Visualización de la Dinámica en Endosoma Vivir terminaciones nerviosas con imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones

Neuroscience

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Summary

Cuatro dimensiones (4D) de formación de imágenes se utiliza para estudiar el comportamiento y las interacciones entre los dos tipos de endosomas en los terminales nerviosos de vertebrados vivían. Movimiento de estas pequeñas estructuras se caracteriza en tres dimensiones, permitiendo la confirmación de eventos tales como la fusión endosoma y la exocitosis.

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Stewart, R. S., Kiss, I. M., Wilkinson, R. S. Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51477, doi:10.3791/51477 (2014).

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Abstract

Cuatro dimensiones (4D) de imágenes de luz se ha utilizado para estudiar el comportamiento de las pequeñas estructuras dentro de las terminaciones nerviosas motoras del transverso del abdomen delgado muscular de la serpiente de liga. Los datos en bruto comprende secuencias de time-lapse de z-pilas 3D. Cada pila contiene 4-20 imágenes adquiridas con la óptica de epifluorescencia en planos focales separados por 400-1,500 nm. Los pasos en la adquisición de pilas de imágenes, tales como el ajuste de enfoque, la conmutación de longitudes de onda de excitación, y el funcionamiento de la cámara digital, se automatizan tanto como sea posible para maximizar la velocidad de imagen y minimizar el daño de tejido de exposición a la luz. Después de la adquisición, un conjunto de pilas de imágenes se deconvolved para mejorar la resolución espacial, la convierte al formato 3D deseada, y se utiliza para crear una "película" 4D que es adecuado para una variedad de análisis basados ​​en computadoras, dependiendo de los datos experimentales se persiguen. Una aplicación es el estudio del comportamiento dinámico de dos clases de endosomas encontrados en terminales nerviosas-macroendosomes (MES)y endosomas ácidos (AA)-cuyos tamaños (200-800 nm para ambos tipos) están en o cerca del límite de difracción. Acceso a la información 3D en cada momento ofrece varias ventajas sobre time-lapse convencional. En particular, el tamaño y la velocidad de movimiento de las estructuras pueden ser cuantificados en el tiempo sin pérdida de enfoque nítido. Ejemplos de datos de formación de imágenes 4D revelan que las ME se acercan a la membrana plasmática y desaparecen, lo que sugiere que se exocitado en lugar de simplemente moviendo verticalmente lejos de un único plano de enfoque. También reveló es la fusión putativo del MES y EA, por la visualización de superposición entre las dos estructuras que contienen un colorante tal como se ve en cada una de tres proyecciones ortogonales.

Introduction

Time-lapse de tejido vivo proporciona acceso visual a dinámicas relaciones estructura-función que no se puede apreciar en los preparativos fijos o que viven fotografiados en un solo punto en el tiempo. A menudo, sin embargo, la compensación para el acceso a la información temporal es una disminución en la resolución óptica. Altos objetivos de inmersión en aceite apertura numérica no son prácticos en los tejidos vivos debido a su estrecho rango de enfoque, dejando a la inmersión en agua o los objetivos secos como las únicas alternativas. Por otra parte, el aumento de la resolución proporcionada por la óptica confocal no puede ser utilizado en algunas preparaciones de vida debido a la fototoxicidad de los niveles relativamente altos de iluminación requerida 1,2. Por último, mientras que varias técnicas ópticas en tiempo real o con lapso de tiempo están disponibles que ofrecen una mayor resolución, su aplicabilidad se limita a las elaboraciones en las estructuras de interés se puede colocar dentro de unos pocos cientos de nanómetros de objetivo 1. El método descritohace uso de un equipo relativamente de bajo costo, es versátil, sin embargo, ofrece una resolución mejorada en comparación con las técnicas de time-lapse de uso común más. Está diseñado para su uso en laboratorios individuales, así como las instalaciones de formación de imágenes.

El método utiliza la microscopía de epifluorescencia convencional, combinado con una cámara digital sensible y con hardware diseñado para adquirir rápidamente los conjuntos de imágenes en momentos ligeramente diferentes planos focales (Z-pilas). Cada z-stack se deconvolved digitalmente para aumentar la resolución. Una característica de las imágenes en 3D de lapso de tiempo (4D) es un seguimiento preciso de los orgánulos u otras estructuras en movimiento. Si se configuran correctamente, estructuras proyectadas no salen fuera de foco, y el movimiento en las tres direcciones pueden ser observados y cuantificados. Por lo tanto es imposible que una estructura manchado a desaparecer en uno o más marcos de lapso de tiempo simplemente por la deriva por encima o por debajo de un plano focal estrecho. El método también sirve como una herramienta sensible para la evaluación de las interacciones y posible Fusión de las estructuras pequeñas. Epifluorescencia convencional o confocal de imágenes de estructuras cerca del límite de difracción (unos pocos cientos de nm) no confirman fusión aunque las imágenes fusionadas muestran la superposición de sus respectivas etiquetas 3. Se sugiere la fusión, pero sigue siendo posible que los objetos están separados horizontalmente o verticalmente por una distancia que está por debajo del límite de difracción. Tres-o formación de imágenes de cuatro dimensiones, en contraste, permite ver los objetos en cada una de tres direcciones ortogonales. La aparición de la fusión en todos los tres puntos de vista aumenta el nivel de certeza. Y, en algunas preparaciones de vida, dirigió o movimiento browniano de objetos supuestamente fusionados proporciona una prueba más de que ambas etiquetas se mueven juntos en el tiempo. Por supuesto, cuando está cerca del límite de difracción del nivel de certeza en las estructuras exigentes de fondo, o demostrando que contienen dos tintes (de fusión), no es absoluta. Si, técnicas especializadas aplicables, tales como la fluorescencia de resonancia la transferencia de energía (FRET)4, son más apropiados.

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Protocol

1. Teñir la preparación con supravital Colorantes

  1. Para el protocolo de disección culebra ver Stewart et al. 5 y Teng et al. 6 tejido reptil permanece fisiológica durante tiempos más largos y con menos contaminación bacteriana, cuando se mantiene a bajas temperaturas (véase más adelante). Tejidos de mamíferos por lo general se mantiene a temperatura ambiente o superior.
  2. Para lisosomal tinción colorante vital, disolver el colorante en 1:5.000 fríos reptiles Timbres solución (0,2 M). Incubar a 4 º C durante 15 min. Lavar varias veces con Ringers fríos. Imagen tan pronto como sea posible.
  3. Para FM1-43 tinción utilizando KCl estimulación, diluir el colorante en alta KCl Ringers 1:500 (7 M). Incubar a 4 º C durante 30-60 seg máximo. Lave rápidamente tres veces con Ringers fríos, ~ 1 min / aclarado. Imagen tan pronto como sea posible.
  4. Para FM1-43 tinción utilizando hipertónica (sacarosa) la estimulación, diluir el colorante en 0,5 M de sacarosa Ringers que el anterior. Incubar a 4 y #176; C durante 2-5 min. Lavar como en el paso 1.3 anterior con Ringers fríos. Imagen tan pronto como sea posible.
  5. Para la tinción de FM1-43 a través de la estimulación eléctrica, ver Teng et al. 6 Brevemente, la preparación se coloca un plato que contiene la solución salina fisiológica y el colorante. El nervio se estimula con un tren preprogramado de 200 microsegundos pulsos rectangulares (~ 7 V, 30 Hz, 18 microsegundos). Lavar como en el paso 1.3 anterior con Ringers fríos. Imagen tan pronto como sea posible.

2. Configure la Preparación de la Imagen

  1. Orientar la preparación de modo que las estructuras de interés están tan cerca como sea posible del objetivo del microscopio.
  2. Si se utiliza un microscopio invertido, utilizar una cámara cuyo fondo contiene una delgada hoja de la cubierta redonda. Normalmente, la cámara de imágenes debe tener un fondo de acero inoxidable fino con un diámetro de 25 mm # 1 vaso de espesor cubierta de resbalón en el centro. Si se utiliza un microscopio vertical, no se requiere un cubreobjetos parte inferior, pero es útilpara permitir la formación de imágenes con luz transmitida (por ejemplo, el contraste de interferencia diferencial, DIC) para orientar la muestra y localizar objetos de interés.
  3. Elija un objetivo apropiado para obtener la resolución más alta posible en 3D. Hay ventajas y desventajas entre la apertura numérica (NA), distancia de funcionamiento, ampliación, y el tipo de lente (seco, sin agua y de inmersión en aceite). Para las preparaciones finas como cultivos de tejidos, los objetivos del petróleo son los mejores. Usando un microscopio vertical, flotar una hoja de cubierta en el baño acuoso, y el uso de aceite de inmersión entre la parte superior de la hoja de la cubierta y el objetivo.
  4. Si se utiliza el software de deconvolución, el proveedor podría proporcionar funciones de dispersión de punto predeterminado (PSF) para ciertos objetivos. Si no se proporciona dicha información, o si se elige un objetivo compatible, determinar el PSF por imágenes micropuntos fluorescentes u objetos de difracción limitada similares 7,8.

3. Establecer la profundidad de campo deseada y número de Imabios deseados por Frame Time-lapse

  1. Seleccione la profundidad total del campo de manera que moviendo o interactuar estructuras de interés no desaparecen o ir fuera de foco a medida que avanzan en la dirección z. El campo z debe exceder ligeramente la dimensión vertical del proceso celular o célula se va a examinar. Para terminales del motor de vertebrados, 15-20 micras es típico.
  2. Calcular el paso del eje z necesaria para cada incremento de foco. Resolución en el eje z varía dependiendo de las propiedades del objetivo; se trata de una cuarta parte de la resolución del plano xy. Si se utiliza ya sea de imagen confocal o software de deconvolución, se mejora la resolución del eje z. Mejorar la resolución final por sobremuestreo deliberada en la dirección z 5, pero véase también el paso 3.3. Un intervalo de paso típico es en el intervalo de 400-1,500 nm para objetivos 40-100X. La luz debe ser cerró off entre cada imagen z a paso.
  3. Seleccione el número de imágenes por z-stack, es decir, la profundidad de campo deseada divididapor el intervalo de paso. Tiempo para completar un típico z-stack es 1-10 seg. Objetos en rápido movimiento (100 nm / seg) pueden aparecer borrosa en una pila de imágenes en 3D, ya que cada plano de la imagen corresponde a un punto de tiempo ligeramente diferente. Además, cada imagen adicional contribuye a photobleaching y posible fototoxicidad (ver Discusión). Si cualquiera de estas situaciones corresponde, elija una más grande z paso para recoger menos imágenes por pila. Compensar más tarde el uso de software de interpolación de imágenes (paso 6.3).

4. Seleccione la Time-lapse Frame Rate

Elija por experimentación de una tasa que es sólo adecuada para resolver problemas cambios con el tiempo tales como el movimiento, las interacciones o acontecimientos de fusión 9. Bajo el muestreo puede producir artefactos de movimiento (errores de muestreo), mientras que aumenta innecesariamente sobremuestreo exposición a la luz. Recoger ya sea una única secuencia larga o varias secuencias repetidas de la misma preparación, cada uno con un relativamente pequeño intervalo de tiempo total (

5. Completa todos los imágenes en vivo de una preparación particular

Preparaciones reptiles suelen permanecer robusta para ~ 1-2 horas, más si se enfría.

6. Analizar datos según uso deseado

  1. Conserve todos los archivos de datos brutos. Mientras que el almacenamiento digital por lo general no es un problema, el tiempo de procesamiento es significativa incluso con los ordenadores personales o estaciones de trabajo rápidos. Por esta razón, las imágenes de los cultivos en una región de interés [ROI]. Asegúrese de que toda la región de interés está en la ventana recortada durante todo el curso del tiempo.
  2. Deconvoluir imagen pilas utilizando el software adecuado y la función de dispersión de punto correcto. Confirmar que la resolución se mejora y que ningún artefacto ha sido generada por laalgoritmo de deconvolución. Figura 3 muestra imágenes de ejemplo.
  3. Utilice un algoritmo de interpolación para ampliar eje z aparente resolución. Se sugiere una expansión 6X de una imagen 1.5 micras plano de separación real a una aparente separación de 0,25 m. También puede utilizar una combinación de sobremuestreo (paso 3.2) y la interpolación.
  4. Lleve a cabo el contraste, el brillo, el filtrado de ruido, fotoblanqueo y otros ajustes típicos de procesamiento de imágenes, si lo desea. Las normas de manipulación de imágenes dictan que para la mayoría de los trabajos científicos, es conveniente que las mismas correcciones se aplicarán a todas las imágenes, tanto dentro de una pila y en diferentes puntos de tiempo. La consecuencia de un ajuste particular, debe evaluarse entre todas las imágenes 9.
  5. Seleccione un modo de pantalla en particular para la exportación de datos. La pantalla más directa es de vídeo estéreo utilizando ya sea anaglifos rojo-verde o rojo-azul (ejemplos en la Figura 3), pares estéreo, o alternando izquierda / right ojo enmarca con gafas de obturación. Anaglifos se limitan a un solo color. Mejorar la profundidad de la imagen aparente si se desea para mejorar la resolución visual eje z.
  6. Experimente con diferentes técnicas de mejora de filtrado y de imagen. Por ejemplo, el filtrado de Laplace es útil para aumentar el contraste de las pequeñas estructuras por encima del fondo. El brillo de los píxeles en el centro de una ventana de funcionamiento se mejora mientras que el brillo de las zonas circundantes se reduce. Tenga en cuenta que algunos métodos de filtrado no funcionan bien en combinación.
  7. Aplicar corrección de deriva si hay movimiento sustancial de la preparación con el tiempo. Tal movimiento es común en el músculo viviente, incluso con fármacos añadidos para suprimir los potenciales de acción y potenciales sinápticos. Un algoritmo de registro de píxeles (por ejemplo. Imaris, Adobe AfterEffects, TurboReg plug-in para ImageJ) alinea las imágenes con lapso de tiempo y puede reducir, pero por lo general no elimina completamente, tal movimiento.

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Representative Results

Los datos mostrados son de los terminales neuromusculares serpiente (ver puntos de vista baja y alta magnificación en la Figura 3, el tinte endocítica (FM1-43) la absorción crea una neblina que llena cada bouton) y, en particular, macroendosomes (MES) y endosomas ácidos (AA) dentro de estos terminales 5. MEs son creados por endocitosis mayor durante la actividad neuronal 10 y su número disminuye exponencialmente con el tiempo después de la actividad ha cesado 6. El uso de imágenes en vivo 4D fue determinar si la EM se mueven hacia la membrana plasmática y rápidamente desaparecen, lo que sugiere que su número disminuye debido a que algunos de ellos exocitosis. Todas estas MEs estaba presente en un punto de tiempo (y los de antes) y completamente ido en el siguiente punto de tiempo (y después de los). Por lo tanto el tiempo requerido para la desaparición era menos de nuestro intervalo de trama (tan corto como 30 seg) y de conformidad con la exocitosis. Una teoría alternativa, no apoyada por datos 4D, es que las microempresas se disipan lentamente a través de gemación de vesicles hasta que desaparecen. Ciernes de vesículas se produce 6, pero por lo menos algunos EM se exocitado ya sea durante o después del florecimiento 5. Figura 1 y la película de S1 a ilustrar la desaparición de un ME entre dos marcos de lapso de tiempo. ME destinados a desaparecer no cambian de forma o el brillo sobre dos o más marcos (N = 16), lo que habría sido coherente con la disipación lenta durante el período de tiempo de la película (que comienza varios minutos después de la estimulación breve). ME desaparición se observó anteriormente en time-lapse convencional, pero era posible que las estructuras simplemente habían dejado el plano de enfoque. Por otra parte, se muestran desde una variedad de perspectivas (Película S1) confirmó que la desaparición ME fue repentina. Con las imágenes en vivo convencional (mirando desde una sola perspectiva, por ejemplo, el plano de la imagen xy) artefactos de ruido limitan la capacidad del investigador para confirmar que una estructura se mantuvo sin cambios. Tales artefactos a menudo están presentesen una vista, pero no en otros.

Estudios de microscopia electrónica mostraron que los endosomas en bornes del motor son de tamaño pequeño, cerca del límite de difracción de la luz 10. De ahí que la fusión de estos endosomas no puede ser absolutamente distinguirse de asociación espacial de cerca el nivel de luz. MEs se marcaron con FM1-43 (verde fluorescente) y AES con un colorante vital lisosomal (rojo fluorescente). Las estructuras que fluoresció en ambos colores (que aparece de color amarillo) se han utilizado ocasionalmente anotados en registros de imagen 4D. Utilizando el software adecuado, opiniones de estos endosomas doble etiquetado, por lo que aparentemente fusionadas desde una variedad de perspectivas se generaron con el fin de examinar la coincidencia de las dos etiquetas en voxels cerca y dentro de la estructura aparente. Figura 2 muestra una supuesta fusionado AE-ME como se ve desde tres direcciones ortogonales. Un punto de vista es el plano xy; los otros puntos de vista son ortogonales a ese plano y el uno al otro. Usando este método se encontró que los voxelso bien se superponen, como en este ejemplo, o que no lo hicieron claramente en uno o más planos de visualización. Película S2 muestra la misma supuesta fusionado AE-me presentó como una pantalla interactiva de realidad virtual (totalmente giratoria en 3 dimensiones).

Deconvolución Digital es una herramienta útil para mejorar la resolución de 3D, así como imágenes de 4D, desde microscopios convencionales y confocales 11. Deconvolución es un proceso numérico, iterativo que compensa, en cierta medida, para la resolución espacial limitada del objetivo utilizado. Esta resolución se caracteriza por diferencia de puntos función del volumen 3D del objetivo ocupado por la imagen de un punto infinitesimal. En teoría, deconvolución restaura la imagen que se produciría si el objetivo era perfecto. Figura 3 es una vista en volumen 3D de dos conjuntos de datos diferentes, cada uno se muestran como un par de anaglifos rojo-verde. Las imágenes de la derecha muestran una mejoría en la agudeza típica después digitales deconvolución de la pila de imágenes.

Figura 1
Figura 1. Un macroendosome (ME) desaparece después del contacto con la membrana plasmática aparente. Una preparación nervio-músculo serpiente fue estimulado eléctricamente en presencia de FM1-43. Los datos fueron recolectados a través de imágenes en 4D como se describe en Métodos y aparecen como "puntos de vista Volumen 3D" a los seis puntos de tiempo (60 segundos de intervalo) para ilustrar la profundidad Z de una sola bouton. Una ME puede ser observado alejándose del eje Y (línea roja discontinua) sobre varias tramas antes de desaparecer entre los momentos 5 y 6. Justo antes de la desaparición, el ME parece estar localizado en la membrana plasmática de la bouton (delimitada por los FM1-43 de la vesícula manchas o "neblina"; véase la Figura 3 la leyenda). El forense no volvió a aparecer enpuntos de tiempo posteriores (datos no presentados; ver la película de S1). La barra de escala, 2 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

PELÍCULA S1:. Vistas 4D time-lapse de ME desaparición clic aquí para ver la película. El mismo conjunto de datos en bruto que se muestra en la Figura 1 se muestra como un "punto de vista del volumen 4D" con un aumento menor. La secuencia de lapso de tiempo original, compuesto por 8 puntos de tiempo, cada uno separado por 60 seg; la reproducción está en 4 cuadros / seg. La secuencia se detuvo brevemente al comienzo de cada uno de los 24 pasos 3D de rotación sobre el eje y (15 grados / paso) para llamar la atención sobre el pronto-a-ser de desaparecer ME (flecha roja). Tenga en cuenta que el ME es visible, se acerca al borde de la bouton (membrana plasmática), desaparece y no vuelve, entodas las perspectivas de visualización. Debido a una menor resolución de eje z en comparación con la resolución xy, la forma de la ME parece alargarse y acortarse en función de visualización de perspectiva. Las imágenes se exportan como una película QuickTime, y comentan usando QuickTime Pro. La barra de escala, 2 micras.

Figura 2
Figura 2. Vistas ortogonales de un endosoma fusionado putativo. Una preparación muscular del nervio fue secuencialmente tiñe con un colorante vital lisosomal (rojo) para etiquetar los EA y FM1-43 (verde) para etiquetar los EM usando 0,5 M estimulación sacarosa como se describe en Métodos. Los datos de un punto de una película 4D vez se muestran como puntos de vista de volumen 3D en tres orientaciones. En la parte superior (paneles 1-3) es el punto de vista convencional desde arriba (plano xy). En medios (paneles 4-6) es una vista perpendicular al plano XY yen el (arbitrario) dirección de la gran flecha roja. En la parte inferior (paneles 7-9) es una vista mutuamente perpendicular a ambos puntos de vista anteriores, en la dirección de la flecha grande azul. Una ME (verde) está marcado por una flecha verde; dos AE (rojo) están marcados por las flechas rojas. Un endosoma que contiene ambos colorantes (amarillo) está marcada por una flecha amarilla en paneles 3, 6 y 9. Tenga en cuenta que la superposición de rojo y verde es igualmente completo en las tres proyecciones ortogonales. La barra de escala, 2 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

PELÍCULA S2:. Giro interactivo de imagen que contiene MES y endosomas ácidos AEs . Haz clic aquí para ver la película se muestra el conjunto de datos de la Figura 2 se configura como una imagen completamente giratorio 3D (QuickTime Virtual Reality formato; utilizar el ratón para girar la imagen para ver desde cualquier dirección). Los putativo fusionados ME / AE permanece amarilla desde todas las perspectivas.

Figura 3
Figura 3. Deconvolution mejora la resolución espacial en 3D. Dos terminales nerviosas típicas de serpiente, que se muestran a baja (arriba) y alta (parte inferior) de aumento, respectivamente, y manchado durante la estimulación con FM1-43. FM1-43 fondo "bruma", debido al etiquetado de vesículas individuales 50 nm, muestra la forma de boutons terminales dentro de la cual se limitan las ME. Los datos se muestran como anaglifos rojo-verde de puntos de vista de volumen 3D (profundidad puede visualizarse con gafas rojo-verde o rojo-azul, rojo en el ojo izquierdo; nota axón en la parte superior izquierda se hunde en el plano de la terminal desde arriba). Paneles de la izquierda: los datos en bruto; Paneles de la derecha: los datos despuésdeconvolución. Tenga en cuenta la mejora significativa en la resolución de las ME. Paneles superiores: la estimulación eléctrica; terminal de toda muestra (~ 30 x 50 m) (mismos datos en bruto como en la Figura 1 y la película de S1; barra de escala, 10 micras). Los paneles inferiores: KCl de estimulación; magnifica para mostrar cuatro boutons individuales (~ 3 x 5 m; barra de escala, 2 micras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El aspecto más crítico de imágenes 4D es la gestión de la duración e intensidad de la exposición a la luz. Photobleaching disminuye imagen con una relación de señal a ruido y puede ser problemático o no dependiendo de varios factores, incluyendo la elección de fluoróforos. Daños no específica al tejido vivo (fototoxicidad) está relacionada con photobleaching, y, a veces puede ser identificado utilizando sondas fluorescentes diseñados para el propósito 2,12 o mediante el examen de la morfología con óptica de campo claro adecuados, tales como el contraste de interferencia diferencial (DIC).

Es posible, sin embargo, para inducir un efecto fisiológico que se produce en los niveles de luz muy por debajo de la magnitud de los asociados con fotoblanqueo y fototoxicidad. Por ejemplo, en los primeros experimentos utilizando múltiples preparaciones, cada uno fijado en un tiempo diferente después de la estimulación, la velocidad a la que las ME desaparecieron con el tiempo después de una breve estimulación se midió 6. Como es práctica estándar to minimizar la decoloración, las preparaciones se mantuvieron en la oscuridad hasta que fueron vistos. Cuando se realizaron experimentos similares utilizando imágenes en directo 4D, muchos más MEs permanecieron durante todo el experimento (~ 20-60 min) y no desaparecieron. El uso del mismo protocolo de formación de imágenes en vivo, excepto en realidad no la grabación y de ese modo limitar la exposición a la luz a un solo fotograma 3D al principio y un solo marco en el extremo, restauró la tasa global esperado de desaparición endosoma a la de las preparaciones fijos.

Otras soluciones indicó que la tasa de desaparición fue, en parte, a la inversa y monótonamente relacionado con la exposición total de la luz durante un experimento. Después de varios intentos infructuosos para reducir la exposición a través de la óptica confocal convencional y multifotón, el problema fue resuelto finalmente por la compra de una cámara más sensible ~ 3x (Tabla 1). Se recomienda que las comparaciones similares que pueden hacer, si es posible, dependiendo de la aplicación del usuario. Si alguna proceso o de transición están siendo documentados a lo largo del tiempo, confirme que no hay modificación atribuible a la intensidad o la duración total de la iluminación. La fototoxicidad y fotoblanqueo son-colorante específico. Por ejemplo, no vimos ninguna significativa decoloración imágenes 4D después repetida de un terminal (350 exposiciones individuales de luz más de 30 min) con FM1-43. El mismo protocolo de formación de imágenes usando un colorante similares, SGC5 (Tabla 1), sin embargo, resultó en algunos desvanecimiento y, presumiblemente, fototoxicidad también (datos no mostrados).

Con la excepción de las mejoras proporcionadas por deconvolución digital (y la óptica confocal si se utiliza; no mostrados), el método directo descrito no proporciona ninguna resolución "super". Sin embargo, el método tiene la ventaja de mejorar la resolución práctica o intuitivo al visualizar estructuras vivientes, especialmente los móviles, cuyo tamaño es igual o ligeramente mayor que el límite de difracción. La capacidad de ver los objetos desde distintas perspectivas, includipresentación ng en cada uno de tres planos ortogonales, guía al investigador en cuanto a si una estructura realmente existe por encima del nivel de ruido y si está marcado por uno o más fluoróforos. Por ejemplo, en experimentos diseñados para cuantificar el número y tamaño de las ME y AES, fue posible confirmar que la estructura era visible desde varios puntos de vista y que cada dimensión (y por lo tanto su volumen tridimensional) estaba dentro del rango típico para ese estructura. La ubicación de una estructura también está mejor definido, por ejemplo, dentro de un axón, terminación nerviosa, etc. en lugar de por encima o por debajo de ella. En contraste, cuando el campo de visión se limita ni a un único plano de imagen en 2D o para una sola proyección de los datos 3D, estructuras putativo menudo demostraron ser "ruido". Del mismo modo, las estructuras de doble etiquetado putativo menudo resultaron ser dos estructuras que parecían coincidente desde una perspectiva de visión (o dos) pero no de todo. Visualización de tres direcciones ortogonalesción proporciona un estándar y el criterio de rutina para evaluar las características de existencia, el tamaño, y el etiquetado de los endosomas o estructuras similares para usar en los análisis cuantitativos y estadísticos.

La metodología descrita es práctico en que un microscopio de vídeo convencional del tipo encontrado en muchos laboratorios se puede utilizar. La instrumentación es versátil en lugar de especializada, y relativamente barato. Si bien se utilizó un software específico para un microscopio especial aquí, el software de código abierto para la adquisición de imágenes y procesamiento de datos puede producir resultados similares 13. Técnicas (incluyendo deconvolución) son aplicables a las imágenes de un solo y multifotónica confocal con ventajas similares, siempre y cuando exposición a la luz es tolerado por la preparación de estar utilizado. En el futuro, las mejoras de diseño mejorará aún más la imagen en vivo 4D utilidad. Estos incluyen, principalmente, el hardware que mejora la velocidad de enfoque y cha filtro de excitación / emisiónnging, y la disponibilidad de incluso los más sensibles cámaras de vídeo.

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Disclosures

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Grant NS-024572 (a RSW) de los Estados Unidos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
SGC5 Biotium, Hayward, CA 70057 Final conc: 10 mM
FM1-43FX Invitrogen, Carlsbad, CA F35335 Final conc: 7 mM
LysoTracker Red Invitrogen, Carlsbad, CA L7528 Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 86 mM
KCl 60 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
Sucrose 0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm  Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA 175W Xenon arc lamp www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA www.sutter.com
Sensicam CCD camera Cooke Instruments, Tonawanda, NY www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera Photometrics, Tucson, AZ www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0 Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2 Bitplane, South Windsor, CT Drift correction; 3D and 4D data presentation www.bitplane.com
AfterEffects CS6 Adobe, San Jose, CA Drift correction www.adobe.com
ImageJ 1.46 National Institutes of Health, Bethesda, MD Multiple plugins available; Stereo pair construction http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY Stereo pair construction www.zeiss.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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