En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

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Biology

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Summary

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

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Malide, D., Métais, J. Y., Dunbar, C. E. In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (90), e51669, doi:10.3791/51669 (2014).

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Abstract

Hemos desarrollado y validado un marcador fluorescente metodología para el seguimiento clonal de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (hspCs) con alta resolución espacial y temporal para estudiar en la hematopoyesis in vivo usando el trasplante de médula ósea modelo experimental murino. Combinatoria genética marcado utilizando vectores lentivirales que codifican proteínas fluorescentes (FPS) permitió la cartografía destino celular a través de imágenes de microscopía avanzada. Vectores que codifican cinco programas marco diferentes: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato y mCherry se utilizaron para transducir simultáneamente HSPCs, creando una paleta diversa de células de color marcado. Imaging utilizando microscopía confocal híbrido / dos fotones permite la evaluación de alta resolución simultánea de las células marcadas de forma única y su progenie en conjunción con componentes estructurales de los tejidos. Volumétrica analiza en grandes áreas revelan que las células derivadas de HSPC espectralmente codificados se pueden detectar de forma no invasiva en diversos tejidos intactos, incluyendo la médula ósea (BM), Durante largos períodos de tiempo después del trasplante. Los estudios en vivo que combinan multifotón-velocidad de vídeo y time-lapse confocal en 4D demuestran la posibilidad de rastreo celular y clonal dinámico de una manera cuantitativa.

Introduction

La producción de células sanguíneas, denominado hematopoyesis, es mantenida por una pequeña población de células madre y progenitoras hematopoyéticas (hspCs). Estas células residen dentro de la médula ósea (BM) en un complejo que consiste nicho microambientales de los osteoblastos, células del estroma, tejido adiposo, y las estructuras vasculares, todos implicados en el control de la auto-renovación y diferenciación 1,2. Como BM intacto ha sido tradicionalmente inaccesibles a la observación directa, las interacciones entre HSPC y su microambiente sigue siendo en gran medida sin caracterizar in vivo. Anteriormente, hemos establecido una metodología para visualizar la arquitectura 3D de BM intacta utilizando fluorescencia confocal y microscopía de reflexión 3. Nos caracteriza expansión de HSPCs EGFP marcados en la BM, pero el uso de sólo una única FP impidió el análisis de la regeneración en un nivel clonal. Muy recientemente nos aprovechamos de la Ontología de Lentiviral Génica (LEGO) vectores que expresan constitutivamente flproteínas fluorescentes (FPS) para marcar eficazmente células 4,5. Co-transducción de HSPC con 3 o 5 vectores genera una paleta diversa de colores combinatorias, lo que permite el seguimiento de los múltiples clones individuales HSPC.

Marcado HSPC combina con la nueva tecnología de imagen permitido trazar homing individuo HSPC y el injerto en el BM de ratones irradiados. LEGO vectores se utilizaron para marcar HSPC con 3 o 5 MF diferentes (desde Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato, y mCherry) y seguir su injerto en el tiempo en el BM por microscopía confocal y 2-fotón, lo que permite una visualización clara de los huesos y otra estructuras de matriz, y la relación de clones HSPC a los componentes de su microambiente. HSPC se purificaron como las células negativas de linaje de ratones C57BL / 6 ratones BM, transducidas con vectores LEGO, y vuelve a infundir por inyección en la vena de la cola en ratones congenic mielo-ablación. Mediante el control de grandes volúmenes de tejido BM esternón visualizamos injerto endosteal ocurren temprano enRegeneración BM. Grupos de células con diversos espectros de color aparecieron inicialmente en estrecha proximidad con el hueso y progresaron de forma centralizada a través del tiempo. Curiosamente, después de más de 3 semanas, la médula ósea consiste en agrupaciones clónicas macroscópicas, que indica diseminación de la hematopoyesis derivada de HSPCs individuales de forma contigua en la médula, en lugar de amplia difusión de HSPCs través del torrente sanguíneo. Hubo menos diversidad de color en los puntos finales de tiempo, lo que sugiere la dificultad en la transducción a largo plazo repoblar células con múltiples vectores.

Además, HSPCs formado grupos en el bazo, un órgano también responsable de la hematopoyesis en ratones. Células individuales HPSC derivados podrían resolverse en el timo, los ganglios linfáticos, el bazo, el hígado, los pulmones, el corazón, la piel, el músculo esquelético, tejido adiposo y los riñones también. Las imágenes en 3D pueden ser evaluados cualitativamente y cuantitativamente a apreciar la distribución de células con perturbaciones mínimas de los tejidos. Finalmente, ilustramosd la viabilidad de los estudios dinámicos vivos en 4D combinando multifotón escaneo de resonancia y time-lapse confocal. Esta metodología permite una alta resolución no invasiva, multidimensional celda de destino trazado de las poblaciones de células espectralmente marcados en su arquitectura intacta 3D, proporcionando una poderosa herramienta en el estudio de la regeneración de tejidos y la patología.

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Protocol

Todos los ratones fueron alojados y manipulen de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, y se inscribió en un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales NHLBI. Mujer B6.SJL-PTPRC (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) y ratones C57BL / 6, 6-12 semanas de edad, fueron utilizados como donante y receptor, respectivamente.

Una lista de materiales, reactivos y equipo se proporciona en la Tabla 1.

1. LEGO Transducción de Ratón HSPCs y Trasplante de Médula Ósea

Lleve a cabo los procedimientos descritos a continuación en un nivel de bioseguridad certificada 2 (BSL-2) gabinete (campana de cultivo de tejidos).

  1. Producción de LEGO vectores que codifican 5 fps
    1. Utilice la lentiviral "Gene Ontología" (LEGO) plásmidos vectores, cada uno codifica una FP diferente de un fuerte promotor SFFV constitutiva, incluyendo Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Venus), Lego-T2 (tdTomato), y Lego-C2 (mCherry) amablemente proporcionados por el Dr. Boris Fehse (Centro Médico Universitario Hamburg-Eppendorf, Hamburgo, Alemania); ahora también disponible en Addgene 5-7.
    2. Para producir vectores de LEGO, semilla de 5 x 10 6 células 293T en placas de 10 cm (12 utilizar platos para cada vector) 24 h antes de la transfección en 8 ml de medio de I10 (IMDM suplementado con 10% de FCS y glutamina / penicilina / estreptomicina).
    3. Transfectar las células con fosfato de calcio utilizando las recomendaciones del kit CAPHOS ligeramente modificados:
      1. Para cada mezcla de la placa 15 mg vector de Lego, 12 mg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 mg PREV-TAT y 1 mg plásmidos pMD2.G-VSV-G en presencia de 50 l de 2,5 M CaCl 2, y añadir agua para proporcionar un volumen total de 500 l.
      2. Plásmidos de ADN precipitado con 500 l de 2x HeBS (solución salina tamponada con HEPES) y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente antes de añadir a cada placa de células 293T.
      3. Se incuban las células para6 horas en un 37 ° C 5% de CO2; eliminar el medio y añadir nueva cultura mediática 6 h después de la transfección.
    4. Recoger los sobrenadantes del cultivo que contiene partículas lentivirales de cada placa, a diario, durante 3 días. Cada colección sobrenadante día siguiente añadir medios I10 fresca a cada placa.
      1. Se filtra a través de 0,22 micras poros, piscina y concentrarse sobrenadantes por ultracentrifugación en un rotor SW28 durante 2 horas a 71.900 xg y 4 ° C.
      2. Resuspender los sobrenadantes en 1 ml de medio StemSpan. Alícuota de los stocks de lentivirus en 200 l y se almacenan a -80 ° C.
  2. La titulación de Lentiviral Particles
    Determinar el título de partículas de vector de Lego en sobrenadantes recogidos a través de la cuantificación de la transducción de unidades / ml utilizando células NIH3T3. Los títulos permiten el cálculo del volumen de cada sobrenadante del vector necesaria para dar lugar a la multiplicidad relativa deseada de infección (MOI) de objetivo experimentalcélulas.
    1. Plate 5 x 10 4 NIH3T3 células por pocillo (placa de 12 pocillos) en 2 ml de medio I10 un día antes de la valoración.
    2. Preparar diluciones en serie de 5 veces de sobrenadantes de vectores en medios I10 suplementado con sulfato de protamina (4 mg / ml 1,000x es).
    3. Retire el papel de las células, y reemplazar con 500 l de diluciones de sobrenadante que contiene el equivalente a 2, 0.8, 0.32, y 0.128 l de virus concentrado.
    4. Determinar el número (n) de células presentes por pocillo en el momento de la transducción, contando así un control.
    5. 6 horas después de la transducción, añadir 2 ml de medio I10 e incubar durante 3 días a 37 ° C, 5% de CO 2.
    6. Recoger las células de cada pocillo usando Tripsina-EDTA, y determinar el porcentaje de células fluorescentes (% FP) a través de citometría de flujo.
    7. Calcular el título de la siguiente manera, el promedio de los títulos obtenidos para cada pocillo (dilución) resultantes en un FP% entre 1 y 50%: de títulos (partículas de vector / ml) = nx% FP / volumen de sobrenadante de vector (ml). La media de los títulos obtenidos para cada dilución si el FP% está entre 1 y 50%.
  3. Ratón Colección celular, purificación, Transducción y Trasplante (que se muestra esquemáticamente en la Figura 1A adaptado de Malide et al. 4).
    1. Sacrificar los ratones donantes mediante un procedimiento adecuado. Cosecha de médula ósea de las extremidades anteriores y posteriores: diseccionar húmeros, fémures y tibias, eliminar completamente todo músculo, ligamentos y el exceso de tejido de los huesos, corte a través del extremo de cada hueso lo más cerca posible a la articulación, y lavar la médula ósea de el hueso usando una aguja de 27-0 en una jeringa que contiene medios I10.
    2. Pellet enteras las células de la médula ósea durante 10 min a 500 xg, 4 ° C y lisar glóbulos rojos dos veces con 50 ml de tampón ACK. Resuspender las células en 10 ml de medio I10.
    3. Purificar células progenitoras (Lin-) linaje negativas con el kit de agotamiento MACS linaje de acuerdo con un protoco kit modificadol:
      1. Utilice 30 l de microperlas anti-biotina en lugar de 10 l / 10 7 células; completar las etapas de lavado con los medios de comunicación I2 (IMDM suplementado con FCS al 2%) en lugar de tampón.
      2. Inserte una etapa de lavado entre la incubación con Cocktail biotina-anticuerpo y la incubación con anti-biotina microperlas; y equilibrar la columna con tampón en lugar de I10.
    4. Cultura células Lin-durante 48 horas a una densidad inicial de 5 x 10 5 células / ml en medio StemSpan suplementado con 10 ng / IL-3 murina ml, 100 ng / ml de IL-11 murina, 100 ng / ml Flt-3 humana ligando, y 50 ng / factor de células madre murina ml.
    5. Transferencia de 1 a 4 x 10 5 células a 12-así placas revestidas con RetroNectin y transducir con sobrenadantes de Lego, cada uno a una multiplicidad de infección (MOI) de 6-7 para lograr la eficiencia de expresión del 50% para cada FP, en presencia de StemSpan medios de comunicación y citoquinas detallan arriba y 4 mg / ml de sulfato de protamina.
    6. Transducir célulascon cada vector de Lego de forma individual como se describe en el paso 1.3.5 y mezclar las células después de la transducción (llamado Mix) o co-transducir células con todos los sobrenadantes 5 LEGO vector simultáneamente (denominado Co). Retire las células 24 horas más tarde, lavar una vez con medio StemSpan sin citoquinas, y volver a suspender en medios StemSpan sin citoquinas para el trasplante, o transferirlos a medio fresco con citoquinas, y la cultura durante 96 horas adicionales antes de la microscopía confocal y citometría de flujo.
      1. Lleve a cabo el trasplante de médula ósea mediante la infusión de transducidas Lin- HSPCs mediante inyección en la vena de la cola en los destinatarios previamente irradiados 11 Gy dosis única (6-18 hr antes del trasplante) los destinatarios, en un volumen de 100 l, a una dosis de células por ratón correspondiente a 1 células -4 x 10 5 Lin- originalmente plateado para la transducción. En cada experimento, trasplantar toda una cohorte de animales con la misma población de células transducidas BM donantes.
      2. Para la caracterización in vitro de H transducidasSPC, cultivar las células durante otros 4-5 días en StemSpan suplementado con las citoquinas y analizar por citometría de flujo para la eficacia de transducción, y por microscopía a la diversidad de colores.
        1. Sacrificar los ratones individuales y recuperar los tejidos y órganos para formación de imágenes, en varios puntos de tiempo de hasta 120 días post-trasplante.
          1. Rociar con etanol la piel del ratón y incisión de la piel en el lado ventral evitar la difusión del cabello.
          2. Diseccionar y los impuestos especiales de acuerdo con los procedimientos estándar del bazo, los ganglios linfáticos poplíteos, pulmones, el corazón, la piel, el tejido adiposo, el músculo esquelético, el riñón, el hígado, así como la cabeza para el acceso a la bóveda craneal.
          3. Como alternativa, utilice bóveda craneal o la creación de una ventana ósea para imágenes en vivo en varias ocasiones con el tiempo 2,8,9 u órganos superficiales de la imagen tales como los nodos de la piel y de los ganglios en el animal vivo.
        2. Coloca los órganos individuales en 35 mm cultura platos número 0 cubierta de cristal en 50-10056; l PBS para obtener imágenes de ellos intactos sin seccionar, fijación o procesamiento adicional como se describe en el paso 2.5.
        3. Para imagen volumétrica, mantener los órganos en PBS en frío hasta su uso. Para time-lapse de proceder de inmediato a la formación de imágenes órganos en DMEM, 10% FBS que contenía HEPES 20 a 37 ° C

2. confocal y microscopía de dos fotones y Análisis de Imágenes

  1. Realizar imágenes de microscopía utilizando un sistema de cinco canales y confocal Leica SP5 multifotón equipado con varias líneas de argón, diodo de 561 nm, 594 nm HeNe, y HeNe 633 nm láseres visibles. El uso en modo 2-fotón, un femtosegundo pulsada Ti: Zafiro (Ti-Sa) láser, sintonizable para la excitación de 680 a 1080 nm con corrección de dispersión. Uso en experimentos que implican los MF desplazada al rojo (tdTomato y mCherry), un oscilador paramétrico óptico (OPO) de láser para ampliar el rango de longitud de onda de salida en cuanto a 1,030-1,300 nm, secuencialmente o simultáneamente con tque Ti-Sa láser.
  2. Image diversos tejidos usando un HCX-IRAPO-L 25X / 0,95 NA objetivo de inmersión de agua (WD = 2,5 mm), una PLAPO-CS-HC 20x / 0,70 NA objetivo seco (WD = 0,6 mm), o HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA objetivo de inmersión en agua (WD = 0,6 mm).
  3. Obtener espectros de fluorescencia confocal de recogida pilas lambda (xyλ) de luz emitida en 5 nm-anchos de banda del espectro visible a partir de células BM transducidas con un vector único FP LEGO, así como de control, no trasplantados BM.
    1. Procesar imágenes con el software v2.4.1 Leica LAS-AF para crear espectros de referencia de los 5 programas marco, así como de autofluorescencia (Figura 2A). El uso de los espectros individuales FP y la diferencia de brillo de fluorescencia (expresado en% de EGFP) de Cerulean (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) y mCherry (47%) establece 5 canales de imágenes secuenciales de la siguiente manera: Cerulean (458/468 a 482 nm), EGFP (488/496 a 514 nm), Venus (514/523 a 558 nm), tdTomato (561/579 a 597 nm), y mCherry (594/618 a 670 nm) (
    2. Validar la separación los MF precisa, como las células transducidas con cada FP individuo sólo son visibles en el canal correspondiente y ausente del resto (Figura 2C). Además, este enfoque multi-canal definido crea un único 5-canales "Colorprint" que permite el análisis posterior de color y de seguimiento clonal y tiene la ventaja de reducir los tiempos de adquisición en comparación con la imagen espectral.
  4. Separada de emisión de fluorescencia, en el modo de 2 fotones, por alta eficiencia espejos dicroicos de encargo y recoger con un detector de cuatro canales no descanned (NDD) como sigue: un espejo dicroico a 568 nm seguido de un espejo dicroico a 465 nm, seguido por un 452/45 nm filtro de emisión de SHG o autofluorescencia y Cerulean, un filtro de 525/40 nm de emisión para EGFP o Venus, y un espejo dicroico 648 nm y 620/60 nm filtro de emisión para tdTomato o mCherry.
    1. Revelar información estructural mediante microscopía de dos fotones iimágenes de contraste ntrinsic (como se describió anteriormente) de la autofluorescencia del tejido de la elastina, NADH, (emocionado a 780 nm), y segundo armónico de la señal (SHG) de colágeno óseo y fibrilar (emocionado en 920 nm o 860 nm recogido en un dispersada-generados dirección) 10,11.
  5. Para la interpretación del volumen 3D, recoger serie de imágenes xyz (típicamente 1 x 1 x 4 m 3 tamaño voxel) a lo largo del eje z en 5 micras intervalos en un rango de profundidades (150-300 m) a lo largo de la médula ósea y otros tejidos, en grandes regiones utilizando la función de baldosas del software para generar automáticamente los volúmenes cosidos que comprenden una fosas toda esternón, aproximadamente 2,5 x 1,2 mm 2 (xy) y 300 m (z) (Figuras 2D-2E) y de la película 1.
    1. Imagen de calota ósea directamente a través del cráneo sin seccionar 2, 8.
    2. Sección esternón a lo largo del plano sagital (bisección) y luegotransversalmente en la unión entre 2 esternal foso y la imagen a través de la cara de corte 3,4,12 (descripción general en la Figura 1B adaptado de Takaku et al 3).
  6. Para time-lapse de 4D, coloque recién extirpado poplítea ganglios linfáticos, el bazo, pulmón, o muestras de hueso de calota sin cortar en 35 mm cultura platos número 0 cubreobjetos, en 50-100 l DMEM, FBS al 10% que contenía HEPES 20 a 37 ° C y el uso de 2 fotones Ti-Sa excitación (860 nm), combinada con la excitación confocal (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) y un escáner de resonancia Leica (8000 Hz / seg), tomando z-pilas (~ 80 micras) a intervalos de 20 segundos hasta 1 hr.
    1. Para tricolor uso de imágenes 2P simultánea Ti-Sa sintonizado a 860 nm simultáneamente con el láser OPO (sintonizado en 1130 nm para tdTomato, o 1140 nm mCherry) (Movie 2).
  7. Reconstrucción y Análisis de volúmenes en 3D y secuencias de tiempo 4D
    1. Utilice Imaris x64 softwson la versión 7.6, o paquetes de programas alternativos para transformar las-pilas de baldosas de imágenes en bruto en volumen-renderizados (3D) de datos de células fluorescentes dentro de la médula ósea y los diferentes tejidos y para exportarlas como películas 3D de rotación, como se describió previamente 3,4 (Película 1) paso a paso ejemplo:
      1. En Imaris, Abra la imagen z-stack; Seleccione "Supera" con el fin de mostrar la visualización de volumen 3D.
      2. Utilice "navegar" para subir el volumen alrededor de 360 ​​°.
      3. Seleccione "Animación" para crear una animación; utilizar fotogramas clave para agregar vistas seleccionadas, zoom, rotaciones del volumen; Vista previa de la película, editar según sea necesario y guarde el archivo en un formato de vídeo que desee (por ejemplo: avi, mov).
    2. Para la evaluación cuantitativa de la frecuencia celular y clon 3D, posiciones, tamaños y distribución, más proceso de los z-pilas que utilizan los módulos Imaris XT que integran aplicaciones de MATLAB escénicas meas distanciamedi- (utilizando un algoritmo de transformación distancia) y grupos de análisis, como se ha descrito previamente 3,4. Transformar las secuencias de pilas de imágenes a través del tiempo en cuatro dimensiones (4D) películas de volumen-renderizados con software x64 Imaris y utilice punto y análisis de superficie para el seguimiento semiautomatizado de la motilidad celular en tres dimensiones usando algoritmos de movimiento autorregresivos.
    3. Realizar análisis multiespectral de las células de la siguiente manera: extraer el color de múltiples puntos marcados por la adición de los 5 canales a través de la aritmética canal de Imaris XT en un nuevo canal; determinar, para todos los puntos (células) de la intensidad media de fluorescencia en cada uno de los canales de componentes 5. Exportar los valores en el software Excel para trazar gráficos que muestran el "Colorprint" única es decir, el% relativo de cada FP en celda individual (Figura 2E gráfico). Corrija el conjunto de datos de la deriva del tejido, y calcular la velocidad de células y el desplazamiento en el tiempo, longitudes de pista, caminos y distancias; los valores de exportación en Excel software para trazar gráficos. Ensamble figuras compuestas con el software Adobe Photoshop CSS 5.

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Representative Results

Todo el montaje 3D confocal / 2 fotones microscopía reconstrucciones del curso esternal tiempo médula ósea reveló el injerto y la expansión de los compañeros de 5fps trasplantadas en un modelo con características notables: clones aparecieron claramente delimitada, homogénea marcados con amplia paleta de colores inicialmente y el progreso con el tiempo para contener preferentemente a las células de la mayoría de un solo color. La microscopía confocal de configuración y ejemplos representativos de formación de imágenes 5fps marcada-HSPC en la médula ósea del esternón se ilustran en la Figura 2 y Películas 1 y 2.

Reconstrucciones de microscopía confocal / 2 fotones todo el montaje 3D de tejidos intactos demuestran la posibilidad de rastrear el destino de color marcados células derivadas-BM por períodos de tiempo prolongados en los tejidos vivos. Los ejemplos representativos de células derivadas de médula ósea en los órganos hematopoyéticos y no hematopoyéticos después del trasplante se muestran en la Fi gura 3.

Figura 1
Figura 1 Visión general de los procedimientos experimentales. A) Los pasos esquemáticos ilustran el aislamiento de células Lin-BM, la transducción con vectores de LEGO que codifican una variedad de variantes de color fps, y la reinfusión de las células transducidas en-mielo-ablación ratones (trasplante de médula ósea). B) de la médula ósea (esternón, bóveda craneal ), así como diversos órganos / tejidos fueron examinadas por microscopía confocal y de dos fotones en diferentes puntos de tiempo después de un trasplante. El panel A es una adaptación de la figura 1 en Malide et al. 4 y Panel B adaptada de la Figura 1 en Takaku et al 3.

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Figura configuración 2. microscopía confocal y ejemplo representativo de imágenes 5fps marcados-HSPC en la médula ósea. A) Spectral) de formación de imágenes xyλ (utilizado para registrar los espectros de emisión de referencia para cada FP, ilustrado en histogramas normalizados pseudocoloreada con cian (Cerulean), verde (EGFP), amarillo (Venus), magenta (tdTomato) y rojo (mCherry): excited por 594 nm- (línea roja) en comparación con 561 nm- (línea roja discontinua) de longitud de onda B) Cinco canales ajustados a la imagen de emisión secuencial de:. Cerulean (468-482 nm), EGFP (496-514 nm), Venus ( 523-558 nm), tdTomato (579-597 nm) y mCherry (618-670 nm). Los paneles A y B están adaptados de la Figura 1 en Malide et al. 4 C) Formación de imágenes de esternal BM a partir de ratones transplantados con transducidas con vectores individuales de PF. Cada FP era visible sólo en las células transducidas con el vector correspondiente fotografiado en el ch apropiadaannel, y ausente de los demás (sin cross-talk). D, E) El injerto y período de expansión de trasplantado co-5PM marcados células en la médula ósea in vivo. En el día 4 post-trasplante (D) grupos de células marcadas en una amplia variedad de colores eran visibles cerca de la proximidad del borde del hueso (SHG, blanco), preferentemente situado adyacente a la junta entre dos fosas. Durante el día 30 (E) un gran clon de color único (verde - amarillo) se ha ampliado para ocupar toda la fosa, como se ilustra en el combinado, así como imágenes de los canales individuales. Análisis de contenido MF muestra homogénea marcado por 2 MF variantes EGFP y Venus.

Figura 3
Figura 3. Ejemplos de células derivadas de médula ósea en los órganos hematopoyéticos y no hematopoyéticos después del trasplante. Varios tisSues y órganos fueron imágenes intacta a través de profundidades de 150 a 200 micras y grandes superficies, computacionalmente cosidas y prestados en 3D como reconstrucciones de sombra. A) ganglio linfático poplíteo a los 120 días después del trasplante demuestra células dispersas mayormente marcados en amarillo (Venus) y rojo (mCherry) periféricamente rodeado de fibras de colágeno (blanco, SHG). B) Del mismo modo, el bazo, al mismo tiempo, muestra pequeños grupos y células en su mayoría dispersos de diferentes colores entrelazados por fibras de colágeno de la red. C) En las células fluorescentes de hígado con morfología sugerente de las células estrelladas, o macrófagos (células de Kupffer) de varios colores se alinearon a lo largo de la red las fibras de colágeno (SHG blanco) delinear estructuras lobulares hepáticos. D) En un colgajo de piel reflejado a partir de células fluorescentes secundarios dérmica de diversos colores y morfologías fueron vistos, la mayoría con gran tamaño y morfología que sugiere la identidad de Langerhans o dendrítica similar, lying en las fibras de elastina (autofluorescencia en 780 nm, blanco) ya lo largo de colágeno (SHG en 920 nm, blancos) las fibras musculares y los folículos pilosos. E) En el corazón se ve desde el lado del epicardio numerosas células fluorescentes grandes individuales con macrófagos-como la morfología de origen desde múltiples clones basados ​​en los diversos colores que se observan son visibles superficialmente y también intercalados más profunda entre los cardiomiocitos (blanco) visualizados por su intrínseca autofluorescencia de dos fotones (a 780 nm). No se observaron cardiomiocitos fluorescentes de PF. Células cercanas (CE) del mismo color indican en la proliferación in situ y de corta distancia de migración. F) En el pulmón numerosas células fluorescentes con una paleta diversa de colores estaban esparcidos por toda la estructura de encaje de las fibras de colágeno (GAA) en toda la profundidad niveles, con morfologías variables que sugieren las identidades de células, los macrófagos y neumocitos tipo 2 dendríticas.

Movie 1. 3D reconstrucción de esternal BM a los 4 días post-trasplante Co 5 fps. grupos de células marcadas en gran variedad de colores eran visibles en las proximidades del borde del hueso (SHG, blanco), preferentemente situado junto a la unión entre dos fosas. Por favor, haga clic aquí para ver esta película.

Movie 2. 4D lapso de tiempo esternal BM de dos fotones y microscopía OPO en el día 39 después del trasplante Co 3 fps (Cerulean - blanco, Venus - amarillo, tdTomato - magenta) del hueso (SHG en blanco). Nota varios clones estáticos marcados en amarillo o en combinación amarillo-magenta adyacente al hueso en contraste con las células progenitoras mieloides individuales altamente móviles. Haga clic aquí para ver esta película.

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Discussion

Se describen aquí los detalles de una metodología poderosa recientemente ideado para el seguimiento celular clonal, la combinación de la gran diversidad generada por el marcado con vectores que codifican LEGO 5PM-y de formación de imágenes confocal con tándem y microscopía de 2 fotones para lograr volumétrica y la imagen dinámica en los tejidos vivos combinatoria. Esto se extendió el uso del color basados ​​en FP marcado por la grabación de la identidad espectral confocal en 5 "distintos" canales de 8 bits. Así, la relación relativa de Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, mCherry dentro de cada célula crea una "Colorprint" única para la identificación de la progenie clonal. El etiquetado multicolor por 5 fps aumenta la paleta etiqueta con más diversidad, que se mostró particularmente útil en el estudio de la distribución, contactos, arreglos de baldosas y las interacciones competitivas entre las células o grupos de células del mismo tipo en las muestras de tejidos densos. Combinado con 2 fotones de excitación de las características estructurales intrínsecas de diversos tejidos yórganos, que pueden realizar un seguimiento de color marcado células clonales en su ambiente nativo sin necesidad de fijación y seccionamiento física. La demostración de que las células hijas derivadas de progenitores individuales conservan un distintivo "de color-print" a pesar de la diferenciación y la proliferación se demostró en nuestro estudio publicado, con cientos de células diferenciadas que se encuentran en las colonias individuales in vitro (UFC) que muestran la misma "Colorprint."

Este enfoque combina los beneficios de una sola célula resuelto de imágenes de alta resolución junto con la sección óptica a través de la microscopía confocal. Muy grandes X - Y (mm 2) regiones del volumen intacto el tejido denso pueden ser examinadas mediante la generación de imágenes-de baldosas. Estas imágenes de alta resolución a partir de secciones ópticas se pueden utilizar para reconstruir computacionalmente (automática y "on-the-fly") volúmenes completa en 3D de gran complejidad a profundidades de ~ 30 m, que comprende ~ 20-30 capas de células,vasculares, de huesos y estructuras de colágeno. Reconstrucciones 3D se pueden utilizar para los análisis cuantitativos no invasivos morfométricas de interés biológico. Una advertencia importante señalar es que gran volumen / imágenes de alta resolución es mucho tiempo, por ejemplo de 1 hr por ~ 1 mm 3 de tejido (una fosa del esternón), por lo que recomendamos la imagen no más de 1 ratón por experimento por día en el que la médula ósea, así como diferentes tejidos deben ser examinados en detalle.

Aunque es técnicamente imposible actualmente la imagen de la médula ósea del esternón en el mismo ratón repetidamente en el tiempo, información valiosa se puede conseguir mediante el estudio de ratones individuales en diferentes puntos de tiempo de una cohorte originalmente trasplantado con la misma población de células Lin-transducidas con LEGO. El esternón es un lugar excelente para estudiar la regeneración de la médula ósea debido a su pronta y completa reconstitución hematopoyética, la estabilidad, fácil de seccionamiento, reproducibilidad y gran volumen. Es crítico para llegar a cerca de 50% de eficiencia de la transducción de células Lin-para cada vector individuo FP, antes de proceder con el trasplante de un experimento de formación de imágenes y, a fin de tener suficiente diversidad de colores y FP-que expresan las células para hacer el experimento informativo. Siempre habrá una advertencia de que más de un clon puede por casualidad termina con colorprints similares o idénticos, sobre todo si es la transducción de células ineficientes y muchos tienen sólo uno o dos inserciones. También es importante estar seguro de que cada inyección en la vena de la cola individuo entregado cerca de 100% de la dosis celular.

Esto demuestra la viabilidad de alta resolución 4D vivir estudios dinámicos mediante la combinación múltiple de la exploración de resonancia y time-lapse confocal. Se permite no sólo la caracterización estática de varios clones sino también el análisis de las diferencias cinéticas entre las células marcadas por mismo color. Además demuestra-velocidad de vídeo de imágenes 4D de tres muestras etiquetadas MF emplean doccessfully en tándem Tisa y OPO láser para una mayor eficiencia, menos dañina, la penetración más profunda de tejido vivo, allanando el camino para la imagen intravital 2 fotones. Además, establece una opción valiosa para rastrear las células durante períodos prolongados (meses) la superación de las limitaciones basadas en colorantes actuales. Este enfoque utiliza confocal disponibles comercialmente y de dos fotones microscopio láser y los métodos de análisis de imagen por el usuario interactivo automatizado basado en un paquete de software comercialmente disponible que permite una fácil aplicación en instalaciones de microscopía habituales.

Finalmente, esta metodología no se limita al análisis de HSPCs. Muchos sistemas biológicos podrían beneficiarse de la capacidad de resolver arreglos espaciotemporales de los elementos celulares y estructurales clonal complejos a través de etiquetado multicolor y de formación de imágenes confocal y 2-fotón. La regeneración de órganos, la respuesta inmune, y tumorales metastásicas patrones podrían ser interrogados, sugerir unas pocas aplicaciones potenciales.

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Disclosures

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Production of Viruses
LeGO-Cer2 Addgene 27338 Expression of Cerulean
LeGO-G2 Addgene 25917 Expression of eGFP
LeGO-V2 Addgene 27340 Expression of Venus
LeGO-T2 Addgene 27342 Expression of tdTomato
LeGO-C2 Addgene 27339 Expression of mCherry
Calciumm Phosphate Transfection Kit Sigma CAPHOS-1KT
Tissue culture dish BD Falcon 353003
IMDM Gibco, Life Technology 12440-053
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma F4135-500ML
Pen Strep Glutamine Gibco, Life Technology 10378-016
Centrifuge Tubes Beckman Coulter 326823
SW28 Ultracentrifuge Beckman Coulter L60
Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22 µm) Millipore SLGS033SS
Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation
ACK lysing buffer Quality Biologicals Inc. 118-156-101
Lineage Cell Depletion Kit (mouse) Miltenyi Biotec Inc. USA 130-090-858
LS columns + tubes Miltenyi Biotec Inc. USA 130-041-306
Pre-Separation Filters (30 µm) Miltenyi Biotec Inc. USA 130-041-407
StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500 ml) StemCell Technologies Inc  9650
Murine IL-11 CF R & D Systems Inc 418-ML-025/CF 100 µg/ml is 1,000x
Recombinant murine SCF RDI Division of Fitzgerald Industries Intl  RDI-2503 100 µg/ml is 2,000x
Recombinant murine IL-3 R & D Systems Inc 403-ML-050 20 µg/ml is 2,000x
FLT-3 Ligand Miltenyi Biotec Inc. USA 130-096-480 100 µg/ml is 1,000x
12-well plates, Costar Corning Inc. 3527
Retronectin Takara Bio Inc T100A/B Resuspend at 50 µg/ml
Protamine Sulfate Sigma P-4020 4 µg/ml is 1,000x
Confocal and Two-photon Microscopy
DMEM Lonza 12-614F
1 M Hepes Cellgro, Mediatech Inc. 25-060-CI
Glass bottom culture dish P35G-0-20-C MatTek Corporation P35G-0-20-C
Glass bottom culture dish P35G-0-14-C MatTek Corporation P35G-0-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well Thermo Scientific 155383
Coverslips 22 mm No 2 Thomas Scientific 6662-Q55
Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope Leica Microsystems
Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1,080 nm Coherent
Chameleon Compact OPO laser range 1,030-1,350 nm Coherent
HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) Leica Microsystems
HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) Leica Microsystems
HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersion objective (WD=0.6 mm) Leica Microsystems
Imaris software version 7.6 Bitplane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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