皮质的interneurons的亚型选择性电穿孔

Neuroscience

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De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons. J. Vis. Exp. (90), e51518, doi:10.3791/51518 (2014).

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Abstract

中枢神经系统(CNS)的成熟的研究依赖于神经元群体的遗传定位。然而,限制所关心的特定的神经元亚型的基因的表达的任务已被证明非常困难,因为特异性的启动子元件的相对稀缺。 GABAergic中间神经元构成的神经元群具有丰富的遗传和形态多样性。事实上,超过11种不同的GABAergic中间神经元亚型已被鉴定在小鼠皮质1。在这里,我们提出了一个适应协议GABA能居的选择性目标。我们通过使用同源的转录增强子元件来实现GABAergic中间神经元亚型选择性靶向因子DLX5Dlx6,果蝇远侧少(DLL)基因2,3的同系物,通过以驱动特定基因的表达, 在子宫内的电穿孔。

Introduction

从命名的内侧和尾神经节隆起(MGE和专家咨询小组,分别)2瞬态胚胎结构的皮质GABAergic中间神经元的散装起源4。小白蛋白和生长抑素表达的interneurons起源于梅兰日兰,而钙结合蛋白(CR),Vasointestinal肽(VIP)和络丝(RE)表达的interneurons从专家咨询小组发起。这些interneuron亚型可以通过他们的出生日期来区分。梅兰日兰派生亚型胚胎9.5天(E9.5)和E16.5 5,6间出生。相比之下,CGE衍生的interneurons从出生E12.5 E18.5,通过与他们的生产高峰在E15.5 6。这么晚出生人口的遗传定位,但是,仍然遥遥无期。

鼠远侧少(DLX)基因只表达在显影腹侧前脑3。 GABAergic中间神经元及纹状体投射神经元,但不皮质锥体细胞表达Dlx1,2,5,和6个基因在早期发育阶段3。事实上,DLX基因被表达在MGE和CGE脑室下区(SVZ)内所有的GABA能祖细胞。这些基因的表达成为限制在有丝分裂后期阶段7-9选择亚型。先前的实验证据表明,DLX5 / 6增强子元件允许GABA能系在转基因小鼠模型2的选择性靶向。我们测试使用在附加型表达在发育中的小鼠大脑中的上下文这些增强子元件中的一个的。我们的子带最小启动子和在BLUESCRIPT(BS)的骨架质粒的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)( 图1)中克隆的DLX5 / 6增强子元件一起。我们推出的质粒在子宫内电在E15.5的方式选择性地靶向CR-,VIP和重新亚型3,8,10。我们的技术可用于稀疏电穿孔,这有利于对辛格的细胞形态特征的重建。此外,极高的水平在皮层GABA能神经元的基因表达可用于功能研究。我们进行了损失,并使用多种野生型和显性负11的基因功能研究的增益。

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Protocol

所有的动物都按照医学纽约大学的机构动物照顾及使用委员会的规例和指引处理。

品系小鼠
由TACONIC提供瑞士韦伯斯特雌性小鼠用于这些实验。为了特异性靶向表面层的interneurons,E15.5胚胎被使用。

注意:该作品(DLX5 / 6.eGFP质粒3微克/微升),使用标准的克隆技术生成中使用的质粒。 绿色荧光蛋白的cDNA克隆到DLX5 / 6-p最小-聚腺苷酸质粒。该质粒可应要求提供(demarn02@nyumc.org)。

1,准备显微注射移液器

  1. 将牵引热火#2到860。
  2. 放置并固定在附近的长丝玻璃毛细管。检查该移液管的外径(OD)为约30微米。
  3. 按“拉”按钮。
  4. 小心地取出毛细管。底部的部分是针。弃顶部。

2,麻醉过程

  1. 准备一个含有异氟醚室。注:异氟醚是首选的麻醉剂,由于其快速的行动和副作用发生率低。苯巴比妥是另一种选择;然而,这种药物的耐受性是可变的,并可能导致死亡率比异氟烷更高。
  2. 在0.5-1升/分钟O 2的设置异氟醚4-5%的流量。
  3. 确保阀的腔室是打开的,而阀的头部适配器被关闭。
  4. 将怀孕小鼠中的腔室中。
  5. 让鼠标在麻醉状态下的作用去。这将需要大约2-3分钟。检查呼吸速率。如果鼠标开始换气过度,低级异氟醚的剂量。
  6. 之后鼠标麻醉,迅速将其从室内除去。把它放在腹侧的加热垫,我nsert头中,将继续在整个手术提供异氟烷掩模。确保从室切换的异氟醚的流动连接头转接件管材。放在每只眼睛一滴眼润滑剂和瞑。
  7. 设定加热垫36°C度,以减少体温过低。
  8. 按捏后爪和尾检查没有脚和尾巴反射。

3手术

  1. 清洁皮肤覆盖,用70%乙醇的腹部。
  2. 使用镊子拉扯皮肤向上。每次手术后,清洗所有工具用清洁剂和水,灭菌在72℃CO / N。
  3. 做一个小切口垂直(2厘米左右)沿着第三和第四对乳腺腺体之间的中途开始的中线。用细的手术剪刀。小心不损坏腹壁。
  4. 轻轻分开腹膜皮肤。
  5. 可视化的动脉和腹壁上的静脉。使通过腹膜另外2厘米的垂直切口(避开血管)以暴露腹腔。
  6. 夹紧每侧避免夹住动脉皮肤和腹壁。注意:如果动脉被意外刺破,通过进行颈椎脱位或异氟过量,立即牺牲的动物。
  7. 预暖无菌PBS至37℃。封面用PBS夹湿抹布金。
  8. 滋润暴露腹腔,用PBS。在执行手术重复这一步骤数次。
  9. 用圆钳,轻轻一拉胚链(E15.5)离腔。让我们在湿巾链条休息。首先露出半个子宫第一。一旦它的胚胎被电穿孔,将其带回里面,然后工作在下半年。

4,电穿孔

  1. 继续用圆钳操纵胚胎。
  2. 六sualize侧脑室。沿中线( 图1b)上运行的侧脑室。
  3. 添加固绿(股票:10%W / V)为1:20混合的DNA溶液的注射过程中形象化了。通过将来自于蒸馏水中的标准加厚制备型纯化方案得到的粒料制备的DNA溶液。
  4. 使用预拉带微量柱塞注射1毫升DNA溶液(DLX5 / 6-EGFP,3微克/微升)与固绿的。切微量的前端用细钳子#5(蒙特)离开6毫米长度从肩部到针的尖端的端部的开始装入吸管之前。保持胚胎的头圆镊子。进入大脑的吸管以45度角瞄准位于中线附近侧脑室。如果针穿过心室,慢慢缩回吸管,所使用的活塞注入的DNA。脑室应该变成绿色时,溶液开始填充它。此时,停止移动的移液管和注1毫升的DNA。轻轻地,撤回吸管。
  5. 设置CUY21电穿孔五45V脉冲50毫秒由950毫秒间隔。
  6. 使用5毫米桨电极的E15.5胚胎。浸在PBS的电极,以保证高效的电流传输。
  7. 周围放置胚胎的头部的电极极板与上含有该DNA溶液的心室正桨。略低的积极桨与尊重的负一层通过神经节隆起创建腹电流。该操作会减少异位表达的锥体细胞。
  8. 将电极放置后,通过按下脚踏开关一次提供一个脉冲。
  9. 取下电极和擦拭干净。重复,每个胚胎的步骤4.6-4.9。
  10. 电穿孔所有的胚胎后,倒入3mL的PBS的进入腹腔,并将它们返回到腹腔。
  11. 首先缝合腹壁有弯针和5-0丝线缝合,然后在皮肤上。对伤口应用利多卡因(4%)。辖120毫克/千克的阿司匹林腹膜内镇痛。
    注意:整个过程应在20分钟或更少的时间内完成。可取的做法是初学者电穿孔只有几个胚胎,以保持手术时间短。延长手术会降低胚胎存活率。
  12. 从麻醉导管取出的动物,并允许恢复对纸张加热垫擦拭。
  13. 返回动物笼子,把它加热垫在37℃和监控健康状况。动物通常耐受手术以及与开始缓慢移动它们从麻醉导管取出后不久。如果出血过多或嗜睡观察,通过执行IACUC批准的安乐死程序,如颈椎脱位或麻醉过量,立即牺牲的动物。
  14. 回到笼子里的VIVArium。女性会生出自然。

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Representative Results

我们适应了在子宫内电穿孔技术来实现细胞类型特异性成熟神经元的目标。来驱动的eGFP在CGE衍生的interneurons的表达,我们使用了DLX5 / 6增强子元件和受限制了注射至E15.5,在产生阶段的大部分CGE衍生的interneurons。我们所进行的分析,在P8和P15 11( 图12)。我们通过共电穿孔àCAG-mCherryDLX5 / 6-EGFP质粒等摩尔浓度在E15.5电穿孔证实神经元的腹起源。在这个实验中,我们观察到位于脑室下区(SVZ)的合作只是腹部祖细胞表达两种蛋白11。荧光蛋白的这个时空时空表达与DLX56基因的正常发育阶段的表达,其不表达于心室但subventr一致icular区4。此外,我们评估DLX5 / 6 mCherry电穿孔的interneurons的GABA能认同的GAD67-EGFP敲入小鼠品系。我们发现,电穿孔的神经元中的绝大多数表达GAD67,由所有的GABA能电池11表达的酶。此外,我们通过在P15进行免疫组织化学和电生理分析确定电穿孔的interneurons的子类型标识。亚型特异性标记物的表达模式是在冷冻切片11( 图2)显示通过免疫荧光。我们发现,电穿孔的interneurons在E15.5几乎完全表达NPY,颤,贵宾和Cr,前面描述的CGE衍生interneuron标记6。此外,这些神经元的内在电性能均符合先前的命运图谱研究6,11描述的一致。总之,这些结果表明,electropo比用在E15.5的DLX5 / 6增强子元件选择性地针对CGE衍生interneuron亚型。

图1
图中的电穿孔实验1示意图。一)亚克隆战略,DLX5 / 6-EGFP质粒。 二)示出了实验的策略。

图2
图2:将电穿孔的interneurons是由CGE衍生亚型标记物的表达所划定。 A)CGE衍生的interneurons电穿孔与DLX5 / 6-EGFP质粒。注稀疏电多元化CGE亚型。B)贵宾表达interneuron在P8。 EGFP表达描绘的整个树突树和单个神经元的轴突乔木。C)一种神经肽Y表达interneuron在P8。 NPY表达描绘neurogliaform细胞D)的NPY表达interneuron在P15。比例尺A,100毫米; BD,50毫米

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Discussion

该技术的局限性

尽管该技术允许对细胞过程的细胞中自主分析,它是不适合于人口分析。在电穿孔是非常稀疏的不到一千细胞每大脑电穿孔。因此,该技术不能被用来评估从CGE衍生的interneurons的遗传操作而产生的行为后果。

而电穿孔进行在E13.5-E14.5目标MGE衍生的亚型,效率低10。我们推测,DLX5 / 6增强剂是在有丝分裂后的MGE亚型活性较低,至少在附加型表达的情况下。

相对于现有方法的意义

该技术代表从先前电穿孔方法[12,13]为的interneurons的研究进展。由于其相对稀缺性和胚胎的腹面NIC的起源,神经元的这部分人口已经证明,很难瞄准。我们的技术提供了手段,开展专家咨询小组,衍生的interneurons细胞自主性分析。高含量的eGFP表达允许单个的interneurons的可视化和分析。

未来的应用

通过组合使用特定的质粒和转基因小鼠系中也能够实现在感兴趣的基因的表达时间和空间控制。例如,我们使用了DLX5 / 6-TTA的质粒打开的TETO诱导外源基因的表达。在这些实验中,我们能够通过给予强力霉素8沉默的转基因表达。目前,我们正在开发一个协议,使用该技术结合了瑰珀翠系统。

该协议中的关键步骤

为了实现高效的电穿孔和生存,尽量避免exces西伯操纵胚胎和/或器官。此外,避免挤压动脉和静脉。如果出血发生时,鼠标将很快成为低血容量性。电穿孔完成后,将胚胎器官在哪里找到它们,以避免产生扭结,可能导致缺氧的相同位置。旨在为20分钟或更少的手术时间。在手术过程中滋润腹腔,用PBS无数次。在电,尝试用毛细管针穿破侧脑室只有一次。重复穿刺会降低存活率。训练期后,存活率为80%或更高。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgements

我们非常感谢尹立红提供技术援助。 NVD是一个NARSAD青年研究者奖的获得者,也从美国国立卫生研究院(5 K99 MH095825-02)支持补助。研究在Fishell实验室由卫生心理健康(5 R01 MH095147-02,5 R01 MH071679-09)的神经疾病和中风(5 R01 NS081297-02研究所研究所,研究所,支持,1 P01 NS074972 -01A1)和西蒙斯基金会。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Electroporator  with pedal Protech International CUY21
5 mm paddle electrodes  Protech International CUY650P5
Heating pad  Kent Scientific DCT-15
Sutter Instruments P30 Puller  Sutter Instruments 3282322
Fluovac Anesthesia Systems Harvard Apparatus 726425
Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp Roboz RS-6702
5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36  Roboz SUT-1073-21
Micro Clip Applying Forceps 5.5" Roboz RS-5410
2 Clamp scissors Roboz RC-4894
Holding forceps  Fine Science Tools 11031-15
Glass capillary tubing  FHC 27-30-0 Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID
Fast Green Sigma-Aldrich F7258 
Sterile PBS Life Technologies 20012-027

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References

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