Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência

Neuroscience

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Summary

Quadridimensional (4D) de imagem é utilizada para estudar o comportamento e as interacções entre os dois tipos de endossomas em terminais nervosos vertebrado vivo. O movimento destas pequenas estruturas é caracterizado em três dimensões, permitindo a confirmação de eventos, tais como a fusão do endossoma e exocitose.

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Stewart, R. S., Kiss, I. M., Wilkinson, R. S. Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51477, doi:10.3791/51477 (2014).

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Abstract

Quadridimensional (4D) Luz de imagem tem sido usada para estudar o comportamento de pequenas estruturas dentro de terminais nervosos do motor do transverso abdominal muscular magra da cobrinha. Os dados brutos compreende as sequências de lapso de tempo de z-stacks 3D. Cada pilha contém 4-20 imagens adquiridas com óptica de epifluorescência a planos focais separados por 400-1,500 nm. Etapas na aquisição de pilhas de imagens, tais como o ajuste de foco, de comutação de comprimentos de onda de excitação, e o funcionamento da câmara digital, são automatizados, tanto quanto possível para maximizar a taxa de imagem e para minimizar danos nos tecidos da exposição à luz. Após aquisição, um conjunto de pilhas de imagens é deconvolved para melhorar a resolução espacial, convertido para o formato 3D desejado, e utilizado para criar um 4D "filme" que é adequado para diversas análises baseadas em computador, dependendo dos dados experimentais pretendidos. Uma aplicação é o estudo do comportamento dinâmico de duas classes de endosomes encontrados em terminais nervosos-macroendosomes (MES)e endossomas ácidas (AEs), cujos tamanhos (200-800 nm para ambos os tipos) estão em ou próximo do limite de difracção. O acesso à informação 3D em cada momento fornece várias vantagens sobre imagens de lapso de tempo convencional. Em particular, o tamanho e a velocidade de movimento das estruturas podem ser quantificados ao longo do tempo sem perda de foco. Exemplos de dados de imagens 4D revelam que MEs aproximar da membrana plasmática e desaparecem, o que sugere que eles são exocytosed em vez de um simples movimento, afastado verticalmente, a partir de um único plano de foco. Também é revelado fusão putativo de MEs e AES, através da visualização de sobreposição entre as duas estruturas que contêm corante como visto em cada três projeções ortogonais.

Introduction

Time-lapse de imagem de tecidos vivos proporciona acesso visual para as relações estrutura-função dinâmicos que não podem ser apreciados em preparações que vivem fixos ou fotografada em um único ponto no tempo. Muitas vezes, no entanto, a desvantagem de acesso a informação temporal é uma redução na resolução óptica. Objetivos de imersão em óleo alta abertura numérica são impraticáveis ​​em tecidos vivos por causa de sua estreita faixa de foco, deixando de imersão em água ou objetivos secos como as únicas alternativas. Além disso, o aumento da resolução proporcionada pelo óptica confocal não pode ser utilizado em algumas preparações de vida devido a fototoxicidade dos níveis relativamente elevados de iluminação necessárias 1,2. Por fim, enquanto várias técnicas ópticas em tempo real ou time-lapse estão disponíveis que oferecem uma melhor resolução, a sua aplicabilidade é limitada às preparações onde as estruturas de interesse podem ser posicionados dentro de algumas centenas de nanômetros do objectivo 1. O método descritofaz uso de equipamentos de custo relativamente baixo, é versátil, mas oferece melhor resolução em comparação com técnicas de lapso de tempo mais comumente usados. Ele é destinado para uso em laboratórios individuais, bem como instalações de imagem.

O método utiliza microscopia de epifluorescência convencional, combinado com uma câmera digital sensível e com hardware projetado para adquirir rapidamente conjuntos de imagens a um nível ligeiramente diferentes planos focais (Z-pilhas). Cada pilha z digitalmente é deconvolved para aumentar a resolução. Uma característica do 3D time-lapse (4D) de imagem é o acompanhamento preciso das organelas ou outras estruturas em movimento. Quando configurado corretamente, as estruturas fotografadas não saem de foco, eo movimento em todas as três direções podem ser observados e quantificados. Assim, é impossível para uma estrutura manchado a desaparecer em um ou mais quadros de lapso de tempo apenas por deriva acima ou abaixo de um plano focal estreita. O método também serve como uma ferramenta sensível para avaliar as interações e possíveis fução de pequenas estruturas. Epifluorescência Convencional ou imagens confocal de estruturas perto do limite de difração (algumas centenas de nm) não confirmam fusão mesmo que as imagens fundidas mostram sobreposição das respectivas etiquetas 3. Fusão é sugerida, mas permanece a possibilidade de que os objectos estão separados horizontalmente ou verticalmente por uma distância que é inferior ao limite de difracção. Três ou quatro imagiologia tridimensional, em contraste, permite a visualização dos objectos em cada uma de três direcções ortogonais. O aparecimento de fusão em todos os três pontos de vista aumenta o nível de segurança. E, em algumas preparações de vida, dirigido ou movimento browniano de objetos supostamente fundidos fornece mais uma prova quando ambos os rótulos se movem juntos no tempo. Claro que, quando perto do limite de difração o nível de certeza em estruturas mais exigentes de fundo, ou mostrando que eles contêm dois corantes (fusão), não é absoluta. Se aplicável, técnicas especializadas, tais como a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET)4, são mais apropriadas.

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Protocol

1. Mancha a preparação com supravital Corantes

  1. Para o protocolo de dissecção liga cobra ver Stewart et al. 5 e Teng et al. 6 tecido Reptilian permanece fisiológico para tempos mais longos, e com menos contaminação bacteriana, quando mantido a baixas temperaturas (ver abaixo). Tecidos de mamíferos, é normalmente mantida a temperatura ambiente ou superior.
  2. Para lisossômico vital coloração dye, dissolver o corante em frias reptilianos 1:5.000 solução de Ringer (0,2 mm). Incubar a 4 ° C durante 15 min. Lavar várias vezes com Ringer frio. Imagem tão depressa quanto possível.
  3. Para FM1-43 coloração utilizando estimulação de KCl, diluir o corante em maior KCl Ringers 1:500 (7 uM). Incubar a 4 ° C durante 30-60 segundos no máximo. Lave rapidamente três vezes com Campainhas frias, ~ 1 min / lavagem. Imagem tão depressa quanto possível.
  4. Para FM1-43 utilizando coloração hipertónico estimulação (sacarose), dilui-se o corante em 0,5 M de Ringer sacarose como acima. Incubar a 4 & #176; C durante 2-5 min. Lave como no passo 1.3 acima, com Campainhas frias. Imagem tão depressa quanto possível.
  5. Para a coloração de FM1-43 através da estimulação eléctrica, ver Teng et al. 6 Resumidamente, a preparação é colocada uma placa contendo solução salina fisiológica e o corante. O nervo é estimulado com um trem pré-programado de 200 ms pulsos retangulares (~ 7 V, 30 Hz, 18 ms). Lave como no passo 1.3 acima, com Campainhas frias. Imagem tão depressa quanto possível.

2. Configure a preparação for Imaging

  1. Orientar a preparação de modo a que as estruturas de interesse são o mais próximo possível para o objectivo de microscópio.
  2. Se um microscópio invertido é usado, utilizar uma câmara cujo fundo contém uma fina capa de deslizamento rodada. Normalmente, a câmara de imagem deve ter um fundo de aço inoxidável fino com a 25 mm de diâmetro # 1 copo espessura tampa de deslizamento no centro. Se um microscópio vertical é utilizado, uma lamela inferior não é exigido, mas é útilpara permitir a imagem com luz transmitida (por exemplo, contraste de interferência diferencial, DIC) para orientar a amostra e localizar objetos de interesse.
  3. Escolha um objetivo adequado para obter a mais alta resolução 3D possível. Existem vantagens e desvantagens entre abertura numérica (NA), distância de trabalho, ampliação, e do tipo de lente (seco, a água e de imersão em óleo). Para as preparações finas como culturas de tecidos, os objetivos do petróleo são as melhores. Usando um microscópio vertical, flutuar uma lamela no banho aquoso, e usar óleo de imersão entre a parte superior da lamínula ea objetiva.
  4. Se o software de deconvolução é usado, o vendedor pode fornecer funções predeterminadas ponto spread (PSFs) para determinados objectivos. Se tal informação não é fornecida, ou se um objetivo não suportado for escolhida, determinar o PSF pela imagem micropontos fluorescentes ou limitado de difração de objetos semelhantes 7,8.

3. Estabelecer a profundidade de campo desejada e Número de Images desejados por Quadro Time-lapse

  1. Selecione a profundidade de campo total, de modo que se deslocam ou interagindo estruturas de interesse não desaparecer ou sair de foco à medida que avançam na direção z. O campo z deve exceder ligeiramente a dimensão vertical do processo de células ou célula que está sendo trabalhada. Para os terminais do motor de vertebrados, 15-20 um é típico.
  2. Calcula-se a etapa de eixo z necessária para cada incremento de focagem. Resolução ao longo do eixo z varia dependendo de propriedades da objectiva; é cerca de um quarto da resolução do plano xy. Se qualquer imagem confocal ou software de deconvolução é usado, a resolução do eixo z é melhorada. Melhorar a resolução final por oversampling deliberada em direção z 5, mas ver também o passo 3.3 abaixo. Um intervalo típico etapa está no intervalo de 400-1,500 nm para objectivos 40-100X. Luz deve ser fechada fora de cada imagem z-passo entre os dois.
  3. Selecione o número de imagens por z-stack, ou seja, a profundidade de campo desejada divididopelo intervalo de passo. Tempo para completar um z-pilha típica é de 1-10 seg. Objetos em movimento rápido (100 nm / seg) pode aparecer desfocada em uma pilha de imagens em 3D, pois cada plano de imagem corresponde a um ponto no tempo um pouco diferente. Além disso, cada imagem adicional contribui para a fotodegradação e fototoxicidade possível (ver Discussão). Se uma ou outra situação diz respeito, escolha um z-passo maior para coletar menos imagens por pilha. Compensar mais tarde usando o software de interpolação de imagem (passo 6.3 abaixo).

4. Selecione o Time-lapse Frame Rate

Escolha pela experimentação uma taxa que é apenas adequado para resolver problemas muda com o tempo, como movimento, interações ou eventos de fusão 9. Sob amostragem pode produzir artefatos de movimento (erros de amostragem), enquanto oversampling aumenta desnecessariamente a exposição à luz. Coletar uma única seqüência longa ou várias seqüências repetidas da mesma preparação, cada um com um pequeno intervalo de tempo total (

5. Conclua Todos Imagens ao vivo para uma preparação especial

Preparações reptilianos geralmente permanecem robustos para ~ 1-2 horas, mais tempo se resfriado.

6. Analisar dados de acordo com uso desejado

  1. Guarde todos os arquivos de dados brutos. Embora o armazenamento digital geralmente não é um problema, o tempo de processamento é ainda significativa com computadores pessoais rápidas ou estações de trabalho. Por esta razão, as imagens das culturas para uma região de interesse [ROI]. Assegurar que toda a região de interesse é a janela cortada ao longo de todo o curso do tempo.
  2. Deconvolve imagem pilhas usando software apropriado ea função de propagação do ponto correto. Confirme que a resolução é melhorada e que nenhum artefato foi gerado pelaalgoritmo de desconvolução. Figura 3 mostra exemplos de imagens.
  3. Use um algoritmo de interpolação para expandir eixo z aparente resolução. Uma expansão 6X de uma separação real do plano de imagem de 1,5 um para um de 0,25 mM de separação aparente é sugerido. Como alternativa, use uma combinação de oversampling (passo 3.2) e interpolação.
  4. Realize contraste, brilho, filtragem de ruído, fotodegradação e outros ajustes típicos de processamento de imagem, se desejar. Normas de manipulação de imagem determinam que para a maioria dos trabalhos científicos, é conveniente que as mesmas correções ser aplicada a todas as imagens, tanto dentro de uma pilha e em momentos diferentes. A conseqüência de um ajustamento especial deve ser avaliada entre todas as imagens 9.
  5. Selecione um modo de exibição específico para exportação de dados. A exibição mais simples é de vídeo estéreo usando tanto anaglyphs vermelho-verde ou vermelho-azul (exemplos na Figura 3), pares estéreo, ou alternando esquerda / right olho quadros com óculos. Anaglyphs estão limitados a uma única cor. Melhore a profundidade da imagem aparente se desejado para melhorar a resolução visual-eixo z.
  6. Experimentar várias técnicas de aprimoramento de filtragem e de imagem. Por exemplo, a filtragem de Laplace é útil para aumentar o contraste de pequenas estruturas acima do fundo. O brilho dos pixels no centro de uma janela de correr é melhorada enquanto a luminosidade das áreas circundantes é reduzida. Note-se que alguns métodos de filtragem não funcionam bem em combinação.
  7. Aplicar correção de desvio se não houver movimento substancial da preparação ao longo do tempo. Tal movimento é comum no músculo vivo, mesmo com medicamentos adicionados para suprimir os potenciais de ação e potenciais sinápticos. Um algoritmo de registro de pixel (eg. Imaris, Adobe After Effects, TurboReg plugin para o ImageJ) alinha imagens de lapso de tempo e pode reduzir, mas geralmente não eliminar completamente, tal movimento.

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Representative Results

Os dados apresentados são a partir de terminais de cobra neuromusculares (ver as vistas de baixo e de alta ampliação na Figura 3, o corante endocítica (FM1-43) absorção cria uma neblina que enche cada Bouton) e, em particular, macroendosomes (MES) e endossomas ácidas (EAs) dentro destes terminais 5. MEs são criados por endocitose massa durante a atividade neural 10 e seu número diminui exponencialmente com o tempo após a atividade cessou 6. Uso de imagens 4D vivo foi determinar se MEs avançar para a membrana plasmática e desaparecem rapidamente, o que sugere que o seu número diminui, porque alguns deles exocitose. Todas essas MEs estavam presentes em um ponto de tempo (e seus antecessores) e completamente desaparecido no próximo ponto de tempo (e os posteriores). Assim, o tempo necessário para o desaparecimento era menos do que a nossa intervalo de quadro (tão curto como 30 segundos) e consistente com a exocitose. Uma teoria alternativa, não é suportado por dados 4D, é que MEs lentamente dissipar via brotamento de vesicles até desaparecerem. Brotamento Vesicle ocorre 6, mas pelo menos algumas MEs são exocytosed durante ou após o brotamento 5. Figura 1 e S1 filme ilustrar o desaparecimento de um ME entre dois quadros de lapso de tempo. MEs destinados a desaparecer não alterar a forma ou o brilho ao longo de dois ou mais quadros (N = 16), o que teria sido coerente com dissipação lenta durante o período de tempo do filme (que começa vários minutos após a breve estimulação). ME desaparecimento foi observada anteriormente no lapso de tempo convencional, mas é possível que as estruturas tinham simplesmente deixado o plano de foco. Além disso, a visualização de uma variedade de perspectivas (S1 Filme) confirmou que o desaparecimento ME foi repentina. Com imagens ao vivo convencional (olhando a partir de um único ponto de vista, por exemplo, o plano de imagem xy) artefatos de ruído limitar a capacidade do investigador para confirmar que a estrutura não foi alterada. Tais artefatos são frequentemente presenteem um ponto de vista, mas não outros.

Estudos de microscopia eletrônica mostrou que endosomes em terminais do motor são de tamanho pequeno, perto do limite de difração da luz 10. Daí a fusão destes endosomes não pode ser absolutamente diferenciado de estreita associação espacial a nível de luz. MEs foram marcadas com FM1-43 (verde-fluorescente) e AEs com um corante vital lisossômico (vermelho-fluorescente). Estruturas que fluorescência em ambas as cores (aparecendo amarelo) foram ocasionalmente observado em registos de imagens 4D. Usando o software adequado, pontos de vista desses endosomes duplamente marcada e, portanto, aparentemente, fundidos de uma variedade de perspectiva foram gerados, a fim de examinar a coincidência dos dois rótulos em voxels próximos e dentro da estrutura aparente. Figura 2 mostra um putativo fundido AE-ME como visto a partir de três direcções ortogonais. Um ponto de vista é o plano xy; os outros pontos de vista são ortogonal a esse plano e uma à outra. Usando este método, verificou-se que os voxelsou sobrepostos, como neste exemplo, ou que claramente não fez em um ou mais planos de visualização. S2 filme mostra a mesma putativo fundido AE-ME apresenta-se como um visor de realidade virtual interativa (totalmente rotativo em 3 dimensões).

Deconvolução Digital é uma ferramenta útil para melhorar a resolução de 3D, bem como imagens 4D, de microscópios convencionais e confocal 11. Desconvolução é um processo numérico, iterativo que compensa, em certa medida, para limitar a resolução espacial da objectiva utilizada. Esta resolução é caracterizada como ponto de disseminação função de o volume 3D do objetivo ocupado pela imagem de um ponto infinitesimal. Em teoria, desconvolução restaura a imagem que resultaria se o objectivo fosse perfeito. Figura 3 é uma vista em volume 3D de dois conjuntos de dados diferentes, cada exibidas como um par de anaglyphs vermelho-verde. As imagens certas mostram melhoria típico na nitidez depois de digitaisconvolução da pilha de imagens.

Figura 1
Figura 1. Uma macroendosome (ME) desaparece após contato aparente com membrana plasmática. Uma preparação nervo-músculo cobra foi estimulado eletricamente na presença de FM1-43. Os dados foram coletados por meio de imagens 4D, conforme descrito em Métodos e são apresentados como "vistas 3D Desconto" em seis pontos de tempo (60 segundos de intervalo) para ilustrar a Z-depth de um único Bouton. Uma ME pode ser observado se afastando do eixo Y (linha tracejada vermelha) ao longo de vários quadros antes de desaparecer entre momentos de tempo 5 e 6. Pouco antes do desaparecimento, o ME parece estar localizado na membrana plasmática do Bouton (delineada por FM1-43 vesícula coloração ou "neblina"; veja a Figura 3 legenda). O ME não reapareceu empontos temporais posteriores (dados não mostrados; ver S1 Filme). Barra de escala, 2 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

FILME S1:. Vistas 4D lapso de tempo de ME desaparecimento Clique aqui para ver filme. O mesmo conjunto de dados brutos apresentados na Figura 1 é mostrado como uma "visão de volume 4D" com uma ampliação menor. A seqüência de time-lapse originais conta com 8 pontos de tempo, cada um separado por 60 seg; a reprodução é em 4 frames / seg. A seqüência é brevemente uma pausa no início de cada um dos 24 passos 3D de rotação em torno do eixo-y (15 graus / passo) para chamar a atenção para o logo-a-ser desaparecendo ME (seta vermelha). Note-se que a EM é visível, se aproxima da borda do Bouton (membrana plasmática), desaparece, e não volta, emtodas as perspectivas de visualização. Por causa da baixa resolução do eixo z em relação a resolução xy, a forma do ME parece alongar e diminuir, dependendo visualização perspectiva. As imagens foram exportados como um filme do QuickTime, e anotada usando o QuickTime Pro. Barra de escala, 2 m.

Figura 2
Uma preparação de músculo nervo Figura 2. Vistas ortogonais de um endossoma fundido putativo. Foi corado sequencialmente com um corante vital lisossomal (vermelho) para rotular AEs e FM1-43 (verde) para rotular MEs usando 0,5 M de sacarose estimulação como descrito em Métodos. Os dados de um ponto de tempo de um filme 4D são exibidos como vistas 3D de volume em três orientações. No top (painéis 1-3) é a visão convencional de cima (plano xy). No meio (painéis 4-6) é uma vista perpendicular ao plano xy eno (arbitrária) o sentido da grande seta vermelha. No fundo (painéis 7-9) é uma vista mutuamente perpendiculares às duas vistas anteriores, na direcção da seta grande azul. Uma ME (verde) é marcado por uma seta verde; duas AEs (vermelho) são marcadas por setas vermelhas. Um endosome contendo ambos os corantes (amarelo) é marcado por uma seta amarela em painéis de 3, 6 e 9. Note-se que a sobreposição de vermelho e verde é igualmente completa em todos os três projeções ortogonais. Barra de escala, 2 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

FILME S2:. Rotação Interativo de imagem contendo MEs e endosomes ácidas AEs . Clique aqui para ver filme O conjunto da figura 2 são apresentados dados configurado como uma imagem 3D totalmente rotativo (QuickTime Virtual Reality formato; use o mouse para girar a imagem para visualização a partir de qualquer direção). Os putativo fundido ME / AE permanece amarelo de todas as perspectivas.

Figura 3
Figura 3. Deconvolution aumenta resolução espacial 3D. Dois terminais nervosos típicos cobra, mostrados em baixo (em cima) e alta (em baixo), respectivamente, e ampliação manchada durante a estimulação com FM1-43. FM1-43 fundo "névoa", devido à rotulagem de vesículas 50 nm individuais, mostra a forma de boutons terminais dentro do qual MEs estão confinados. Os dados são apresentados como anaglyphs Vermelho-Verde de pontos de vista de volume 3D (profundidade podem ser visualizadas com óculos vermelho-verde ou vermelho-azul, vermelho no olho esquerdo; nota axônio na parte superior esquerda desce para o plano do terminal de cima). Painéis de Esquerda: dados brutos; Painéis à direita: dados apósdeconvolução. Note-se a melhoria significativa na resolução de MEs. Principais painéis: estimulação elétrica; terminal de toda mostrado (~ 30 x 50 mm) (os mesmos dados brutos como na Figura 1 e S1 filme; barra de escala, 10 fim). Painéis de fundo: estimulação KCl; ampliada para mostrar quatro boutons individuais (~ 3 x 5 m; barra de escala, 2 mm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O aspecto mais crítico de 4D de imagem é a gestão da duração e intensidade da exposição à luz. Fotodegradação diminui imagem relação sinal-ruído e pode ser problemático ou não, dependendo de vários fatores, incluindo a escolha de fluoróforos. Danos não específica para o tecido vivo (fototoxicidade) está relacionada com a fotodegradação, e, por vezes, pode ser identificada utilizando sondas fluorescentes concebidos para o efeito ou 2,12 por exame da morfologia com ópticas de campo claro adequados, tais como interferências contraste diferencial (DIC).

É possível, no entanto, para induzir um efeito fisiológico que ocorre em níveis de luz muito abaixo da grandeza dos que lidam com a fotodegradação e fototoxicidade. Por exemplo, nas experiências iniciais, utilizando várias preparações, cada uma fixada a um tempo diferente, após estimulação, a taxa à qual MEs desapareceu com o tempo depois de um breve estímulo foi medida 6. Como é prática padrão tpara minimizar a atenuação, os preparativos foram mantidos no escuro até que eles eram vistos. Quando experimentos semelhantes foram realizados com imagens ao vivo 4D, muito mais MEs permaneceu durante todo o experimento (~ 20-60 min) e não desapareceu. A utilização do mesmo protocolo de imagens em tempo real, excepto não efectivamente a gravação e, assim, limitando a exposição à luz de um único quadro de 3D no início e um único frame no final, restaurou a taxa total esperado de endossoma desaparecimento de que preparações de fixos.

A solução do problema indicado que a taxa de desaparecimento foi, em parte, inversamente e monotonicamente relacionada com a exposição total de luz durante uma experiência. Depois de tentativas frustradas de reduzir a exposição via óptica confocal convencional e multiphoton, o problema foi finalmente resolvido por compra de um ~ 3x câmera mais sensível (Tabela 1). Recomenda-se que as comparações semelhantes ser feita, se possível, em função da aplicação do usuário. Se algum processo ou transição está sendo documentada ao longo do tempo, confirmar que não há nenhuma modificação atribuível a intensidade ou duração total de iluminação. Fototoxicidade e fotodegradação são específicos do corante. Por exemplo, nós não viu desvanecer após repetidas imagens 4D significativa de um terminal (350 exposições individuais de luz mais de 30 min), utilizando FM1-43. O protocolo de imagens mesmo utilizando um corante semelhante, SGC5 (Tabela 1), no entanto, resultou em alguma desvanecimento e, presumivelmente, fototoxicidade, bem como (dados não mostrados).

Com a exceção de melhorias fornecidos por deconvolução digitais (óptica e confocal se usado; não mostrados), o método simples descrito fornece nenhuma resolução "super". No entanto, o método tem a vantagem de melhorar a resolução prática ou intuitiva ao exibir estruturas de vida, em particular as que se deslocam, cujo tamanho é igual ou ligeiramente maior do que o limite de difracção. A capacidade de visualizar objetos a partir de várias perspectivas, including apresentação em cada um dos três planos ortogonais, orienta o investigador quanto ao facto de uma estrutura, na verdade, existe acima do nível de ruído e se é marcado por um ou mais fluoróforos. Por exemplo, em experiências concebidas para quantificar o número e tamanho das ME e AEs, foi possível confirmar que a estrutura era visível de várias perspectivas, e que cada dimensão (e, consequentemente, o seu volume tridimensional) estava dentro da gama normal para esse estrutura. A localização de uma estrutura também é melhor definido, por exemplo, dentro de, um terminal do nervo axónio etc. em vez de acima ou abaixo do mesmo. Em contraste, quando o campo de visão foi confinada a um só plano de imagem 2D ou a uma única projecção de dados 3D, as estruturas putativas frequentemente provaram ser "ruído". De igual modo, as estruturas de marcação dupla putativos, muitas vezes provou ser duas estruturas que apareceram coincidente de uma perspectiva de visualização (ou dois), mas não de todas. Visualização de três direção ortogonalções fornece um padrão e critério de rotina para avaliar as características de existência, tamanho e rotulagem de endosomes ou estruturas semelhantes, para uso em análises quantitativas e estatísticas.

A metodologia descrita é prático em que um microscópio convencional de vídeo do tipo encontrado em muitos laboratórios, podem ser utilizados. A instrumentação é versátil em vez de especializado, e relativamente barata. Embora o software específico para um microscópio especial foi usado aqui, o software de código aberto para a aquisição de imagens e processamento de dados pode produzir resultados semelhantes 13. Técnicas (incluindo desconvolução) são aplicáveis ​​a imagem confocal único e multiphoton com vantagens semelhantes, contanto que a exposição à luz é tolerado pela preparação de estar utilizado. No futuro, melhorias no projeto irá aumentar ainda mais o 4D utilitário de imagem ao vivo. Estes incluem, principalmente, o hardware que aumenta a velocidade do foco e cha filtro de excitação / emissãonging e disponibilidade de ainda mais sensível câmeras de vídeo.

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Disclosures

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Grant NS-024572 (para RSW) dos Estados Unidos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
SGC5 Biotium, Hayward, CA 70057 Final conc: 10 mM
FM1-43FX Invitrogen, Carlsbad, CA F35335 Final conc: 7 mM
LysoTracker Red Invitrogen, Carlsbad, CA L7528 Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 86 mM
KCl 60 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
Sucrose 0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm  Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA 175W Xenon arc lamp www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA www.sutter.com
Sensicam CCD camera Cooke Instruments, Tonawanda, NY www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera Photometrics, Tucson, AZ www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0 Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2 Bitplane, South Windsor, CT Drift correction; 3D and 4D data presentation www.bitplane.com
AfterEffects CS6 Adobe, San Jose, CA Drift correction www.adobe.com
ImageJ 1.46 National Institutes of Health, Bethesda, MD Multiple plugins available; Stereo pair construction http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY Stereo pair construction www.zeiss.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122, (6), 753-767 (2009).
  2. Tinevez, J. -Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
  3. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
  4. Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
  5. Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
  6. Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
  8. Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
  9. Cromey, D. W. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).
  10. Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20, (21), 7986-7993 (2000).
  11. Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19, (12), 4855-4866 (1999).
  12. Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. 1495-1505 (2010).
  13. Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).

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