon extraído (área do pico MS1) em vez de intensidades de um scan.

O protocolo proteômica Redi descrita aqui inclui inúmeras melhorias 11,15,17 feitas desde a primeira descrição de rotulagem dimetil reduçãode peptídeos para espectrometria de massa 5. Nós descrevemos um método "na coluna" rotulagem para permitir que maiores quantidades de peptídeos ea eficiência de marcação pode ser verificado antes de mistura da amostra, mas "em solução" e "on-line" métodos de rotulagem existem também 19. Além proteoma quantificação, rotulagem Redi está a ser aplicado para a determinação da isoforma 20 e pode ser combinado com outros métodos para analisar as modificações pós-translacionais, tais como a fosforilação 11,18 acetilação 21, e 22 de glicosilação. Devido à sua versatilidade e baixo custo química, quantitativa, rotulagem Redi serão cada vez mais aplicada a proteômica quantitativos de maneiras novas e emocionantes.

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Disclosures

Os autores declaram não competindo interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T9159 protein precipitation
Acetone Sigma-Aldrich 650501 protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 71736 denature, reduce protein
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045 denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43816 denature, reduce, alkylate protein
Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail Roche 4693124001 denature, reduce protein
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 alkylate protein
HEPES Sigma-Aldrich H7523 resuspend, extract, label protein
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 resuspend protein
Lysyl Endoprotease Wako Chemicals 129-02541 protein digestion
Sequencing grade trypsin Promega V5111 protein digestion
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 protein digestion
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537 Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges Waters WAT054960 Reversed-phase peptide extraction
Extraction manifold Waters WAT200609 Reversed-phase peptide extraction
Acetonitrile Sigma-Aldrich 14261 various
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549 “light” peptide labeling
Cyanoborohydride Sigma-Aldrich 71435 “light” peptide labeling
Deuterated formaldehyde Sigma-Aldrich 492620 “heavy” peptide labeling
Sodium cyanoborodeuteride CDN isotopes D-1797 “heavy” peptide labeling
MES Sigma-Aldrich M3671 peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) Agilent 770450-902 basic pH reversed-phase chromatography
Formic acid Sigma-Aldrich 399388 various
C18 Empore Disks 3M 14-386-3  STAGE tips
Methanol Sigma-Aldrich 494437 STAGE tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74, (7), 1650-1657 (2002).
  2. Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1, (5), 376-386 (2002).
  3. Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17, (10), 994-999 (1999).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3, (12), 1154-1169 (2004).
  5. Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75, (24), 6843-6852 (2003).
  6. Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7, (3), 1036-1045 (2008).
  7. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75, (3), 663-670 (2003).
  8. Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5, (11), 976-989 (1994).
  9. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4, (3), 207-214 (2007).
  10. Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7, (11), 4756-4765 (2008).
  11. Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). (2013).
  12. Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
  13. Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74, (6), 1300-1313 (2009).
  14. Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
  15. Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404, (4), 991-1009 (2012).
  16. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84, (17), 7469-7478 (2012).
  17. Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8, (22), 4624-4632 (2008).
  18. Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). (2014).
  19. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4, (4), 484-494 (2009).
  20. She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12, (3), 369-379 (2012).
  21. Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12, (7), 3277-3287 (2013).
  22. Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84, (20), 8452-8456 (2012).

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