Visualisering af endosome Dynamics i Living nerveender med Firdimensional fluorescensimagografi

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fire-dimensionelle (4D) billeddannelse er udnyttet til at studere adfærd og samspillet mellem to typer af endosomes i levende hvirveldyr nerveender. Bevægelse af disse små strukturer er karakteriseret i tre dimensioner, hvilket tillader bekræftelse af begivenheder såsom endosome fusion og exocytose.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stewart, R. S., Kiss, I. M., Wilkinson, R. S. Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51477, doi:10.3791/51477 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Firedimensionale (4D) lys billeddannelse er blevet brugt til at studere opførsel af små strukturer i motoriske nerveender af den tynde transversus abdominis muskel strømpebåndet slange. Rå data omfatter time-lapse sekvenser af 3D z-stakke. Hver stak indeholder 4-20 billeder erhverves med epifluorescens optik på fokusplaner adskilt af 400-1,500 nm. Trin i købet af billedstakke, såsom justering af fokus, omskiftning af excitationsbølgelængder og drift af det digitale kamera, automatiseres så meget som muligt for at maksimere billedet sats og minimere vævsskader fra lys eksponering. Efter overtagelsen et sæt billedstakke udfoldede for at forbedre rumlig opløsning, konverteres til det ønskede 3D-format, og bruges til at skabe en 4D "film", der er velegnet til række computer-baserede analyser, afhængig af de eksperimentelle data, der ønskes. Én ansøgning er studiet af den dynamiske opførsel af to klasser af endosomes findes i nerveender-macroendosomes (MES)og sure endosomer (AES)-hvis størrelser (200-800 nm for begge typer) er på eller i nærheden af ​​diffraktionsgrænsen. Adgang til 3D information på hvert tidspunkt tilvejebringer adskillige fordele i forhold til konventionelle time-lapse billeddannelse. Navnlig kan størrelse og hastighed af bevægelse af strukturerne kvantificeres over tid uden tab af skarpe fokus. Eksempler på data fra 4D billeddannelse afslører, at MV nærmer plasmamembranen og forsvinder, hvilket tyder på, at de er exocytosed snarere end blot at flytte lodret væk fra et enkelt fly af fokus. Afslørede også er formodet fusion MV og AES, ved visualisering af overlapning mellem de to dye-holdige strukturer set i hver tre ortogonale projektioner.

Introduction

Time-lapse billeddannelse af levende væv giver visuel adgang til dynamiske struktur-funktion relationer, der kan ikke blive værdsat i faste eller levende præparater afbildet på et enkelt tidspunkt. Men ofte den tradeoff for adgang til tidsmæssig information er et fald i optisk opløsning. Høj numerisk blænde olieimmersionsobjektiv målsætninger er upraktisk i levende væv på grund af deres snævert interval af fokus, forlader nedsænkning i vand eller tørre formål som de eneste alternativer. Desuden kan den øgede opløsning gives ved konfokal optik ikke udnyttes i nogle levende præparater på grund fototoxicitet fra de relativt høje niveauer af belysning krævede 1,2. Endelig mens flere real-time eller time-lapse optiske teknikker er til rådighed, der tilbyder forbedret opløsning, er deres anvendelighed begrænset til præparater, hvor strukturer af interesse kan placeres inden for et par hundrede nanometer i mål 1. Den beskrevne fremgangsmådegør brug af relativt lave omkostninger udstyr, er alsidig, men tilbyder forbedret opløsning i forhold til mere almindeligt anvendte time-lapse teknikker. Den er beregnet til brug i de enkelte laboratorier samt billeddiagnostiske faciliteter.

Fremgangsmåden udnytter konventionelle epifluorescens mikroskopi kombineret med et følsomt digitalt kamera og med hardware designet til hurtigt at opnå sæt af billeder på lidt forskellige fokusplaner (z-stacks). Hver z-stakken er digitalt udfoldede at forøge opløsning. Et element i 3D time-lapse (4D) billeddannelse er præcis sporing af bevægelige organeller eller andre strukturer. Når den er indstillet korrekt, behøver filmede strukturer ikke gå ud af fokus, og kan iagttages bevægelse i alle tre retninger og kvantificeres. Det er derfor umuligt for en farvet struktur til at forsvinde i løbet af et eller flere time-lapse frames blot ved drifting over eller under en smal fokalplan. Metoden fungerer også som et følsomt redskab til at vurdere samspillet og mulig fudelse af små strukturer. Konventionel epifluorescens eller konfokal billeder af strukturer nær diffraktionsgrænsen (et par hundrede nm) ikke bekræfte fusion selvom flettede billeder viser overlapning af deres respektive etiketter 3. Fusion foreslået, men det er stadig muligt, at objekter er adskilt vandret eller lodret med en afstand, der er under diffraktionsgrænsen. Tre eller fire-dimensional imaging derimod tillader visning af objekter på hver af de tre ortogonale retninger. Fremkomsten af ​​fusion i alle tre visninger øger niveauet af sikkerhed. Og i nogle levende præparater, instrueret eller Brownske bevægelse af formodet smeltet genstande giver yderligere bevis, når begge mærker bevæger sig sammen i tide. Selvfølgelig, når nær diffraktionsgrænsen niveauet af sikkerhed i kræsne strukturer fra baggrund, eller som viser, at de indeholder to farvestoffer (fusion), er ikke absolut. Hvis det er relevant, specialiserede teknikker, såsom fluorescens resonans (FRET)4, er mere passende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Farv Forberedelse med Supravital Farvestoffer

  1. For strømpebåndet slange dissektion protokol se Stewart et al. 5. Teng et al. 6 Reptilian væv forbliver fysiologisk i længere tid, og med mindre bakteriel forurening, når den opbevares ved lave temperaturer (se nedenfor). Pattedyrvæv opretholdes sædvanligvis ved stuetemperatur eller højere.
  2. For lysosomale vital farvestof farvning opløse farvestoffet i kolde reptil Ringers opløsning 1:5000 (0,2 um). Der inkuberes ved 4 ° C i 15 min. Vask flere gange med koldt Ringers. Billede så hurtigt som muligt.
  3. For FM1-43 farvning hjælp KCl stimulation, fortyndes farvestoffet i high-KCl Ringers 1:500 (7 uM). Inkuber ved 4 ° C i 30-60 sek maksimum. Vask hurtigt tre gange med koldt Ringers ~ 1 min / skylning. Billede så hurtigt som muligt.
  4. For FM1-43 farvning hjælp hypertoniske (saccharose) stimulation, fortyndes farvestoffet i 0,5 M saccharose Ringers som ovenfor. Inkuber ved 4 & #176; C i 2-5 min. Vask som i trin 1.3 ovenfor med kolde Ringers. Billede så hurtigt som muligt.
  5. For FM1-43 farvning via elektrisk stimulation, se Teng et al. 6. Kort fortalt er præparatet placeret en skål indeholdende fysiologisk saltopløsning, og farvestoffet. Nerven stimuleres med et forudprogrammeret tog på 200 mikrosekunder rektangulære pulser (~ 7 V, 30 Hz, 18 mikrosekunder). Vask som i trin 1.3 ovenfor med kolde Ringers. Billede så hurtigt som muligt.

2.. Konfigurer Forberedelse til Imaging

  1. Vend forberedelse, så strukturer af interesse er så tæt som muligt til mikroskopet mål.
  2. Hvis der anvendes et inverteret mikroskop, udnytte et kammer hvis bund indeholder en tynd runde dækglas. Typisk skal imaging kammer har en tynd rustfri bund med en 25 mm diameter # 1 tykkelse dækglas i centrum. Hvis der anvendes en opretstående mikroskop, er en bund dækglas ikke påkrævet, men er nyttigat tillade billeddannelse med transmitteret lys (f.eks kontrast differential interferens, DIC) at orientere prøven og find genstande af interesse.
  3. Vælg en passende målsætning om at opnå den højest mulige 3D-opløsning. Der er kompromiser blandt blændetal (na), der arbejder afstand, forstørrelse, og type linse (tør, vand-og olie-fordybelse). Til tynde præparater som vævskulturer, olie mål er bedst. Ved hjælp af en opretstående mikroskop flyde et dækglas på den vandige bad, og bruge immersionsolien mellem toppen af ​​dækglasset og målet.
  4. Hvis der anvendes deconvolution software, kan sælgeren tilbyde forudbestemte punkt spredes funktioner (vævede) for visse mål. Hvis der ikke fremlægges sådanne oplysninger, eller hvis en ikke-understøttet mål er valgt, fastlægge PSF af imaging fluorescerende mikroprikker eller lignende diffraktionsbegrænset objekter 7,8.

3.. Etablere ønskede dybdeskarphed og antallet af IMAGES Ønsket per Time-lapse Frame

  1. Vælg den samlede dybdeskarphed, så flytter eller interagere strukturer af interesse ikke forsvinde eller gå ud af fokus, når de bevæger sig i z-retningen. Z-felt skal være lidt større end den lodrette dimension celle eller proces, der afbildes. For hvirveldyr motorklemmer 15-20 um er typisk.
  2. Beregn z-aksen skridt er nødvendige for hver stigning på fokus. Opløsning langs z-aksen varierer afhængigt egenskaber mål; er det omkring en fjerdedel af xy-planet opløsning. Hvis der anvendes enten konfokal billeddannelse eller dekonvolution softwaren, z-aksen opløsning forbedres. Forbedre den endelige beslutning bevidst oversampling i z-retningen 5, men se også trin 3.3 nedenfor. En typisk trinstørrelsen er i området fra 400-1,500 nm for 40-100X mål. Lys skal nøglehullet off mellem hvert z-trin billede.
  3. Vælg antallet af billeder pr z-stakken, nemlig ønskede dybdeskarphed deltaf trinstørrelsen. Tid til at fuldføre en typisk z-stak er 1-10 sek. Hurtig bevægelse (100 nm / sek) kan vises sløret i et 3D-billede stak fordi hver billedplan svarer til et lidt andet tidspunkt. Også hvert ekstra billede bidrager til fotoblegning og mulig fototoksicitet (se Diskussion). Hvis begge situationer vedrører, vælge en større z-skridt til at indsamle færre billeder pr stack. Kompensere senere bruge billedet interpolation software (trin 6.3 nedenfor).

4.. Vælg Time-lapse Frame Rate

Vælg ved at eksperimentere en sats, der er lige nok til at problemfrit løse ændrer sig med tiden, såsom bevægelse, interaktioner eller fusionsbegivenheder 9. Under prøvetagning kan producere bevægelsesartefakter (prøvetagning fejl), mens oversampling unødigt øger lyspåvirkning. Saml enten en enkelt lang sekvens eller flere gentagne sekvenser fra det samme præparat, hver med en relativt lille total tidsinterval (

5.. Gennemfør Alle Direkte Imaging for et bestemt præparat

Reptil præparater typisk forblive robust for ~ 1-2 timer, længere, hvis afkølet.

6.. Analyser data i henhold til ønskede brug

  1. Gem alle rå datafiler. Mens digital lagring er normalt ikke noget problem, behandlingstid er betydelig, selv med hurtige personlige computere eller arbejdsstationer. Af denne grund, beskære billeder i et område af interesse [ROI]. Sikre, at hele regionen af ​​interesse er i det beskårne vindue under hele tidsforløbet.
  2. Deconvolve billede stakke ved hjælp af passende software, og den korrekte punktspredningsfunktionen. Bekræft, at opløsningen er forbedret, og at der ikke artefakt er blevet genereret af dendekonvolution algoritme. Figur 3 viser eksempel billeder.
  3. Brug en interpolation algoritme til at udvide z-aksen tilsyneladende opløsning. En 6X ekspansion fra en egentlig 1,5 um billedplan adskillelse til en tilsyneladende 0,25 um adskillelse er foreslået. Alternativt kan du bruge en kombination af oversampling (trin 3.2) og interpolation.
  4. Udfør kontrast, lysstyrke, støj-filtrering, fotoblegning og andre typiske reguleringer billedbehandling, hvis det ønskes. Image manipulation standarder dikterer, at for de fleste videnskabelige arbejde, er det hensigtsmæssigt, at de samme korrektioner anvendes på alle billeder, både inden for en stak, og på forskellige tidspunkter. Konsekvensen af en særskilt justering bør vurderes blandt alle billeder 9.
  5. Vælg en bestemt visningstilstand til eksport af data. Den mest ligefremme skærm er stereo video ved hjælp af enten rød-grøn eller rød-blå anaglyphs (eksempler i figur 3), stereo par, eller skiftevis venstre / vet øje rammer med shutter briller. Anaglyphs er begrænset til en enkelt farve. Forbedre tilsyneladende billede dybde, hvis det ønskes at forbedre z-aksen visuel opløsning.
  6. Eksperimenter med forskellige filtrerings-og billedfiler ekstraudstyr teknikker. For eksempel Laplace filtrering er nyttigt at øge kontrasten af ​​små strukturerne over baggrund. Lysstyrken af ​​pixels i centrum af en kørende vindue forstærket, mens lysstyrken af ​​de omgivende områder er reduceret. Bemærk, at nogle filtrering metoder ikke fungerer godt i kombination.
  7. Anvend drive korrektion, hvis der er en betydelig bevægelse af præparatet over tid. En sådan bevægelse er almindelig i levende muskler, selv med stoffer tilføjes at undertrykke virkningspotentialer og synaptiske potentialer. En pixel registrering algoritme (f.eks. Imaris, Adobe eftervirkninger, TurboReg plugin til ImageJ) justerer time-lapse billeder og kan reducere, men som regel ikke helt fjerne, sådan bevægelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De viste data er fra slange neuromuskulære terminaler (se lave og høje udsigt forstørrelsen i figur 3; den endocytiske farvestof (FM1-43) optagelse skaber en tåge, der fylder hver Bouton), og i særdeleshed macroendosomes (MES) og sure endosomes (AES) inden for disse terminaler 5. MV er skabt ved bulk endocytose i neurale aktivitet 10 og deres antal aftager eksponentielt med tiden, efter at aktiviteten er ophørt 6. Brug af 4D billeddannelse var at afgøre, om ME'er bevæge sig mod plasmamembranen og hurtigt forsvinde, hvilket tyder på, at deres antal falder, fordi nogle af dem exocytose. Alle sådanne MV var til stede på et tidspunkt (og dem før), og helt væk ved næste tidspunkt (og dem efter). Den nødvendige tid til forsvinden var således mindre end vores rammeinterval (så kort som 30 sek) og i overensstemmelse med eksocytose. En alternativ teori, som ikke understøttes af 4D-data, er, at ME langsomt sprede via knopskydning af vesicles indtil de forsvinder. Vesikel spirende sker 6, men i det mindste nogle MV er exocytosed enten under eller efter spirende 5. Figur 1 og Movie S1 illustrerer forsvinden en ME mellem to tidsforskudte rammer. MV bestemt til at forsvinde ikke ændre form eller lysstyrke i løbet af to eller flere frames (N = 16), hvilket ville have været i overensstemmelse med langsom spredning i løbet af den periode af filmen (begyndende flere minutter efter kortvarig stimulering). ME forsvinden blev observeret tidligere i konventionel time-lapse, men det var muligt at strukturerne blot havde forladt flyet af fokus. Desuden ser fra en række forskellige perspektiver (Movie S1) bekræftede, at ME forsvinden var pludselig. Med konventionel billeddannelse (ser fra en enkelt perspektiv, fx xy billedplan) støjartefakter begrænser investigator evne til at bekræfte, at en struktur var uændret. Sådanne artefakter er ofte til stedei én visning, men ikke andre.

Elektronmikroskopi undersøgelser viste, at endosomes i motorterminaler er små i størrelse, nær diffraktion grænsen af lys 10. Derfor fusion af disse endosomes kan ikke helt adskilles fra tæt rumlig forening på lysniveau. ME blev mærket med FM1-43 (grøn-fluorescerende) og bivirkninger med en lysosomalt vital farvestof (rød-fluorescerende). Strukturer, der fluoresced i begge farver (vises gul) lejlighedsvist er set i 4D billede optegnelser. Ved hjælp af passende software er visninger af disse dobbelt-mærket, og derfor tilsyneladende kondenserede endosomer fra en række af perspektiv genereret for at undersøge sammenfald af de to etiketter i voxel nær og inden for den tilsyneladende struktur. Figur 2 viser en formodet fusioneret AE-ME set fra tre ortogonale retninger. Et synspunkt er xy-planet; de andre synspunkter er vinkelret på dette plan, og til hinanden. Ved anvendelse af denne metode blev det fundet, at voxelenten overlappede, som i dette eksempel, eller at de helt klart ikke i et eller flere Viewing fly. Movie S2 viser den samme formodede smeltet AE-ME præsenteret som en interaktiv virtual reality display (fuldt drejeligt i 3 dimensioner).

Digital deconvolution er et nyttigt værktøj til at forbedre løsningen af 3D samt 4D billeder, fra både konventionelle og konfokal mikroskoper 11. Deconvolution er en numerisk, iterativ proces, der kompenserer i nogen grad for begrænset rumlig opløsning af målet anvendes. Denne resolution er karakteriseret som objektivets punktspredningsfunktionen-3D volumen besat af billedet af et uendeligt lille punkt. I teorien dekonvolution gendanner det billede, ville opstå, hvis målet var perfekt. Figur 3 er et 3D volumen visning af to forskellige datasæt, hver vist som et par af rød-grøn anaglyphs. De rigtige billeder viser typisk forbedring i skarphed efter digital defoldning af billedet stakken.

Figur 1
Fig. 1. En macroendosome (ME) forsvinder efter tilsyneladende kontakt med plasmamembranen. En slange nerve-muscle præparat blev elektrisk stimuleret i nærvær af FM1-43. Data blev indsamlet ved hjælp af 4D billeddannelse som beskrevet i metoder og vises som "3D-visninger Volume" på seks tidspunkter (60 sek interval) til at illustrere Z-dybden af ​​en enkelt Bouton. En ME kan observeres på vej væk fra Y-aksen (rød stiplet linie) over flere frames før de forsvinder mellem tidspunkter 5 og 6. Lige før forsvinden, synes mig at være placeret på Bouton plasmamembran (afgrænset af FM1-43 vesikel farvning eller "tåge," se figur 3 legende). ME ikke igen isenere tidspunkter (data ikke vist, se Movie S1). Scale bar, 2 mM. Klik her for at se en større version af dette tal.

MOVIE S1:. 4D time-lapse synspunkter ME forsvinden Klik her for at se filmen. Den samme rå data, der vises i figur 1 sæt er vist som en "4D volumen view" på et lavere forstørrelse. Den originale time-lapse-sekvens består af 8 tidspunkter, hver adskilt af 60 sek; afspilningen er på 4 billeder / sek. Rækkefølgen er kortvarigt på pause ved begyndelsen af ​​hver af 24 3D rotation skridt omkring y-aksen (15 grader / trin) for at henlede opmærksomheden på den snart-til-være at forsvinde ME (rød pil). Bemærk, at ME er synligt, nærmer sig kanten af ​​Bouton (plasma membran), forsvinder, og ikke vender tilbage, ialle visning perspektiver. På grund af lavere z-aksen beslutning i forhold til xy opløsning, formen af ​​ME synes at forlænge og forkorte afhængigt visning perspektiv. Billeder blev eksporteret som en QuickTime-film, og kommenteret med QuickTime Pro. Scale bar, 2 mM.

Figur 2
Figur 2. Ortogonale visninger af en formodet fusioneret endosom. En nerve muskel præparat blev sekventielt farvet med en lysosomal vitale farvestof (rød) til at mærke bivirkninger og FM1-43 (grøn) til at mærke MV anvendelse af 0,5 M saccharose stimulering som beskrevet i Methods. Data fra et tidspunkt af en 4D film vises som 3D-volumen synspunkter i tre retninger. På toppen (panelerne 1-3) er den konventionelle ovenfra (XY-plan). På mellemlederniveau (paneler 4-6) er en visning vinkelret på xy-planet ogi (vilkårlige) retning af den store røde pil. Nederst (panelerne 7-9) er en visning gensidigt vinkelret på begge visninger ovenfor, i retning af den store blå pil. En ME (grøn) er markeret med en grøn pil; to bivirkninger (rød) er markeret med røde pile. En endosomet indeholder både farvestoffer (gul) er markeret med en gul pil i paneler 3, 6 og 9. Bemærk, at overlapning af rødt og grønt er lige så fuldstændig i alle tre ortogonale projektioner. Scale bar, 2 mM. Klik her for at se en større version af dette tal.

MOVIE S2:. Interaktiv rotation af billede, der indeholder MV og sure endosomer AE'er . Klik her for at se film Datasættet i figur 2 er vist konfigureret som en fuldt drejelig 3D-billede (QuickTime Virtual Reality format; bruge musen til at rotere billedet til visning fra enhver retning). De formodede smeltet ME / AE forbliver gul fra alle perspektiver.

Figur 3
Figur 3. Deconvolution forbedrer 3D rumlig opløsning. To typiske slange nerveender, vist ved lav (øverst) og høj (nederst) forstørrelse henholdsvis og farves under stimulation FM1-43. FM1-43 baggrunden "tåge" på grund af mærkning af individuelle 50 nm vesikler, viser formen af ​​terminale boutons inden for hvilke ME er begrænset. Data er vist som rød-grøn anaglyphs af 3D-visninger volumen (dybde kan visualiseres med rød-grøn eller rød-blå briller, rød på venstre øje, note Axon øverst til venstre ned i flyet af terminalen fra ovenfor). Venstre paneler: rå data; Højre paneler: data efterdeconvolution. Bemærk den markante forbedring i opløsning MV. Top paneler: elektrisk stimulation; Hele terminal vist (~ 30 x 50 mM) (samme rådata som i figur 1, og Movie S1, skala bar, 10 um). Bundpaneler: KCI stimulation; forstørret for at vise fire individuelle boutons (~ 3 x 5 m; skala bar, 2 um). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det mest kritiske aspekt af 4D billeddannelse er styring af varigheden og intensiteten af ​​lys eksponering. Fotoblegning nedsætter billede signal-til-støj-forhold og kan være problematisk eller ikke afhængigt af forskellige faktorer, herunder valg af fluorophores. Uspecifik skade på levende væv (fototoksicitet) er relateret til fotoblegning, og kan nogle gange blive identificeret ved hjælp af fluorescerende prober designet til formålet 2,12 eller ved undersøgelse af morfologi med egnede lysfelt optik, såsom kontrast differential interferens (DIC).

Det er dog muligt at fremkalde en fysiologisk virkning, der forekommer ved lysniveauer langt under størrelsen af ​​dem er forbundet med fotoblegning og fototoksicitet. For eksempel i tidlige eksperimenter ved hjælp af flere præparater, som hver er fastgjort på et andet tidspunkt efter stimulering blev den hastighed, hvormed MV forsvandt med tiden efter en kort stimulation målt 6. Som det er almindelig praksis to minimere fading blev forberedelser holdt i mørke, indtil de blev vist. Da lignende forsøg blev udført ved hjælp af 4D billeddannelse, mange flere MV forblev i hele forsøget (~ 20-60 min) og ikke forsvinde. Anvendelse af samme direkte billedvisning protokol, undtagen faktisk ikke optagelse og dermed begrænse lys eksponering til en enkelt 3D-billede i begyndelsen og en enkelt ramme i slutningen, restaureret den forventede samlede sats for endosome forsvinden til faste præparater.

Yderligere fejlfinding viste, at antallet af forsvinden var delvis omvendt og monotont relateret til den samlede udsættelse for lys under et eksperiment. Efter mislykkede forsøg på at reducere eksponering via konventionelle og multiphoton konfokal optik, blev problemet endelig løst ved køb af en ~ 3x mere følsom kamera (tabel 1). Det anbefales, at tilsvarende sammenligninger foretages, hvis muligt, afhængigt af brugerens anvendelse. Hvis nogle pprocesmodeller eller overgang bliver dokumenteret over tid, bekræfter, at der er ingen ændring kan henføres til intensitet eller samlede varighed af belysning. Fototoksicitet og fotoblegning er dye-specifikke. For eksempel oplevede vi ingen signifikant fading efter gentagen 4D billeddannelse af en terminal (350 individuelle lys engagementer over 30 min) ved hjælp af FM1-43. Den samme billeddannelse protokol anvendelse af en lignende farvestof, SGC5 (tabel 1), resulterede imidlertid i en vis fading og formodentlig fototoksicitet samt (data ikke vist).

Med undtagelse af forbedringer med digital deconvolution (og konfokal optik, hvis de anvendes, ikke vist), den enkel metode beskrevet giver ingen "super" opløsning. Men metoden har den fordel at forbedre praktisk eller intuitiv opløsning ved visning af levende strukturer, især bevægelige dem, hvis størrelse ligger på eller lidt større end diffraktionsgrænsen. Evnen til at se genstande fra forskellige perspektiver, including præsentation i hver af de tre ortogonale planer, guider investigator, om en struktur, rent faktisk eksisterer over støjniveauet, og om det er mærket af en eller flere fluoroforer. For eksempel i eksperimenter designet til at kvantificere antallet og størrelsen af ​​MV og bivirkninger, var det muligt at bekræfte, at strukturen var synlig fra forskellige perspektiver og at hver dimension (og dermed dets tredimensionale volumen) inden for intervallet typisk for struktur. Placeringen af en struktur er også en bedre defineret, for eksempel inden for en Axon, nerveterminal osv. snarere end over eller under det. I modsætning hertil, når synsfeltet var begrænset enten til en enkelt 2D billedplan eller til en enkelt projektion af 3D data, formodede strukturer ofte vist sig at være "støj". Tilsvarende formodede dobbelt-mærkede strukturer ofte vist sig at være to strukturer, der optrådte sammenfaldende fra én visning perspektiv (eller to), men ikke fra alle. Visualisering fra tre ortogonale retningtioner giver en standard og rutine kriterium for vurderingen af ​​eksistensen, størrelse og mærkning af karakteristika for endosomes eller lignende strukturer til brug i kvantitative og statistiske analyser.

Den beskrevne metode er praktisk, at en konventionel videomikroskop af den type, der findes i mange laboratorier kan anvendes. Instrumenteringen er alsidig end specialiserede, og relativt billig. Mens software specifikt til en bestemt mikroskop blev brugt her, kan open source-software til både erhvervelse billede og databehandling producere lignende resultater 13. Teknikker (herunder deconvolution) er gældende for single-og multiphoton konfokal billedbehandling med lignende fordele, så længe lys eksponering tolereres af den levende præparat anvendes. I fremtiden vil design forbedringer yderligere styrke nytte 4D direkte billedvisning. Disse omfatter først og fremmest hardware, der øger hastigheden af ​​fokusering og excitation / emission filter changing, og tilgængeligheden af ​​endnu mere følsomme videokameraer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af det amerikanske National Institutes of Health Grant NS-024.572 (til RSW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
SGC5 Biotium, Hayward, CA 70057 Final conc: 10 mM
FM1-43FX Invitrogen, Carlsbad, CA F35335 Final conc: 7 mM
LysoTracker Red Invitrogen, Carlsbad, CA L7528 Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 86 mM
KCl 60 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
Sucrose 0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm  Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA 175W Xenon arc lamp www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA www.sutter.com
Sensicam CCD camera Cooke Instruments, Tonawanda, NY www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera Photometrics, Tucson, AZ www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0 Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2 Bitplane, South Windsor, CT Drift correction; 3D and 4D data presentation www.bitplane.com
AfterEffects CS6 Adobe, San Jose, CA Drift correction www.adobe.com
ImageJ 1.46 National Institutes of Health, Bethesda, MD Multiple plugins available; Stereo pair construction http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY Stereo pair construction www.zeiss.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122, (6), 753-767 (2009).
  2. Tinevez, J. -Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
  3. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
  4. Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
  5. Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
  6. Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
  8. Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
  9. Cromey, D. W. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).
  10. Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20, (21), 7986-7993 (2000).
  11. Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19, (12), 4855-4866 (1999).
  12. Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. 1495-1505 (2010).
  13. Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics