Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje

Biology
 

Summary

El embrión de pez cebra es un excelente modelo para la investigación de la biología del desarrollo. Durante la embriogénesis, el desarrollo de pez cebra con una masa de yema, que presenta retos en tres dimensiones para la observación de muestras y análisis. Este protocolo se describe cómo crear dos dimensiones planas montar preparaciones de todo el montaje in situ (WISH), teñidas muestras de embriones de pez cebra.

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Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604, doi:10.3791/51604 (2014).

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Abstract

El embrión de pez cebra se utiliza hoy día para la investigación básica y biomédica para investigar el control genético de los procesos de desarrollo y para modelar las anomalías congénitas. Durante el primer día de vida, el embrión de pez cebra que avanza a través de muchas etapas de desarrollo, incluyendo la fertilización, segmentación, gastrulación, segmentación y la organogénesis de estructuras tales como el riñón, el corazón y el sistema nervioso central. La anatomía de un joven embrión de pez cebra presenta varios desafíos para la visualización y el análisis de los tejidos involucrados en muchos de estos eventos ya que el embrión se desarrolla en asociación con una masa de yema ronda. Por lo tanto, para un análisis preciso y de formación de imágenes de fenotipos experimentales en especímenes embrionarias fijas entre la tailbud y 20 somite etapa (10 y 19 horas después de la fecundación (HPF), respectivamente), tales como las teñidas utilizando un montaje toda la hibridación in situ (desea), se a menudo es deseable eliminar el embrión de la yema de Btodos y a la posición plana sobre un portaobjetos de vidrio. Sin embargo, la realización de un procedimiento de soporte plano puede ser tedioso. Por lo tanto, plana exitosa y eficiente montaje preparación se facilita en gran medida a través de la demostración visual de la técnica de disección, y también ayudado por el uso de reactivos que facilitan el manejo óptimo de los tejidos. Aquí, le ofrecemos nuestro protocolo DESEO para la detección de uno o dos colores de la expresión génica en el embrión de pez cebra, y demostrar cómo el procedimiento de montaje plana se puede realizar en este ejemplo de una muestra fija de colores. Este protocolo de montaje plana es ampliamente aplicable al estudio de muchas estructuras embrionarias que surgen durante el desarrollo de pez cebra temprana, y puede ser implementado en conjunción con otros métodos de tinción realizadas en muestras de embrión de fijos.

Introduction

El pez cebra, Danio rerio, se ha convertido en un organismo ampliamente utilizado en el estudio de la biología del desarrollo. El pez cebra son una tropicales, especies de vertebrados de agua dulce pertenecientes a la familia de los ciprínidos. El pez cebra fueron utilizados originalmente para la investigación del medio ambiente para obtener información sobre los riesgos potenciales de los contaminantes del agua, ya que eran fáciles de obtener, baratos y fáciles de mantener 1. En los últimos treinta años, el pez cebra se ha reconocido como un sistema modelo de vertebrados genéticamente manejable para una serie de razones. El pez cebra muestran un alto nivel de conservación anatómica y fisiológica con los vertebrados superiores, incluyendo mamíferos 2,3. Recientes secuencia del genoma anotación ha puesto de manifiesto que aproximadamente el 70% de los genes humanos tienen al menos un homólogo pez cebra 4. Por ejemplo, muchos genes ortólogos que juegan un papel importante durante el desarrollo del riñón se han identificado entre estas especies 5-7. Este dramatic grado de conservación en relación con la biología celular y molecular ha permitido a los investigadores para crear modelos para una amplia gama de enfermedades humanas en el pez cebra 8, y el pez cebra se han convertido en una herramienta valiosa para identificar posibles terapias de drogas utilizando las pantallas de genética químicas 9.

Por otra parte, el modelo de pez cebra no sólo es capaz de recapitular una serie de complejos procesos de desarrollo y estados patológicos que se observan en los seres humanos, pero varios atributos adicionales también aumentar su atractivo como un organismo modelo para estudios embriológicos. El pez cebra son ovíparos y se reproducen a través de desove de difusión, lo que proporciona a los investigadores un acceso fácil a los embriones desde el inicio de la fertilización 10. Otras ventajas incluyen el tamaño del embrión, la transparencia, y el rápido desarrollo, externa 10. Además, los adultos de pez cebra poseen alta fecundidad y por lo general producen relativamente grandes tamaños de postura que pueden oscilar entre 200 a 500por semana, lo que en última instancia, los investigadores para llevar a cabo experimentos de rendimiento altas, tales como pantallas químicas fenotipo basado, con facilidad 9.

Aún así, a pesar de la gran cantidad de ventajas que se exhiben por el modelo de pez cebra, existen retos que se refieren al análisis y la comunicación de los resultados experimentales obtenidos a partir de las etapas tempranas del desarrollo. En algunos casos, la anatomía inherente del embrión de pez cebra podría oscurecer la visualización de los datos de uno. Después de la fecundación, la célula inicial se somete a múltiples eventos de escisión como progresa el desarrollo 11. Después de la gastrulación, el eje embrionario surge en la fase de tailbud (10 HPF) de tal manera que se envuelve alrededor de la yema 11. Como el desarrollo posterior avanza a través del período de segmentación, el tronco crecerá en masa y también alargar por alargamiento axial de tal manera que una cola junto con una porción del saco vitelino en sí se extiende hacia fuera de la masa central de la yema11. Entre el tailbud y somite etapa 20 (19 HPF), los intentos de observar las características específicas de desarrollo después de la utilización de los distintos protocolos de tinción, tales como el deseo, puede ser un reto tanto para visualizar y fotografiar debido a la geometría del embrión y la opacidad de el saco vitelino. Una forma de eliminar estos retos es eliminar la yema y luego aplanar el embrión en una muestra de dos dimensiones que puede ser analizada de una manera más sencilla.

Los siguientes recursos de protocolo y de vídeo proporcionan una guía para saber cómo deyolk con éxito y plana montar un embrión después de la fijación y la tinción, utilizando el ejemplo de uno o tinción DESEO de dos colores. Deseo es una técnica ampliamente utilizado que permite la detección de ácidos nucleicos específicos en muestras conservadas y por lo tanto permite el sitio (s) de la expresión génica para ser detectado dentro de los tejidos. Técnicas de WISH se han descrito extensamente, y se puede realizar con diversos sustratos de colores, así como la gripesistemas de detección de orescent 12-20. Aquí ofrecemos nuestro protocolo DESEO modificado utilizado para los embriones de pez cebra entre las etapas tailbud y segmentación de desarrollo. DESEO protocolos alternativos, sin embargo, son compatibles con el procedimiento de montaje plana descrita aquí, como se señaló al comienzo del protocolo a continuación. Además, el montaje plano podría ser utilizado en conjunción con cualquier número de técnicas de visualización existentes, como toda la inmunohistoquímica monte, ni etiquetas de seguimiento de linaje celular, que no están escritas en este protocolo. En general, la técnica de montaje plana mejor puede permitir el análisis superior y presentación de los datos obtenidos a partir de experimentos con las primeras etapas del desarrollo embrionario en el pez cebra.

Protocol

Los procedimientos para trabajar con embriones de pez cebra que se describen en este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso de la Universidad de Notre Dame. Nota: Los procedimientos que se describen en las partes 1 a 5 fueron utilizados para generar las imágenes de embriones que aquí en los resultados representativos. Los procedimientos descritos en las partes 1-5 podrían estar sustituidos como se desee con procedimientos alternativos de WISH 12-16 u otras técnicas de visualización tales como el etiquetado de inmunohistoquímica para proteínas específicas utilizando anticuerpos específicos. Al realizar montajes planos en embriones de pez cebra deseo con el protocolo descrito en las partes 1 a 5, la fijación inicial del embrión y los últimos pasos de fijación tinción son las principales manipulaciones que afectan a la capacidad de eliminar los gránulos de yema de la muestra para el montaje plano. Se obtienen cuando la fijación inicial se realiza con hielo recién descongelado frío 4% de paraformaldehído (PFA) / 1x PBS y la fijación de los mejores resultados de montaje planala reacción final tinción DESEO con hielo frío 4% PFA/1x PBS (que no tiene que estar recién descongelado), y se aconseja a los lectores a considerar esto cuando la sustitución de métodos de tinción alternativos en combinación con piezas de 6-8.

1. Embryo colección, fijación y almacenamiento

  1. Preparar jaulas de apareamiento mediante la colocación de pez cebra macho adulto (s) y hembra (s) en las cámaras de agua del sistema de modo que están separados por un divisor durante la noche.
  2. Retire los separadores entre los adultos y recoger los huevos fertilizados usando un alambre de malla colador de té multa dentro de ~ 15 a 30 min de apareamiento para reunir garras que tienen etapas embrionarias equivalentes.
  3. Girar el filtro al revés y enjuagar la superficie con una fina corriente de E3 dispensado desde una botella con atomizador para transferir los embriones en platos de incubación que contiene aproximadamente 25 ml de solución de E3.
  4. Después de recoger las garras, dividirlos en varios platos de tal manera que aproximadamente 50 a 60 embriones se incubanen cada placa de 25 ml de solución E3. Nota: El hacinamiento de los embriones puede conducir a la asincronía dramático desarrollo en el embrague y se debe tener cuidado para evitar que esto permitirá la recolección oportuna de la etapa (s) deseada.
  5. Incubar los embriones a 28,5 ° C para permitir la evaluación del desarrollo de acuerdo con el pez cebra serie estándar de estadificación 11.
  6. Utilice una pipeta de transferencia de plástico para colocar con cuidado el número deseado de los embriones en el punto de tiempo seleccionado, hasta la etapa 20 somite (19 HPF), en un tubo de microcentrífuga de fondo plano. Nota: Tenga cuidado en la manipulación de los embriones jóvenes, ya que son frágiles y pueden dañarse fácilmente por aplastamiento o manejo agresivo con pipetas de transferencia. Alternativamente, viales de vidrio se pueden utilizar para la fijación y el procesamiento de los embriones. Para todos los lavados posteriores de protocolo pipetas de transferencia de plástico pueden ser utilizados, con la excepción de la adición de ribosonda y la eliminación (Pasos 3,11, 3,14).
  7. Vuelva a colocar el E3 con hielo frío 4% PFA/1x PBS, yfijar los embriones en sus chorions en 4% PFA/1x PBS durante 4 horas a temperatura ambiente o a 4 º C durante la noche. Nota de precaución: PFA es tóxico y soluciones de PFA debe ser manejado en una campana química mientras usa el equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes y una bata de laboratorio. Además, el polvo de PFA debe ser manejado con cuidado excepcional al hacer la solución de reserva, ya que incluso el granulado PFA puede tender a dispersarse a través de la carga estática. Típicamente PFA se prepara por calentamiento de la PBS 1x a ebullición para disolver el polvo de PFA, y después la solución se almacena en alícuotas a -20 ° C. Si los sedimentos finos están presentes en el 4% PFA/1x PBS una vez que se enfría la solución, filtro de esterilizar la solución enfriada antes de alícuotas para almacenamiento congelado haciéndolo pasar a través de un sistema de filtro de 0,45 micras. Sólo recién preparada o recién descongelado de PFA se usa para esto (es decir, primaria) fijación inicial del embrión.
  8. Retire la solución y lavar los embriones dos veces con 1x PBST, y luego transferir aun plato de incubación.
  9. Vea los embriones bajo un microscopio estereoscópico y utilizar dos pares de pinzas finas para eliminar los chorions rodean los embriones, de manera que un par se utiliza para apalancar suavemente el embrión, mientras que el segundo par se utiliza para rasgar el corion.

2. Permeabilización de embriones

  1. La transferencia de los embriones dechorionated de nuevo en el tubo de microcentrífuga o ampolla de cristal, luego enjuague dos veces con 1x PBST para eliminar cualquier residuo restante corion.
  2. Retire el 1x PBST y se lavan los embriones dos veces con 100% de metanol (MeOH).
  3. Coloque los embriones a -20 ° C durante al menos 20 min. Nota: Los embriones se pueden almacenar a -20 ° C en MeOH durante un año o más. El metanol hace que los chorions pegajosa, por lo que no proceda a este paso hasta que se hayan eliminado los chorions.
  4. Rehidrate los embriones mediante la eliminación de la MeOH 100% y lavarlos a temperatura ambiente durante 5 min cada uno en 50% MeOH/1x PBST, 30% MeOH/1x PBST, a continuación, dos veces con 1x PBST. </ Li>
  5. Preparar una solución de proteinasa K fresca de trabajo (5 g / ml) mediante la adición de 25 l de proteinasa K recién descongelado de stock (10 mg / ml) a 50 ml de 1x PBST.
  6. Retire el 1x PBST de los embriones, luego vuelva a colocar la proteinasa K solución de trabajo y se incuba con base en la etapa embrionaria: <= 5 somitas durante 1 min; 10-12 somitas durante 1,5 min; 15 somitas durante 2 min, y 20 somitas durante 3 min.
  7. Retire la solución de trabajo de proteinasa K y se lavan los embriones dos veces con 1x PBST.
  8. Retire el 1x PBST y reemplace con hielo frío 4% PFA/1x PBS durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente.

3. Ribosonda Síntesis, prehibridación, hibridación y desinstalación de la sonda

  1. Montar la ribosonda antisentido de reacción de transcripción in vitro a temperatura ambiente en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mientras que mantiene las enzimas en hielo, mediante la combinación de una plantilla de ADN que contiene la secuencia correspondiente al gen de interés (ya sea de 100-200 ng de PCRproducto o 1,5 g de plásmido linealizado de ADN, preparado como se describe 12,13), 2 l de digoxigenina o ribonucleótidos marcados con fluoresceína, 2 l de la ARN polimerasa apropiada (SP6, T3, T7, dependiendo de qué secuencia se incorpora en el producto de PCR o presente en el plásmido de ADN), 2 l de 10x tampón de transcripción, 0,5 l de inhibidor de RNasa, y llevar a un volumen total de 20 ul con grado molecular del agua destilada (DNasa, RNasa libre). Nota: El tampón de transcripción 10x debe ser precalentado colocando el tubo en un baño de agua a 37 ° C durante 10-20 min, y se agitó después para asegurar que todos los componentes estén en solución. Si copos blancos están presentes, se incuba el tubo a otro 5-10 min y agitar de nuevo. Transcripción reacciones pueden fallar o tener bajos rendimientos si el tampón de transcripción no se haya disuelto completamente y se mezcla a fondo.
  2. Mezclar los componentes e incubar cada reacción a 37 ° C durante 2 horas en un baño de agua.
  3. Retire la reacción maser (s) desde el baño de agua, y destruir el molde de ADN en cada muestra mediante la adición de 5 l de 10x DNasa I buffer, 2 l de DNasa I enzima, y ​​23 l de agua de grado molecular destilada para llevar el volumen total a 50 l, y luego incubar cada tubo a 37 ° C durante 20 min en un baño de agua.
  4. Llevar a cabo una precipitación con etanol en cada tubo de microcentrífuga mediante la adición de 5 l de acetato de sodio 3 M, pH 5,2 y 110 l de hielo frío 100% de etanol, seguido por 1 l de glucógeno de stock para facilitar la visualización sedimento de ARN en los pasos posteriores, y luego incubar la tubo a -20 ° C durante al menos 1 hora o durante la noche.
  5. Centrífuga de cada tubo de microcentrífuga a máxima velocidad 4 ° C durante 20 minutos, luego retire el sobrenadante de etanol 100% y reemplaza con 100 l de 70% etanol helado.
  6. Centrifugar cada tubo de microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min, a continuación, eliminar el sobrenadante de etanol 70% y aire secar el sedimento durante 5 min, y por último añadir 100 l de MOgrado molecular de agua destilada para volver a suspender el sedimento y cuantificar la concentración stock ribosonda utilizando un espectrofotómetro nanogota. Nota: Una vez que la pastilla ha entrado en solución, la población de ribosonda debe mantenerse en hielo y se almacenó a -20 ° C.
  7. Para preparar los embriones fijos para el proceso de prehibridación, quitar el 4% PFA/1x PBS de cada muestra y se lavan los embriones dos veces con 1x PBST.
  8. Traslado entre 25-40 embriones en 1x PBST en cada tubo de microcentrífuga de fondo plano individual. Nota: El hacinamiento de los embriones dará lugar a las manchas irregulares más tarde, y se debe tener cuidado de limitar el tamaño de la muestra en cada tubo de aproximadamente 40 embriones.
  9. Vuelva a colocar el 1x PBST en cada tubo con 500-1.000 l de HYB +.
  10. Colocar el tubo (s) de embriones en un horno a 70 ° C, y se incuba ellos a esta temperatura durante 4 horas para llevar a cabo la prehibridación.
  11. Prepare la ribosonda / HYB + solución mediante la adición de 100-500 ng de ribosonda (digoxigenina y / o colgEin marcado con) a 500 l de fresco HYB + y luego incubar esta solución a 70 ° C durante al menos 20 min antes de la Etapa 3.11 para precalentar ella. Nota: para detectar múltiples transcripciones de genes, mediante el etiquetado colorimétrico individual y / o doble, cada una de las ribosondas correspondientes a estos genes deben combinarse en una sola ribosonda / HYB + cóctel.
  12. Retire la HYB prehibridación + de cada tubo de embriones y reemplazar con la suficiente ribosonda / HYB + para cubrir los embriones. Nota: Por lo general, es necesario cubrir los embriones en un tubo de microcentrífuga de fondo plano 200-250 l de ribosonda / HYB +. Ribosonda / HYB + adición y la eliminación se lleva a cabo normalmente utilizando una pipeta y de barrera consejos para evitar la contaminación cruzada entre las muestras.
  13. Incubar los embriones a 70 º C durante la noche con ribroprobe / HYB +.
  14. Prepare el siguiente conjunto de soluciones de lavado y pre-calentar durante la noche a 70 ° C: 50% formamide/2x SSCT, 2x SSCT y SSCT 0.2x. Nota: Es conveniente preparar 50 ml aliquots de cada solución de lavado, debido a que el exceso se puede almacenar a temperatura ambiente y posteriormente se vuelve a calentar para su uso futuro.
  15. Retire la ribosonda / HYB + utilizando una pipeta y de barrera consejos y almacenar a -20 ° C. Nota: Normalmente, cada ribosonda / HYB + mezcla se pueden utilizar varias veces (por ejemplo, 3 o más) sin disminución de la señal. Mientras reutilizado ribosonda / HYB + se asocia con el fondo inferior, sin embargo, tener en cuenta que reutilizar mezclas ribosonda pueden estar sujetas a la degradación.
  16. Lavar los embriones dos veces con 50% SSCT formamide/2x durante 30 min a 70 ° C.
  17. Lavar los embriones una vez con 2x SSCT durante 15 min a 70 ° C.
  18. Lavar los embriones dos veces con 0,2 x SSCT durante 30 min a 70 ° C.
  19. Retire la SSCT 0.2x y lavar los embriones dos veces con MABT a temperatura ambiente.

4. Anti-digoxigenina anticuerpos de incubación y detección

  1. Preparar la solución de bloque fresco.
  2. Retire la MABT y reemplazar con el bloque de soluciónción.
  3. Incubar los embriones en solución de bloqueo durante 2-4 horas a temperatura ambiente. Nota: Las incubaciones de bloques más largos proporcionan resultados óptimos con etapas jóvenes embriones de pez cebra (<15 somitas). Para el procedimiento de bloqueo prolongado, lleve a cabo la incubación de bloques para 8-12 horas a temperatura ambiente o una combinación de la temperatura ambiente de más (hasta ~ 8 horas) de una incubación de 4 ° C durante la noche posterior.
  4. Preparar la solución de anticuerpo anti-digoxigenina haciendo una dilución de plegado 5000 en solución fresca de bloque (por ejemplo, 1 l por 5 ml de bloque).
  5. Retire el bloque y la solución de anticuerpo / bloque.
  6. Cubrir la muestra en papel de aluminio y se incuba durante la noche a 4 ° C o durante 4 horas a temperatura ambiente.
  7. Retire la anti-digoxygenin/block y lavar los embriones por lo menos 10 veces con MABT. Nota: Transferencia de los embriones a los platos de 12 pocillos durante los lavados MABT. Esto aumenta la velocidad a la que los embriones se pueden lavar, que es útil cuando el procesamiento de grandes cantidades de muestra, unand hace que sea fácil supervisar el progreso de la reacción de tinción (paso 4,11) bajo un microscopio estereoscópico. Nota: En este paso los embriones pueden ser "lavada súper ', mediante su incubación durante la noche en MABT a 4 ° C antes de proceder con el Paso 4.8, que es un tratamiento útil para las sondas que tienden a dar de alta de fondo o manchas que requiere un largo periodo de monitoreo durante el trabajar día.
  8. Prepare el buffer de pre-coloración y la solución de tinción deseada (sustrato de color púrpura o rojo).
  9. Retire la MABT y lavar los embriones en tampón de pre-tinción durante 5 min a temperatura ambiente.
  10. Retire la memoria de pre-tinción y añadir la solución de tinción.
  11. Monitorear el progreso de la reacción de tinción temperatura ambiente cada 15-30 min en el control de la aparición de los embriones bajo un estereomicroscopio. Nota: La velocidad de la reacción de tinción puede ser frenado mediante la transferencia de las muestras a 4 ° C, si es necesario dar más tiempo para la finalización de la mancha. Una vez enfriado a 4° C, sin embargo, la reacción puede no ser acelerada por calentamiento a temperatura ambiente.
  12. Cuando la reacción de tinción, retire la solución de tinción y reemplazar con 1x PBST.
  13. Lavar dos veces con 1x PBST durante 5 min. Nota: Si no detectar otros genes con otro sustrato, y luego fijar las muestras en hielo frío 4% PFA/1x PBS durante al menos 20 minutos, y continúe con el paso 6.1. De lo contrario, vaya al paso 5.1.

5. Anti-fluoresceína de anticuerpos de incubación y detección

  1. Retire el 1x PBST y lavar los embriones dos veces con 0,1 M de glicina, pH 2,2 durante 15 minutos cada uno a temperatura ambiente. Nota: El tiempo para los lavados de glicina es esencial para desactivar completamente la primera reacción de tinción.
  2. Retire la glicina 0,1 M y lavar los embriones dos veces con MABT durante 5 min a temperatura ambiente.
  3. Preparar la solución de anticuerpo anti-fluoresceína haciendo una dilución de plegado 5000 en solución fresca de bloque (por ejemplo, 1 l por 5 ml de bloque).
  4. Retire la MABT y la solución de anticuerpo / bloque. Siga los pasos 4.6 a 4.13 para llevar a cabo la detección de la ribroprobe marcado con fluoresceína. Nota: Cuando se completa la reacción de tinción final, es esencial que la última fijación de la muestra se realiza en hielo frío 4% PFA/1X PBS. La fijación con soluciones más cálidos PFA tiende a estar asociado con la yema pegajosa que es difícil de eliminar del embrión durante la disección y deyolking para el procedimiento de montaje plana.

6. Disección de Embriones y deyolking inicial del embrión

  1. Seleccionar un embrión manchado fijo para montaje plano.
  2. Utilizar una pipeta de transferencia para colocar la muestra embrión seleccionado en un plástico o vidrio placa de Petri que contiene 1x PBST.
  3. Coloque el plato bajo un microscopio estereoscópico, y rodar el embrión utilizando un par de pinzas finas o herramienta de las pestañas de manera que se obtiene una vista lateral y los extremos de cabeza y cola se visualizan.
  4. Use un par de pinzas finas para hacer una incisión en the yema en una posición situada centralmente entre la cabeza y la cola del embrión, y mientras tanto utilizar un segundo par de pinzas finas para mantener el embrión para proporcionar apalancamiento para la incisión de la yema. Nota: Como alternativa, hacer dos incisiones importantes en la yema de huevo, uno cerca de la cabeza y el otro cerca de la cola del embrión.
  5. Utilice unas pinzas finas y / o una herramienta de pestañas hasta saca la yema de la cavidad de la célula huevo.
  6. Enjuague el embrión suavemente con 1x PBST para eliminar la yema callejero.

7. Fine deyolking del embrión

  1. Transferir el embrión a un portaobjetos de vidrio plano con 1-2 gotas de 1x PBST.
  2. Utilice una herramienta de pestañas y unas pinzas finas para colocar suavemente el embrión con la cara ventral (yema) sobre la placa de vidrio.
  3. Arrastre el embrión hasta el borde de la solución 1x PBST usando la herramienta de las pestañas de manera que el embrión permanece en una posición plana contra el portaobjetos de vidrio.
  4. Raspe la superficie ventral del embrión suavemente con el látigo aol con el fin de eliminar los gránulos de yema sin necesidad de digitalizar el embrión. Simultáneamente utilizar un par de pinzas finas para anclar el embrión mientras que raspando con la herramienta de las pestañas. Nota: La eliminación de los gránulos de yema puede requerir rascado repetitivo durante 5-10 min.
  5. Si la solución PBST se lleno de exceso de yema o comienza a evaporarse, añadir 1-2 gotas frescas de 1x PBST a la diapositiva utilizando una transferencia de pipeta de plástico o vidrio, y luego arrastrar el embrión a la zona con la solución limpia para más de gránulos de yema eliminación.
  6. Cuando la yema se ha eliminado satisfactoriamente, utilizar una pipeta de transferencia para mover suavemente el embrión de nuevo en un plástico o vidrio placa de Petri que contiene 1x PBST durante un enjuague final con el fin de eliminar los gránulos de yema de callejeros.
  7. Transferir el embrión deyolked utilizando una pipeta de transferencia de plástico o de vidrio en un plástico o vidrio placa de Petri que contiene 100% de glicerol.
  8. Incubar el embrión en 100% de glicerol durante ~ 5 min para aclimatar el embrión.

8. Montaje sobre un portaobjetos de vidrio

  1. Transferir el embrión deyolked a un portaobjetos de vidrio limpio en 1-2 gotas de 100% de glicerol.
  2. Coloque el embrión con el lado ventral (yema) frente a la placa de vidrio.
  3. Utilizando una herramienta de las pestañas, arrastrar el embrión hasta el borde de la gota de glicerol de manera que el embrión permanece en una posición plana contra el portaobjetos de vidrio. Si el eje embrionario es curvada, utilizar las pinzas finas para hacer suavemente incisiones muy pequeñas en la membrana celular yema restante para aliviar la tensión de manera que el embrión puede ser colocado de plano sobre el portaobjetos con un eje recto.
  4. Coloque pequeñas chuletas de plastilina en las cuatro esquinas de un cubreobjetos de vidrio de 18 mm x 18. Nota: Como alternativa, las pequeñas gotas de grasa de vacío 15 pueden ser sustituidos para el modelado de la arcilla.
  5. Coloque el cubreobjetos de vidrio lentamente en el embrión, inclinando el cubreobjetos con el fin de minimizar la generación de burbujas de aire en el glicerol alrededor de la muestra.
  6. Añadir una caída adicional del 100% de glicerolal lado de la cubreobjetos de vidrio para llenar el espacio entre el cubreobjetos y el portaobjetos de vidrio.
  7. Presione hacia abajo lentamente y con cuidado en las cuatro esquinas del cubreobjetos para posicionar firmemente el embrión entre el vidrio y eliminar la deriva. Nota: Tenga cuidado de no aplastar el embrión.
  8. Si el embrión no está colocado como se desea, utilizar unas pinzas finas para retirar el cubreobjetos. Utilice la herramienta de las pestañas para cambiar la posición del embrión y / o unas pinzas finas para hacer incisiones adicionales para que el embrión puede ser colocada de nuevo. Repita los pasos 8.4 a 8.7.
  9. Observar y / o la imagen de la muestra utilizando un microscopio estereoscópico o compuesto.
  10. Almacene el soporte plano preparación plana con un soporte de diapositivas de cartón en la oscuridad a 4 ° C durante varias semanas o temporalmente a temperatura ambiente. Nota: La mancha DESEO desaparecerá progresivamente con el tiempo, las reacciones de sustratos particularmente rojos, y no puede ser conservado en glicerol indefinidamente. Manchas púrpuras también se desvanecen más fácilmente si se mantiene en el glicerol en comparación conPFA (ver paso 8,11). Curiosamente, se ha publicado que los embriones de montaje en Permount en lugar de glicerol pueden permitir el almacenamiento indefinido a temperatura ambiente 15.
  11. Para el almacenamiento a largo plazo de sustrato púrpura muestras teñidas, retire el cubreobjetos y enjuague el embrión se enjuaga dos veces en 1x PBST, a continuación, transferir a un tubo de microcentrífuga con 4% PFA/1x PBS para el almacenamiento a largo plazo. Nota: Como alternativa, los embriones en 1x PBST pueden ser procesados ​​para análisis adicionales, como el aislamiento de ADN para el genotipado.

Representative Results

El procedimiento de protocolo de montaje plana implica la transformación del embrión de pez cebra de su anatomía normal, en la que el eje del cuerpo se envuelve alrededor de una pelota de yema situado en el centro, en una de dos dimensiones preparación (Figura 1A). Total de imágenes monte de la joven embrión de pez cebra se ve limitada por la naturaleza de cómo se ajusta el eje embrionario alrededor de la yema. Como resultado, vistas laterales o dorsales de todo el montaje de embrión de especímenes teñidos sólo pueden capturar una parte del eje o tejidos particulares oscuros (Figura 1B). Por comparación, deyolking y aplanamiento del embrión permite que todo el eje embrionario para ser visualizado en un momento (Figura 1B). Estas limitaciones se demuestran mediante el examen de un embrión de WISH manchado que se marcó con ribosondas antisentido para detectar irx3b (púrpura), que marca un subconjunto de los progenitores renales adyacentes a somitas 7 a través de 13, y MYOD1 (rojo) que las etiquetas de lasomitas (Figura 1B). El campo de la irx3b + renales progenitores está oscurecida en el conjunto de montaje en vista lateral porque transcripciones irx3b son abundantes en el sistema nervioso central, por lo que el campo renal prácticamente imposible visualizar con el ángulo de la cámara lateral; Además, el campo de la irx3b + progenitores renales es sólo parcialmente visible cuando el embrión se hace girar en una vista de cámara dorsal porque el campo se envuelve alrededor de la yema (Figura 1B). Sin embargo, una vista dorsal del mismo embrión siguiente montaje plana permite a todo el campo de irx3b + progenitores renales para ser analizados de una forma sencilla en relación con los somitas a lo largo del tronco y otras estructuras embrionarias (fig. 1B). Por lo tanto, los dominios espaciales elaboradas pueden ser idealmente documentados con este método.

Varios pasos más importantes están involucrados en la ejecución con éxito del procedimiento en lo plano. Para realizar esta techniquE, el balón yema debe ser separada primero del embrión adecuado (Figura 2A), que se puede hacer con instrumentos finos tales como un par de pinzas finas, mientras que el embrión se visualizó usando un microscopio estereoscópico. Después de la eliminación crudo de la bola de yema de huevo, una herramienta de pestañas fina se utiliza para raspar gránulos de yema de que se han mantenido unido al embrión (Figura 2B). La eliminación de los gránulos resto de yema ayuda para facilitar la visualización de los tejidos embrionarios. Finalmente, el embrión deyolked se manipula para posicionarlo de manera estable en un portaobjetos de vidrio (Figura 2C), que permite la documentación de la observación y el SIDA de la muestra usando el software de imágenes y una cámara conectada a un microscopio. Las herramientas de las pestañas son dispositivos caseros que se pueden construir mediante la colocación de un látigo adecuado para una punta de pipeta utilizando pegamento, que se pueden montar en un mango (Figura 3A, mesa de Materiales) si se desea. Diferentes muestras de pestañas pueden ser adquiridos para producirarremeter herramientas con características ligeramente diferentes en términos de longitud y forma cónica (Figura 3B), que cada usuario puede tener distintas predilecciones para una vez que comienzan a experimentar con el procedimiento en lo plano. Los ejemplos de muestras de pestañas incluyen arrojar naturalmente pestañas humanos, vertiente natural de pelo hirsuto animal o bigotes, y, finalmente, las variedades sintéticas de las pestañas disponibles en el mercado encuentran en los departamentos de cosméticos de venta.

La zona que rodea y que contiene la muestra (s) posicionado sobre un portaobjetos de vidrio (Figura 4A) se pueden obtener imágenes para el análisis de alta resolución. Una combinación de sondas se utilizaron para etiquetar los progenitores renales en desarrollo que dan lugar al riñón en el embrión de tipo salvaje en las etapas tempranas del desarrollo con el deseo de dos colores, y luego montar plana preparativos se realizaron para ver las muestras (Figura 4B, 4C ). Durante las primeras etapas somite, progenitores renales están demarcadas en un patrón en forma de U por thEIR expresión de las transcripciones pax2a (púrpura) que rodean el mesodermo paraxial que expresa de forma concomitante Delta C (DLC) (rojo) (columna de la izquierda, la figura 4B) 6,7. En comparación, cuando se detectaron las transcripciones de DLC con un sustrato de color púrpura, y se marcaron en combinación con el marcador de Krox20 cerebro posterior (rojo), un subdominio rostral de los progenitores renales se visualizó que expresa DLC (columna de la derecha, Figura 4B), como se señaló anteriormente 6,7. Montar preparaciones planas pueden ser utilizados de manera similar para estudiar las etapas somitogenesis posteriores. En la etapa de somite 14, se analizó la expresión de marcadores renales pax2a, slc4a4 y SLC12A3 (púrpura), junto con smyhc1 (rojo), que marca las somitas (Figura 4C). Estas combinaciones permiten el mapeo de todo el dominio progenitoras renal con pax2a, al tiempo que revela que un subconjunto de células en una expr subdominio rostralcomputan slc4a4a y se distinguen por un subdominio caudal que no se solapan de progenitores renales que expresaban SLC12A3.

WISH-Dos color y la preparación plana de montaje también son valiosos para el estudio de dominios celulares durante la organogénesis en el pez cebra con mutaciones genéticas u otras perturbaciones de la exposición ambiental a moléculas pequeñas 6,7 (Figura 5). Las NLS de pez cebra y mutantes lib albergan mutaciones en aldehído deshidrogenasa 1A2 (aldh1a2, anteriormente conocido como RALDH2), que codifica una enzima necesaria para la biosíntesis de ácido retinoico (RA). RA es esencial para el correcto desarrollo de muchos tipos de células renales, incluyendo la formación de células podocitos que contribuyen a hacer que el filtro de sangre del riñón embrionario, conocido como el glomérulo 6,7. DESEO se realizó para etiquetar los progenitores podocitos con wt1a concomitantemente con demarcación de tque el desarrollo de somitas con smyhc1 y cerebro posterior con Krox20 en embriones de tipo salvaje, nls embriones mutantes, embriones mutantes lib, y los embriones tratados con un inhibidor de la enzima ALDH química, DEAB (Figura 5). Los embriones con expresión aldh1a2 deficientes mostraron reducción de la expresión wt1a en comparación con los embriones de tipo salvaje, mientras que los embriones tratados con DEAB mostraron una abrogación de transcripciones wt1a (Figura 5, columna derecha). En conjunto, estos resultados representativos demuestran cómo la técnica plana de montaje se puede utilizar para analizar y documentar las diferencias anatómicas con precisión en el embrión temprano, y así implementar para los estudios de desarrollo de valor.

Figura 1
Figura 1. Visión general del plano de montaje preparación para los embriones de pez cebra. A) El procedimiento de montaje plana permite la visión simultánea de los tejidos a lo largo del eje embrionario, porque se retira la masa de yema central y el embrión de forma estable colocada sobre una superficie plana. B) Las imágenes de un montaje DESEAN embrión manchada en las vistas lateral y dorsal, y luego, después se llevó a cabo una preparación plana de montaje. El embrión se tiñó con sondas antisentido para detectar transcripciones de genes que codifican irx3b (púrpura) y MYOD1 (rojo).

Figura 2
Figura 2. Esquema del procedimiento de montaje plana para los embriones de pez cebra. A) El embrión se primera groseramente deyolked para eliminar la mayoría de la masa de yema de huevo, a continuación, (B) la superficie ventral se deyolked finamente para eliminar restantes gránulos de yema, ydespués de lavar el embrión es (C) montado lado dorsal sobre un portaobjetos de vidrio para el análisis visual y / o de formación de imágenes fotográficas.

Figura 3
Figura 3. Fotografías de ejemplo herramientas de pestañas en comparación con unas pinzas finas. A) herramientas de pestañas hechas en casa eran imágenes junto con un par de pinzas finas estándar, situado adyacente a una regla métrica para proporcionar una referencia. B) La vista ampliada de las herramientas de las pestañas al lado de las pinzas finas, con la referencia milímetro proporcionado a lo largo de la parte superior de la vista . Dos herramientas de pestañas diferentes se muestran, con el asterisco (*) se utiliza para marcar el látigo obtenido de una vertiente natural de las pestañas humana, y el doble asterisco (**) utiliza para marcar un latigazo que se obtuvo de un pelo arrojar naturalmente felino y se recorta a hacer un final un tanto romo. En cada case, el látigo se ha enhebrado a través de la punta de la pipeta y se fija con varias capas de pegamento para crear progresivamente un sello fuerte para estabilizar / anclar el látigo de la pipeta conectada a un dispositivo de manipulación.

Figura 4
Figura 4. Caracterización de los cambios de desarrollo en el campo progenitoras renal en el embrión de pez cebra de tipo salvaje. A) Deslice esquemática que indica el área observada para el análisis en (B, C). B) embriones de tipo salvaje en el 1, 3, y 5 somite etapa se tiñeron por el deseo de dos colores para evaluar la composición del campo progenitoras renal que da la altura de las de riñón de embrión o pronephros. (Columna izquierda) Las transcripciones que codifican el factor de transcripción pax2a (teñida de púrpura) marcan varias poblaciones en el embrión, incluyendo el p renalcampo rogenitor que emerge de la mesodermo intermedio. Las transcripciones que codifican el ligando de Notch DLC marcan los somitas que se forman a partir del mesodermo paraxial (teñido en rojo). (Columna derecha) Cuando la expresión de transcritos dlc (teñidas en púrpura) y el cerebro posterior rhombomere marcador Krox20 (teñido en rojo) se examinan en los mismos embriones, expresión dlc se puede observar en un subdominio rostral de los progenitores renales adyacentes a somitas 1-5, que se oscurece durante la co-tinción de dlc con pax2a. C) embriones de tipo salvaje en la etapa 14 somite eran doble o triple manchado con una combinación de un marcador renal (púrpura), el smyhc1 marcador somite (rojo) y el cerebro posterior rhombomere marcador Krox20 (también rojo). (Panel superior) En esta etapa, las transcripciones pax2a seguir para demarcar los progenitores renales. (Media, paneles inferiores) Dentro del territorio progenitor renal, un subdominio rostral está marcadopor slc4a4 y transcripciones que codifican SLC12A3 marcar un subdominio caudal.

La figura 5
Figura 5. El uso de preparaciones montadas planas para caracterizar los fenotipos causados ​​por mutaciones genéticas o perturbaciones genéticas químicos que modulan la biosíntesis de ácido retinoico. El patrón de expresión de deseo en la etapa 15 somite de wt1a (púrpura) y smyhc1/krox20 (rojo) se comparó entre los tipos silvestres y embriones con deficiencia de ácido retinoico (RA) de la producción debido a los defectos en la aldehído deshidrogenasa 1a2 (nls y mutaciones lib) o la inhibición química de la actividad deshidrogenasa retinaldehído con diethylaminobenzaldehyde (DEAB). La reducción de la producción de la AR en lib es ligeramente más grave que nls, talesque los embriones lib expresan ligeramente reducida tinción de las transcripciones wt1a que organizó de manera similar nls embriones mutantes, mientras que el tratamiento DEAB de tipos silvestres se asocia con la derogación completa de la expresión wt1a.

Discussion

El pez cebra han demostrado ser un organismo modelo de gran valor en toda la comunidad de investigación durante los últimos años. El pez cebra exhiben un alto grado de conservación genética con la de los vertebrados superiores, y las ventajas relacionadas con su anatomía, reproducción y ciclo de vida hacen de esta especie muy susceptible a los análisis experimentales. Por otra parte, el avance de las técnicas moleculares aplicables a la pez cebra ha promovido además el uso de este organismo modelo en la investigación científica. Por ejemplo, una gran variedad de líneas de pez cebra transgénico se han generado para estudiar la progresión de la enfermedad y para responder a muchas preguntas fundamentales que son la base de los mecanismos fundamentales del desarrollo, incluyendo la organogénesis.

Por consiguiente, basado en el uso dinámico de pez cebra en tanto la enfermedad y la investigación del desarrollo, metodologías de etiquetado celular y cuantificación de la señal son un aspecto crucial de análisis de datos. Mientras que los métodos que emplean un fluorescentetibodies se pueden utilizar para detectar la expresión de la proteína en el pez cebra transgénico, los investigadores normalmente se basan en procedimientos estándar como de WISH 12-16 a examinar la localización espacio-temporal de las transcripciones de genes en una, muestra el pez cebra transgénico no fijo. De hecho, el deseo es una de las técnicas más utilizadas en la biología 16, y es una herramienta vital que se utiliza para caracterizar el fenotipo de las mutaciones genéticas y perturbaciones genéticas químicas. No obstante, desea que se asocia con una serie de dificultades y retos potenciales. Para confirmar la especificidad de la ribroprobe antisentido, ribosondas sentido se pueden utilizar como un control para evaluar la especificidad de los patrones de tinción ribosonda antisentido. Mientras que las secciones 4 y 5 se presentan en el orden de etiquetado y detección de una sonda marcada con digoxigenina seguida de la sonda marcada con fluoresceína, este orden se puede invertir. Normalmente, las señales más débiles (genes con niveles de expresión más bajos) se detectan mejor con sondas marcadas con digoxigenina y esta manchadesarrollado primero con un sustrato púrpura, seguido por la detección y la tinción de la señal más fuerte (gen más abundantemente expresado) utilizando el sustrato de color rojo. Sin embargo, si las reacciones de dos colores se van a realizar, se recomienda que diversas combinaciones de etiquetas y sustratos se ponen a prueba para encontrar el procedimiento que sea el más adecuado para la recolección y análisis de datos. Además, los tiempos previstos de bloqueo, de anticuerpos de incubación y el lavado suministrada en los Capítulos 4-5 se adaptan para los embriones de menos de 24 horas después de la fecundación; largos intervalos de estos mismos pasos con embriones mayores pueden conducir a la acumulación de sales en la muestra. Extensas consejos para la solución de problemas DESEO embrión de pez cebra norma ya se han documentado en la literatura 12-16. Podría decirse que el dilema más común es el alto fondo. Se recomienda aumentar el número de lavados MABT en el paso de 4,7 a 15 a 20 lavados, si es necesario, sin embargo, en nuestra experiencia, la adición de la noche a la mañana MABT 'súper-wash'da excelentes resultados cuando se utiliza junto con 10 o más lavados MABT cortos antes de proceder al paso 4.8. Otro ejemplo dilema es pobre infiltración de la sonda, que puede ocurrir con largas ribosondas. Esquila la ribosonda siguiente Paso 3.6 a través de la hidrólisis alcalina puede contrarrestar esto. En nuestra experiencia con las muestras de los jóvenes, no se requiere típicamente esquila sonda. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los parámetros de este tipo pueden ser factores contribuyentes en el resultado de un experimento de DESEO, y sugerimos el examen de soluciones en esta sección útil ya disposición del público en la comunidad, según sea necesario para refinar los parámetros experimentales para DESEO en su propia investigación 12.

Además de las técnicas tradicionales de WISH 12-16, ha habido un surgimiento continuo de los avances en las metodologías de deseo y protocolos alternativos que se han formulado. Estos incluyen nuevas formas de detección de la señal, tales como mediante el uso de fluorescenciacencia 17-19, a los métodos que permiten la localización de microRNAs 20. Aún así, a pesar de las muchas mejoras que se han hecho a los métodos de etiquetado células actuales, la eficacia de estos procedimientos son negados si la mancha (s) no se puede visualizar fácilmente dentro de la muestra de interés en un punto de tiempo deseado. Esta limitación es un problema para los investigadores, especialmente cuando se refiere a las primeras etapas embrionarias de la ontogenia del pez cebra, que podría dar lugar a lagunas en nuestra comprensión de los diversos procesos de desarrollo que se plantean en estos momentos. Durante el desarrollo normal del pez cebra, el saco vitelino disminuye progresivamente de tamaño como los embriones mayores de 11 años. Por lo tanto, en estas etapas de desarrollo posteriores (> 24 horas después de la fecundación), tinción DESEO es bastante sencillo de analizar porque el embrión es más grande en comparación con su contiguo saco vitelino. Sin embargo, este no es el caso de la etapa de yema de cola a somitogenesis temprana (cuando el embrionariamasa se coloca alrededor de la yema), donde el saco vitelino opaco a veces puede oscurecer la visualización de la mancha. En consecuencia, el método de montaje plana fue ideado para ayudar a aliviar los problemas de formación de imágenes y de análisis de datos asociados con la caracterización de las muestras de embrión de pez cebra (esquematizados en la Figura 1 y la Figura 2), y ha sido ampliamente utilizado desde la fenotipificación sistemática de mutaciones genéticas aisladas a partir de las primeras pantallas genéticos a gran escala 21.

Desde el advenimiento de la técnica de montaje plana, el análisis de las etapas tempranas del desarrollo se ha mejorado significativamente. Una vez que la yema de huevo se retira del embrión, es posible colocar el plano de embriones en un portaobjetos de vidrio en la orientación deseada para la imagen. Esta posición de dos dimensiones permite la visualización de todo el embrión de una sola vez, lo que elimina la necesidad de girar la muestra. Numerosos tejidos se encuentran en amplios dominios del embrión, tales comolos precursores que forman la sangre y el riñón. Además, uno puede necesitar para comparar varios tejidos en desarrollo diferentes al mismo tiempo. El montaje plano permite al investigador ver simultáneamente todo el dominio de tales grupos de células, y por lo tanto puede ser de gran ayuda cuantificaciones como una medición de área para un tejido o célula recuentos. Esta técnica ha ayudado en última instancia, conducen a muchos descubrimientos sobre una variedad de mecanismos de desarrollo importantes que subyacen en la hematopoyesis, la neurogénesis y organogénesis. Así, una vez dominado, las solicitudes de esta técnica sencilla para los investigadores son muy importantes.

Por ejemplo, en un estudio que examina la elección linaje durante la hematopoyesis, plana montar preparaciones de embriones de pez cebra en las etapas 14 y 18 somite (ss) se utilizaron para ilustrar los cambios que se produjeron en el patrón de expresión del factor de transcripción PU.1 dedo de zinc entre de tipo salvaje y GATA1 morpholino inyectado embriones 22.Este método permitió la detección de un dominio de PU.1 expandido en 18 SS, lo que indica que GATA1 es más probable que la regulación de la expresión de PU.1 en la masa celular intermedia (ICM) alrededor de este punto de tiempo. Embriones montados en plano adicional teñidas para diferentes genes eritroides incluyendo gtpbp1 y epsin demostraron una pérdida en la expresión de estos genes en mutantes VLT que eran GATA1 - / -. Otros análisis no mostraron cambios en la expresión de los genes del eritroides como biklf y testhymin que se sabe que es independiente de la actividad Gata. Por lo tanto, en conjunto con sus otros resultados experimentales, se reveló que GATA1 es esencial en la regulación de la diferenciación de células dentro del linaje eritroide mielo-. En un estudio de desarrollo de la cresta neural, se utilizaron soportes planos para examinar la expresión Crestin en mont blanc (m610 mob) mutantes en un estudioexaminar los papeles de mont blanc y la función del gen TFAP2A 23. A las 10 y 20 ss, expresión Crestin fue abrogado por completo en la cabeza y se redujo en la región del tronco de mutantes m610 mafia en comparación con la expresión normal de tipo salvaje, en última instancia, ayudar a este grupo a una conclusión sobre la importancia de la mont blanc y TFAP2A regulación durante la formación de la cresta neural. Además, en términos de la organogénesis, montajes planos han permitido el descubrimiento de la presencia de dominios distintos a principios del campo progenitoras renal durante el desarrollo del riñón embrionario de pez cebra, conocido como los pronephros. El embrión de pez cebra ofrece un sistema conservada y sin embargo sencillo anatómicamente para estudiar cómo progenitores renales dan lugar a las unidades de nefrones funcionales que comprenden los pronephros, un proceso conocido como nefrogénesis 6,7 (Figura 4). Análisis montar plana ha sido útil para los dominios de documentos de reprogenitores internos y para diseccionar el resultado de cambios en la señalización de RA durante pronephros que modelan 6,7 (Figura 5), que era desconocida hasta entonces. En conjunto, estos ejemplos sugieren que de hecho hay muchas aplicaciones generales para este piso protocolo de montaje en el estudio de diversos procesos que ocurren durante el desarrollo normal y estados de enfermedad.

Conceptualmente, este procedimiento plana de montaje es bastante simple en general. Sin embargo, las manipulaciones y el grado de finura necesaria para dominar este método puede ser muy difícil de dominar, a falta de demostración visual. Por lo tanto, este protocolo fue compilado para permitir a los investigadores, especialmente los nuevos en el modelo de pez cebra, con la oportunidad de comprender mejor cómo llevar a cabo esta técnica y compartir nuestros consejos sobre los reactivos que pueden optimizar la manipulación de tejidos. Esperamos que este protocolo en última instancia permitirá a otros en la comunidad para perfeccionar las condiciones de la muestra más ideales para ser used para obtener imágenes de alta calidad, análisis de datos y la comunicación de sus resultados en publicaciones. En última instancia, esto debería permitir a los investigadores para superar los obstáculos anatómicos del pez cebra durante la embriogénesis temprana, que puede oscurecer la presentación de los resultados experimentales, y resolver estos a través de la utilización de esta técnica simple pero significativo.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado en parte por la financiación a RAW de cada uno de los siguientes: subvenciones del NIH K01 DK083512, DP2 OD008470 y R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor arranque Académico de subvención n º 5-FY12-75; poner en marcha los fondos de la Universidad de Notre Dame Colegio de Ciencias y el Departamento de Ciencias Biológicas. Nos gustaría agradecer especialmente a Elizabeth y Michael Gallagher, junto con toda la familia Gallagher, quien impartió una generosa donación a la Universidad de Notre Dame para fomentar investigación con células madre. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Damos las gracias a los funcionarios del Departamento de Ciencias Biológicas por su apoyo, y el Centro de Investigación de Pez Cebra en Notre Dame por su extraordinaria dedicación en el cuidado y el bienestar de nuestra colonia de pez cebra. Por último, agradecemos a los miembros de nuestro laboratorio de investigación para sus comentarios, discusiones y puntos de vista acerca de este trabajo, ya queasí como Marigold (Maripooka) y Zinnia Wingert para proporcionar arrojar naturalmente bigotes felinos para hacer más excelentes herramientas de pestañas para nuestra investigación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 X E3 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.
1 X E3 Dilute 50 X E3 in distilled water.
Mesh tea strainer English Tea Store SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
Embryo incubation dish Falcon 35-1005
Transfer pipette Samco 202, 204
Flat bottom microcentrifuge tube VWR 87003-300; 87003-298
Glass vial Wheaton 225012
1x PBST 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water.
Tween-20 stock American Bioanalytical AB02038
10x PBS American Bioanalytical AB11072
Paraformaldehyde Electron Microscopy Services 19210
4% PFA/1X PBS Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Filter sterilization unit Corning 430516 1 L filter system, 0.45 μm CA
MeOH Sigma 34860-4L
Proteinase K Roche 03-115-879-001 Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C.
HYB+ 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents Roche 11175025910; 11685619910 Refer to manufacturer instructions.
SP6 RNA polymerase Roche 11487671001
T7 RNA polymerase Roche 10881775001
T3 RNA polymerase Roche 11031171001
RNase 1 inhibitor Roche 3335399001
DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer Roche 4716728001
Glycogen Roche 10901393001
Ethanol (EtOH) Sigma E7023 Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C.
Molecular grade distilled water Mediatech 25-055-CM
Waterbath Thermo 51221073 Model 2831
Nanodrop Thermo ND-2000c
Formamide American Bioanalytical AB00600 Store at -20 °C.
20x SSC American Bioanalytical AB13156
MAB 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.
MABT MAB + 0.1% (v/v) Tween-20
Block solution We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).
FCS (fetal calf serum) stock Invitrogen 16140089 Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C.
BSA (bovine serum albumin) stock American Bioanalytical AB00448 Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C.
Anti-digoxigenin antibody Roche 11-093-274-910 Store at 4 °C.
Anti-fluorescein antibody Roche 11-426-338-910 Store at 4 °C.
12-well staining dish BD-Falcon 35-3225
Pre-staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.
Staining solution-purple For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
Staining solution-red For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
NBT stock Sigma N6876 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water.
INT stock Sigma I8377 Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water.
BCIP stock Sigma B8503 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF.
DMF (dimethylformaldehyde) American Bioanalytical AB00450
Glycine Sigma G8898 0.1 M glycine, pH 2.2
Small plastic Petri dish Corning 430589, 430588
Glycerol Sigma G7893
Fine forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55
Lash tool Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.
Glass slide Thermo-Fisher 4445 White Frost
Glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
Modeling clay Hasbro Playdoh Other craft modeling clay products can be substituted.
Slide holder Thermo-Fisher 12-587-10 Cardboard tray to store slides flat.
Stereomicroscope Nikon SMZ645, SMZ1000
Compound microscope Nikon 80i, 90i

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References

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