동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

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Neuroscience

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Summary

우리는 라벨 및 신생아 쥐의 유전형과 그들로부터 차의 연결을 문화를 생성하는 절차에 대해 설명합니다. 유전자형은 신속하고 효율적이며 신뢰성 및 자동 핵산 추출 할 수 있습니다. 이 neonatally 치명적인 마우스와 유전자형의 이전 완료를 필요로 그들의 문화에 특히 유용합니다.

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Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

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Abstract

포유류 신경 세포의 형태와 기능의 고해상도 분석은 종종 뉴런의 일차 배양 분석 하였다 개별 동물의 유전자형을 필요로한다. 유전자형되는 신생아 마우스, 빠른 유전자형 레이블, 이러한 마우스의 뇌 신경 세포의 저밀도 문화를 확립 : 우리는 절차의 집합을 설명합니다. 개별 마우스는 성인이 지속되는 장기 식별 할 수 있습니다 문신에 의해 표시되어 있습니다. 설명 프로토콜에 의한 유전자형 빠르고 효율적이며, 좋은 안정성과 핵산 자동 추출 할 수 있습니다. 이 신생아 치사 고통 생쥐에서, 예를 들어 기존의 유전자형 충분한 시간을 사용할 수없는 상황에서 유용합니다. 기본의 연결을 문화가 높은 공간 해상도 이미징 실험을 가능하게 낮은 밀도에서 생성됩니다. 이 배양법 종래 신경 교세포 도금 세포층의 제조를 필요로한다. Protocol은 운동 장애 DYT1 된 근긴장 (ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐)의 마우스 모델에 전체적으로 도포하고, 신경 세포 배양은 이들 마우스의 해마, 대뇌 피질 및 선조체로부터 제조된다. 이 프로토콜은 다른 종의 동물뿐만 아니라, 다른 유전 적 돌연변이 마우스에 적용 할 수있다. 또한, 프로토콜의 개별 구성 요소는 격리 된 서브 프로젝트를 위해 사용될 수있다. 따라서이 프로토콜은 신경 과학뿐만 아니라 생물학 및 의료 과학의 다른 분야에서뿐만 아니라 다양한 응용 프로그램을해야합니다.

Introduction

유전병의 설치류 모델은 정상 단백질과 핵산뿐만 아니라, 이들의 결함의 병태 생리 학적 결과의 생리 기능을 확립하는데 유용 입증되었다. 예로는 주요 세포 기능에 관여하는 단백질 결핍 마우스뿐만 아니라 알츠하이머 질환과 같은 질환의 마우스 모델을 포함한다. 그러나, 특정 유전자 조작 곧 신생아 치사 또는 출생 후 몇 일이 발생할 수 있습니다. 이 경우, 일차 세포 배양 생균 사망 전 배아 또는 신생아 새끼로부터 획득 될 수 있기 때문에 중요한 도구들은 시험 관내에서의 적어도 몇 주 동안 유지 될 수 있으며,이 시간 동안 초기 신경 발달은 다음 수 생화학 적 기능과 형태 학적 실험. 차 배양 들어, 저밀도 뉴런 판형 것이 유익 할 수있다; 이것은 개별 세포체, 수상 돌기 축삭 통로 및 신경 TERMI을 시각화하는 것을 가능하게높은 공간 해상도 NALS. 그러나, 낮은 밀도에서 뉴런의 생존과 분화는 일반적으로 그들이 신경교 영양 세포층에 플레이 팅되는 것을 필요로 공 배양 신경교 의해 컨디셔닝 물리적 그들과 접촉, 또는 배지에서의 부재와 신경 교세포.

아교 세포층에 저밀도의 연결을 문화의 설립은 사전에 신속하고 신뢰할 수 유전자형에 종속 될 수 있습니다 - 몇 일에 대비 몇 시간 내에. 신경 유전자형 미리 준비된 신경교 세​​포층의 것과 일치해야 할 때 속도는 특히 중요하다. 더 구체적인 예로서, 그 유전자형이 새끼 실험의 효율을 최적화하기 위해, 생성 배양에 사용할 것인지를 결정하는 것이 필요할 수있다.

여기에서 우리는 이전의 출판물 2-6, 빠르고 간단하고 신뢰할 수있는 마우스 유전자형에 사용 된 작업 프로토콜을 보여줍니다. 마우스 꼬리와시중에서 판매하는 키트가 사용된다. 이 프로토콜은 조직으로부터의 단일 핵산 추출 단계를 포함하고, ( '정지 용액'), 핵산 정제 공정이나 종단 버퍼의 이용도를 필요로한다. 유전자형이 방법의 신뢰성은 차이 시험편의 개시 량, 동물의 연령 및 PCR 증폭 산물의 길이에 대하여 소개하는 경우 일련의 테스트의 결과를 제시하여 설명한다. 이 키트는 자동 추출 및 신뢰성의 이점을 제공한다.

포괄적 인 위해, 유전자형 생쥐의 장기 식별 문신의 용도도 설명된다. 문신 (표피 하) 피부의 진피 문신 잉크를 적용함으로써 달성된다 7. 절차가 이러한 꼬리 문신 발가락 등 신체의 다른 부분에 적용 할 수 있지만, 신생아 또는 1 일된 쥐의 발바닥 문신에 기술되고,하기 ANIM모든 연령의 루게릭 병. 또한 절차는 신경교 세포층 2,8의 다른 유형의 최적화에 기초하여 제조, 저농도 마우스 뉴런 도금 및 배양 입증 될 것이다.

(; p.Glu302del / p.Glu303del c.904_906delGAG / c.907_909delGAG) 9 유전자 TOR1A의 돌연변이에 의해 발생하는 상 염색체 지배적 인 운동 장애 - 우리는 상속 된 신경 학적 장애 DYT1의 근육 긴장의 유전 마우스 모델을 사용하고 있습니다. 단백질 전개, 단백질 복잡한 분해, 막 인신 매매 및 소포 융합 : 인코딩 된 단백질, torsinA는, 누구의 회원 일반적으로, 보호자와 같은 기능을 수행에서 지원 (단 +) 단백질의 가족, "다양한 세포 활동과 연관 -ATPase를"에 속하는 10-13. 돌연변이 글루탐산에 대한 코돈의에서 프레임 삭제하고 따라서 '조기 발병 일반화 고립 된 근육 긴장 이상'14, 15의 발현으로 이어질 수 있습니다. 그러나, 경로이 질환에 대한 책임 ophysiological 메커니즘을 제대로 이해 남아있다. 녹아웃 마우스 모델에서, 돌연변이 대립 유전자 Tor1a ΔE로 이하 언급 Tor1a tm2Wtd이다. 이형 ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐 DYT1의 근육 긴장 이상으로 실행 가능하고 유 전적으로 모방 인간의 환자이며, 반면에 동형 접합 노크에 쥐가 유전 적 배경 (18)에 의해 영향을받는 출생 후 사망에 대기 시간, 출생 16, 17 후 죽는다. 동형 접합 노크에서 마우스의 조기 사망은 동물의 유전자형과의 연결을 문화의 설립이 모두 빠르게 완료되었는지 필요로한다. 유전자형의 다른 예로서, Tfap2a (전사 인자는 AP-2α, 인핸서 2α 단백질 결합을 활성화하는) 사용될 것이다. 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 증식, 분화, 생존 및 사멸 (19) 같은 다수의 세포 과정을 조절하는 것이 중요하다.

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Protocol

참고 : 본 연구에서 수행되는 모든 동물 절차는 아이오와 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

발 패드를 문신 사용하여 마우스 1. 장기 식별

  1. 실험에 직면 발 패드 (발바닥 표면)과 발을 고정. 엄지 손가락과 집게 손가락으로 발바닥을 잡아. 발을 끼지 않도록주의하십시오.
    주 : 안정 고정화 문신 안료 발 패드의 진피 내로 배치되도록하는 것이 중요하고, 따라서 영구 7이다.
  2. 거즈 스폰지 또는 면봉에 70 % 에탄올로 발 패드를 면봉.
  3. 면봉에 스킨 오일을 적용하고 부드럽게 발 패드 차례의 표면에 대한 팁을 누릅니다. 피부 오일의 소량만을 사용; 존재하는 경우 다량으로, 그것은 피부에 도달하는 문신 안료를 방지 할 것이다.
  4. 직전 문신 잉크로 문신 바늘의 팁을 찍어문신에. 통증 및 감염의 가능성을 감소하고, 또한 문신 효율을 높이기 위해, 깨끗하고 선명한 무균 문신 바늘을 사용한다.
  5. 발 패드 표면은 피부의 기름으로 덮여 있지만, 발 패드의 중앙에 수직으로 피부에 가볍게 문신 바늘 팁을 누르고, 여러 번 잉크를 분사. 전기 문신 시스템에 대한 자세한 내용은 재료 / 장비의 표를 참조하십시오.
  6. 부드럽게, 거즈 스폰지에 70 % 에탄올 스프레이 피부 표면에 여분의 문신 색소를 제거하는 발에 대해 그것을 누르고, 문신의 품질을 검사합니다. 발 패드의 중간 정상 피부 착색과 다른 어두운 둥근 반점을 가지고 있는지 확인하십시오. 문신 어둡거나 쉽게 볼 충분하지 않은 경우, 종래 문신 단계를 반복한다.

고속 PCR 유전자형 키트를 사용하여 2. 유전자형 신생아 마우스

  1. 70 % 에탄올 마우스 꼬리의 말단부 소독 꼬리 5mm 이하 잘라팁 및 PCR에 사용 된 형태의 8 튜브 스트립의 튜브에 옮긴다. 시편 간의 교차 오염을 방지하기 위해 각 강아지 미사용 면도날을 사용한다. 대안 적으로, 가위를 사용하지만,이 경우에는, 빠짐없이주의 70 % 에탄올을 사용하여 블레이드의 나머지 조직을 제거. 출혈을 확인합니다. 출혈이 발생하면 출혈이 멈출 때까지, 거즈 스폰지로 꼬리의 절단 부분에 압력을 적용합니다.
  2. 표본을 포함하는 각 PCR 튜브에 DNA 추출 용액 200 μl를 추가합니다. 키트에 대한 조성 및 정보 재료 / 장비의 표를 참조하십시오.
  3. PCR 서멀 사이 클러로 튜브 스트립을 배치하고, 다음 프로그램을 이용하여 DNA 추출을 시작하는 1 사이클을 55 ° C에서 10 분, 10 분 동안 95 ° C에서 1주기, 4 ℃에서 들고.
    주 :이 나중에 PCR에 사용 된 것과 동일한 PCR 서열 증폭기이다.
  4. DNA 추출이 완료되면, 유전자 증폭기의 튜브로부터 스트립을 제거차 5 번 반전.
  5. 미사용 8 튜브 스트립의 튜브 및 혼합 각 시편의 전송 솔루션 (DNA 추출물)의 4 μL : 2X PCR 준비 믹스 II의 10 μL, 앞으로 및 역방향 프라이머를 혼합 2 μL (에 권장 0.5 μM, 각 시료에 대한 핵산 분해 효소가없는 H 2 O의 시퀀스 재료 / 장비의 표 참조), 4 μL. 탁상 형 원심 분리기를 사용하여 스핀 짧게 (예를 들어, 3 초). 처리하는 경우를 제외하고는 항상 얼음에 튜브를 유지합니다.
  6. 열 순환을 수행합니다. 참조 열 프로그램에 대한 재료 / 장비의 표.
  7. 증폭 된 DNA의 제품을 감지합니다. 직접 아가 로스 젤의 우물에 PCR (20 μL)에서 총 반응 액을 넣습니다. 별도의 우물에 분자량 마커를로드합니다. 전기장을 적용합니다.
  8. 자외선 아래 밴드의 형광 이미지를 획득.

마우스 뇌 신경 세포의 3 차 문화폐해 세포층에의

참고 : 뇌 해부 및 세포 해리 (3.1)에 대한 절차는 모든 후속 절차에 공통입니다. 마우스 아교 세포 배양을위한 절차 (3.2), 쥐 아교 세포 배양 (3.3), 마우스의 연결을 문화 (3.4) 이후에 별도​​로 설명되어 있습니다.

  1. 뇌 해부 및 세포 Dissocaiation
    1. 신속하게 뇌를 제거하고 행크스 '솔루션으로 배치, 잘린 하나의 마우스 또는 쥐 새끼를 희생 (조성은 표 1 참조) + 20 % (얼음에 보관) 35mm 접시에 소 태아 혈청 (FBS).
    2. 두 개의 반구로 중간 선을 통해 뇌를 잘라. 뇌의 각 반구에서 관심 영역 (예를 들어, 대뇌 피질, 선조체 (striatum)와 해마)를 제거합니다. 표면의 수막 및 주요 혈관을 제거합니다. 수술 블레이드를 사용하여 4-10 얇은 조각으로 뇌 영역을 잘라.
    3. 재치되면, 15 ML의 원심 분리 관에 뇌 조각을 씻어시간 행크스 '솔루션 + 20 % FBS, 행크스와 다음 3 회'(혈청이없는 즉,) 솔루션 (4 ° C에서). 린스 5-10 ml의 용액을 추가 슬라이스 튜브 바닥에 침전 뇌, 위에서 용액을 흡인하도록하고 신선한 용액을 첨가한다. 솔루션을 흡입하여 세척 절차를 마칩니다.
    4. 3 ㎖ 주사기가 0.2㎛ 시린지 필터를 사용 트립신 - 함유 소화 용액 (조성은 표 1 참조) 2 ㎖를 여과하고 뇌 조각을 함유하는 튜브에 직접 여액을 추가한다. 트립신은 실온에서 13 분 동안 진행하자.
    5. 그것의 대부분을 흡입하여 다음 7 ~ 10 ml의 행크스 '솔루션 + 20 % FBS (4 ° C)의 추가하여 먼저 트립신 용액을 중화.
    6. 행크스 두 번, 뇌 조각을 씻어 '솔루션 + 20 % FBS 및 행크스와 3 회'솔루션 (즉, 혈청없이) (4 ° C에서). 오디오 솔루션을 흡입하여 세척 절차를 완료이온.
    7. 3 ㎖ 주사기가 0.2㎛ 시린지 필터를 이용하여 해리 용액 (조성은 표 1 참조) 2 ㎖를 필터링 및 뇌 슬라이스 튜브에 직접 여액을 추가한다.
    8. 기계적으로 보이는 조직 조각이 사라질 때까지 부드럽게, 10 ~ 20 시간을 분쇄하여하여 세포를 떼어 놓다. 솜 연결, 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 분쇄하는 동안 거품을 피하십시오.
    9. 작은 조각이 정착을 위해 3 분을 기다립니다.
    10. 용액의 대부분을 이동시켜 (~ 1.5 ㎖, 하단 일부 용액을 떠나)을 사용하여, 3 ㎖ 행크 용액 + 20 % FBS 용액 (39 °의 C)를 포함하는 15 ml의 원심 분리 튜브에 목화 꽂혀, 방화 광택 파스퇴르 피펫. 맨 아래에있는 퇴적물의 포함은 일반적으로 문화의 저하를 초래하기 때문에 모든 솔루션을 전송하지 마십시오.
    11. 4 ° C에서 ~ 185g (~ 1,100 RPM)에서 13 분 동안 원심 분리기.
    12. 조심스럽게 뜨는을 대기음,추가 1 ml의 미리 예열 펠릿 중간 (37 ° C)을 도금, 부드럽게 솜 연결, 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 여러 번 피펫 팅하여 재현 탁.
      주 : 매체 도금 세 종류의 다른 배양 목적에 사용된다 : 마우스 뉴런 배지 -2- 도금, 마우스 신경교 세포 용 배지 -1- 도금 및 래트 뉴런 및 신경교 세포 배지 -3- 도금 (조성물은 표 1을 참조) .
    13. 또는 자동 혈구 세포 계수기를 사용하여, 세포 현탁액 10㎕를 꺼내 0.4 % 트리 판 블루 용액 10 μL와 혼합하고, 생균의 밀도를 측정한다.
  2. 마우스 폐해 문화
    1. 마우스 세포의 건강한 문화를 확립하는 데 도움이 된 커버를 세척 할 것.
      1. 유리 페트리 접시에서 70 % 질산에 커버 글라스 (원형, 12mm 직경)을 담근다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하고, 진탕 기의 O / N에 놓습니다.
      2. 유리 coversli을 씻어증류수로 페트리 접시에서 PS 세 번 이상. 증류 된 물에 담가. 진탕 O를 /의 N에 접시를 놓습니다.
      3. 생물 안전 캐비닛 와트 150mm 필터 종이에 커버 슬립을 건조.
      4. 커버 슬립을 압력솥.
      5. 24 웰 배양 접시로 된 커버를 놓습니다.
    2. 1 단계와 2 단계에 따라 레이블 및 유전자형 신생아 쥐.
    3. 3.1 단계에 따라, 마우스 새끼의 뇌 세포를 얻습니다.
      참고 : 대뇌 피질의 사용은 마우스 아교 세포층을 준비하기위한 전형이다. 그러나, 해마 및 선조체 같은 다른 뇌 영역은 인해 상이한 개수 및 상이한 영역에서 세포의 수율 셀 밀도의 조정 후 적절한 작동 할 것이다.
    4. 미리 예열 최종 세포 현탁액 중간-1 도금 ~ 4 ML을 추가 (1 ~ ㎖). 사전 온난화 문화 미디어의 경우, 문화 인큐베이터에서 솔루션 (5 % CO 2 -95 %의 O 2, 37 ° C) O / N,에 배치온도와 산도 값이 안정 될 수 있도록.
    5. 목화 연결, 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 코팅 T25 문화 플라스크에 세포 현탁액을 전송합니다. 문화 인큐베이터에서 플라스크를 놓습니다.
    6. 시험 관내 (DIV)에서 일일에서 두 번 도금와 T25 플라스크에서 배양 된 세포를 씻어 매체-1 (4 ° C). 인큐베이터로 플라스크를 놓습니다. 소용돌이 모션에서 여러 번 새로운 배지의 ~ 5 mL를 추가, 완전히 파스퇴르 피펫, 플라스크 내부 매체를 흡입 조심스럽게 플라스크를 기울여 세척 수행합니다.
    7. 6-9 DIV에서 (즉, 하나의 트립신 전날과 3.2.8-3.2.13 단계에서, 된 커버에 도금), (세포 외 기질 단백질로 코팅 재료의 100 μl를 배치에 대한 의견을 재료 / 장비의 표를 참조 코팅 배양 접시에서 커버 글라스에 재료), 그리고 문화 인큐베이터에서 배양 접시를 놓습니다.
    8. DIV 7-10에서, 세포를 20-4 때0 % 합류 (공간적으로 연속)는 이들을를 Trypsinize.
      1. 플라스크 내의 모든 솔루션을 흡입하고 ~ 행크스 '솔루션 (4 ° C)의 13 ml에 추가하여, 한 번 플라스크를 씻어 부드럽게 소용돌이 치는 동작으로 플라스크를 여러 번 기울 완전히 솔루션을 대기음.
      2. 4 ml의 트립신 EDTA 용액에 DNase의 용액 (최종 농도 750 단위 / ㎖)의 40 μL를 추가 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 용액을 통과하고, 플라스크 내의 세포에 직접 여액을 추가한다.
      3. 트립신은 인큐베이터에서 37 ° C에서 13 분 동안 진행하자.
      4. 플라스크에 100 % FBS (39 ° C) 2 ㎖을 첨가함으로써 트립신을 중화 용액.
      5. 행크스 '솔루션 + 20 %의 FBS (4 ° C)에서 원심 분리기 ~ 4를 가하여 5 ~ 10 ㎖의 피펫을 사용하여 15 ㎖의 원심 분리 튜브에 트립신 세포로 이동 ~ 185g, 13 분 동안 4 ° C 상층 액을 대기음.
    9. 사전 warme 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁D 도금 매체-1.
    10. 단계 3.1.13에 따른 세포의 밀도를 측정한다.
    11. 커버 슬립에 재현 탁 ~ 신경교 세​​포의 50 μL를 도포 커버 글라스 완전히 재료 및 기음 플레이트.
      참고 :이 세포는 아교 세포층을 설정합니다.
    12. 인큐베이터 된 커버와 배양 접시를 놓습니다.
    13. 20 ~ 60 분 후, 미리 예열이 잘 각 매체-1 도금 1 ㎖를 추가하고 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 주 : 도금 배지 첨가 동안, 커버 슬립이 배지에서 부유하지 않도록, (어떠한 도금 세포가없는) 커버 슬립의 주연을 눌러 다른 피펫을 사용하는 것이 도움이 될 것이다.
    14. (유리 커버 슬립에서 예) 폐해 세포층 1 DIV에서 1 ml의 배지를 교체 미리 예열 도금 중간 1 웰 모든 용액을 흡입 한 다음 신선한 배지로 채워서.
    15. 아교 세포층의 2-3 DIV에서 때 CEL각 웰에 따라서 DNA 복제 및 행을 억제하기 위해, LS는 유사 분열 억제제 (81.2 및 204.8 μM의 최종 농도 각각 5- 플루오로 -2'- 데 옥시 우리 딘 + 우리 딘의 혼합물을 10 μL)을 추가 80-100 %의 합류 아르 신경교 세​​포 증식을 억제.
    16. 세포 90-100 %의 컨 플루 언트 (폐해 세포층에 뉴런 도금 전 1-2 시간) 7-9 DIV 경우에서와 배지를 교체 미리 예열 도금 중간이 (37 ° C).
      주 : 뉴런 단계 3.4를 사용하여, 같은 날에 플레이 팅한다.
  3. 쥐 폐해 문화
    1. 코트 같은 도료와 T25 플라스크 배양.
      주 :이 단계 3.3.5 비 부착 세포의 제거 이후에​​ 필요하다.
      1. 플라스크에 코팅 재료의 2.0 ML을 추가하고, 문화 인큐베이터에서 플라스크를 배치합니다.
      2. 2-3 시간 후, 플라스크의 바닥 건조가되도록 완전히 도료 대기음.
    2. 세포를 얻기래트 새끼로부터 3.1 단계에있어서.
      주 : 해마 CA1-CA3 영역 래트 신경아 피더 층의 제조에 사용된다. 그러나, 대뇌 피질 및 선조체 같은 다른 뇌 영역은 인해 상이한 개수 및 상이한 영역에서 세포의 수율 셀 밀도의 차이를 보정 한 후에 작동 할 것이다.
    3. 미리 예열 최종 세포 현탁액에 중간 3 도금 ~ 4 ML을 추가 (1 ~ ㎖).
    4. 목화 연결, 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 코팅 T25 문화 플라스크에 세포 현탁액을 전송합니다. 문화 인큐베이터 (5 % CO 2 -95 %의 O 2, 37 ° C)에서 플라스크를 놓습니다.
    5. 2-3 DIV에서 세포 20-40 %의 컨 플루 언트 될 때, 단단히 뚜껑을 닫은 플라스크를 흔들어, 미부착 된 또는 약하게 부착 세포를 제거 격렬 ~ 10 배, 용액을 흡인하고, 도금 4-5 mL를 넣은 매체-3 (4 ° C에서). 한 번이 절차를 반복합니다. 예를 들어 (전체 플라스크 바닥에서 배양 된 세포를 검사,완전히 제거된다) 전지 본체의 외부 테두리가 위상 밝다 해당되는 신경을 (나타날 것과 확인하는 위상차 현미경)을 사용. 이러한 세포를 제거하고 인큐베이터에 플라스크를 반환 할 필요 시마다 절차를 반복합니다.
      참고 : 강도와 개별 실험자 다를 수 있습니다 필요한 '쉐이크'의 총 수. 중요한 것은 일련 번호 쉐이크의 총 수를 유지하는 것이 아니라 신경 세포 유사 세포를 제거하는 것을 확인하기 위해이 아니다.
    6. 6-8 DIV에서, 세포 90-100 %의 합류 통로 단계 3.2.8에서 그들을 trypsinizing으로 아교 세포를 때.
    7. 원심 분리 후, 코팅되지 않은 T75 플라스크에 트립신으로 세포를 전송 매체-3 (39 ° C)를 도금의 10 mL를 넣어 배양 이들을 매체에서는-3 (39 ° C)을 도금 한 ㎖에 펠렛을 재현 탁 인큐베이터.
      참고 : 쥐 신경 교세포 두 번 계대됩니다; 대조 마우스 아교 세포는 아칸소그들은 여러 통로 후 건강에 해로운 될 수 있기 때문에 전자는 한 번만 계대. 쥐 신경교 세​​포는 임의의 코팅 재료로 코팅되지 않은 T75 플라스크에서 계대 배양된다. 코팅은 쥐 아교 세포가 너무 빨리 성장하고 나중에 신경 세포의 배양 조건을 저하됩니다 많은 섬 모세포 (추정 뇌실막 세포)를 얻을 수 있습니다.
    8. 플라스크에 아교 문화의 17-19 DIV에서 (즉, 십일일 계대 및 트립신 하루 전날과 3.3.9-3.3.14 단계로 된 커버에 도금 후), (씻지 않은 커버 글라스에 코팅 재료의 100 μl를 배치 라운드, 12mm 직경) 배양 접시에서 배양 인큐베이터에서 배양 접시를 놓습니다.
      참고 : 쥐 아교 세포 배양를 들어, 차이가 있거나 된 커버를 세척하지 않고 배양 결과에 발견되지 않았습니다.
    9. 플라스크에 아교 문화의 18-20 DIV에서 (즉, 계대 후 12 일), 세인트에 따르면, 배양 된 세포를 trypsinizing하여 아교 세포층을 준비EP 3.2.8.
    10. 원심 동안, 커버 글라스에서 완전히 도료 대기음.
    11. 원심 분리 후, 단계 3.1.13 항에있어서, 중간 3 (39 ° C)를 1 ml의 도금에 펠렛을 재현 탁하고, 세포 밀도를 측정한다.
    12. 라이브 104 세포 / ml로 폐해 농도를 조정하고 피복 된 유리 커버 슬립에 아교 세포 현탁액 100 μl를 접시.
      참고 :이 세포는 아교 세포층을 설정합니다.
    13. 20 ~ 60 분 동안 인큐베이터로 된 커버와 배양 접시를 놓습니다.
    14. 각 웰에 중간 3 (4 ° C)을 도금 한 ML을 추가하고, 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
    15. 커버 슬립에 세포 40-80% 합류 때 폐해 세포층 3-4 DIV에서, 상기 예열 된 증식 배지 1 ㎖를 추가 (시토신 β-D 아라 비노 푸라 노 시드를 포함하는 (조성물은 표 1을 참조) ARAÇ, 4 μM의 최종 농도)는 아교 세포 증식을 정지합니다. 플레이트 신경신경교 세​​포층의 7-9 DIV들에서 세포를 이용하여 단계 3.4 60-80 % 컨 플루 언트 (confluent) 상태 인 경우.
  4. 마우스의 연결을 문화
    1. 1 단계와 2 단계에 따라 레이블 및 유전자형 신생아 쥐.
    2. 단계 3.1 마우스 새끼를 사용합니다.
    3. 살아있는 세포 현탁액의 농도를 조절하기 ~하여 2.0 × 105 세포 / ml 미리 예열 매체 -2- 마우스 신경교 세포 도금, 또는 사용하는 금도금 매체 -3- 래트 신경교 세포상의 도금.
    4. 부드럽게 각각의 배지에 균체 현탁액을 첨가하여 웰, 신경교 피더 레이어 상에 세포를 접시. 주의 : 첨가되는 세포 현탁액의 부피는 웰 배양 세포의 목표 수에 의해 결정된다. 예를 들면, 플레이트는 ~ 세포 현탁액 60 μL은 / 웰 12,000 세포를 달성했다.
    5. 뉴런은 도금 후 해결책 변경이 필요하지 않습니다. 문화의 과정을 통해, 내부 O를 가습하여 우물에서 솔루션의 증발을 방지하기 위해주의문화 인큐베이터 바.

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Representative Results

이 프로토콜의 적용 예를 들어, 대표적인 결과는 다양한 실험 조건 하에서 문신, 신뢰할 수있는 유전자형으로 마우스를 라벨 및 아교 피더 레이어에 기본의 연결을 문화를 확립 표시됩니다.

문신

신생아 새끼 (그림 1에서 '신생아') 문신 시스템을 사용하여 발바닥에 표시 하였다. 라벨 3 주에서 명확하게 볼 남아 ( '3 주짜리')과 연령의 32주 ('32 '주 이상 된). 개별 마우스 고유 네 발 (번호 1-16)에 문신의 조합에 의해 그리고 동물 케이지, 또는 더 복잡한 넘버링 스킴에 대한 정보에 의해 식별 될 수있다 (도시 생략).

유전자형

유전자형의 한 대표적인 예는 (그림 2) 표시됩니다. 야생형의 유전자 Tor1a (Tor1a (Tor1a + / ΔE)와 동형 접합 (Tor1a ΔE / ΔE) ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐는 신생아 강아지의 꼬리 클립에서 분리 된 게놈 DNA로부터 증폭되었다. 이 구체 예에서 유전자형 네오 마이신 내성 카세트 (16, 18)의 성공적인 Cre 호텔 재결합 삭제 후 Tor1a 돌연변이 대립 유전자의 단일 34 염기쌍에 loxP 부위의 존재 여부에 기초한다.

게놈 DNA는 최소의 실제적인 시간 추출하고, 다수의 샘플을 동시에 처리 하였다. 추출 부피는 일정하게 유지하고, 따라서, 볼륨 조정은 어떤 테스트 조건의 변화를 수용 할 필요가 없었다. 아래에 설명 된대로 유전자형의 신뢰성, 네 개의 조건에서 테스트되었다.

먼저, 조직의 개시 량의 차이의 영향은 (도 3)을 조사 하였다. 서로 다른 길이의 꼬리가 있었다이유 나이에 이형 ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐 (Tor1a + / ΔE) (~ 3 주)에서 준비했다. 2-5mm의 꼬리 길이는 일반적으로 유전자형 프로토콜에서 권장하는 범위는, 높은 품질의 동일한 유전자형 결과를 주었다. 두 밴드는 야생형과 돌연변이 대립 유전자 (Tor1a +와 Tor1a ΔE, 각각)에 해당합니다.

둘째, 동물 시대에 변화의 효과는 (그림 4)을 조사 하였다. 꼬리는 신생아, 3 주령에서 얻은 하였다 ~ 24 주 된 이형 ΔE-torsinA 노크-에 마우스 (Tor1a + / ΔE). 그들이 출생 16-18 후 몇 일을 죽을 때문에 동형 접합자는 사용되지 않았다. 두 야생형 예상 밴드 Tor1a 돌연변이 유전자는 동물의 연령에 상관없이 (도 4a)를 표시했다. 이 결과의 일반적인 적용은 야생 t에서 두 번째 유전자, Tfap2a (19)를 사용하여 테스트 하였다타 입 마우스 (Tfap2a + / +) (그림 4B).

세째로, PCR 증폭 산물의 길이의 차이의 영향은 (도 5)를 시험 하였다. 이를 위해, 상이한 프라이머 쌍은 증폭 된 DNA가 다른 염기쌍 길이의이되도록, 소정의 유전자를 합성 하였다. Tfap2a 유전자는 지속적으로 다른 앰플 리콘 길이로 검출되었다.

넷째, 두 DNA 추출 방법은 (그림 6)를 비교 하였다. 하나의 방법에서, PCR 스트립 튜브 및 PCR 서멀 사이 클러 (단계 2에서 기재되어 있음)를 사용 하였다. 이것은 자동화 된 병렬 다중 튜브 추출법 (도 6의 '자동')이다. 다중 튜브 스트립 포맷에서 동시에 처리 할 수​​ 있고, PCR 기계 네 온도 단계에서 동작하는 프로그램과 함께 사용되기 때문에, 수동으로 튜브를 전송 추출시의 온도를 변경 또는 여러 개를 사용할 필요는 없다장비. 따라서 많은 시료를 처리하기 쉽다. 이는 (도 6의 '수동') 서, 단일 튜브 추출에 기초하여 상기 제 2 방법과 비교 하였다. 이 DNA 추출시 온도를 제어하기 위해 개별 PCR 튜브 및 별도의 비-PCR 기계 (열 블록 및 수조)를 사용합니다. 이 경우에서, 다수의 단일 튜브는 다중 온도 - 제어 장치를 요구하는 각 단계 후에 새 온도로 이동되었다. 두 경우 모두, Tor1a 유전자는 야생형, 이형과 동형 ΔE-torsinA 노크 된 마우스 (도 6a)에서 분석 한 Tfap2a 유전자는 야생형 마우스 (도 6B)에서 분석 하였다. 두 추출 프로토콜은 동일 유전자형 결과를 수득 하였다.

요약하면,도 3 내지 6에 제시된 결과는 유전자형 VA 방법에도 불구하고 신뢰성 있고 재현 가능한 결과를 달성하는, 강력 함을 입증양 조직, 동물의 나이, 앰플 리콘 길이, 사용 된 추출 프로토콜 riations.

신경 세포의 문화

마우스 아교 세포층에 마우스 신경 세포를 배양를 들어, 절차의 순서는 다음과 같습니다 신경 세포 배양 → 신경 세포 문화 신생아 쥐 → 유전자형 문신 폐해 문화 → (아교 문화 → 용 문신 신생아 쥐 → 유전자형). 쥐의 폐해 세포층에 설립 된 문화의 경우, 괄호의 절차는 건너 뜁니다.

우리는 신경 세포의 생존과 성장에 사전 시드 폐해 피더 층의지지 효과를 조사 하였다. 뉴런의 해마 CA1-CA3 영역, 대뇌 피질의 운동 영역 및 신생아 야생형 쥐의 선조체로부터 수득 하였다. 그들은에 따라, 해마의 CA3-CA1 지역에서 얻은 신경 세포 도금 이전에 접종했다 쥐의 폐해 세포층에 낮은 밀도로 도금했다도 7에 도시 계획 (절차의 간소화 요약). 저밀도 배양, 높은 공간 해상도의 세포체 4,6- 신경 축삭 단자 2,3,5,8 샤프트 (5)를 개개의 촬상 수지상에 최적이다. 해마 세포 (뉴런 및 신경교 세포를 모두 포함) 중 하나 (도 8a) 또는 미리 설정된 신경교 세포층 (도 8B, C)없이, 피복 된 유리 커버 슬립 상에 플레이 팅하고 위상차 광학 관찰되었다. 거의 합류 아교 피더 층의 존재에서, 뉴런 (각 패널은, 화살촉 한 대표적인 신경을 나타냄) 상대적으로 (in vitro에서 일, DIV) (그림 8A)을 도금 한 후 3, 7 일 분산시켰다. 그들은 또한 신경 세포체의 명확한 마진, 확장 돌기, 세포체 클러스터의 부족, 그리고 번들 신경 돌기의 부족으로 건강의 징후를 보여 주었다 (고배율 IMAG세트에들). 14 DIV에서, 이러한 신경 세포는 긴 신경 돌기 (수상 돌기 및 축삭)을 특징으로하는 고밀도 네트워크를 형성했다. 뉴런은 유사 분열 억제제 ARAÇ (단계 3.3.15)를 함유하는 성장 배지를 첨가하여 배양 하였다 전에 신경교 증식 억제 참고.

대조적으로, 해마 뉴런 도금시의 폐해 피더 층의 부재 하에서, 배양 된 해마 뉴런의 성장에도 ARAÇ의 부재에서 손상되었다. 3 DIV에서 (새로 도금 해마 세포에 포함) 아교 세포 (도 8b의 상단 패널에 별표) 합류 시트를 형성하지 않았습니다. 배양은 기본 교세포 (별표)없이 넓은 영역으로서 고해상도 영상 검사, 적합하지 않은 여러 징후, 클러스터 세포체의 존재 및 일부 지역 번들 신경 돌기의 존재를 보였다 (데이터는 보이지 않음). 7 DIV으로 아교 세포 합류 시트 (도 8c의 가운데 패널) 형성. Howev어, 신경 세포는 신경 세포가 미리 설정된 폐해 세포층에 도금 때 수보다 적었다. 살아남은 뉴런은 긴, 네트워크 형성 신경 돌기 (삽입)를 부족. 신경 교세포 따라서 위상 밝은 나타나는 세포층 문화에 비해 곡률과 두께가 더 이기종했다. 신경 아교 세포 증식에​​ 억제 효과를 시험하기 위해, 우리는 성장 배지를 함유 ARAÇ가인가. ARAÇ가 3 또는 7 DIV에 첨가하고, 세포를 14 DIV까지 배양하고,이 날 (도 8BC, 하단 패널)에서 관찰 한 결과, 글 리아 세포는 커버 슬립의 표면의 대부분을 커버. 그러나, 신경 ARAÇ가 7 DIV에 적용 특히, 여전히 수의 몇했다. 살아남은 신경 세포는 짧은 프로세스를했다 광범위하게 연결되지 않았다. 따라서, ARAÇ의 후반 추가 형성하기 위해 균일 한 아교 층을 허용하지만 신경 세포의 생존 또는 신경 돌기의 확장을 촉진하지 않았다; 통제되지 않은 폐해 성장이 아니라신경 세포에 유해한 영향이 있었다.

이러한 데이터는 신경교 세​​포층은 저밀도 도금 뉴런의 생존 및 성장을 위해 중요하다고하고, 신경 아교 층 이상 동안 배양 신경보다는 도금시에 존재해야 것을 보여준다. 유사한 결과는 대뇌 피질의 문화 (그림 9)와 선조체 신경 세포 (그림 10)를 사용하여 얻었다.

신경 세포의 생존에 대한 정성적인 관찰은 정량 분석​​에 의해 확인 하였다. 구체적으로는,도 14에서 DIV 살아남은 신경 세포 수는 배양의 위상차 이미지 (도 11)에 기초하여 계산 하였다. 수는 아교 세포층에서 배양 신경 세포 (예., 아교 세포층에 도금)에 대한 가장 큰했다. 숫자는 신경교 피더 층의 부재 하에서 배양 된 신경 세포의 경우에 낮았다. 세포에서 처리 하였다 ARAÇ 때 개수가 더 감소시켰다나중에. 이러한 차이는 통계 학적으로 유의 한 차이를 보였다, 그리고 세 개의 뇌 영역에서 얻은 뉴런의 문화에서 관찰되었다.

생존 세포 유형은 배양 된 해마 래트 해마 영양 세포층에 플레이 팅 14 DIV 마우스에서 확인 하였다. 두 번 면역 세포는 신경 세포 마커에 대해, 미세 소관 - 관련 단백질 2 (MAP2)을 항체를 사용하여 수행되었다 성상 아교 세포 마커, glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP). 기본 폐해 피더 층 세포 GFAP (대표 화상 개의 필드,도 12A) 양성인 반면 확장 프로세스와 세포, MAP2 양성이었다. 이차 항체의 다른 세트는 (도 12B)을 이용한 경우와 동일한 패턴을 얻었다 때문에 염색, 일차 항체 및 이차 항체의 특정 조합의 이슈가 아니었다.

대조적으로, 동일한 염색 PERFO 때첨가 마우스 세포 (대표 화상 개의 필드,도 13a)의 부재 만 신경교 피더 레이어, 즉 이루어진 배양 rmed에 어떠한 세포 MAP2 양성 없었다. 피더 층 세포 일관 GFAP 양성이었다. 음성 대조군의 경우 두 차 항체는 면역 세포 화학 절차 (그림 13B)에서 생략되었다. 세포가 존재하지만 어떤 염색 투과광 광학​​ (미분 간섭 대비, DIC) 및 훽스트 염색 핵 염색로부터도 알 수있는 바와 같이,이 시료에서 검출되지 않았다. 따라서, MAP2와 GFAP 채널에서 비특이적 염색은 매우 약했다.

이러한 면역 조직 화학적 데이터는 정량적으로 (도 14)를 분석 하였다. 각각 8 비트의 화상에서, 강도를 측정하고, 선을 따라 플롯. 마우스 세포 (뉴런을 포함하는 샘플) (신경 세포 + 아교 세포층에서 배양 할 때 오버레이 플롯, MAP2 염색을 공개글 리아 +, 이러한 염색은 혼자 아교 피더 세포의 배양 (신경 세포에 결석 반면 일차 항체 (1 ° AB) +), -, 글 리아 + 1 ° Ab의 +). (- 1 ° Ab의, 아교 + - 신경 세포) 차 항체가없는 음성 대조군에서, 염색은 혼자 폐해 피더 세포의 문화 무시할 수 있었다. GFAP 염색에 관계없이 마우스 세포를 도금했다 여부, 아교 세포층에 분명했다 (신경 세포 +, 글 리아 + 1 ° Ab의 +) 또는하지 (신경 - 글 리아 + 1 ° Ab의 +). 또, 음성 대조군의 염색 (신경 - 글 리아 + 1 ° Ab의 -) 무시했다. 이러한 결과는 래트 신경아 세포층 주로 성상 세포로 이루어지는 것을 보여주고, 뉴런 존재 생쥐 세포를 첨가 할 때만. 또한 이러한 문화에 존재하는 신경 세포가 마우스만으로 유래을 나타냅니다.

온라인 비디오의 결과 섹션도 보 아교 피더 층에 도금 배양 신경 세포의 DIC와 MAP2 이미지를 보여줍니다제 야생형 마우스의 해마 CA1-CA3 영역으로부터 제조.

세포 배양의 상세한 제어를 들어, 두 뇌 절개 및 세포 해리 단계들의 일반적인 품질을 평가하고, 미리 결정된 농도로 세포에 도금 생균의 밀도를 측정하는 것을 추천합니다. 전형적인 밀도 측정의 네 세트 아래 나열된. 이러한 숫자는 배양 조건 및 시약에 따라 다를 수 있다는 점에 유의. 예를 들어, 동일한 벤더로부터의 상이한 혈청 심지어 많은 결과에 영향을 줄 수있다. 따라서, 이들 수치는 일반적으로 표시하기보다는 절대적 지침 고려되어야한다.

세포 해리 (단계 3.1.13)의 경우, 하나의 새끼로부터 얻은 살아있는 세포 밀도에 대한 통상적 인 값은 다음과 같다 : 1 ~ 2 × 105 세포 / ㎖ (마우스 운동 피질 및 마우스 CA3-CA1 해마) ~ 5 × 105 세포 / ㎖ (마우스 대뇌 피질과 쥐 CA3-CA1 해마),와 ~ 1 × 6 CELL 학생 / ㎖ (마우스 선조체). 이러한 모든 경우에, 생균의 분획 (세포의 총 수의 생균 수의 비율로 정의, 생존)> 90 %이었다. 운동 피질은 느슨하게 즉시 선조체 (20)에 지느러미 거짓말 대뇌 피질의 영역으로 정의된다. 해마 문화를 들면, 해마의 CA3 및 CA1 영역은 적절한 것이 바람직하다. 전체 해마는 추가로 과립 세포의 큰 신경 터미널의 형성을 유도하고 시냅스 속성 (21)에 이성을 소개 포함하는의 치아 이랑 (dentate gyrus)를 포함한다. 선조체의 문화는 미상 - 피질과 글로 창백 포함되지만 핵 중격 의지를 포함, 또는 인근 구조에 내측 또는 외측 중격 핵하지 않습니다.

마우스 신경교 배양 (단계 3.2.11)의 경우, 도금 밀도는 ~ 2 ×의 밀도로 각각 12 mm의 커버 슬립 라운드 ~ 10,000 교세포 사용 ~ 세포 현탁액 50 μL 인105 세포 / ㎖. 일반적으로 상등액에서 측정 된 밀도가 비교적 일정하며 조정을 필요로하지 않는다. 서로 다른 영역을 통해 밀도를 변환하려면, 유용한 정보는 커버 슬립이 1.20 cm 직경 및 1.13 cm 2의 영역을 갖는다는 것이다. 따라서, ~ 10,000 세포 / 커버 슬립 = ~ 8,800 세포 / 커버 슬립에 cm 2.

래트 신경교 배양 (단계 3.3.12)의 경우, 도금 밀도는 ~ 1 × 104 세포 / ml의 밀도로 세포 현탁액 ~ 100 μL를 사용하여 각 12 mm 둥근 커버 슬립에 교세포 ~ 1000이다. 따라서, 1,000 세포 / 커버 슬립 = ~ 900 세포 / 커버 슬립에 cm 2.

저밀도 신경 세포 배양 마우스 (단계 3.4.4)의 경우, 도금 밀도는 24- 웰 플레이트의 웰 당 2000 내지 48,000 세포의 범위이다. 쥐 아교 세포에서 신경 세포를 도금 일반적인 값은 다음과 같습니다 10,000-24,000 세포 / 웰 대뇌 피질 뉴런, 12,000-24,000 세포 / 웰 CA3-CA1 해마 신경 세포 및 2잘 선조체 신경 세포에 대한 4,000-48,000 세포 /. 마우스 신경교 세포 도금하면 수가 감소되고, 예를 들면, 2000 세포 / 웰 대 CA1-CA3 해마 뉴런. 첨언, 래트 신경아 세포층에 래트 해마 CA1-CA3 뉴런을 위해 도금, 도금 밀도 / 웰 1,000-6,000 세포이다. 커버 슬립에 밀도 웰 밀도 변환, 유용한 정보는 하단 웰 내부 직경이 1.56 cm이고, 그 면적은 1.91 cm (2)로되어있다. 따라서, 예를 들어, 12,000 세포 / 웰의 세포 = 7100 / 6300 = 세포를 커버 슬립 커버 슬립 온 / cm 2. 이 밀도는 세포의 고해상도 영상화 비교적 성긴 뉴런을 배양 할 목적으로 선택되었다. 연구진은 가장 자신의 실험 목적에 맞게 자신의 번호를 선택해야합니다.

그림 1
그림 마우스 1. 문신 발 패드. Newborn 마우스 발 패드를 문신으로 표시했다. 그들은 (3 주령) 시대의 삼주에서, 문신 (신생아) 직후 촬영과 나이 (32 주령) 32 주에 있었다. 레이블은 성인기에 걸쳐 쉽게 볼 남아 있었다. 이미지는 다른 동물에서 촬영되었다. 그들은 같은 규모로 표시되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 야생 형의 유전자형 (Tor1a + / +), 이형 (Tor1a + / ΔE)와 동형 접합 (Tor1a ΔE / ΔE) Tor1a 유전자의 대립 유전자가 야생형과 돌연변이 분석 하였다 녹아웃 생쥐. ΔE-torsinA 형태는 사용하는 DNA는 신생아 새끼 꼬리로부터 추출. 티괴롭히다 팁의 길이는 ~ 4mm했다. DNA는 SYBR 안전 DNA 젤 얼룩을 사용하여 염색. Tor1a 유전자에 대한 프라이머 및 열 순환 프로그램에 대한 자세한 내용은 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
출발 물질의 양의 변동의 맥락에서 게놈 DNA의 검출도 3. 테일 길이가 다른 팁을 사용 하였다. 시험 동물 3 주령했다, 이형 ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐 (Tor1a + / ΔE). 레인에서 중복 (왼쪽부터), 2, 3, 4, 5mm의 꼬리 길이를 나타낸다. 꼬리 팁은​​ 상이한 마우스로부터 얻었다. 가장 왼쪽 차선 분자량 크기 마커는 DNA의 길이에 나타낸다100 염기쌍의 TEPS. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
동물 연령 변동의 맥락에서 게놈 DNA의 검출 4. 도표. (A) Tor1a 유전자. (왼쪽에서 중복으로) ~ 24 주 된 3 주 된 신생아 및 (B) : 레인은 다음 단계에서 이형 ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐 (Tor1a + / ΔE)에서 얻은 꼬리 끝을 나타냅니다. Tfap2a 유전자. (왼쪽에서 중복으로) ~ 24 주 된 신생아, 3 주령 및 : 레인은 다음 단계에서 야생형 (Tfap2a + / +) 마우스에서 얻은 꼬리 끝을 나타냅니다. 두 유전자는 꼬리 길이 ~ 4mm에서 증폭되었다. 예상 된 PCR 단편은 498 염기쌍이다. PCR 프로그램 WA Tor1a 유전자에 사용되는 것과 같은이야. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
PCR 앰플 리콘의 길이 변화의 맥락에서 게놈 DNA의도 5 검출. Tfap2a 유전자를 PCR 증폭 물에 498 bp의 길이 (좌측 레인), 983 (BP) (중간 레인) 및 1990 bp의 (우측 차선)에서 분석 한 중복. 유전자는 3 주 된 쥐의 꼬리에서 증폭되었다. 겔의 가장 좌측 및 가장 우측 차선 분자량 크기 마커는 각각 100, 200 염기쌍의 DNA 단계의 길이를 나타낸다. 다른 증폭 산물의 프라이머에 대한 자세한 내용은 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. 879fig5highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
DNA 추출법 변동의 맥락에서 게놈 DNA의도 6 검출. 설명서 성과는 단관 추출 (수동) 및 자동화 된 병렬 다중 튜브 추출 방법 (자동)를 비교한다. 후자의 방법은이 보고서에서 사용되었다. 유전자는 꼬리 신생아에서 수집 길이 ~ 4mm에서 증폭되었다. ΔE-torsinA의 신생아 새끼의 (A) Tor1a 유전자 녹아웃 생쥐. 레인은 (수동 및 자동) 야생 형, 이형 (수동 및 자동), 동형 접합체 마우스 (수동 및 자동) (왼쪽)에서 추출 된 DNA를 나타냅니다. 3 주 된 야생형 마우스 (B) Tfap2a 유전자를. 예상 된 PCR 단편은 498 염기쌍이다.jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
아교 세포가 먼저 문화에 도금 한 후 그림 7. 마우스 (A)와 쥐 (B) 폐해 피더 레이어에 마우스 신경 세포를 도금을위한 절차의 개략도를 단순화. 번호를 일의 (체외에서 일) 누적 일을 참조하십시오 플라스크. 그들은 단지 대략적인 견적 역할을한다. 실제 자세한 내용은 절차 섹션을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
그림 8. 협력적인 효과저밀도 배양 된 해마 뉴런의 성장 신경교 세포층. 뉴런 신생아, 야생형 마우스 해마 CA3-CA1 영역으로부터 수득 하였다. (A) 마우스 해마 세포가 피복 된 유리 커버 슬립 상에 도금 된 해마 CA1-CA3 영역으로부터 얻어진 래트 신경아 세포층가 미리 접종했다. 신경 세포는 건강한 방식으로 균일하게 분산시켰다. 배양액은 3, 7, 14 DIV 관찰되었다. (B, C) ​​마우스 해마 세포에는 미리 설정된 세포층 없었다 코팅 유리 커버 슬립 상에 플레이 팅 하였다. 문화 3 DIV (B의 상단 패널)와 ARAÇ 치료없이 7 DIV (C에서 중간 패널)에서 관찰되었다. 문화의 다른 세트에서 세포를 3 DIV (B의 하단 패널)와 7 DIV (C에서 하단 패널)에 ARAÇ으로 처리하고, 14 DIV에서 관찰. 모든 이미지는 누구의 신경 세포 같은 날에 도금 된 같은 강아지로부터 취득 된 자매 문화를 나타냅니다. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 각 패널의 경우, 전신경 세포의 충분한 흰색 화살표로 표시하고 삽입으로 확대됩니다. 뉴런은 그 둘레 위상차 광학 볼 때 밝게 나타나는 세포 기관을 갖고, 또한 두께 프로세스를 갖는다. 별표는 신경 교세포없이 영역을 나타냅니다. 문화 (1 배속, 즉) 중간 렌즈없이 20 배 대물 렌즈 (0.45 개구)과 위상차 광학을 사용하여 거꾸로 현미경에 살고 군데 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9
저밀도 문화의 대뇌 피질 신경 세포의 성장에 아교 세포층의 그림 9. 협력적인 효과.하지만 C의 모터 지역에서 얻은 뉴런 그림 8과 유사한 결과,erebral 피질. AC는 그림 8에 그에 해당하는 라벨 조건. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10
도 10 저밀도 배양 선조체 뉴런의 성장 신경교 피더 층을지지하는 효과.도 8 및도 9에서와 같이 있지만 선조체로부터 얻은 신경 세포와 비슷한 결과. AC는 그림 8에 그에 해당하는 라벨 조건. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 11 신경 생존 신경교 세포층지지 효과. 살아남은 신경 세포의 수는 위상차 현미경에 의해 취득 된 이미지를 사용하여,도 8에 나타낸 실험에서 계수 하였다. 14 DIV에 대한 이미지는 다시 여기에 표시하지만, 화살촉으로 계산 뉴런의 예를 가리키는. 막대 그래프는 (각 문화의 상태에 따라 7-24 필드를 평균의 표준 오차 평균 ±, N =) 이미지 필드 (449.0 μm의 X 335.5 μm의) 당 뉴런의 수를 보여줍니다. '(-), ARAÇ 3 DIV에 폐해 세포층'와 '폐해 세포층 (-), ARAÇ 7 DIV에'폐해 세포층 (+) '(에서 * P <0.05, ** 별표는 통계적으로 유의 한 차이를 나타냅니다 P <0.01, 짝이없는 학생의 t의 -test). 상술 한 바는 다수의 숫자 이미지의 몽타주 필드 측정 신경 밀도를 나타낸다. 이미지는 있었다20 배 대물 렌즈를 사용하여 인수했다. 취득 바이어스를 피하기 위해, 모든 이미지는 커버 슬립의 위에서 아래로, 완전 수직 스트립을 따라 취득 및 커버 슬립의 대략 중심을 통과 하였다. 개별 이미지는 (위쪽과 아래쪽에 이미지 필드의 1/4로 예, 1/6) 약간 오버랩이 있었다. 두 가지 방법을 분석에 사용 하였다. 하나의 뉴런은 개별 뉴런이 한 번 이상 계산되지 않았 음을 보장하기 위해 이미지를 교대로 계산되었다. 얻어진 번호는 막대 그래프를 생성하는데 사용되었다. 두 번째 방법은, 하나의 몽타주는 개별 이미지에서 만들어졌습니다. 그들은 포토샵을 사용하여 수동으로 Microsoft 이미지 복합 편집기를 사용하거나 스티치되었다. 몽타주도 같은 신경 세포의 여러 수를 제외. 그 결과 번호는 막대 위에 나열되어 있습니다. 두 방법 모두에서, 어떤 세포를 포함하지 않은 커버 슬립 주변에 넓은 지역은 제외 하였다. 그들은 밝은 등장 세포 기관이 있다면 세포는 신경 세포로 계산되었다위상차 현미경뿐만 아니라 확장 된 세포 과정에 의해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 12
신경 세포 배양에서의 세포 유형도 12. 면역 세포 화학적 식별. 배양 조건은도 8a의 하단 왼쪽 이미지에 대응한다. 뉴런은 야생형 쥐의 해마 CA1-CA3 영역으로부터 얻어지고, 야생형 쥐의 해마 CA1-CA3 영역으로부터 생성 신경교 영양 세포층에 플레이 팅 하였다. 배양 된 세포는 신경 세포 마커 MAP2 대한 면역 세포, 성상 세포 및 아교 세포 마커 GFAP로 분석 하였다. 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경, 14 ~ 17 군데 필드의 일반적인 형태를 나타 내기 위해 사용되었다뉴런 후 일이 아교 세포층에 도금했다. (A) 3 색 염색, 핵 마커의 Hoechst 33342 염료로 대조 염색을 포함. 두 대표 이미지 필드가 표시됩니다. (B) 2 색 염색, 다른 형광체가 결합 이차 항체의 다른 조합. CaCl2를, 2 (125)의 NaCl, 2의 KCl, 2의 MgCl 2, (30) D- 글루코스, 25 HEPES, pH가 7.4 :이 실험에서, 배양 된 세포는 타이로드의 용액 (단위 mM 함유 4 % 파라 포름 알데히드 및 4 % 자당과 고정시켰다 5 M NaOH로 조정 ~ 4 ℃에서 30 분 동안 조정없이 310 mOsm). 타이로드의 용액으로 세정 한 후, 10 분 동안의 타이로드 용액에 0.1 % 트리톤 X-100으로 투과 가능 하였다. 이들은 또 타이로드의 용액으로 세척 한 다음, RT에서 60 분 동안 인산염 - 완충 식염수 (PBS) (블로킹 용액)을 2 % 정상 염소 혈청으로 차단 하였다. 그 후 그들은 토끼 폴리 처리 하였다클론 항 MAP2 항체 (AB5622; 차단 솔루션에 400 배 희석) 및 마우스 단일 클론 항 GFAP 칵테일 (NE1015, 1,000 배 희석) O / N (15-21 시간) 4 ° C에서. PBS로 세척에 이어, 세포를 (블로킹 용액 500X 희석) 알렉사 형석 405 결합 염소 항 - 토끼 항 - 마우스 IgG 항체, 알렉사 형석 488 (1000 배) 또는 60 알렉사 형석 568 염료 (500X)와 함께 배양 하였다 RT에서 분. 이들은 PBS로 세척하고 PBS에서 직접 관찰되었다. 일부 문화권에서는, 위의 절차의 최종 세척 후, 세포를 RT에서 10 분 동안 PBS 0.5 ㎍ / ml의에서 훽스트 33342으로 처리하고, 관찰하기 전에 PBS로 세척 하였다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.

그림 13
그림 13. 글로불린nocytochemical 신경교 세포층을 배양 세포 유형 식별.도 12에서와 같이 래트 신경아 세포층의 자매 배양하지만 마우스 뉴런의 도금없이. (A)는도 12a에 기재된 면역 세포 화학적 방법을 사용하여 염색. 두 대표 화상 필드. 도시에서 설명한 절차를 이용하여 면역 조직 화학적 아교 세포층의 (B) 염색 있지만 일차 항체로 생략한다. 도 12A와 13A, B의 모든 이미지는 MAP2 같은 촬상 조건으로 취득하고, 강도의 비교를 위하여 동일한 이미지 콘트라스트에 나타낸다. 같은 절차도 12A13A, B에서 GFAP 이미지를 사용 하였다. 아교 세포층 문화는 그림 12의 문화와 같은 날에 몇 군데 있었다. 따라서 아교 세포층에 13)는 같은 시간에 대한 체외에서 배양 하였다 피규어> g. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 14
면역 조직 화학적 염색의 강도를 14도. 선은도 12 및도 13에 도시 된 이미지 연신을 시행하고, 이들 강도에 따라 플롯 팅되었다. 세트는도 ​​12a의 맨 위 행의 이미지를 보여줍니다. 세 가지 조건이 있었다 : 차 항체 (신경 세포 +, 글 리아 + 1 ° Ab의 +)와 쥐 피더 층과 염색에 마우스 세포 (포함하는 신경 세포)의 1) 도금, 2) 아교 세포층 만 (아무 신경 도금) 일차 항체 (신경 - 글 리아 + 1 ° Ab의 +)와 염색, 3) 아교 공급(-, 글 리아 + 1 ° Ab의 - 신경 세포) 어 만 (더 신경 도금) 및 염색 차 항체가없는 계층 없습니다. 마우스 세포 (조건 1 대 2) 도금 및 아교 세포 염색 (GFAP)의 문화 (조건 1 대 2)의 두 세트에 존재 한 경우에만 신경 세포의 염색 (MAP2)의 존재. 면역 세포 화학 염색은 모두 차 항체 (조건 1 대 3) 특정했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

솔루션
TAE 완충액 (50X 용액)
트리스베이스, 486g
빙초산, 114.2 ml의
0.5 M EDTA, pH가 8.0, 200㎖의
2 L로 전체 볼륨을 가지고 증류수 추가
화학 흄 후드에서 확인합니다.
사용하기 전에 50 배 희석.
행크스 '솔루션
행크스 균형 염, 염화 칼슘, 황산 마그네슘, 중탄산 나트륨이없는 (1 L)에
NaHCO3, 350 mg의 (최종 농도 4.17 mM의)
HEPES, 2.38 g (최종 농도 10 mM의)
5 M의 NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.
(삼투압 어떤 조정없이 ~ 290 mOsm하는 경향이있다) 자당을 사용하여 310 mOsm에 삼투압을 조절합니다.
1 L에 총 부피를 가지고 증류수 추가
(뇌 조직의 트립신 처리를위한) 소화 솔루션
염화나트륨, 800.6 mg의 (최종 농도 137 mM의)
KCl을, 37.3 mg의 (F원고 판 농도, 5 mM의)
2 HPO 4 · (7H 2 O), 187.6 mg의 (최종 농도, 7 mM의)
HEPES, 595.8 mg의 (최종 농도 25 mM의)
포도당, 97.3 mg의 (최종 농도 5.4 mM의)
5 M의 NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.
삼투압은 조정없이 ~ 310 mOsm하는 경향이있다.
100 ml의 총 부피를 가지고 증류수를 추가합니다.
마우스 오른쪽 버튼으로 사용하기 전에, 트립신 20 mg의의 DNase의 20 μL (10 ㎎ / ㎖의 최종 농도) 소화 용액 2 ㎖에 (750 단위 / ㎖의 최종 농도)를 추가합니다.
(뇌 조직의 기계적 분리에 대한) 해리 솔루션
행크스 '솔루션
황산 · (7H 2 O), 295.1 mg의 (최종 concentrati에, 11.97 mM의)
자당을 사용하여 310 mOsm에 삼투압을 조절합니다.
총 부피는 100 mL로한다.
마우스 오른쪽 버튼으로 사용하기 전에, DNase의 분리 솔루션 2 ㎖에 (750 단위 / ㎖의 최종 농도) 20 μl를 추가합니다.
(마우스 신경교 세포에 대한) 중간 한 도금
둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM), 449.5 ml의
미토 + 세럼 익스텐더, 0.5 ml의
FBS, 50 ㎖
총 부피는 500 ml 인 것을.
도금 매체-2 (마우스 뉴런)
로 Neurobasal-A, 485 ml의
B27, 10 ml의
루타-I, 5 ㎖ (최종 농도, 2 mM)을
총 부피는 500 ml 인 것을.
도금 매체 -3- (래트 뉴런 및 신경 교세포의 경우)
(페놀 레드없이 MEM) 최소 필수 미디어
포도당, 2.5 g (최종 농도, 27.8 mM의)
NaHCO3을 100 mg의 (최종 농도 2.38 mM)을
트랜스페린, 50 mg의
FBS, 50 ㎖
루타-I, 5 ㎖ (최종 농도, 2 mM)을
인슐린, 12.5 mg의
총 부피는 500 ml 인 것을.
성장 매체 (쥐의 신경 세포와 신경 교세포에 대한)
(페놀 레드없이) MEM
포도당, 2.5 g (최종 농도, 27.8 mM의)
NaHCO3을 100 mg의 (최종 농도 2.38 mM)을
트랜스페린, 50 mg의
FBS,25 ml의
루타-I, 1.25 ㎖ (최종 농도 0.5 mM)을
B27 또는 NS21 {첸 2008 # 2399}, 10 ml의
사이토의 β-D-아라 비노 푸라 (ARAÇ), 0.56 mg의 (최종 농도, 4 μM)
총 부피는 500 ml 인 것을.
일반 댓글
그들이 배양 아교 세포와 신경 세포 (참고 70, 71)에 대한 세포 독성 효과를 발휘할 수 있기 때문에 우리의 문화 미디어는 항생제가 포함되어 있지 않습니다. 이것은 특히 중요 문화 관련 업무 절차를 멸균을 준수 할 수 있습니다.
화학 물질의 자세한 소스에 대한 시약의 표를 참조하십시오.

표 1. 솔루션

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
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