عزل حيدات الإنسان من مزدوجة التدرج الطرد المركزي والتمايز لالضامة في تفلون المغلفة حقائب خلية ثقافة

Immunology and Infection
 

Summary

نقدم بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليد الضامة الإنسان. تتم معالجة الشهباء المعاطف بالنقر المزدوج كثافة التدرج الطرد المركزي ومن ثم يتم التمييز حيدات معزولة لالضامة في أكياس زراعة الخلايا المغلفة تفلون. هذا يعظم عوائد البلاعم ويسهل الحصاد خلية لتجارب لاحقة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Menck, K., Behme, D., Pantke, M., Reiling, N., Binder, C., Pukrop, T., Klemm, F. Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags. J. Vis. Exp. (91), e51554, doi:10.3791/51554 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وتشارك الضامة الإنسان في عدد كبير من العمليات مرضية تتراوح من الأمراض المعدية إلى السرطان. وبالتالي فإنها تشكل أداة قيمة لفهم الآليات الكامنة وراء هذه الأمراض. لذا نقدم بروتوكول اضحة لعزل حيدات الإنسان من المعاطف الشهباء، يليها إجراء المفاضلة مما يؤدي إلى عوائد عالية البلاعم. وتعتمد هذه التقنية في الغالب على معدات المختبرات المتاحة عموما وبالتالي يوفر التكلفة والوقت فعالة طريقة للحصول على كميات كبيرة من الضامة الإنسان. باختصار، يتعرض المعاطف الشهباء من المتبرعين بالدم صحية إلى مضاعفة كثافة التدرج الطرد المركزي لحصاد حيدات من الدم المحيطي. هذه حيدات ثم يتم تربيتها في المفلورة الإثيلين البروبيلين (محطة إثراء الوقود) أكياس زراعة الخلايا المغلفة تفلون بحضور بلعم عامل تحفيز مستعمرة (M-CSF). الضامة متباينة يمكن حصادها بسهولة واستخدامها لدراسات لاحقة وظيفية ويقول. وسيتم تسليط الضوء طرق هامة لمراقبة الجودة والتحقق من العزلة والتمايز الخطوات ضمن البروتوكول. وباختصار، فإن بروتوكول الموصوفة هنا تمكن العلماء من عزل بشكل روتيني وبتكاثر الضامة الإنسان دون الحاجة إلى أدوات مكثفة التكلفة. وعلاوة على ذلك، ونماذج المرض يمكن دراستها في النظام البشري مسانج التحايل على استخدام الضامة الفئران.

Introduction

خلايا من سلالته الوحيدات والتي متباينة عضال مشتق - الضامة - تبدي مرونة لافتة في الصدد إلى وظائفها البيولوجية، مما يؤدي إلى مشاركتهم في هذه العمليات متنوعة والتنمية، وإصلاح الأنسجة، والحصانة 1. ومن المقرر أن أكلة وقدرتها العارضة للمستضد الذي يضع الضامة في مفترق الطرق بين الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية (2) والأخير. ومع ذلك، قدرتها على إفراز السيتوكينات، كيموكينات، عوامل النمو، والجزيئات الأخرى 1 يشير ليس فقط وظيفة تقوي المناعة تغييري ولكن أيضا بمثابة أساس لوظائف إضافية لهم. محاولات لتعكس هذه الخطوات تفعيل المتنوعة في سياق غير الميكروبية-الظروف بوساطة أدت في الفئات M1 و M2 3. في حين أن هذا التصنيف ليست كاملة، لأنها تتيح فهم أساسي من البلاعم علم الأحياء.

بسبب هذه القدرات المتعددة الأوجه أنه لم يكن مفاجئا أن الضامة ترتبط مع العديد من الظروف التي في بعض الطريق تنطوي على إعادة عرض الأنسجة أو التهاب. بجانب دور أساسي في الاعتراف والتخليص غزو مسببات الأمراض 4-6، الضامة قد يأتي على نحو متزايد إلى التركيز في تصلب الشرايين، والتليف، والسمنة، والسرطان 7-10. وهناك طريقة استنساخه لتوليد الضامة الإنسان هو بالتالي حاسما لفهم هذه الأمراض. نحن هنا نقدم وسيلة تقوم على عزل حيدات الإنسان من الدم المحيطي من المتبرعين الأصحاء بواسطة تقنية التدرج الكثافة الطرد المركزي مزدوجة كما هو موضح سابقا 11. من أجل تسهيل التمايز نحو الضامة، يتم تحضين الخلايا الوحيدات المعزولة في وجود تركيزات منخفضة من M-CSF والمصل البشري العادي 12. لتخفيف مزيد من التعامل وحصاد الخلايا، ويتم التفريق في محطة إثراء الوقود الغاز قابلة للاختراقأكياس زراعة الخلايا المغلفة تفلون مع سطح مسعور 12-15. الضامة يستريح الناتجة يمكن أن تخضع لمجموعة واسعة من فحوصات لأنها لا تزال قادرة على الاستجابة في إما M1 أو M2 مثل الموضة. طرق بديلة لعزل الوحيدات والتمايز اللاحق مثل المغناطيسية تنشيط الخلايا الفرز (MACS) أو معاكس تصويل الطرد المركزي (CCE) لديها بعض القيود فيما يتعلق العائد والتكلفة والوقت المطلوب. بروتوكول الموصوفة هنا يوفر ميزة أنه يمكن تنفيذها مع المعدات المختبرية القياسية دون الحاجة للمواد الخاصة (على سبيل المثال، أجهزة ماكينتوش حبات مغناطيسية) أو أجهزة (على سبيل المثال، جهاز CCE) ويسمح لتجهيز كميات كبيرة من الخلايا.

Protocol

1. إعداد العقيمة المصل AB الإنسان

  1. جمع 4-5 أكياس من البلازما الطازجة المجمدة (FFP). مخزن الحقائب في -20 درجة مئوية حتى تم جمع ما يكفي من الحقائب.
  2. ذوبان الجليد الحقائب واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية في حمام مائي لتعطيل مكملا وإزالة الفيبرين.
  3. تطهير بدقة خارج الحقائب ونقل البلازما إلى 50 مل أنابيب.
  4. الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للتخلص من الرواسب والصفائح الدموية المتبقية.
  5. تجميع كل supernatants وتجاهل الكريات.
  6. عينات مصل قسامة في 15 مل الأنابيب وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام المتاحة تجاريا الحرارة المعطل AB المصل البشري العادي.

2. عزل حيدات

لتسهيل موازنة من أجهزة الطرد المركزي، فمن المستحسن لمعالجة اثنين من المعاطف الشهباء بشكل متواز. ومع ذلك، واتخاذ كاليفورنياإعادة استخدام مواد منفصلة لكل المانحة وعدم خلط الخلايا. في حالة لا يمكن الحصول عليها بسهولة المعاطف الشهباء، 400 مل من الدم المحيطي heparinized يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك.

  1. تطهير بعناية الأكياس البلاستيكية التي تحتوي على المعاطف الشهباء ونقل محتويات كل معطف الشهباء لمدة 50 مل أنابيب.
  2. لكل معطف الشهباء ملء ثلاثة أنابيب مع 50 مل 15 مل Ficoll الحل (1.077 جم / مل). وFicoll يجب أن يكون في درجة حرارة الغرفة لإعداد.
  3. طبقة 30-35 مل من الدم معطف الشهباء على أعلى من حل Ficoll لأول التدرج الكثافة. كن حذرا للقيام بذلك ببطء وبعناية من أجل منع خلط كل من طبقات.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج بدون فرامل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. لكل التدرج جمع حلقة بيضاء من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) الذي يقع بين المرحلتين مع ماصة باستير البلاستيك ونقل إلى أنبوب 50 مل.
  6. ملء كل أنبوب مع PBS-EDTA (1 ملم) يصل إلى 40 مل في المجموع.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة دون فرامل في درجة حرارة الغرفة.
  8. نضح طاف ويغسل بيليه مرة أخرى مع 40 مل PBS-EDTA (1 ملم).
  9. لكل تجمع المانحة الكريات في 20 مل RPMI-1640 دون الفينول الحمراء + 10٪ FCS.
  10. إعداد الحل Percoll-ISO الاسموزي للكثافة التدرج الثاني: للحصول على مزيج اثنين من المانحين 23.13 مل Percoll الحل (الكثافة: 1.131 جم / مل) في أنبوب 50 مل مع 1.87 مل 10 أضعاف PBS. ثم نقل 23 مل من هذا المحلول إلى أنبوب جديد 50 مل و 27 مل إضافة RPMI-1640 مع الفينول الحمراء + 10٪ FCS للحصول على 46٪ ايزو الاسموزي Percoll الحل. وPercoll يجب أن يكون في درجة حرارة الغرفة لإعداد.
  11. لكل المانحة نقل 25 مل من محلول Percoll استعداد لأنبوب 50 مل وطبقة الحل PBMC أعد 2.9) على رأس من الحل Percoll. كن حذرا للقيام بذلك ببطء شديد ود بعناية، كل من طبقات تميل إلى خلط بسهولة. إذا فعلت بشكل صحيح المرحلتين يمكن تمييز بسبب اختلاف في اللون.
  12. أجهزة الطرد المركزي في 550 x ج بدون فرامل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  13. لكل التدرج جمع حلقة بيضاء من حيدات الذي يقع بين المرحلتين مع ماصة باستير البلاستيك ونقل إلى أنبوب 50 مل.
  14. ملء كل أنبوب مع PBS-EDTA (1 ملم) إلى 50 مل في المجموع.
  15. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة دون فرامل في درجة حرارة الغرفة.
  16. نضح طاف و resuspend الكريات في 20 مل RPMI-1640 مع الفينول الحمراء + 10٪ FCS.

3. تمايز حيدات الضامة ل

  1. تحديد عدد حيدات معزولة في التخفيف 01:10 في التريبان الأزرق. عد فقط، خلايا كبيرة في كثير من الأحيان غير منتظمة الشكل، والتي هي وحيدات. لا تعول على خلايا مستديرة على شكل أصغر والتي هي الخلايا الليمفاوية.
    NOTE: أرقام الوحيدات لا يجب أن يتم تحديدها بدقة جدا لأنها تعطي تلميحا فقط حول كيفية العديد والتي المغلفة تفلون-FEP حقائب (صغيرة أو كبيرة) لا بد من استخدامها للتمايز الخلايا.
  2. ل1.0-1.5 × 10 8 حيدات من أحد المانحين، البذور الخلايا في FEP كبيرة تفلون المغلفة كيس ثقافة الخلية. لكل حقيبة إعداد مستنبت يتكون من 174 مل RPMI-1640، 2٪ مصل AB البشري (كما أعدت في القسم 1)، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، و 2.5 نانوغرام / مل M-CSF (الحجم الإجمالي: 180 مل).
    1. ل3.0-5.0 × 10 7 حيدات من أحد المانحين، البذور الخلايا في حقيبة صغيرة زراعة الخلايا المغلفة تفلون. لكل حقيبة إعداد مستنبت تتكون من 28.5 مل RPMI-1640، 2٪ مصل AB البشري (كما أعدت في القسم 1)، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، و 2.5 نانوغرام / مل M-CSF (الحجم الإجمالي: 30 مل).
      ملاحظة: إذا كان على سبيل المثال، يتم الحصول على 8.0 × 10 7 حيدات، ونحن نوصي على البذور منها في TWس أكياس حجم أصغر مع 4.0 × 10 7 خلايا لكل منهما. بدلا من M-CSF، وحيدات يمكن بدلا من ذلك أن تكون متباينة مع محببة بلعم عامل تحفيز مستعمرة (GM-CSF) في نفس التركيز (2.5 نانوغرام / مل).
  3. إضافة تعليق خلية (20 مل) إلى متوسطة استعداد وتخلط بعناية. إذا تم إعداد كيسين من أحد المانحين، إضافة 20 مل RPMI-1640 لتعليق الخلية ثم قم بإضافة نصف لتعليق لكل إعداد المتوسط.
  4. اختياري: لتحديد ما إذا كان قد بقي إعداد الوحيدات عقيمة، المسيل للدموع قطرة واحدة من تعليق الخلية على طبق أجار الدم واحتضان أكثر من ليلة عند 37 درجة مئوية.
  5. تشديد غمد من 50 مل حقنة perfusor على المكونات من محطة إثراء الوقود تفلون المغلفة كيس زراعة الخلايا وملء مع تعليق خلية استعداد.
  6. افصل حقنة ودفع الهواء المتبقية للخروج من الحقيبة. إغلاق كيس مع مخروط الختام.
  7. احتضان الحقائب لمدة 6-7 أيام في 3776، C مع 5٪ CO 2.

4. بلعم الحصاد

  1. وضع أكياس زراعة الخلايا FEP تفلون المغلفة مع الضامة متباينة على الجليد لمدة 1 ساعة على الأقل لتسهيل مفرزة من الخلايا (على حضانة تصل إلى 3 ساعة هو ممكن). تأكد من أن السطح كله من كيس مغطى بالثلج.
  2. سحب الحقيبة مع الحد الأدنى من ضغط 10X على حافة مكتب / المجلس.
  3. تطهير بعناية خارج الحقيبة وإزالة مخروط الختام.
  4. تشديد حقنة 50 مل على المكونات من الحقيبة، وإزالة تعليق الخلية، وتحويلها إلى 50 مل أنابيب.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتدور باستمرار الخلايا.
  6. نضح طاف وحشد من الكريات في كيس واحد 10 مل RPMI-1640 + 10٪ FCS في المجموع.
  7. تحديد عدد الخلايا في عدادة الكريات (1: 4-1: 10 التخفيف باللون الأزرق التريبان). الاعتماد فقط الخلايا الجولة الكبيرة.
    ملاحظة: بعد التفريق الضامة في أكياس FEP تفلون المغلفة، يمكن أن يكون هناك خلايا المتبقية على سبيل المثال، الخلايا الليمفاوية، اعتمادا على الجهات المانحة وعلى نوعية من العزلة الوحيدات.
  8. إعادة استخدام أكياس FEP تفلون المغلفة، غسلها مرتين مع 70٪ من الإيثانول لإزالة الخلايا المتبقية. ملئها 50 مل 70٪ من الإيثانول واحتضان بين عشية وضحاها. غسل أكياس 3X مع برنامج تلفزيوني العقيمة، والانتهاء منها في ورقة التعقيم، وتعقيم في الأوتوكلاف باستخدام إجراءات القياسية.
    ملاحظة: أكياس زراعة الخلايا يمكن إعادة استخدامها عدة مرات دون أي خسارة في عائدات البلاعم. ومع ذلك، قررنا التخلص من أكياس بعد 10 يستخدم قبل أن تبدأ في تسرب.
  9. لاحقة الضامة الثقافة التجارب في RPMI-1640 + 10٪ FCS. إذا كانت هناك حاجة تركيزات مصل أقل، زراعة في RPMI-1640 مع 1٪ FCS هو ممكن أيضا. البذور والخلايا احتضان لمدة 3-4 ساعة. بعد هذه الفترة، علما بأن الضامة نعلق على سطح خلية ثقافة طبق حينأي تلويث الخلايا (أي الكريات الحمراء، الخلايا الليمفاوية، والخلايا الجذعية) البقاء في تعليق. غسل الخلايا مرتين على الأقل مع PBS لإزالة الخلايا غير ملتصقة.
  10. لفصل مثقف الضامة من الطبق ثقافة الخلية لمزيد من التجارب، وتتخلص منها بعناية من السطح. بدلا من ذلك، واحتضان الأطباق لمدة 20 دقيقة على الجليد، ونضح مستنبت، وإضافة 1 مل خالية من انزيم تفارق العازلة الخلية. بعد 5 دقائق الحضانة عند 37 درجة مئوية، إضافة 4 مل PBS، وفصل الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا لمدة 3 دقائق على الأقل.

Representative Results

أول الطرد المركزي التدرج الكثافة باستخدام Ficoll غلة البيني الأبيض تحتوي على PBMCs (الشكل 1A) أي اللمفاويات وحيدات. ويمكن التأكد من ذلك من خلال تلطيخ مايو Gruenwald (الأرقام 1B و C) من الخلايا التي تم جمعها مما يدل على حد سواء نواة / نسبة عالية السيتوبلازم (نموذجي من الخلايا الليمفاوية) وbean- أو نوى على شكل حلقة (نموذجي من وحيدات). عندما يتم بعد ذلك تحميل هذه الخلايا على التدرج الكثافة الثاني باستخدام Percoll، يمكن أن يكون أبعد حيدات فصلها عن الخلايا الليمفاوية ومرة أخرى تبدو وكأنها الطور البيني الأبيض (أرقام 1D-F). لكل الغلالة الشهباء وصفها كثافة مزدوجة التدرج الطرد المركزي ينتج عادة 150 ± 40 × 10 6 حيدات التي يمكن أن تكون متباينة إلى 70 ± 30 × 10 6 الضامة (الشكل 2) في معطف الشهباء. العائد بلعم يعني منوكانت الاستعدادات مستقلة 20 47 ± 14٪ من إجمالي حيدات معزولة.

بعد التدرج Percoll الطرد المركزي قد يكون لا يزال هناك بعض الخلايا غير الوحيدات المتبقية الحالية في إعداد التي تعتمد على المتبرعين بالدم وكذلك على دقة عملية العزلة. ومع ذلك، بعد مرحلة التمايز من 6-7 أيام، وإعداد يتكون أساسا من الضامة الناضجة (الشكل 3) الذي يمكن تخصيبه أكثر بسبب تمسكهم الأسطح البلاستيكية، وهي الميزة التي لا يتم مشاركتها من قبل الخلايا تلويث العشوائي (أرقام 4A وB). مرة واحدة مطلية، فإن غالبية الضامة تظهر الكلاسيكية "البيض المقلي" مورفولوجيا في حين أن هناك أيضا الخلايا مع تمدد مثل مغزل النمط الظاهري (الشكلان 4C و D). وينعكس ذلك من خلال توزيع F-الأكتين في غضون السيتوبلازم والتصاق المجموعات. خلايا متباينةتتميز التعبير عن CD45، CD14، CD16، CD206 (مستقبلات المانوز)، وCD11b CD11c والتي هي علامات نموذجية لالضامة الناضجة (الشكل 5). وجود CD11b يجادل ضد التمييز في الغالب شجيري الذي يدعمه حقيقة أن الخلايا هي سلبية على شجيري CD209 علامة الخلية (DC-SIGN).

بعد عملية التمايز تبقى الخلايا نشطة وظيفيا وعملية الأيض لحوالي 5-7 أيام (الشكل 6) كما يمكن تصور بواسطة calcein AM تلطيخ وقدرتها على تناول الحويصلات خارج الخلية من تسليط الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك، لا يزال يتم تفعيل الخلايا كما هو مبين على سبيل المثال، من أجل التحفيز مع عديد السكاريد الشحمي (LPS) الذي ينتج التعبير عن عدة جينات الموالية للالتهابات (الشكل 7).

الشكل 1 الرقم 1. المظهر وتكوين PBMC- والوحيدات طبقة مزدوجة الكثافة بعد التدرج الطرد المركزي. صورة توضح (A) والموجات PBMC بعد التدرج Ficoll و (D) للمرحلة الوحيدات بعد متسق الضغط التناضحي Percoll الطرد المركزي. stainings مايو Gruenwald الاستعدادات cytospin من (B، C) PBMC جزء والباقي (E، F) وحيدات. شريط النطاق = 200 ميكرومتر في B و E، = 50 ميكرون في C و F.

الشكل 2
الشكل 2. العائد من وحيدات الضامة. فرزان خلية التمثيلية للحيدات معزولة والضامة من 20 معطف الشهباء العلاقات العامةeparations.

الرقم 3
الرقم 3. الميكروسكوب وقياسات حجم خلية وحيدات الضامة. المجهر النقيض المرحلة من تعليق خلية الوحيدات قبل (A) وبعد (B) بلعم التمايز. المقابلة رسوم بيانية حجم الخلية من حيدات (C) والضامة (D). مقياس بار = 100 ميكرون.

الرقم 4
الرقم 4. الصرف وتنظيم هيكل الخلية الضامة ملتصقة. المجهر النقيض من المرحلة الضامة ملتصقة قبل (A) وبعد (B) إزالة غير adheren- خلايا تي. (C، D) Phalloidin-TRITC تلطيخ أكتين الخيطية في ملتصقة الضامة، غير حفز. مقياس بار = 100 ميكرون في AC، 20 ميكرون في D. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. نمط ظاهري مناعي الضامة متباينة. التدفق الخلوي تحليل الضامة بعد 6 أيام من التمايز في محطة إثراء الوقود تفلون المغلفة أكياس زراعة الخلايا (المشار إليها باللون الأحمر). وتظهر الضوابط نمط إسوي المقابلة في الرمادي. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

تكفي ل= "دائما"> الرقم 6
الرقم 6. امتصاص microvesicles الخلايا السرطانية بواسطة الضامة. الميكروسكوب الضامة ملتصقة بعد المعرض لPKH26 المسمى (أحمر فلوري) ورم microvesicles المستمدة من الخلية. ويغطى الصور إلى المقابلة (A) brightfield أو (B) تلطيخ عصاري خلوي مع بقاء الصبغة calcein AM. أشرطة النطاق = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. Upregulation من IL-1 β، Wnt5a، TNFα، IL-6، MMP-2، MMP-7، وMT1-MMP بعد stimuوقد تم قياس lation الضامة مع LPS (100 نانوغرام / مل) لمدة 24 ساعة. التعبير الجيني بواسطة RT-PCR الكمي من مجموع عينات الحمض النووي الريبي (A) وتطبيع على HPRT1 وGNB2L1 التعبير. القيم المعروضة هي التغييرات أضعاف بالمقارنة مع السيطرة غير المعالجة (يعني ± SD، ن = 5، * P <0.05، ** P <0.01، *** P <0.001). وأكد TNFα و IL-6 تحريض تحت التحفيز LPS مزيد من ELISA (B) (يعني ± SD، * P <0.05).

Discussion

الضامة هي خلايا المستجيب الهامة من نظام المناعة الفطري وعرض وظائف مهمة في تعديل مناعي، عرض المستضد وتوازن الأنسجة. بسبب اللدونة لها ملحوظة، فهي قادرة على الاستجابة للمؤثرات مختلفة مع التغيرات في النمط الظاهري بهم. ومع ذلك، يتم الحصول حتى الآن الكثير من البيانات المتعلقة بلعم الاستقطاب في النظام الفئران، وإن كانت هناك تقارير تبين أن حوالي 50٪ فقط من علامات الاستقطاب البلاعم يمكن ترجمتها مباشرة من الفأر إلى الإنسان 16. لذا، نقدم هنا طريقة للحصول على الضامة الإنسان الأولية في عدد ونقاء كافية دون الحاجة إلى المواد باهظة الثمن، على سبيل المثال، MACS حبات مغناطيسية أو معاكس جهاز تصويل الطرد المركزي.

ويستند أسلوبنا على عزل حيدات من PBMCs والتمايز لاحقا إلى الضامة في محطة إثراء الوقود أكياس زراعة الخلايا تفلون المغلفة في حضور منخفضة بغية دراسته واقرارهntrations من M-CSF 11-13. بينما حيدات تشكل أقل من 5 إلى 10٪ من الكريات البيض الدموية المحيطية في البشر، على التحفيز وتجنيدهم إلى مواقع هامشية حيث التفريق الأنسجة الضامة إلى المقيمين أو الخلايا الجذعية 17. خلوى M-CSF مهم لبقاء الوحيدات ويقود التمايز لالضامة 18،19. حتى الآن، وتراوحت تركيزات M-CSF التي تم اختيارها لالوحيدات التمايز تصل إلى 100 ​​نانوغرام / مل، ولكن في بروتوكول لدينا ونحن قادرون على الحصول على أعداد كافية من الضامة ناضجة مع تركيز M-CSF فقط 2.5 نانوغرام / مل 12 20. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا المستزرعة في محطة إثراء الوقود تفلون المغلفة أكياس ثقافة الخلية التي تسهل من عملية فصل الضامة والبذر في وقت لاحق في أعداد الخلايا المحددة. منذ أكياس يمكن إعادة استخدامها عدة مرات، وهذا يقلل كذلك تكاليف عملية العزلة.

الضامة التي حصل عليها هذا الإجراءهي ايجابية للغاية لCD45، CD14، CD11b، وإظهار CD11c والتعبير عن مستقبلات المانوز CD206 التي تقول لسكان نقية، الضامة ناضجة 21،22. خاصة ارتفاع التعبير CD14 هو الحال بالنسبة للالضامة متباينة في وجود M-CSF 23. بعد زرع الخلايا، لأنها تكشف التقيد سريع على الأسطح البلاستيكية مع بعض الخلايا تظهر مثل مغزل مورفولوجيا نموذجية، والبعض الآخر يحمل النمط الظاهري البيض المقلي. هذا هو وفقا لملاحظات من مؤلفين آخرين 18،22،24.

أفيد بأن التمايز الوحيدات في حضور M-CSF يؤدي إلى الاستقطاب-M2 الضامة 16،25. ومع ذلك، فإن الضامة معزولة بسبب بروتوكول لدينا ما زالت قادرة على الاستجابة لمجموعة واسعة من المحفزات بما في ذلك التعرض لورم microvesicles المشتقة من خلية وثقافة مشتركة مع الخلايا السرطانية 26،27 أو التعرض لLPS التي تتفاعل مع تحريض المؤيدة الجينات الالتهابية مثل IL-1 &# 946؛، TNFα، Wnt5a، أو مختلف مصفوفة metalloproteinases التي تعتبر نموذجية لالضامة M1-الاستقطاب 3،5،28.

في الختام، عزل مزدوج حيدات بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج والتمايز اللاحق نحو الضامة في محطة إثراء الوقود تفلون المغلفة زراعة الخلايا أكياس النتائج في أعداد كبيرة من الضامة دون الحاجة إلى إجراءات صعبة أو مكلفة من الناحية الفنية. ويمكن استخدام الضامة التي تم الحصول عليها لتحليلها لاحقا تتراوح بين الكلاسيكية من خلال تفعيل LPS إلى ثقافة التعاون مع الخلايا السرطانية.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما تكشف عن وجود أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر السيدة مايكه Schaffrinski لها المساعدة التقنية ممتازة دائما خلال السنوات القليلة الماضية.

وقد تم تمويل هذا العمل من خلال مجلس البحوث الألمانية (DFG) ضمن مجموعة البحوث المشتركة 942 (FOR942) وبرنامج البحوث في كلية الطب، جورج-أغسطس جامعة غوتنغن.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies for immunophenotyping Beckman Coulter for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)
BioLegends for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)
Axiovert 200M microscope Zeiss
Calcein AM AnaSpec 89201
Combi-stopper closing cones Braun 4495101
1x PBS, w/o Ca and Mg Pan biotech P04-36500 for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0.5 M EDTA per 500 ml PBS
10x PBS, w/o Ca and Mg Invitrogen 14200-067
EDTA (Titriplex III) Merck 1084211000 prepare a 0.5 M solution in H2O, use a sterile filter
Cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based) Gibco 13151-014
Fetal calf serum (FCS) Invitrogen 10091148 heat-inactivated
Ficoll (density 1.077 g/ml) Biochrom AG L6115
FACSCanto II BD Biosciences
Goat anti-mouse FITC santa cruz sc-2010
LPS from E.coli Sigma L8274 final conc: 100 ng/ml
Multifuge 3 L-R Heraeus
Penicillin/streptomycin Biochrom AG A2213
Percoll (density 1.131 g/ml) GE Healthcare 17-0891-02
Perfusor syringe 50 ml Braun 8728844F
Phalloidin-TRITC Sigma P1951 resuspend in methanol (c = 0.1 mg/ml)
Name Company Catalog Number Comments
Plastic disposable Pasteur pipettes LVL technologies 2655181
rh M-CSF ImmunoTools 11343117 Resuspend in 500 µl sterile H2O (c = 100 ng/µl), aliquot
RPMI-1640 with phenol red Gibco 21875-034
RPMI-1640 without phenol red Gibco 11835-063
Sterilization paper VP group 3KFKFS230116
Trypan blue stain (0.4% w/v) Sigma T8154
FEP Teflon-coated cell culture bag, small CellGenix 72-C
FEP Teflon-coated cell culture bag, large CellGenix 197-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496, 445-455 (2013).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System. Science. 327, 291-295 (2010).
  3. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).
  4. Lionakis, M. S., et al. CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival. J Clin Invest. 123, (3), 5035-5051 (2013).
  5. Blumenthal, A., et al. The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation. Blood. 108, 965-973 (2006).
  6. Lima, D. S., et al. Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania. Nat Med. 19, 909-915 (2013).
  7. Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).
  8. Subramanian, V., Ferrante, A. W. Jr Obesity, inflammation, and macrophages. Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).
  9. Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).
  10. Pradere, J. P., et al. Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice. Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).
  11. Danciger, J. S., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).
  12. Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity. J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).
  13. Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes. J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).
  14. van der Meer, J. W., et al. Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast. Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).
  15. van der Meer, J. W., et al. Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag. Immunology. 47, 617-625 (1982).
  16. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
  17. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).
  18. Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
  19. Tushinski, R. J., et al. Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy. Cell. 28, 71-81 (1982).
  20. Rietkotter, E., et al. Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion. Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).
  21. Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts. Plos One. 4, E7475 (2009).
  22. Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. Plos One. 7, e42656 (2012).
  23. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  24. Chernykh, E. R., et al. The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair? Cell Ther Transplant. 2, (2010).
  25. Verreck, F. A., et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
  26. Pukrop, T., et al. Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).
  27. Hagemann, T., et al. Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK. J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).
  28. Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10. Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).

Comments

1 Comment

  1. Hi! First of all, I want to thank you the authors for the very detailed methodology presented here.

    You suggests this technique as a intersting substitute for the other most used approaches to isolate monocytes (i.e. magnetic beads and plastic adherence).

    I've tried this protocol to isolate monocytes for dendritic cell in vitro differentiation. I see that when you do the macrophage differentiation, you wash the non-adherent cells to increase the purity of these cells (eliminating most lymphocytes). Do you often achieve

    Reply
    Posted by: Daniel G.
    January 18, 2016 - 8:29 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics