पूरा पर्वत से zebrafish भ्रूण नमूने सना का अवलोकन और विश्लेषण के लिए फ्लैट माउंट तैयारी

Biology
 

Summary

zebrafish भ्रूण विकास जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए एक शानदार मॉडल है. Embryogenesis दौरान, zebrafish नमूना अवलोकन और विश्लेषण के लिए तीन आयामी चुनौतियां प्रस्तुत करता है, जो एक जर्दी जन, साथ विकसित करना. इस प्रोटोकॉल सीटू (इच्छा) दाग zebrafish भ्रूण नमूनों में पूरे माउंट के दो आयामी फ्लैट माउंट तैयारी बनाने के लिए कैसे करें.

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Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604, doi:10.3791/51604 (2014).

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Abstract

zebrafish भ्रूण अब सामान्य विकास की प्रक्रिया के आनुवंशिक नियंत्रण की जांच के लिए और जन्मजात असामान्यताएं मॉडल पर बुनियादी और जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए प्रयोग किया जाता है. जीवन के पहले दिन के दौरान, zebrafish भ्रूण निषेचन, दरार, gastrulation, विभाजन, और इस तरह के गुर्दे, हृदय, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रूप में संरचनाओं की जीवोत्पत्ति सहित कई विकास के चरणों के माध्यम से प्रगति. भ्रूण एक दौर की जर्दी जन के सहयोग से विकसित करता है क्योंकि एक युवा zebrafish भ्रूण की शारीरिक रचना इन घटनाओं के कई में शामिल ऊतकों के दृश्य और विश्लेषण के लिए कई चुनौतियां प्रस्तुत करता. इस प्रकार, सटीक विश्लेषण और tailbud और 20 विखंड चरण में इस तरह के दाग का उपयोग कर उन के रूप में (क्रमश: 10 और 19 घंटे के बाद निषेचन (HPF),), के बीच तय भ्रूण नमूनों में प्रयोगात्मक phenotypes की इमेजिंग के लिए पूरे आईटी, सीटू संकरण (इच्छा) में माउंट जर्दी बी से भ्रूण को निकालने के लिए अक्सर वांछनीय हैसभी और एक गिलास स्लाइड पर फ्लैट स्थित करने के लिए. हालांकि, एक फ्लैट माउंट प्रक्रिया प्रदर्शन कठिन हो सकता है. इसलिए, फ्लैट सफल और कुशल तैयारी बहुत विच्छेदन तकनीक का दृश्य प्रदर्शन के माध्यम से मदद की है माउंट, और भी इष्टतम ऊतक से निपटने में सहायता कि अभिकर्मकों का उपयोग करके मदद की. यहाँ, हम zebrafish भ्रूण में जीन की अभिव्यक्ति का एक या दो रंग का पता लगाने के लिए हमारी इच्छा प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और फ्लैट बढ़ते प्रक्रिया एक दाग तय नमूना के इस उदाहरण पर प्रदर्शन किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है. इस फ्लैट बढ़ते प्रोटोकॉल जल्दी zebrafish विकास के दौरान उभरने कि कई भ्रूण संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए मोटे तौर पर लागू है, और तय भ्रूण के नमूने पर प्रदर्शन अन्य धुंधला तरीकों के साथ संयोजन के रूप में लागू किया जा सकता है.

Introduction

zebrafish, Danio rerio, विकास जीव विज्ञान के अध्ययन में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल जीव बन गया है. Zebrafish परिवार Cyprinidae से संबंधित एक उष्णकटिबंधीय, मीठे पानी हड्डीवाला प्रजातियों हैं. वे आसानी से प्राप्य सस्ती, और 1 को बनाए रखने के लिए आसान थे के रूप में zebrafish मूल रूप से, संभावित जल प्रदूषण के खतरों के बारे में जानकारी हासिल करने के लिए पर्यावरण अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया गया. पिछले तीस वर्षों में, zebrafish कारणों की मेजबानी के लिए एक आनुवंशिक विनयशील हड्डीवाला मॉडल प्रणाली के रूप में मान्यता प्राप्त हो गया है. Zebrafish स्तनधारियों 2,3 सहित उच्च रीढ़ के साथ शारीरिक और शारीरिक संरक्षण के एक उच्च स्तर दिखा. हाल के जीनोम अनुक्रम टिप्पणी मानव जीन का लगभग 70% कम से कम एक zebrafish समकक्ष 4 है कि पता चला है. उदाहरण के लिए, गुर्दे विकास के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि कई orthologous जीन इन प्रजातियों 5-7 के बीच पहचान की गई है. इस नाटकीयसेलुलर और आणविक जीव विज्ञान के संबंध के साथ संरक्षण के राजनयिक डिग्री zebrafish 8 में मानव रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए मॉडल बनाने के लिए शोधकर्ताओं के लिए सक्षम है, और zebrafish रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन 9 का उपयोग संभावित दवा उपचार की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गए हैं.

इसके अलावा, zebrafish मॉडल न केवल जटिल विकास की प्रक्रिया और मानव में देखा जाता है कि रोग राज्यों की एक किस्म पुनरावृत्ति, लेकिन कई अतिरिक्त विशेषताओं भी embryological के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में जीव अपनी अपील बढ़ाने के लिए सक्षम है. Zebrafish अंडप्रसू हैं और निषेचन 10 के शुरू होने से भ्रूण के लिए आसान पहुँच के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है जो प्रसारण spawning, के माध्यम से पुन: पेश. अन्य लाभ भ्रूण आकार, पारदर्शिता, और तेजी से, बाह्य विकास 10 में शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, zebrafish वयस्कों उच्च उपजाऊपन के अधिकारी और आम तौर पर 200-500 के बीच लेकर कर सकते हैं कि अपेक्षाकृत बड़े क्लच आकार का उत्पादनप्रति सप्ताह, अंततः आसानी 9 के साथ इस तरह के phenotype आधारित रासायनिक स्क्रीन के रूप में उच्च throughput प्रयोगों, प्रदर्शन करने के लिए शोधकर्ताओं को सक्षम.

फिर भी, zebrafish मॉडल के आधार पर प्रदर्शित कर रहे हैं कि फायदे की अधिकता के बावजूद, विश्लेषण और जल्दी विकास के चरणों से प्राप्त प्रयोगात्मक परिणामों के संचार से संबंधित चुनौतियों का सामना कर रहे हैं. कुछ मामलों में, zebrafish भ्रूण के निहित शारीरिक रचना एक के डेटा के दृश्य अस्पष्ट सकता है. विकास 11 प्रगति के रूप में निषेचन के बाद, प्रारंभिक सेल कई दरार घटनाओं आए. Gastrulation के बाद भ्रूण अक्ष यह जर्दी 11 के आसपास लिपटे है कि इस तरह के tailbud चरण (10 HPF) पर उभर रहे हैं. बाद के विकास के विभाजन की अवधि के माध्यम से प्रगति, ट्रंक जन में आगे बढ़ने और भी अक्षीय बढ़ाव से लंबा होगा जर्दी के एक हिस्से के साथ एक पूंछ ही थैली केंद्रीय जर्दी जन से बाहर का विस्तार है कि इस तरह के11. Tailbud और 20 विखंड चरण (19 HPF) के बीच, इस तरह की इच्छा के रूप में विभिन्न धुंधला प्रोटोकॉल, के उपयोग के बाद विशिष्ट विकासात्मक सुविधाओं का निरीक्षण करने के लिए प्रयास करता है, दोनों की वजह से भ्रूण और अस्पष्टता की ज्यामिति को कल्पना और तस्वीर के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है जर्दी थैली. इन चुनौतियों को खत्म करने के लिए एक तरह की जर्दी को हटाने और फिर एक और अधिक सरल तरीके से विश्लेषण किया जा सकता है कि एक दो आयामी नमूना में भ्रूण समतल करने के लिए है.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल और वीडियो संसाधनों सफलतापूर्वक deyolk और फ्लैट एक या दो रंग इच्छा धुंधला के उदाहरण का उपयोग, निर्धारण और धुंधला निम्नलिखित एक भ्रूण माउंट करने के लिए एक गाइड प्रदान करते हैं. काश संरक्षित नमूनों में विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में सक्षम बनाता है और इस प्रकार के ऊतकों के भीतर पता लगाया जा जीन अभिव्यक्ति की साइट (ओं) के लिए अनुमति देता है एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक है. काश तकनीक बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है, और विभिन्न रंग substrates के रूप में अच्छी तरह से किया जा सकता है फ्लूorescent पता लगाने प्रणालियों 12-20. यहाँ हम विकास की tailbud और विभाजन चरणों के बीच zebrafish भ्रूण के लिए इस्तेमाल हमारे संशोधित इच्छा प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. नीचे प्रोटोकॉल के शुरू में के रूप में विख्यात वैकल्पिक इच्छा प्रोटोकॉल, हालांकि, यहां वर्णित फ्लैट माउंट प्रक्रिया के साथ संगत कर रहे हैं. इसके अलावा, फ्लैट बढ़ते इस तरह के प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं कर रहे हैं, जो पूरे माउंट immunohistochemistry, या सेल वंश ट्रैकिंग लेबल, के रूप में मौजूदा दृश्य तकनीकों के किसी भी संख्या के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जा सकता है. कुल मिलाकर, फ्लैट बढ़ते की तकनीक बेहतर zebrafish में भ्रूण के विकास के प्रारंभिक चरणों के साथ प्रयोगों से प्राप्त आंकड़ों के बेहतर विश्लेषण और प्रस्तुति सक्षम कर सकते हैं.

Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित zebrafish भ्रूण के साथ काम करने के लिए प्रक्रियाओं नोट्रे डेम विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. नोट: पार्ट्स 1-5 में वर्णित प्रक्रियाओं प्रतिनिधि परिणामों में यहाँ प्रदान भ्रूण छवियों को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया. वैकल्पिक इच्छा प्रक्रियाओं 12-16 या ऐसे विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग विशिष्ट प्रोटीन के लिए immunohistochemical लेबलिंग के रूप में अन्य दृश्य तकनीकों के साथ वांछित के रूप में भाग 1-5 में वर्णित प्रक्रियाओं प्रतिस्थापित किया जा सकता है. पार्ट्स 1-5 में वर्णित प्रोटोकॉल, प्रारंभिक भ्रूण निर्धारण और अंतिम धुंधला निर्धारण कदम के साथ इच्छा zebrafish भ्रूण पर फ्लैट mounts प्रदर्शन में फ्लैट बढ़ते के लिए नमूना से जर्दी कणिकाओं को दूर करने की क्षमता को प्रभावित करने वाले प्रमुख जोड़तोड़ कर रहे हैं. प्रारंभिक निर्धारण हौसले thawed बर्फ के ठंडे 4% paraformaldehyde (पीएफए) / 1x पीबीएस और के निर्धारण के साथ किया जाता है जब सबसे अच्छा फ्लैट बढ़ते परिणाम प्राप्त कर रहे हैंबर्फ के ठंडे 4% PFA/1x पीबीएस (हौसले thawed करने की आवश्यकता नहीं है), और यह भागों 6-8 के साथ संयोजन में वैकल्पिक धुंधला तरीकों प्रतिस्थापन जब पाठकों को इस पर विचार करने की सलाह दी है साथ अंतिम इच्छा धुंधला प्रतिक्रिया.

1. भ्रूण संग्रह, निर्धारण, और भंडारण

  1. वे रात भर एक विभक्त से अलग होती है, ताकि सिस्टम पानी की कोठरियों में वयस्क zebrafish पुरुष (एस) और महिला (ओं) रखकर संभोग पिंजरों तैयार करें.
  2. वयस्कों के बीच डिवाइडर निकालें और बराबर भ्रूण चरणों है कि चंगुल इकट्ठा करने के लिए संभोग के 15-30 मिनट ~ भीतर एक महीन तार की जाली चाय का झरनी का उपयोग निषेचित अंडे इकट्ठा.
  3. उल्टा झरनी मुड़ें और E3 समाधान के लगभग 25 मिलीलीटर युक्त ऊष्मायन बर्तन में भ्रूण स्थानांतरण करने के लिए एक धार बोतल से तिरस्कृत E3 का जुर्माना धारा के साथ सतह कुल्ला.
  4. चंगुल इकट्ठा करने के बाद, लगभग 50-60 भ्रूण incubated हैं कि इस तरह के कई व्यंजन में उन्हें विभाजितE3 समाधान की 25 मिलीलीटर की प्रत्येक थाली में. नोट: भ्रूण के भीड़भाड़ क्लच और देखभाल वांछित मंच (ओं) की समय पर वसूली को सक्षम करने के लिए इस से बचने के लिए लिया जाना चाहिए के भीतर नाटकीय विकास asynchrony हो सकती है.
  5. Zebrafish मानक मंचन 11 श्रृंखला के अनुसार विकास मूल्यांकन सक्षम करने के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण सेते हैं.
  6. धीरे एक फ्लैट नीचे microcentrifuge ट्यूब में, 20 विखंड चरण (19 HPF) तक, चयनित timepoint में भ्रूण की वांछित संख्या स्थान के लिए एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करें. नोट: वे कमजोर हैं और आसानी से हस्तांतरण pipettes से कुचल या आक्रामक निपटने द्वारा क्षतिग्रस्त किया जा सकता है, के रूप में युवा भ्रूण की हैंडलिंग में ख्याल रखना. वैकल्पिक रूप से, कांच की शीशियों भ्रूण का निर्धारण और प्रसंस्करण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बाद के सभी प्रोटोकॉल washes के लिए प्लास्टिक हस्तांतरण pipettes (3.11, 3.14 कदम) riboprobe अलावा और हटाने के अपवाद के साथ उपयोग किया जा सकता है.
  7. बर्फ के ठंडे 4% PFA/1x पीबीएस के साथ E3 बदलें, औरकमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर 4 घंटे के लिए 4% PFA/1x पीबीएस में उनके chorions में भ्रूण को ठीक. सतर्कता का नोट: पीएफए ​​विषैला होता है और दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट सहित उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, जबकि पहने पीएफए ​​समाधान एक रासायनिक हुड पर नियंत्रित किया जाना चाहिए. शेयर समाधान करते समय भी दानेदार पीएफए ​​स्थिर प्रभारी के माध्यम से फैलाने के लिए करते हैं सकता है के रूप में इसके अलावा, पीएफए ​​पाउडर, असाधारण देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए. आमतौर पर पीएफए ​​पीएफए ​​पाउडर भंग करने के लिए एक फोड़ा करने के लिए 1x पीबीएस हीटिंग द्वारा तैयार किया जाता है, और फिर समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में संग्रहीत किया जाता है समाधान ठंडा है एक बार ठीक अवसादों 4% PFA/1x पीबीएस में मौजूद हैं, तो फिल्टर एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर प्रणाली के माध्यम से इसे पारित करके फ्रीज भंडारण के लिए aliquoting पहले ठंडा समाधान बाँझ. केवल हौसले से तैयार या हौसले thawed पीएफए ​​भ्रूण के इस प्रारंभिक (यानी प्राथमिक) निर्धारण के लिए प्रयोग किया जाता है.
  8. तय निकालें और में स्थानांतरित तो, 1x PBST के साथ दो बार भ्रूण धोनेएक ऊष्मायन पकवान.
  9. एक stereomicroscope के तहत भ्रूण देखें और दूसरी जोड़ी खुला जरायु फाड़ करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि एक जोड़ी धीरे भ्रूण का लाभ उठाने के लिए किया जाता है कि इस तरह के भ्रूण के आसपास के chorions, दूर करने के लिए ठीक संदंश के दो जोड़े का उपयोग करें.

2. भ्रूण Permeablization

  1. वापस microcentrifuge ट्यूब या कांच की शीशी में dechorionated भ्रूण स्थानांतरण, तो किसी भी शेष जरायु मलबा हटाने के लिए 1x PBST के साथ दो बार कुल्ला.
  2. 1x PBST निकालें और 100% मेथनॉल (MeOH) के साथ दो बार भ्रूण धो लो.
  3. कम से कम 20 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण रखें. नोट: भ्रूण एक साल या उससे अधिक के लिए MeOH में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है. मेथनॉल chorions हटा दिया गया है जब तक कि इसलिए इस कदम के लिए आगे बढ़ना नहीं है, chorions चिपचिपा बना देता है.
  4. 100% MeOH हटाने के द्वारा भ्रूण rehydrate और 1x PBST के साथ दो बार तो, 50% MeOH/1x PBST, 30% MeOH/1x PBST में 5 मिनट प्रत्येक के लिए कमरे के तापमान पर उन्हें धोने. </ ली>
  5. 1x PBST की 50 मिलीलीटर हौसले thawed proteinase कश्मीर स्टॉक (10 मिलीग्राम / एमएल) की 25 μl जोड़कर एक ताजा proteinase कश्मीर काम कर समाधान (5 ग्राम / एमएल) तैयार करें.
  6. भ्रूण से 1x PBST निकालें, तो भ्रूण अवस्था पर आधारित proteinase कश्मीर के साथ काम कर समाधान की जगह और सेते हैं: <= 1 मिनट के लिए 5 somites; 10-12 1.5 मिनट के लिए somites; 2 मिनट, और 3 मिनट के लिए 20 somites के लिए 15 somites.
  7. Proteinase कश्मीर में काम कर समाधान निकालें और 1x PBST के साथ दो बार भ्रूण धो लो.
  8. 1x PBST निकालें और कमरे के तापमान पर कम से कम 20 मिनट के लिए बर्फ के ठंडे 4% PFA/1x पीबीएस के साथ बदलें.

3. Riboprobe संश्लेषण, Prehybridization, संकरण, और जांच निकालना

  1. बर्फ पर एंजाइमों रखते हुए पीसीआर की 100-200 एनजी या तो (ब्याज की जीन को इसी अनुक्रम युक्त डीएनए टेम्पलेट के संयोजन से, एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में कमरे के तापमान पर antisense riboprobe में इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया इकट्ठाdigoxygenin या fluorescein लेबल ribonucleotides, उचित शाही सेना पोलीमरेज़ जो अनुक्रम पर निर्भर करता है (SP6, T3, T7 के 2 μl के उत्पाद या linearized डीएनए प्लाज्मिड के 1.5 ग्राम, वर्णित 12,13 के रूप में तैयार), 2 μl पीसीआर उत्पाद या में शामिल किया है ) डीएनए प्लाज्मिड पर मौजूद है, 10x प्रतिलेखन बफर के 2 μl, RNase अवरोध करनेवाला के 0.5 μl, और आणविक ग्रेड आसुत जल के साथ 20 उल की कुल मात्रा को लाने (DNase, मुक्त RNase). नोट: 10x प्रतिलेखन बफर 10-20 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस waterbath में ट्यूब डाल द्वारा prewarmed, और सभी घटकों समाधान में हैं यह सुनिश्चित करने के लिए बाद में vortexed किया जाना चाहिए. सफेद गुच्छे मौजूद हैं, तो फिर एक और 5-10 मिनट और भंवर के लिए ट्यूब सेते हैं. प्रतिलेखन बफर पूरी तरह से भंग है और अच्छी तरह से मिश्रित नहीं है अगर ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं गरीब पैदावार असफल हो या हो सकता है.
  2. घटकों का मिश्रण और एक waterbath में 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक प्रतिक्रिया सेते हैं.
  3. प्रतिक्रिया तू निकालेंwaterbath से (ओं) हो, और 50 μl के लिए कुल मात्रा लाने के लिए मैं बफर 10x DNase, मैं एंजाइम DNase के 2 μl के 5 μl, और आणविक ग्रेड आसुत जल का 23 μl जोड़कर प्रत्येक नमूने में डीएनए टेम्पलेट नष्ट, और फिर एक waterbath में 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक ट्यूब सेते हैं.
  4. बाद के चरणों में शाही सेना गोली दृश्य की सुविधा के लिए ग्लाइकोजन शेयर की 1 μl द्वारा पीछा किया, 3 एम सोडियम एसीटेट, 5.2 पीएच और बर्फ के ठंडे 100% इथेनॉल के 110 μl के 5 μl जोड़ने, और फिर सेते द्वारा प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब में एक इथेनॉल वर्षा प्रदर्शन करना कम से कम 1 घंटा या रात भर के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब.
  5. अपकेंद्रित्र अधिकतम गति 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब, तो 100% इथेनॉल सतह पर तैरनेवाला निकालें और 70% बर्फ ठंड इथेनॉल के 100 μl के साथ बदलें.
  6. अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब, तो 5 मिनट के लिए गोली सूखी 70% इथेनॉल सतह पर तैरनेवाला और हवा निकालने, तो अंत में मो के 100 μl जोड़नेlecular ग्रेड गोली resuspend और एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग riboprobe शेयर एकाग्रता यों तो पानी आसुत. नोट: गोली समाधान में चला गया है एक बार, riboprobe शेयर बर्फ पर रखा और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए.
  7. Prehybridization प्रक्रिया के लिए तय भ्रूण तैयार करने के लिए, प्रत्येक नमूने से 4% PFA/1x पीबीएस हटाने और 1x PBST के साथ दो बार भ्रूण धो लो.
  8. प्रत्येक एकल फ्लैट नीचे microcentrifuge ट्यूब में 1x PBST में 25-40 भ्रूण के बीच स्थानांतरण. नोट: भ्रूण के भीड़भाड़ बाद में असमान धुंधला करने का नेतृत्व करेंगे, और देखभाल के लगभग 40 भ्रूण को प्रत्येक ट्यूब में नमूने का आकार सीमित करने के लिए लिया जाना चाहिए.
  9. HYB + का 500-1,000 μl के साथ प्रत्येक ट्यूब में 1x PBST बदलें.
  10. 70 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक ओवन में भ्रूण की ट्यूब (ओं) प्लेस, और prehybridization प्रदर्शन करने के लिए 4 घंटे के लिए इस तापमान पर उन्हें सेते हैं.
  11. Riboprobe (digoxygenin और / या fluoresc की 100-500 एनजी जोड़कर riboprobe / HYB + समाधान तैयारताजा HYB + के 500 μl के लिए) Ein लेबल और फिर यह prewarm को 3.11 चरण से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इस समाधान सेते हैं. नोट: एकल और / या डबल वर्णमिति लेबलिंग, इन जीनों को इसी riboprobes में से हर एक riboprobe / HYB + कॉकटेल में संयुक्त होने की जरूरत का उपयोग, एकाधिक जीन टेप का पता लगाने.
  12. भ्रूण की प्रत्येक ट्यूब से + prehybridization HYB निकालें और पर्याप्त riboprobe / HYB के साथ की जगह + भ्रूण को कवर करने के लिए. नोट: सामान्यतया, riboprobe / HYB + के 200-250 μl एक फ्लैट नीचे microcentrifuge ट्यूब में भ्रूण को कवर करने के लिए आवश्यक है. Riboprobe / HYB + अलावा और हटाने आमतौर पर नमूनों के बीच पार संक्रमण को रोकने के लिए एक विंदुक और बाधा सुझावों का उपयोग किया जाता है.
  13. रात भर ribroprobe / HYB + के साथ 70 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण सेते हैं.
  14. 70 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात धो समाधान और पूर्व उन्हें गर्म के निम्नलिखित सेट तैयार: 50 SSCT, 2x SSCT formamide/2x%, और 0.2x SSCT. नोट: यह 50 मिलीलीटर अल तैयार करने के लिए सुविधाजनक हैअतिरिक्त कमरे के तापमान पर संग्रहित किया और बाद में भविष्य में उपयोग के लिए reheated किया जा सकता है क्योंकि प्रत्येक का iquots, समाधान धो लो.
  15. -20 डिग्री सेल्सियस पर riboprobe / HYB + एक विंदुक और बाधा सुझावों और दुकान का उपयोग कर निकालें नोट: आमतौर पर प्रत्येक riboprobe / HYB + मिश्रण संकेत की कमी के बिना कई बार (जैसे, 3 या अधिक) का उपयोग किया जा सकता है. Reused riboprobe / HYB + कम पृष्ठभूमि के साथ जुड़ा हुआ है, हालांकि, riboprobe मिश्रण गिरावट के अधीन किया जा सकता है reused कि मन में रखो.
  16. 70 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 50% formamide/2x SSCT साथ दो बार भ्रूण धो लें
  17. 70 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 2x SSCT साथ एक बार भ्रूण धो लें
  18. 70 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 0.2x SSCT साथ दो बार भ्रूण धो लें
  19. 0.2x SSCT निकालें और कमरे के तापमान पर MABT साथ दो बार भ्रूण धो लो.

4. विरोधी digoxygenin एंटीबॉडी ऊष्मायन और जांच

  1. ताजा ब्लॉक समाधान तैयार करें.
  2. MABT निकालें और ब्लॉक समाधान के साथ की जगहtion.
  3. कमरे के तापमान पर 2-4 घंटे के लिए ब्लॉक समाधान में भ्रूण सेते हैं. नोट: अब ब्लॉक incubations युवा zebrafish भ्रूण चरणों (<15 somites) के साथ इष्टतम परिणाम प्रदान करते हैं. रातोंरात (~ 8 घंटा तक) बाद में एक 4 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन, लंबा ब्लॉक प्रक्रिया कर कमरे के तापमान या कमरे के तापमान का एक संयोजन में 8-12 घंटे के लिए ब्लॉक ऊष्मायन प्रदर्शन प्लस के लिए.
  4. ताजा ब्लॉक समाधान (जैसे, ब्लॉक के 5 मिलीलीटर प्रति 1 μl) में 5,000 गुना कमजोर पड़ने बनाकर विरोधी digoxygenin एंटीबॉडी समाधान तैयार है.
  5. ब्लॉक निकालें और एंटीबॉडी / ब्लॉक समाधान जोड़ने.
  6. पन्नी में नमूना कवर और 4 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए रातोंरात सेते हैं.
  7. Anti-digoxygenin/block निकालें और MABT साथ भ्रूण कम से कम 10 बार धो लो. नोट: MABT washes के लिए 12 अच्छी तरह से बर्तन को भ्रूण स्थानांतरण. यह बड़ा नमूना मात्रा प्रसंस्करण जो उपयोगी है जब भ्रूण धोया जा सकता है जिस गति से, बढ़ जाती है, एकएन डी यह आसान एक stereomicroscope के तहत धुंधला प्रतिक्रिया (4.11 चरण) की प्रगति की निगरानी करने के लिए बनाता है. नोट: इस चरण भ्रूण में दौरान लंबा निगरानी की आवश्यकता है कि उच्च पृष्ठभूमि या दाग दे देते हैं कि जांच के लिए एक उपयोगी उपचार है, जो 4.8 चरण के लिए आगे बढ़ने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर MABT में उन्हें रातोंरात incubating द्वारा 'सुपर धोया' किया जा सकता है दिन काम करते हैं.
  8. पूर्व धुंधला बफर और वांछित धुंधला समाधान (बैंगनी या लाल सब्सट्रेट) तैयार करें.
  9. MABT निकालें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पूर्व धुंधला बफर में भ्रूण धो लो.
  10. पूर्व धुंधला बफर निकालें और धुंधला समाधान जोड़ने.
  11. एक stereomicroscope के तहत भ्रूण की उपस्थिति की जाँच करके हर 15-30 मिनट पर कमरे के तापमान धुंधला प्रतिक्रिया की प्रगति की निगरानी. नोट: धुंधला प्रतिक्रिया की दर में यह दाग के पूरा होने के लिए अधिक समय देने के लिए आवश्यक है, तो 4 डिग्री सेल्सियस के लिए नमूने के हस्तांतरण से धीमा किया जा सकता है. एक बार 4 को ठंडाडिग्री सेल्सियस, हालांकि, प्रतिक्रिया कमरे के तापमान को वार्मिंग द्वारा त्वरित किया जा सकता.
  12. धुंधला प्रतिक्रिया के पूरा होने पर, धुंधला समाधान निकालने और 1x PBST के साथ बदलें.
  13. 5 मिनट के लिए 1x PBST के साथ दो बार धोएं. नोट: एक और सब्सट्रेट के साथ अन्य जीन का पता लगाने यदि नहीं, तो कम से कम 20 मिनट के लिए बर्फ के ठंडे 4% PFA/1x पीबीएस में नमूने ठीक है, और 6.1 कदम आगे बढ़ना. वरना 5.1 कदम आगे बढ़ना.

5. विरोधी fluorescein एंटीबॉडी ऊष्मायन और जांच

  1. 1x PBST निकालें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट प्रत्येक के लिए 0.1 एम ग्लाइसिन, पीएच 2.2 से दो बार भ्रूण धो लो. नोट: ग्लाइसिन washes के लिए समय पूरी तरह से पहले धुंधला प्रतिक्रिया को निष्क्रिय करने के लिए आवश्यक है.
  2. 0.1 एम ग्लाइसिन निकालें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए MABT साथ दो बार भ्रूण धो लो.
  3. ताजा ब्लॉक समाधान (जैसे, ब्लॉक के 5 मिलीलीटर प्रति 1 μl) में 5,000 गुना कमजोर पड़ने बनाकर विरोधी fluorescein एंटीबॉडी समाधान तैयार है.
  4. MABT निकालें और एंटीबॉडी / ब्लॉक समाधान जोड़ने. पालन ​​fluorescein लेबल ribroprobe का पता लगाने के प्रदर्शन करने के लिए 4.6-4.13 कदम. नोट: अंतिम धुंधला प्रतिक्रिया पूरा हो गया है, यह नमूना के अंतिम निर्धारण बर्फ के ठंडे 4% PFA/1X पीबीएस में किया जाता है कि आवश्यक है. गर्म पीएफए ​​समाधान के साथ फिक्सेशन फ्लैट माउंट प्रक्रिया के लिए विच्छेदन और deyolking दौरान भ्रूण से हटाना मुश्किल है कि चिपचिपा जर्दी के साथ जुड़ा हो जाता है.

6. भ्रूण विच्छेदन और भ्रूण के प्रारंभिक Deyolking

  1. फ्लैट बढ़ते के लिए एक तय, दाग भ्रूण का चयन करें.
  2. 1x PBST युक्त एक प्लास्टिक या कांच पेट्री डिश में चयनित भ्रूण नमूना स्थान के लिए एक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करें.
  3. एक stereomicroscope के तहत पकवान, जगह और एक पार्श्व दृश्य प्राप्त की है और सिर और पूंछ समाप्त होता है कल्पना की जाती है, ताकि ठीक संदंश या चाबुक उपकरण की एक जोड़ी का उपयोग भ्रूण रोल.
  4. वें में एक चीरा बनाने के लिए ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करेंजर्दी चीरा के लिए लाभ उठाने प्रदान करने के लिए इतनी के रूप में इस बीच ई सिर और भ्रूण की पूंछ के बीच केन्द्र स्थित एक स्थान पर जर्दी, और भ्रूण पकड़ ठीक संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करें. नोट: वैकल्पिक रूप से, जर्दी में दो प्रमुख चीरों, एक सिर के करीब है और भ्रूण की पूंछ के लिए अन्य करीबी बनाते हैं.
  5. जर्दी सेल गुहा से जर्दी बाहर निकालना ठीक संदंश और / या एक चाबुक उपकरण का उपयोग करें.
  6. आवारा जर्दी को हटाने के लिए 1x PBST के साथ धीरे भ्रूण कुल्ला.

भ्रूण के 7. ललित Deyolking

  1. 1x PBST की 1-2 बूंदों के साथ एक फ्लैट गिलास स्लाइड पर भ्रूण स्थानांतरण.
  2. धीरे उदर (जर्दी) की ओर कांच स्लाइड पर ऊपर का सामना करना पड़ के साथ भ्रूण की स्थिति के लिए एक चाबुक उपकरण और ठीक संदंश का प्रयोग करें.
  3. भ्रूण गिलास स्लाइड के खिलाफ एक फ्लैट की स्थिति में रहता है कि इतने जोर से मारना उपकरण का उपयोग 1x PBST समाधान के किनारे करने के लिए भ्रूण खींचें.
  4. धीरे जोर से मारना का उपयोग भ्रूण के उदर सतह परिमार्जनभ्रूण तेजस्वी बिना जर्दी कणिकाओं को दूर करने के क्रम में राजभाषा. इसके साथ ही चाबुक उपकरण के साथ scraping जबकि भ्रूण लंगर के लिए ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें. नोट: जर्दी कणिकाओं का हटाया 5-10 मिनट के लिए दोहराए scraping आवश्यकता कर सकते हैं.
  5. PBST समाधान अतिरिक्त जर्दी से बरबाद हो जाता है या लुप्त हो जाना शुरू होता है, तो एक प्लास्टिक या कांच हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर स्लाइड पर 1x PBST के 1-2 ताजा बूँदें जोड़ने, और फिर आगे की जर्दी दाना के लिए स्वच्छ समाधान के साथ क्षेत्र के लिए भ्रूण खींचें हटाने.
  6. जर्दी संतोषजनक ढंग से निकाल दिया गया है, धीरे आवारा जर्दी कणिकाओं को दूर करने के क्रम में एक अंतिम कुल्ला के लिए 1x PBST युक्त एक प्लास्टिक या कांच पेट्री डिश में वापस भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करें.
  7. 100% ग्लिसरॉल युक्त एक प्लास्टिक या कांच पेट्री डिश में एक प्लास्टिक या कांच हस्तांतरण पिपेट का उपयोग deyolked भ्रूण स्थानांतरण.
  8. भ्रूण acclimate करने के लिए ~ 5 मिनट के लिए 100% ग्लिसरॉल में भ्रूण सेते हैं.

8. एक गिलास स्लाइड पर बढ़ते

  1. 100% ग्लिसरॉल की 1-2 बूंदों में एक साफ ग्लास स्लाइड पर deyolked भ्रूण स्थानांतरण.
  2. उदर (जर्दी) की ओर कांच स्लाइड का सामना करना पड़ के साथ भ्रूण रखें.
  3. भ्रूण गिलास स्लाइड के खिलाफ एक फ्लैट की स्थिति में रहता है, ताकि एक चाबुक उपकरण का उपयोग, ग्लिसरॉल बूंद के किनारे करने के लिए भ्रूण खींचें. भ्रूण अक्ष घुमावदार है, तो भ्रूण एक सीधे अक्ष के साथ स्लाइड पर फ्लैट तैनात किया जा सकता है, ताकि ठीक संदंश धीरे तनाव को दूर करने के लिए शेष जर्दी कोशिका झिल्ली में बहुत छोटे चीरों बनाने के लिए उपयोग करें.
  4. एक 18 x 18 मिमी कांच coverslip के चार कोनों पर क्ले मॉडलिंग के छोटे divots रखें. नोट: एक विकल्प के रूप में, वैक्यूम तेल 15 की छोटी बूंदों क्ले मॉडलिंग के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
  5. नमूना के आसपास ग्लिसरॉल में हवा के बुलबुले की पीढ़ी को कम करने के क्रम में coverslip angling, भ्रूण पर धीरे धीरे गिलास coverslip जगह.
  6. 100% ग्लिसरॉल के एक अतिरिक्त बूंद जोड़ेंकांच coverslip के पक्ष को coverslip और गिलास स्लाइड के बीच की जगह भरने के लिए.
  7. मजबूती से कांच के बीच भ्रूण की स्थिति और बहती खत्म करने के लिए coverslip के चार कोनों पर धीरे धीरे और सावधानी से नीचे दबाएँ. नोट: भ्रूण को कुचलने के लिए नहीं सावधान रहना होगा.
  8. वांछित के रूप में भ्रूण तैनात नहीं किया जाता है, coverslip हटाने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें. भ्रूण repositioned किया जा सकता है ताकि अतिरिक्त चीरों बनाने के लिए भ्रूण और / या ठीक संदंश का स्थान बदलने के लिए चाबुक उपकरण का उपयोग करें. दोहराएँ 8.4-8.7 कदम.
  9. एक स्टीरियो या यौगिक सूक्ष्मदर्शी का उपयोग नमूना निरीक्षण और / या छवि.
  10. स्टोर फ्लैट तैयार करने में कई सप्ताह या अस्थायी रूप से कमरे के तापमान पर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में एक गत्ता स्लाइड धारक के साथ फ्लैट माउंट. नोट: इच्छा दाग, समय के साथ उत्तरोत्तर विशेष रूप से लाल सब्सट्रेट प्रतिक्रियाओं फीका करना होगा, और अनिश्चित काल ग्लिसरॉल में संरक्षित नहीं किया जा सकता. ग्लिसरॉल में रखा अगर बैंगनी दाग ​​भी की तुलना में अधिक आसानी से फीकापीएफए ​​(8.11 कदम देखें). दिलचस्प है, बल्कि यह ग्लिसरॉल से Permount में बढ़ते भ्रूण कमरे के तापमान 15 पर अनिश्चितकालीन भंडारण सक्षम कर सकते हैं कि प्रकाशित किया गया है.
  11. बैंगनी सब्सट्रेट दाग नमूनों की लंबी अवधि के भंडारण के लिए, कांच coverslip हटाने और 1x PBST में दो बार rinsed भ्रूण कुल्ला, तो लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4% PFA/1x पीबीएस के साथ एक microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण. नोट: वैकल्पिक रूप से, 1x PBST में भ्रूण ऐसे जीनोटाइपिंग के लिए डीएनए अलगाव के रूप में अतिरिक्त विश्लेषण, के लिए कार्रवाई की जा सकती.

Representative Results

फ्लैट बढ़ते प्रोटोकॉल प्रक्रिया शरीर धुरी एक दो आयामी तैयारी (चित्रा 1 ए) में, एक केन्द्र स्थित जर्दी गेंद के चारों ओर लपेटा जाता है, जिसमें अपने सामान्य शरीर रचना विज्ञान, से zebrafish भ्रूण की परिवर्तन शामिल है. युवा zebrafish भ्रूण के पूरे माउंट इमेजिंग भ्रूण अक्ष जर्दी चारों ओर लिपटी है कैसे की प्रकृति द्वारा सीमित है. नतीजतन, पूरे के पार्श्व या पृष्ठीय दृश्य दाग भ्रूण नमूनों ही अक्ष या अस्पष्ट विशेष ऊतकों (चित्रा 1 बी) के एक हिस्से पर कब्जा कर सकते माउंट. तुलना करके, भ्रूण की deyolking और सपाट एक समय (चित्रा 1 बी) पर देखे जा करने के लिए पूरे भ्रूण अक्ष में सक्षम बनाता है. इन सीमाओं लेबल जो एक इच्छा दाग 13 के माध्यम से somites 7 के निकट स्थित गुर्दे progenitors के एक सबसेट जो अंक (बैंगनी) irx3b पता लगाने के लिए antisense riboprobes साथ चिह्नित किया गया है कि भ्रूण,, और myod1 (लाल) का परीक्षण करके प्रदर्शन कर रहे हैंsomites (चित्रा 1 बी). irx3b + गुर्दे progenitors के क्षेत्र irx3b टेप पार्श्व कैमरा कोण के साथ कल्पना करने के लिए गुर्दे क्षेत्र व्यावहारिक रूप से असंभव है, जिससे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में प्रचुर मात्रा में हैं क्योंकि पार्श्व दृश्य माउंट पूरे में छिप जाता है; क्षेत्र की जर्दी (चित्रा 1 बी) के चारों ओर लपेटा जाता है क्योंकि भ्रूण एक पृष्ठीय कैमरा देखने में घुमाया जा रहा है इसके अलावा, जब irx3b + गुर्दे progenitors के क्षेत्र केवल आंशिक रूप से दिखाई दे रहा है. हालांकि, फ्लैट बढ़ते निम्नलिखित एक ही भ्रूण के एक पृष्ठीय दृश्य irx3b + ट्रंक और अन्य भ्रूण संरचनाओं (चित्रा 1 बी) के साथ somites के संबंध में एक सरल फैशन में विश्लेषण किया जा गुर्दे progenitors के पूरे क्षेत्र में सक्षम बनाता है. इस प्रकार, विस्तृत स्थानिक डोमेन आदर्श रूप में इस विधि के साथ प्रलेखित किया जा सकता है.

कई प्रमुख कदम फ्लैट माउंट प्रक्रिया के सफल क्रियान्वयन में शामिल रहे हैं. इस तकनीकों को करने के लिएई, जर्दी गेंद पहले भ्रूण एक stereomicroscope का उपयोग कल्पना है, जबकि इस तरह ठीक संदंश की एक जोड़ी के रूप में ठीक उपकरणों के साथ किया जा सकता है, जो उचित भ्रूण (2A चित्रा) से अलग किया जाना चाहिए. जर्दी गेंद के कच्चे तेल निकालने के बाद, एक ठीक चाबुक उपकरण भ्रूण (चित्रा 2B) से जुड़ी बनी है कि जर्दी कणिकाओं दूर परिमार्जन करने के लिए उपयोग किया जाता है. शेष जर्दी कणिकाओं को हटाने भ्रूण ऊतकों के दृश्य की सुविधा के लिए मदद करता है. अंत में, deyolked भ्रूण अवलोकन और एड्स इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर नमूने के प्रलेखन और माइक्रोस्कोप से जुड़ी एक कैमरा सक्षम बनाता है एक गिलास स्लाइड (चित्रा -2), पर stably स्थित करने के लिए चालाकी से किया जाता है. चाबुक उपकरण एक संभाल अगर वांछित (चित्रा 3, सामग्री तालिका) पर रखा जा सकता है जो superglue का उपयोग कर एक विंदुक टिप करने के लिए एक उपयुक्त चाबुक affixing द्वारा निर्माण किया जा सकता है कि घर का बना उपकरणों रहे हैं. विभिन्न चाबुक नमूनों का उत्पादन करने के लिए प्राप्त किया जा सकता हैलंबाई और प्रत्येक उपयोगकर्ता वे फ्लैट माउंट प्रक्रिया के साथ प्रयोग करने के लिए शुरू में एक बार के लिए अलग predilections हो सकता है जो घटना (चित्रा 3 बी), के मामले में थोड़ा अलग विशेषताओं के साथ उपकरण जोर से मारना. चाबुक नमूने के उदाहरण स्वाभाविक रूप से, मानव eyelashes बहाने स्वाभाविक रूप से पशु कडा बाल या मूंछ शेड, और अंत में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पलकों की कृत्रिम किस्मों खुदरा कॉस्मेटिक विभागों में पाया शामिल हैं.

आसपास के और एक गिलास स्लाइड (चित्रा -4 ए) पर तैनात नमूना (ओं) युक्त स्थानीय क्षेत्र उच्च संकल्प विश्लेषण के लिए imaged किया जा सकता है. जांच का एक संयोजन दो रंग इच्छा के साथ जल्दी विकास के चरणों में जंगली प्रकार भ्रूण में गुर्दे को जन्म दे कि विकासशील गुर्दे progenitors लेबल, और फिर फ्लैट की तैयारी के नमूने (चित्रा 4B, 4C देखने के लिए प्रदर्शन किया गया माउंट करने के लिए इस्तेमाल किया गया ). जल्दी विखंड चरण के दौरान, गुर्दे progenitors वें द्वारा एक यू के आकार का पैटर्न में सीमांकन कर रहे हैंसमन्वित रूप से डेल्टा सी (डीएलसी) (लाल) (बाएँ स्तंभ, चित्रा 4 बी) 6,7 व्यक्त करता है कि paraxial mesoderm आसपास (बैंगनी) pax2a टेप के EIR अभिव्यक्ति. डीएलसी टेप एक बैंगनी सब्सट्रेट के साथ पाया गया, और पश्चमस्तिष्क मार्कर krox20 (लाल) के साथ संयोजन में चिह्नित किया गया है, जब कि पहले उल्लेख के रूप में इसकी तुलना में, गुर्दे progenitors के एक व्याख्यान चबूतरे वाला उप डोमेन, डीएलसी (सही कॉलम, चित्रा 4 बी) को व्यक्त करता है कि कल्पना की गई थी 6,7. फ्लैट माउंट तैयारी बाद somitogenesis चरणों का अध्ययन करने के लिए इसी का इस्तेमाल किया जा सकता है. 14 विखंड स्तर पर, हम गुर्दे मार्कर pax2a, slc4a4, और somites (चित्रा 4C) जो निशान smyhc1 (लाल), के साथ (बैंगनी) slc12a3 की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया. खुलासा करते हुए ये संयोजन, pax2a साथ पूरे गुर्दे पूर्वज डोमेन की मैपिंग सक्षम है कि एक व्याख्यान चबूतरे वाला उपडोमेन expr में कोशिकाओं का एक सबसेटslc4a4a essed और slc12a3 व्यक्त की है कि गुर्दे progenitors के एक गैर अतिव्यापी दुम उपडोमेन द्वारा प्रतिष्ठित किया गया.

दो रंग चाहते हैं और फ्लैट माउंट तैयारी भी छोटे अणुओं 6,7 करने के लिए पर्यावरण जोखिम (चित्रा 5) से आनुवंशिक उत्परिवर्तन या अन्य perturbations साथ zebrafish में जीवोत्पत्ति के दौरान सेलुलर डोमेन के अध्ययन के लिए मूल्यवान हैं. zebrafish एनएलएस और उदारीकरण म्यूटेंट एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 1A2 retinoic एसिड (आर ए) के biosynthesis के लिए आवश्यक एक एंजाइम encodes जो (पूर्व raldh2 के रूप में जाना aldh1a2,), में उत्परिवर्तन बंदरगाह. आरए ग्लोमेर्युल्स 6,7 के रूप में जाना भ्रूण गुर्दे की रक्त फिल्टर, बनाने में योगदान देने वाले podocyte कोशिकाओं के निर्माण सहित कई वृक्क कोशिका प्रकार के समुचित विकास के लिए आवश्यक है. काश समन्वित रूप से टी के सीमांकन के साथ wt1a साथ podocyte progenitors लेबल करने के लिए प्रदर्शन किया थावह wildtype भ्रूण में krox20 साथ smyhc1 और पश्चमस्तिष्क साथ somites विकास, उत्परिवर्ती भ्रूण, उदारीकरण उत्परिवर्ती भ्रूण, और एक ALDH एंजाइम रासायनिक अवरोध करनेवाला, DEAB (चित्रा 5) के साथ इलाज भ्रूण एनएलएस. DEAB इलाज भ्रूण wt1a टेप की एक अभिनिषेध (चित्रा 5, सही स्तंभ) से पता चला है, जबकि कमी aldh1a2 अभिव्यक्ति के साथ भ्रूण, जंगली प्रकार भ्रूण की तुलना में कम wt1a अभिव्यक्ति दिखाया. साथ में ले ली, इन प्रतिनिधि परिणाम फ्लैट माउंट तकनीक का विश्लेषण और दस्तावेज जल्दी भ्रूण में परिशुद्धता के साथ संरचनात्मक मतभेदों, और इस तरह बहुमूल्य विकास अध्ययन के लिए लागू किया जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है.

चित्रा 1
फ्लैट माउंट prepa की चित्रा 1. अवलोकनzebrafish भ्रूण के लिए राशन. केंद्रीय जर्दी जन एक फ्लैट सतह पर हटा दिया है और भ्रूण stably तैनात है क्योंकि ए) फ्लैट बढ़ते की प्रक्रिया भ्रूण अक्ष के साथ ऊतकों के एक साथ देखने में सक्षम बनाता है. एक पूरे माउंट बी) छवियाँ पार्श्व और पृष्ठीय दृश्य में दाग भ्रूण चाहते हैं, और फिर एक फ्लैट माउंट तैयारी आयोजित किया गया था. भ्रूण irx3b (बैंगनी) और myod1 (लाल) एन्कोडिंग जीन टेप का पता लगाने के लिए antisense जांच के साथ सना हुआ था.

चित्रा 2
चित्रा 2. Zebrafish भ्रूण के लिए फ्लैट माउंट प्रक्रिया के योजनाबद्ध. ए) भ्रूण पहले निहायत जर्दी जन के बहुमत को दूर करने के deyolked है, तो (बी) के उदर सतह सूक्ष्मता शेष जर्दी कणिकाओं को दूर करने के deyolked, और हैभ्रूण धोने के बाद (सी) दृश्य विश्लेषण और / या फोटो इमेजिंग के लिए एक गिलास स्लाइड पर पृष्ठीय पक्ष रखा है.

चित्रा 3
चित्रा 3. उदाहरण चाबुक उपकरणों की फोटो ठीक संदंश की तुलना में. ए) घर का चाबुक औजार देखने के शीर्ष के साथ प्रदान की मिलीमीटर संदर्भ में, एक संदर्भ. बी) ठीक संदंश के बगल में चाबुक उपकरणों की आवर्धक अवलोकन प्रदान करने के लिए एक मीट्रिक शासक से सटे तैनात है, ठीक संदंश की एक मानक जोड़ी के साथ imaged थे . दो अलग चाबुक उपकरण से प्राप्त चाबुक चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया तारांकित (*) के साथ दिखाए जाते हैं, एक स्वाभाविक रूप से मानव बरौनी शेड, और डबल तारे (**) एक स्वाभाविक रूप से शेड बिल्ली के समान गलमुच्छा से प्राप्त करने के लिए छंटनी की गई थी कि एक चाबुक चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया एक हद तक कुंद अंत करना. प्रत्येक सीए मेंएसई, चाबुक पिपेट टिप के माध्यम से पिरोया और उत्तरोत्तर एक हैंडलिंग उपकरण के साथ संलग्न पिपेट को चाबुक एंकर / स्थिर करने के लिए एक मजबूत मुहर बनाने superglue की कई कोट के साथ चिपका था.

चित्रा 4
जंगली प्रकार zebrafish भ्रूण में गुर्दे पूर्वज क्षेत्र में विकासात्मक परिवर्तन के चित्रा 4. विशेषता. ए) (बी, सी). बी) जंगली प्रकार 1 पर भ्रूण, 3, और 5 विखंड मंच देता है कि गुर्दे पूर्वज क्षेत्र की संरचना का आकलन करने के लिए दो रंग इच्छा से दाग रहे थे में विश्लेषण के लिए imaged क्षेत्र का संकेत योजनाबद्ध स्लाइड भ्रूण गुर्दे, या pronephros को जन्म. (बैंगनी में दाग) प्रतिलेखन कारक pax2a एन्कोडिंग (बाएँ स्तंभ) देखिए गुर्दे पी सहित भ्रूण में कई आबादी, निशानमध्यवर्ती mesoderm से उभर कि rogenitor क्षेत्र. पायदान ligand डीएलसी एन्कोडिंग देखिए (लाल रंग में दाग) paraxial mesoderm से फार्म कि somites निशान. (बैंगनी में दाग) डीएलसी टेप की अभिव्यक्ति और पश्चमस्तिष्क rhombomere मार्कर krox20 (लाल रंग में दाग) एक ही भ्रूण में जांच कर रहे हैं जब (सही कॉलम), डीएलसी अभिव्यक्ति somites के निकट स्थित गुर्दे progenitors के एक व्याख्यान चबूतरे वाला उप डोमेन में देखा जा सकता है 14 विखंड चरण में pax2a. सी) जंगली प्रकार भ्रूण के साथ डीएलसी की सह धुंधला दौरान छिप गया था जो 1-5,) डबल या (बैंगनी एक गुर्दे मार्कर के संयोजन के साथ ट्रिपल दाग रहे थे, विखंड मार्कर smyhc1 (लाल) , और पश्चमस्तिष्क rhombomere मार्कर krox20 (भी लाल). इस स्तर पर (शीर्ष पैनल), pax2a टेप गुर्दे progenitors हदबंदी जारी है. (मध्य, कम पैनल) गुर्दे पूर्वज क्षेत्र के भीतर, एक व्याख्यान चबूतरे वाला उपडोमेन चिह्नित हैslc4a4 और slc12a3 सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि टेप से एक दुम उपडोमेन निशान.

चित्रा 5
(बैंगनी) wt1a के 15 विखंड चरण में चित्रा 5. आनुवंशिक उत्परिवर्तन या retinoic एसिड जैवसंश्लेषण मिलाना कि रासायनिक आनुवंशिक perturbations के कारण phenotypes विशेषताएँ फ्लैट घुड़सवार की तैयारी के प्रयोग. इच्छा की अभिव्यक्ति पैटर्न और smyhc1/krox20 (लाल) की तुलना में था retinoic एसिड (आर ए) के उत्पादन में कमी के साथ जंगली प्रकार और भ्रूण के बीच होने के कारण एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 1A2 (एनएलएस और उदारीकरण म्यूटेशन) या diethylaminobenzaldehyde (DEAB) के साथ retinaldehyde डिहाइड्रोजनेज गतिविधि का रासायनिक अवरोध में दोष के लिए. उदारीकरण में आरए उत्पादन की कमी इस तरह, एनएलएस की तुलना में थोड़ा अधिक गंभीर हैउदारीकरण भ्रूण जंगली प्रकार की DEAB उपचार wt1a अभिव्यक्ति की पूरी निराकरण के साथ जुड़ा हुआ है, जबकि इसी तरह, एनएलएस उत्परिवर्ती भ्रूण मंचन से wt1a टेप के थोड़ा कम धुंधला व्यक्त कि.

Discussion

Zebrafish हाल के वर्षों के दौरान अनुसंधान समुदाय भर में एक बहुत ही मूल्यवान मॉडल जीव साबित किया है. Zebrafish उच्च रीढ़ के साथ कि आनुवंशिक संरक्षण का एक बड़ा डिग्री दिखा रहे हैं, और उनके शरीर रचना विज्ञान, प्रजनन, और जीवन चक्र से संबंधित फायदे प्रयोगात्मक विश्लेषण करने के लिए इस प्रजाति बहुत उत्तरदायी बनाते हैं. इसके अलावा, zebrafish के लिए लागू आणविक तकनीक की उन्नति के आगे वैज्ञानिक अनुसंधान में इस मॉडल जीव के प्रयोग को बढ़ावा दिया है. उदाहरण के लिए, ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों की एक विशाल विविधता रोग प्रगति का अध्ययन करने और जीवोत्पत्ति सहित विकास की कुंजी तंत्र कायम करना है कि कई मौलिक सवालों के जवाब देने के लिए उत्पन्न किया गया है.

तदनुसार, रोग और विकास के अनुसंधान दोनों में zebrafish के गतिशील उपयोग पर आधारित, सेल लेबलिंग के तरीके और संकेत मात्रा का ठहराव डेटा का विश्लेषण का एक महत्वपूर्ण पहलू हैं. जबकि फ्लोरोसेंट एक है कि रोजगार के तरीकोंtibodies ट्रांसजेनिक zebrafish में प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, शोधकर्ताओं आम तौर पर एक निश्चित, गैर ट्रांसजेनिक zebrafish नमूने में जीन टेप के spatiotemporal स्थानीयकरण की जांच करना चाहते हैं 12-16 की तरह मानक प्रक्रियाओं पर भरोसा करते हैं. वास्तव में, काश जीव विज्ञान में 16 में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीकों में से एक है, और आनुवंशिक परिवर्तन और रासायनिक आनुवंशिक perturbations के phenotype विशेषताएँ इस्तेमाल एक महत्वपूर्ण उपकरण है. फिर भी, काश संभावित नुकसान और चुनौतियों का एक संख्या के साथ जुड़ा हुआ है. Antisense ribroprobe की विशिष्टता की पुष्टि, भावना riboprobes antisense riboprobe धुंधला पैटर्न की विशिष्टता का आकलन करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्गों 4 और 5 लेबलिंग और fluorescein लेबल जांच के बाद digoxygenin लेबल जांच का पता लगाने के क्रम में प्रस्तुत कर रहे हैं, यह क्रम उलट हो सकता है. आमतौर पर, कमजोर संकेतों (कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ जीन) अच्छी digoxygenin लेबल जांच और इस दाग से पता चला रहे हैंपता लगाने और लाल सब्सट्रेट का उपयोग मजबूत संकेत (अधिक बहुतायत व्यक्त जीन) के धुंधला के बाद बैंगनी सब्सट्रेट, के साथ पहली बार विकसित की है. दो रंग प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन होने जा रहे हैं हालांकि, अगर यह लेबल और substrates के विभिन्न संयोजनों डेटा संग्रह और विश्लेषण के लिए सबसे उपयुक्त है कि प्रक्रिया को खोजने के लिए जांच की जाती है कि सिफारिश की है. इसके अलावा, कई बार, 4-5 24 घंटे के बाद निषेचन की तुलना में छोटी भ्रूण के लिए सिलवाया रहे वर्गों में प्रदान की एंटीबॉडी ऊष्मायन और धोने रोकने के लिए प्रदान की जाती; पुराने भ्रूण के साथ ही इन कदमों का लंबा अंतराल नमूना पर नमक संचय के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. मानक zebrafish भ्रूण इच्छा समस्या निवारण के लिए व्यापक सुझावों पहले से ही साहित्य 12-16 में दर्ज किया गया है. यकीनन सबसे आम दुविधा उच्च पृष्ठभूमि है. हम अगर जरूरत रातोंरात MABT 'सुपर धोने' के अलावा हमारे अनुभव में, हालांकि, चरण 4.7 15-20 washes में MABT washes की संख्या बढ़ाने की सिफारिश4.8 चरण के लिए आगे बढ़ने से पहले 10 या अधिक कम MABT washes के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जब उत्कृष्ट परिणाम देता है. एक अन्य उदाहरण दुविधा लंबा riboprobes साथ हो सकता है जो गरीब जांच घुसपैठ है. क्षारीय hydrolysis के माध्यम से 3.6 कदम निम्नलिखित riboprobe कर्तन इस प्रतिक्रिया कर सकते हैं. युवा नमूनों के साथ हमारे अनुभव में, जांच के बाल काटना आम तौर पर आवश्यक नहीं है. हालांकि, एक यह एक इच्छा प्रयोग के परिणाम में कारकों योगदान किया जा सकता है जैसे मानकों कि ध्यान में रखना चाहिए, और हम जरूरत के रूप में अपने खुद में इच्छा के लिए प्रयोगात्मक मापदंडों को परिष्कृत करने के लिए समुदाय में पहले से ही सार्वजनिक रूप से उपलब्ध इन उपयोगी समस्या निवारण निर्देश की परीक्षा का सुझाव शोध 12.

पारंपरिक इच्छा तकनीक 12-16 के अलावा, काश के तरीके और तैयार किया गया है कि वैकल्पिक प्रोटोकॉल के क्षेत्र में प्रगति की एक निरंतर उद्भव हुआ है. ये ऐसे fluores के उपयोग के माध्यम के रूप में संकेत का पता लगाने के नए तरीके, शामिलcence 17-19, microRNAs 20 का स्थानीयकरण कि सक्षम तरीकों के लिए. दाग (एस) आसानी से एक वांछित समय बिंदु पर ब्याज का नमूना भीतर देखे जा नहीं सकते हैं फिर भी, वर्तमान सेल लेबलिंग तरीकों के लिए बनाया गया है कि कई सुधार के बावजूद, इन प्रक्रियाओं के प्रभाव को नकार रहे हैं. इस सीमा संभवतः इन बार में उठता है कि विभिन्न विकास की प्रक्रिया के बारे में हमारी समझ में अंतराल को ले जा सकता है, जो यह zebrafish व्यक्तिवृत्त की जल्दी भ्रूण चरणों से संबंधित है, खासकर जब शोधकर्ताओं के लिए समस्याग्रस्त है. सामान्य zebrafish विकास के दौरान, जर्दी थैली उत्तरोत्तर भ्रूण उम्र 11 के रूप में आकार में कमी होगी. भ्रूण उसके आसपास की जर्दी थैली की तुलना में बड़ा है इसलिए, क्योंकि इन बाद में विकास के चरणों (> 24 घंटे के बाद निषेचन) में, काश धुंधला का विश्लेषण करने के लिए काफी सरल है. बहरहाल, यह (प्रारंभिक somitogenesis पूंछ कली मंच से मामला नहीं है जब भ्रूणअपारदर्शी जर्दी थैली कभी कभी दाग ​​के दृश्य अस्पष्ट कर सकते हैं, जहां बड़े पैमाने पर) की जर्दी के आसपास तैनात है. नतीजतन, फ्लैट बढ़ते की विधि (चित्रा 1 और चित्रा 2 में schematized) जल्दी zebrafish भ्रूण नमूने के लक्षण वर्णन के साथ जुड़े इमेजिंग और डेटा विश्लेषण की समस्याओं को दूर करने में मदद करने के लिए तैयार किया गया था, और मोटे तौर पर अलग आनुवंशिक परिवर्तन के व्यवस्थित phenotyping के बाद से इस्तेमाल किया गया है पहली बार बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन 21 से.

फ्लैट बढ़ते तकनीक के आगमन के बाद से, जल्दी विकास के चरणों का विश्लेषण काफी बढ़ाया गया है. जर्दी भ्रूण से निकाले जाने के बाद, यह इमेजिंग के लिए वांछित अभिविन्यास में एक गिलास स्लाइड पर भ्रूण फ्लैट करना संभव है. इस दो आयामी स्थिति नमूना बारी बारी से करने की आवश्यकता समाप्त, जो एक ही बार में पूरे भ्रूण के देखने के लिए सक्षम बनाता है. कई ऊतकों जैसे भ्रूण की व्यापक डोमेन में स्थित हैंरक्त और गुर्दे कि फार्म व्यापारियों. इसके अलावा, एक एक समय में कई अलग विकासशील ऊतकों की तुलना करने की जरूरत पड़ सकती है. फ्लैट बढ़ते एक साथ इस तरह के सेल समूहों के पूरे डोमेन को देखने के लिए, और इस प्रकार बहुत तरह के एक ऊतक या कोशिकाओं की गिनती के लिए एक क्षेत्र के माप के रूप में quantifications सहायता कर सकते हैं शोधकर्ता सक्षम बनाता है. इस तकनीक को अंततः hematopoiesis, neurogenesis, और जीवोत्पत्ति के अंतर्निहित महत्वपूर्ण विकास तंत्र की एक किस्म के विषय में कई खोजों के लिए नेतृत्व में मदद मिली है. इस प्रकार, एक बार में महारत हासिल है, शोधकर्ताओं के लिए इस सरल तकनीक के लिए आवेदन पत्र काफी महत्वपूर्ण हैं.

उदाहरण के लिए, hematopoiesis दौरान वंश चुनाव की जांच के अध्ययन में, फ्लैट 14 और 18 विखंड चरणों (एसएस) में zebrafish भ्रूण की तैयारी माउंट के बीच PU.1 जस्ता उंगली प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति पैटर्न में किए गए परिवर्तनों को वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया गया जंगली प्रकार और GATA1 morpholino भ्रूण 22 इंजेक्शन.इस विधि GATA1 सबसे अधिक संभावना इस समय बिंदु के आसपास मध्यवर्ती सेल द्रव्यमान (आईसीएम) में PU.1 की अभिव्यक्ति को विनियमित करने का संकेत है कि, 18 एसएस में एक विस्तारित PU.1 डोमेन का पता लगाने में सक्षम बनाया. - / - Gtpbp1 और epsin सहित विभिन्न एर्य्थ्रोइद जीनों के लिए दाग अतिरिक्त फ्लैट घुड़सवार भ्रूण GATA1 थे कि VLT म्यूटेंट में इन जीनों की अभिव्यक्ति में एक नुकसान का प्रदर्शन किया. आगे के विश्लेषण biklf और Gata गतिविधि के स्वतंत्र होने के लिए जाने जाते थे कि testhymin तरह erythoid जीनों की अभिव्यक्ति में कोई परिवर्तन नहीं दिखाई. इसलिए, उनके अन्य प्रयोगात्मक परिणामों के साथ संयोजन के रूप में, यह GATA1 myelo-एर्य्थ्रोइद वंश के भीतर कोशिकाओं की भिन्नता को विनियमित करने में आवश्यक है कि पता चला था. तंत्रिका शिखा विकास के एक अध्ययन में, फ्लैट mounts एक अध्ययन में (भीड़ M610) म्यूटेंट मोंट ब्लांक में crestin अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गयामोंट ब्लांक और tfap2a जीन समारोह 23 की भूमिका की जांच. 10 और 20 एसएस में crestin अभिव्यक्ति पूरी तरह से सिर में निराकृत किया गया था और अंततः मोंट ब्लांक के महत्व और tfap2a विनियमन पर समाप्त करने के लिए इस समूह को सहायता, सामान्य प्रकार के जंगली अभिव्यक्ति की तुलना में भीड़ M610 म्यूटेंट के ट्रंक क्षेत्र में कमी आई थी तंत्रिका शिखा गठन के दौरान. इसके अतिरिक्त, जीवोत्पत्ति के मामले में, फ्लैट mounts pronephros के रूप में जाना zebrafish भ्रूण गुर्दे के विकास के दौरान जल्दी गुर्दे पूर्वज क्षेत्र में अलग डोमेन की मौजूदगी की खोज के लिए सक्षम है. zebrafish भ्रूण गुर्दे progenitors pronephros कि शामिल नेफ्रॉन कार्यात्मक इकाइयों को जन्म दे कैसे अध्ययन करने के लिए एक संरक्षित और अभी तक anatomically सीधा प्रणाली, nephrogenesis 6,7 के रूप में जाना जाता प्रक्रिया (चित्रा 4) प्रदान करता है. फ्लैट माउंट विश्लेषण पुनः के दस्तावेज़ डोमेन के लिए उपयोगी हो गया हैएनएएल progenitors और पहले से अनजान था जो (चित्रा 5), 6,7 patterning pronephros दौरान आरए संकेतन में परिवर्तन के परिणाम काटना. साथ में ले ली, इन उदाहरणों को इस फ्लैट सामान्य विकास और रोगग्रस्त राज्यों के दौरान होने वाले विविध प्रक्रियाओं के अध्ययन में प्रोटोकॉल माउंट के लिए कई व्यापक आवेदन वास्तव में सुझाव है कि वहाँ.

धारणा, इस फ्लैट माउंट प्रक्रिया समग्र काफी सरल है. हालांकि, इस पद्धति मास्टर करने के लिए आवश्यक कौशल की जोड़तोड़ और डिग्री दृश्य प्रदर्शन की अनुपस्थिति में मास्टर करने के लिए काफी चुनौतीपूर्ण हो सकता है. इसलिए, इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं, बेहतर इस तकनीक का प्रदर्शन और ऊतक निपटने का अनुकूलन कर सकते हैं कि अभिकर्मकों पर हमारी सलाह को साझा करने के लिए समझने का अवसर के साथ zebrafish मॉडल के लिए नया है, खासकर उन सक्षम करने के लिए संकलित किया गया था. हम इस प्रोटोकॉल अंततः समुदाय में दूसरों यू होने के लिए सबसे आदर्श नमूना शर्तों को परिष्कृत करने की अनुमति देगा कि आशाSED प्रीमियम इमेजिंग, डेटा विश्लेषण, और प्रकाशनों में उनके परिणामों के संचार के लिए. अंत में, इस प्रयोगात्मक परिणामों की प्रस्तुति अस्पष्ट कर सकते हैं, जो जल्दी embryogenesis दौरान zebrafish के संरचनात्मक बाधाओं पर काबू पाने के लिए सक्षम शोधकर्ताओं, और इस सरल लेकिन महत्वपूर्ण तकनीक के उपयोग के माध्यम से इन का समाधान करना चाहिए.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम आंशिक रूप से निम्नलिखित में से प्रत्येक से रॉ को धन के द्वारा समर्थित किया गया था: एनआईएच अनुदान K01 DK083512, DP2 OD008470, और R01 DK100237; 5 FY12-75 ऑफ डाइम्स तुलसी O'Connor स्टार्टर विद्वान अनुदान पुरस्कार # के मार्च; विज्ञान और जीव विज्ञान विभाग के नोट्रे डेम कॉलेज के विश्वविद्यालय से धन शुरू. हम विशेष रूप से स्टेम सेल अनुसंधान को बढ़ावा के लिए नोट्रे डेम विश्वविद्यालय के लिए एक उदार उपहार प्रदान किया, जो पूरे Gallagher परिवार के साथ साथ, एलिजाबेथ और माइकल Gallagher धन्यवाद देना चाहूंगा. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी. हम उनके समर्थन के लिए जीव विज्ञान विभाग के कर्मचारी धन्यवाद, और हमारे zebrafish कॉलोनी की देखभाल और कल्याण में उनके उत्कृष्ट समर्पण के लिए नोट्रे डेम पर Zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र. अंत में, हम के रूप में, उनकी टिप्पणी, विचार विमर्श और इस काम के बारे में अंतर्दृष्टि के लिए हमारे अनुसंधान प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवादअच्छी तरह से स्वाभाविक रूप से हमारे अनुसंधान के लिए सबसे उत्कृष्ट चाबुक उपकरण बनाने के लिए बिल्ली के समान मूंछ शेड उपलब्ध कराने के लिए मैरीगोल्ड (Maripooka) और Zinnia Wingert के रूप में.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 X E3 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.
1 X E3 Dilute 50 X E3 in distilled water.
Mesh tea strainer English Tea Store SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
Embryo incubation dish Falcon 35-1005
Transfer pipette Samco 202, 204
Flat bottom microcentrifuge tube VWR 87003-300; 87003-298
Glass vial Wheaton 225012
1x PBST 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water.
Tween-20 stock American Bioanalytical AB02038
10x PBS American Bioanalytical AB11072
Paraformaldehyde Electron Microscopy Services 19210
4% PFA/1X PBS Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Filter sterilization unit Corning 430516 1 L filter system, 0.45 μm CA
MeOH Sigma 34860-4L
Proteinase K Roche 03-115-879-001 Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C.
HYB+ 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents Roche 11175025910; 11685619910 Refer to manufacturer instructions.
SP6 RNA polymerase Roche 11487671001
T7 RNA polymerase Roche 10881775001
T3 RNA polymerase Roche 11031171001
RNase 1 inhibitor Roche 3335399001
DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer Roche 4716728001
Glycogen Roche 10901393001
Ethanol (EtOH) Sigma E7023 Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C.
Molecular grade distilled water Mediatech 25-055-CM
Waterbath Thermo 51221073 Model 2831
Nanodrop Thermo ND-2000c
Formamide American Bioanalytical AB00600 Store at -20 °C.
20x SSC American Bioanalytical AB13156
MAB 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.
MABT MAB + 0.1% (v/v) Tween-20
Block solution We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).
FCS (fetal calf serum) stock Invitrogen 16140089 Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C.
BSA (bovine serum albumin) stock American Bioanalytical AB00448 Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C.
Anti-digoxigenin antibody Roche 11-093-274-910 Store at 4 °C.
Anti-fluorescein antibody Roche 11-426-338-910 Store at 4 °C.
12-well staining dish BD-Falcon 35-3225
Pre-staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.
Staining solution-purple For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
Staining solution-red For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
NBT stock Sigma N6876 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water.
INT stock Sigma I8377 Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water.
BCIP stock Sigma B8503 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF.
DMF (dimethylformaldehyde) American Bioanalytical AB00450
Glycine Sigma G8898 0.1 M glycine, pH 2.2
Small plastic Petri dish Corning 430589, 430588
Glycerol Sigma G7893
Fine forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55
Lash tool Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.
Glass slide Thermo-Fisher 4445 White Frost
Glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
Modeling clay Hasbro Playdoh Other craft modeling clay products can be substituted.
Slide holder Thermo-Fisher 12-587-10 Cardboard tray to store slides flat.
Stereomicroscope Nikon SMZ645, SMZ1000
Compound microscope Nikon 80i, 90i

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References

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