המהיר Genotyping של בעלי חיים ואחרי הקמת תרבויות עיקריות של נוירונים במוח

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אנו מתארים נהלים לתיוג וgenotyping עכברי יילוד ויצירת תרבויות עצביות עיקריות מהם. Genotyping הוא מהיר, יעיל ואמין, ומאפשר למיצוי גרעין חומצה אוטומטי. זה שימושי במיוחד עבור עכברי neonatally קטלניים והתרבויות שלהם שדורשות השלמה מוקדמת של genotyping.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ניתוח ברזולוציה גבוהה של המורפולוגיה והתפקוד של תאי עצב ביונקים לעתים קרובות דורש genotyping של בעלי חיים בודדים ואחרי הניתוח של תרבויות העיקריות של תאי עצב. אנו מתארים מערכת של נהלים ל: תיוג עכברי יילוד להיות genotyped, genotyping המהיר, והקמת תרבויות בצפיפות נמוכה של תאי עצב במוח מעכברים אלו. עכברים בודדים מסומנים על ידי קעקוע, שמאפשר זיהוי לטווח ארוך שנמשך לבגרות. Genotyping על ידי הפרוטוקול המתואר הוא מהיר ויעיל, ומאפשר להפקה אוטומטית של חומצות גרעין עם אמינות טובה. זה שימושי בנסיבות שבו זמן מספיק לgenotyping הקונבנציונלי אינו זמין, למשל, בעכברים הסובלים מהקטלניות בילוד. תרבויות עצביות עיקריות נוצרות בצפיפות נמוכה, המאפשרת ניסויי הדמיה ברזולוציה מרחבית גבוהה. שיטת תרבות זו דורשת ההכנה של שכבות מזין גליה לפני ציפוי עצבי. Protocol מיושם במלואו למודל עכבר של דיסטוניה DYT1 הפרעת תנועה (העכברים לדפוק בΔE-torsinA), ותרבויות עצביות מוכנות מן ההיפוקמפוס, קליפת המוח וסטריאטום של עכברים אלו. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על עכברים עם מוטציה גנטית אחרת, כמו גם לבעלי חיים ממינים אחרים. יתר על כן, רכיבים בודדים של הפרוטוקול יכולים לשמש למשנה פרויקטים בודדים. כך פרוטוקול זה יהיה יישומים רחבים, לא רק במדעי המוח, אלא גם בתחומים אחרים של מדעים ביולוגיים ורפואיים.

Introduction

מודלים של מכרסמים של מחלות גנטיות הוכיחו שימושיים בהקמת הפונקציות הפיזיולוגיות של חלבונים וחומצות גרעין נורמלים, כמו גם את השלכות pathophysiological של פגמים באלה. דוגמאות כוללות עכברים חסרים לחלבונים מעורבים בתפקודים תאיים מפתח, כמו גם מודלים של עכברים של הפרעות כגון מחלת אלצהיימר. עם זאת, מניפולציות גנטיות מסוימות יכולות להוביל לקטלני בילוד זמן קצר או כמה ימים לאחר לידה. במקרים אלה, תרביות תאים עיקריות הן כלי חשוב, כי ניתן להשיג תאי חיים מהגורים העובריים או ילוד לפני המוות, הם יכולים להישמר במשך לפחות כמה שבועות במבחנה, ובמשך הזמן הזה התפתחות עצבית מוקדם יכולה להיות מלווה ב ניסויים ביוכימיים, פונקציונליים וצורניים. לתרבויות העיקריות, זה יכול להיות מועיל לצלחת הנוירונים בצפיפות נמוכה; זה עושה את זה אפשר לדמיין את somata הבודד, דנדריטים, פירי axonal וtermi עצבאלכסונים ברזולוציה מרחבית גבוהה. עם זאת, ההישרדות וההתמיינות של תאי עצב בצפיפות נמוכה בדרך כלל דורש כי הם מצופים בשכבת מזין גליה, שיתוף תרבותי עם תאי גלייה בהעדר המגע פיזי עימם, או בתרבית בינונית המותנה בגליה 1.

הקמת תרבויות עצביות בצפיפות נמוכה בשכבות מזין גליה יכולה להיות תלויה במהיר ואמין genotyping מראש - תוך כמה שעות בניגוד לכמה ימים. מהירות היא חשובה במיוחד כאשר גנוטיפ העצבי צריכה להיות מתאים לזה של שכבת מזין גליה מוכנה מראש. כדוגמא מעשית יותר, ייתכן שיהיה צורך להחליט איזה גורים שגנוטיפ להשתמש בתרבויות יצירה, כדי לייעל את היעילות של ניסוי.

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקול עובד שהיה בשימוש כבר genotyping עכבר מהיר, פשוט ואמין בפרסומים קודמים 2-6. זנבות עכבר ומשמשות ערכה זמינה מסחרי. פרוטוקול זה כולל מיצוי בשלב יחיד של חומצות גרעין מהרקמות, ולא דורש צעד טיהור גרעין חומצה ולא שימוש במאגר סיום ("להפסיק פתרון '). האמינות של שיטת genotyping זה בא לידי ביטוי בהצגת התוצאות של סדרה של בדיקות, כאשר הבדלים הם הציגו ביחס לסכום התחלתי של הדגימות, גילם של בעלי החיים ואת אורכו של amplicons PCR. ערכה זו מציעה את היתרונות של מיצוי ואמינות אוטומטיים.

למען להיות מקיף, השימוש בקעקוע לזיהוי לטווח ארוך של עכברי genotyped הוא הוכיח גם. קעקוע מושגת על ידי החלת דיו קעקוע לדרמיס של העור (מתחת לאפידרמיס) 7. הליך מתואר לקעקוע כפות הרגלי של עכברים ילודים או יום 1 ישן, אם כי ניתן ליישם קעקועים לחלקים אחרים של הגוף, כגון זנבות ורגליים, ועניםals בכל הגילים. בנוסף, הליכים יהיו הפגינו לציפוי ונוירונים culturing עכבר בצפיפות נמוכה, המבוססים על הכנה מותאמת סוגים שונים של שכבות מזין גליה 2,8 של.

אנו משתמשים במודל גנטי עכבר של דיסטוניה DYT1 הפרעת נוירולוגית בירושה - הפרעת תנועה אוטוזומלית דומיננטית הנגרמת על ידי מוטציה בגן TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. החלבון המקודד, torsinA, שייך ל" ATPases הקשורים לפעילויות מגוונות סלולריות "משפחה של חלבונים (+ AAA), שחבריה בדרך כלל לבצע פעולות כמו מלווה-, סיוע ב: חלבון התגלגלות, פירוק חלבון מורכב, סחר בקרום, ואיחוי שלפוחית 10-13. תוצאות המוטציה במחיקה במסגרת של קודון לחומצה גלוטמית, ויכולות להוביל לתופעה של 'התחלה המוקדמת של כללי דיסטוניה המבודדת' 14,15. עם זאת, בדרךמנגנוני ophysiological אחראים להפרעה זו יישארו הבין היטב. במודל של עכברי נוק-ב, אלל מוטנטי הוא Tor1a tm2Wtd, ציינו להלן כTor1a ΔE. עכברי מטופלים אנושיים ברי-קיימא וגנטי לחקות עם דיסטוניה DYT1 הטרוזיגוטיים ΔE-torsinA בנוק-, ואילו הומוזיגוטים לדפוק בעכברים למות לאחר הלידה 16,17, עם זמן האחזור למוות לאחר לידה מושפעת מרקע גנטי 18. המוות המוקדם של עכברים לדפוק בהומוזיגוטים מחייב ששני genotyping של בעלי חיים ואת הקמתה של תרבויות עצביות הושלמו במהירות. כדוגמא נוספת של גנוטיפ, Tfap2a (גורם שעתוק AP-2α, הפעלה משפר מחייב 2α חלבון) ישמשו. החלבון מקודד על ידי הגן הזה הוא חשוב בויסות תהליכים תאיים רבים, כגון ריבוי, בידול, הישרדות ואפופטוזיס 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: נהלי כל החיה שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת איווה.

זיהוי 1. לטווח ארוך של עכברים באמצעות קעקוע רפידות Paw

  1. לשתק כפה עם כרית כף הרגל (plantar המשטח) מול הנסיין. החזק את כף הרגל עם האגודל ואצבע המורה. היזהר שלא לצבוט את הכף.
    הערה: הקיבוע יציב חשוב לוודא כי פיגמנט הקעקוע ממוקם לתוך הדרמיס של כרית כף הרגל, ובכך הוא קבע 7.
  2. ספוגית כרית כף הרגל עם אתנול 70% על ספוג גזה או ספוגית.
  3. החלת שמן עור למוליך כותנה שקצה, ולחץ בעדינות את הקצה נגד פני השטח של כמה פעמים כרית כף רגל. השתמש רק כמות קטנה של שמן לעור; כאשר קיימים בכמויות גדולות, זה ימנע פיגמנט הקעקוע מלהגיע העור.
  4. טובלים את קצות מחטי הקעקוע לתוך דיו הקעקוע רק לפנילקעקוע. השתמש נקייה, ספטית ומחטים קעקוע חדות, כדי להקטין את הכאב ואת האפשרות של זיהום, וגם כדי להגביר את יעילות הקעקוע.
  5. בעוד משטח כרית כף הרגל מכוסה בעור השמן, לחץ על הטיפים מחט קעקוע בצורה אנכית וקל על העור במרכז כרית כף הרגל, ולהזריק את הדיו מספר פעמים. ראה טבלה של חומרים / ציוד לקבלת מידע על מערכת קעקוע חשמלית.
  6. תרסיס אתנול 70% על ספוג גזה, לחץ בעדינות עליו מפני הכפה כדי להסיר קעקוע פיגמנט נוסף על פני העור, ולבדוק את האיכות של קעקוע. בדוק שאמצע כרית כף רגל יש כתם כהה, עגול שונים מפיגמנטציה של עור רגילה. אם הקעקוע הוא לא אפל או גדול מספיק כדי להקל על צפייה, חזור על שלבי קעקוע לפני.

2. עכברים Genotyping יילוד באמצעות ערכת PCR Genotyping מהירה

  1. לחטא את הקצה הדיסטלי של זנב עכבר עם 70% אתנול, לחתוך 5 מ"מ או פחות של הזנבלהטות ולהעביר אותו לצינור של רצועת 8-צינור מהסוג המשמש לPCR. השתמש בסכין גילוח אינו בשימוש לכל גור, כדי למנוע זיהום צולב בין דגימות. לחלופין, להשתמש במספריים, אבל במקרה הזה, בזהירות וביסודיות להסיר את הרקמה שנותרה על הלהבים באמצעות אתנול 70%. בדוק לדימום. אם דימום מתרחש, להפעיל לחץ על החלק החתוך של הזנב עם ספוג גזה עד דימום הפסק.
  2. הוסף 200 μl של הפקת DNA פתרון לכל צינור PCR המכיל את הדגימה. ראה טבלה של חומרים / ציוד להרכב שלה ומידע על הערכה.
  3. הנח את רצועת הצינור לתוך Cycler תרמית PCR, ולהתחיל את מיצוי DNA באמצעות התכנית הבאה: מחזור 1 ב 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מחזור 1 ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ומחזיק ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: זוהי אותה Cycler תרמית PCR ששמשה מאוחר יותר לPCR.
  4. לאחר מיצוי DNA נגמר, להסיר את רצועת הצינור מCycler התרמיתnd להפוך 5 פעמים.
  5. העברה 4 μl של הפתרון (תמצית ה- DNA) של כל דגימה לצינור של רצועת 8-צינור, ומערבבים עם אינו בשימוש: 10 μl של 2X PCR מוכן Mix II, 2 μl מעורב קדימה ולהפוך פריימרים (מומלץ ב 0.5 מיקרומטר; ראו טבלה של חומרים / ציוד לרצפים), ו -4 μl של H-חופשי nuclease 2 O, עבור כל דגימה. בקצרה ספין (לדוגמא, 3 שניות) באמצעות צנטריפוגות בטבלה עליונה. שמור את הצינורות על קרח בכל העת למעט בעת הטיפול.
  6. לבצע רכיבה תרמית. ראה שולחן של חומרים / ציוד לתכנית התרמית.
  7. לזהות את מוצרי DNA מוגברים. טען את הפתרון הכולל תגובה מ( μl 20) PCR ישירות לתוך באר של ג'ל agarose. טען את סמני משקל המולקולריים לתוך באר נפרד. החל שדה חשמלי.
  8. לרכוש תמונות הקרינה של הלהקות באור אולטרה סגול.

3. יסודי תרבות של עכבר המוח Neuronים על שכבת מזין גליה

הערה: ההליכים לנתיחה המוח והתא דיסוציאציה (3.1) משותפים לכל הנהלים שלאחר מכן. הנהלים לתרבויות גליה עכבר (3.2), תרבויות גליה חולדה (3.3), ותרבויות עכבר עצביות (3.4) מתוארים בנפרד לאחר מכן.

  1. מוח Dissection והסלולרי Dissocaiation
    1. להקריב את גור עכבר או עכברוש אחד על ידי עריפת ראש, במהירות להסיר את המוח, ולמקם אותו לתוך הפתרון "הנקס (ראה טבלה 1 לרכב) + 20% בסרום שור עוברי (FBS) בצלחת 35 מ"מ (כל הזמן על קרח).
    2. חותך את המוח דרך קו האמצע לשתי ההמיספרות. הסר את האזור של עניין (למשל, קליפת המוח, סטריאטום וההיפוקמפוס) מכל חצי הכדור של המוח. הסר את קרומי המוח וכלי דם גדולים מהמשטח. חותך את האזור במוח ל4-10 פרוסות דקות באמצעות סכין כירורגית.
    3. יש לשטוף את פרוסות המוח בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר, פעם שנינות"הפתרון + 20% FBS, 3 פעמים ולאחר מכן עם הנקס 'h הנקס פתרון (כלומר, ללא סרום) (כל 4 ° C). כדי לשטוף, להוסיף פתרון מיליליטר 5-10, בואו מוח פרוסות להתיישב בחלק התחתון של הצינור, לשאוב את הפתרון מהחלק העליון, ולהוסיף פתרון טרי. לסיים את הליך השטיפה על ידי aspirating הפתרון.
    4. סנן 2 מיליליטר של פתרון העיכול המכיל טריפסין (ראה טבלה 1 לרכב) באמצעות מזרק 3 מיליליטר ומסנן מזרק 0.2 מיקרומטר, ולהוסיף את התסנין ישירות לתוך הצינור המכיל את פרוסות המוח. בואו trypsinization להמשיך במשך 13 דקות ב RT.
    5. לנטרל את פתרון טריפסין הראשון על ידי aspirating ביותר שלו ולאחר מכן על ידי הוספת 7-10 מיליליטר של התמיסה 'הנקס + 20% FBS (4 ° C).
    6. יש לשטוף את פרוסות המוח, פעמיים עם הנקס 'FBS + 20% הפתרון, ולאחר מכן שלוש פעמים עם הנקס' פתרון (כלומר ללא סרום) (כל 4 ° C). לסיים את הליך השטיפה על ידי aspirating solutיון.
    7. סנן 2 מיליליטר של פתרון דיסוציאציה (ראה טבלה 1 לרכב) באמצעות מזרק 3 מיליליטר ומסנן מזרק 0.2 מיקרומטר, ולהוסיף את התסנין ישירות לצינור עם פרוסות המוח.
    8. מכאני לנתק את התאים בעדינות על ידי triturating 10-20 פעמים, עד שפיסות רקמה גלויות תיעלם. השתמש ב, פיפטה פסטר אש מלוטשת פקוק כותנה ולהימנע מבועות במהלך טחינה דקה.
    9. חכה 3 דקות לחתיכות קטנות להתיישב.
    10. העבר את רוב הפתרון (~ 1.5 מיליליטר, והותרתי חלק מפתרון בתחתית) לצינור 15 מיליליטר צנטריפוגה המכיל פתרון FBS + 20% 3 מיליליטר הפתרון "הנקס (4 מעלות צלזיוס), באמצעות פקוק כותנה, Fire- פיפטה פסטר המלוטשת. לא להעביר את כל הפתרון, כי ההכללה של משקעים בתחתית בדרך כלל תוצאות הידרדרות של התרבות.
    11. צנטריפוגה למשך 13 דקות ב ~ 185 גר '(~ 1,100 סל"ד) בשעה 4 ° C.
    12. לשאוב supernatant בעדינות,להוסיף 1 מיליליטר של ציפוי בינוני (37 ° C) לגלולה, וresuspend זה בעדינות על ידי pipetting מספר פעמים באמצעות, פיפטה פסטר אש מלוטשת פקוק כותנה מראש חימם.
      הערה: שלושה סוגים שונים של ציפוי תקשורת המשמשים למטרות תרבות שונות: ציפוי בינוני-1 לתאי גליה עכבר, ציפוי בינוני 2 לנוירונים עכבר, וציפוי בינוני-3 לתאי עצב חולדה ותאי גליה (ראה טבלה 1 ליצירות) .
    13. להוציא 10 μl של ההשעיה התא, לערבב אותו עם 10 μl של פתרון trypan הכחול 0.4%, ולמדוד את הצפיפות של תאי חיים, או באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי.
  2. תרבויות עכבר גליה
    1. שטוף את coverslips כדי לעזור להקים תרבויות בריאים של תאי עכבר.
      1. לטבול את coverslips זכוכית (עגול, קוטר 12 מ"מ) ב- 70% חומצה חנקתית בצלחת פטרי מזכוכית. להגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום, ומניח אותו על שייקר O / N מסלולית.
      2. יש לשטוף את coversli הזכוכיתלפחות שלוש פעמים ps בצלחת פטרי עם מים מזוקקים. לטבול אותם במים מזוקקים. מניחים את הצלחת על N / O ייקר מסלולית.
      3. יבש coverslips על נייר סינון 150 מ"מ Whatman בארון הבטיחות הביולוגי.
      4. החיטוי coverslips.
      5. מניחים את coverslips לתוך צלחת תרבות 24 גם.
    2. עכברים שזה עתה נולד לייבל וגנוטיפ לפי שלבי 1 ו -2.
    3. השג את תאי המוח מגורי העכבר, על פי שלב 3.1.
      הערה: השימוש בקליפת המוח אופייני להכנת שכבת מזין גליה עכבר. עם זאת, אזורים אחרים במוח, כגון ההיפוקמפוס וסטריאטום, יפעלו לאחר התאמה נכונה של צפיפות תאים עקב מספרים ותשואות של תאים מאזורים שונים.
    4. להוסיף ~ 4 מיליליטר של טרום חמם ציפוי בינוני-1 להשעית התא הסופית (~ 1 מיליליטר). לתקשורת ותרבות התחממות מראש, הנח את הפתרון בחממת התרבות (5% O CO 2 -95% 2, 37 ° C) O / N, ללאפשר ערכי הטמפרטורה ו- pH לייצב.
    5. מעביר את ההשעיה התא לבקבוק תרבות T25 ללא ציפוי, באמצעות, פיפטה פסטר אש מלוטשת פקוק כותנה. מניחים את הבקבוק בחממת התרבות.
    6. ביום 1 במבחנה (DIV), לשטוף את התאים בתרבית בבקבוק T25 פעמיים עם ציפוי בינוני-1 (4 ° C). מניחים את הבקבוק בחזרה לתוך החממה. לבצע שטיפה על ידי aspirating הבינוני בתוך הבקבוק עם טפטפת פסטר לחלוטין, והוסיף ~ 5 מיליליטר של מדיום חדש והטה את הבקבוק מספר פעמים בתנועות סיבוביות.
    7. ב6-9 DIV, (כלומר, יום אחד לפני trypsinization וציפוי על coverslips, בצעדי 3.2.8-3.2.13), מקומו של חומר הציפוי 100 μl עם חלבוני מטריצה ​​תאיים (ראה טבלה של חומרים / ציוד להערות על חומר הציפוי) על coverslips הזכוכית בצלחת תרבות, והנח את המנה התרבות בחממת התרבות.
    8. ב7-10 DIV, כאשר התאים 20-4מחוברות 0% (מרחבית רציפה), trypsinize.
      1. יש לשטוף את הבקבוק פעם אחת, על ידי aspirating כל הפתרון בתוך הבקבוק וההוספה ~ 13 מיליליטר של התמיסה "הנקס (4 ° C), בעדינות להטות את הבקבוק מספר פעמים בתנועות סיבוביות, ולשאוב את הפתרון לחלוטין.
      2. הוסף 40 μl של פתרון DNase (ריכוז סופי, 750 יחידות / מיליליטר) ל -4 מיליליטר פתרון טריפסין-EDTA, להעביר את הפתרון דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר, ולהוסיף את התסנין ישירות לתאי הבקבוק.
      3. בואו trypsinization להמשיך במשך 13 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה.
      4. לנטרל את פתרון טריפסין על ידי הוספת 2 מיליליטר של 100% FBS (4 ° C) לבקבוק.
      5. להעביר את תאי trypsinized לצינור 15 מיליליטר צנטריפוגה באמצעות 5 לפיפטה 10 מ"ל, להוסיף ~ 4 מיליליטר של התמיסה 'הנקס + 20% FBS (4 ° C), צנטריפוגות ב ~ 185 גר' ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 13 דקות , ולשאוב supernatant.
    9. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של טרום-warmeבינוני-1 ציפוי ד.
    10. למדוד את הצפיפות של התאים בהתאם לצעד 3.1.13.
    11. לשאוב את חומר הציפוי לחלוטין מcoverslips הזכוכית, וצלחת ~ 50 μl של תאי הגלית resuspended על coverslips.
      הערה: תאים אלה יקימו שכבת מזין גליה.
    12. מניחים את צלחת התרבות עם coverslips בחממה.
    13. 20-60 דקות מאוחר יותר, להוסיף 1 מיליליטר של טרום חמם ציפוי בינוני-1 זה טוב, ומניח את הצלחת בחזרה בחממה. שים לב: בעוד בינוני הציפוי הוא הוסיף, זה יהיה מועיל להשתמש פיפטה נוספת לחץ כלפי מטה בפריפריה של coverslip (שבו אין תאים מצופים), כך שcoverslip לא יצוף במדיום.
    14. יום 1 DIV של שכבת גליה המזין (כלומר, על coverslip הזכוכית), להחליף את המדיום עם 1 מיליליטר של ציפוי מראש חימם בינוני-1, על ידי aspirating כל הפתרון בבאר ולאחר מכן למלא אותו במדיום חדש.
    15. ב2-3 DIV של שכבת מזין גליה כאשר cells הם 80-100% ומחוברות, להוסיף מעכב mitotic (10 μl מתערובת של 5-fluoro-2'-deoxyuridine + uridine; ריכוזים סופיים של 81.2 ו204.8 מיקרומטר, בהתאמה) זה טוב, לעכב שכפול הדנ"א, ולכן ל לדכא התפשטות גליה תאים.
    16. ב7-9 DIV, כאשר התאים% ומחוברות 90-100 (1-2 שעות לפני ציפוי הנוירונים בשכבת מזין גליה), להחליף את התרבות בינונית עם ציפוי מראש חימם בינוני-2 (37 ° C).
      הערה: נוירונים יהיו מצופים באותו היום, תוך שימוש בשלב 3.4.
  3. תרבויות עכברוש גליה
    1. מעיל בקבוק תרבות T25 עם אותו חומר הציפוי.
      הערה: זו היא הכרחית להסרת מאוחר יותר של תאים שאינם חסיד בשלב 3.3.5.
      1. להוסיף 2.0 מיליליטר של חומר הציפוי לבקבוק, ומניח את הבקבוק בחממת התרבות.
      2. לאחר 2-3 שעות, לשאוב את חומר הציפוי לחלוטין, כך שהרצפה של הבקבוק הופכת יבשה.
    2. השג את התאיםמגורי החולדה, על פי שלב 3.1.
      הערה: אזור CA3-CA1 של ההיפוקמפוס משמשת להכנת שכבת מזין גליה חולדה. עם זאת, אזורים אחרים במוח, כגון קליפת המוח וסטריאטום המוחי, יעבדו לאחר ההתאמה להבדלים בצפיפות תאים עקב מספרים ותשואות של תאים מאזורים שונים.
    3. להוסיף ~ 4 מיליליטר של טרום חמם ציפוי בינוני-3 להשעית התא הסופית (~ 1 מיליליטר).
    4. מעביר את ההשעיה התא לתוך בקבוק תרבות T25 המצופה, באמצעות, פיפטה פסטר אש מלוטשת פקוק כותנה. מניחים את הבקבוק בחממת התרבות (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C).
    5. ב2-3 DIV, כאשר תאים הם 20-40% ומחוברות, להסיר שאינם חסיד או חלש תאים חסיד, על ידי סגירת המכסה בחוזקה, לוחץ את הבקבוק במרץ ~ 10 פעמים, aspirating הפתרון, והוסיף 4-5 מיליליטר של ציפוי בינוניים-3 (ב 4 מעלות צלזיוס). חזור על תהליך זה פעם אחת. לבחון את התאים בתרבית על רצפת הבקבוק השלם (כגון,באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד) כדי לאשר כי אלו המופיעים עצביים (כלומר, אלה שעבורם השפה החיצונית של גוף התא מופיעה שלב בהיר) יוסרו לחלוטין. חזור על התהליך כמה שצריך כדי להסיר תאים אלה, ולאחר מכן להחזיר את הבקבוק לחממה.
      הערה: כוח ואת המספר הכולל של 'יקים' הנדרשים עשויים להיות שונה בין הנסיינים בודדים. הדבר החשוב הוא לא לשמור על המספר הכולל של יקים למספר קבוע, אבל כדי לוודא שתאים כמו נוירון בוטלו.
    6. ב6-8 DIV, כאשר תאים הם 90-100% ומחוברות, מעבר תאי גלייה ידי trypsinizing כמו בשלב 3.2.8.
    7. לאחר צנטריפוגה, resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של ציפוי בינוני-3 (4 ° C), להוסיף 10 מיליליטר של ציפוי בינוני-3 (4 ° C), להעביר את תאי trypsinized לבקבוק T75 מצופה un, והתרבות ב החממה.
      הערה: תאי גליה עכברוש יהיה passaged פעמיים; בניגוד לתאי גליה עכבר arדואר passaged רק פעם אחת כי הם הופכים להיות לא בריאים לאחר מעברים מרובים. תאי גליה עכברוש יהיה passaged בצלוחיות T75 שאינם מצופים בכל חומר ציפוי. הציפוי מאפשר לתאי גליה העכברוש לגדול מהר מדי ויניבו הרבה תאי ריסי (תאי ependymal משוערים), שידרדרו את מצב התרבות העצבי מאוחר יותר.
    8. ב17-19 DIV של תרבות גליה בבקבוק (כלומר, 11 ימים לאחר passaging ויום אחד לפני trypsinization וציפוי על coverslips על ידי צעדים 3.3.9-3.3.14), מקומו של חומר הציפוי 100 μl על coverslips זכוכית רחוץ ( עגול, קוטר 12 מ"מ) בצלחת תרבות, והנח את המנה התרבות בחממת התרבות.
      הערה: לתרבויות גליה חולדה, הבדל לא היה שם לב בתוצאות התרבות עם או בלי לשטוף את coverslips.
    9. ב18-20 DIV של תרבות גליה בבקבוק (כלומר, 12 ימים לאחר passaging), להכין את שכבת מזין גליה ידי trypsinizing התאים בתרבית, על פי step 3.2.8.
    10. במהלך צנטריפוגה, לשאוב חומר הציפוי לחלוטין מcoverslips הזכוכית.
    11. לאחר צנטריפוגה, resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של ציפוי בינוני-3 (4 ° C), ולמדוד את צפיפות התאים, על פי שלב 3.1.13.
    12. התאם את צפיפות גליה עד 10 4 תאים / מיליליטר בשידור חי, וצלחת של ההשעיה תא גליה 100 μl על coverslips הזכוכית המצופה.
      הערה: תאים אלה יקימו שכבת מזין גליה.
    13. מניחים את צלחת התרבות עם coverslips לתוך החממה ל20-60 דקות.
    14. הוסף 1 מיליליטר של ציפוי בינוני-3 (4 ° C) זה טוב, ומניח את הצלחת בחזרה בחממה.
    15. ב-3-4 DIV של שכבת מזין גליה, כאשר התאים על coverslip הם 40-80% ומחוברות, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום הגידול מראש התחמם (ראה טבלה 1 לרכב) המכיל ציטוזין β-D-arabinofuranoside ( ARAÇ, ריכוז סופי של 4 מיקרומטר) כדי לעצור את התפשטות גליה תאים. נוירון צלחתים ב7-9 DIV של שכבת מזין גליה כאשר התאים 60-80% ומחוברות, באמצעות צעד 3.4.
  4. תרבויות עכבר עצביים
    1. עכברים שזה עתה נולד לייבל וגנוטיפ לפי שלבי 1 ו -2.
    2. השתמש בגורי העכבר לשלב 3.1.
    3. התאם את הצפיפות של השעיה לחיות תאים ל~ 2.0 x 10 5 מיליליטר תאים / באמצעות ציפוי בינוני 2 לציפוי בתאי גליה עכבר, או באמצעות מראש חימם ציפוי בינוני-3 לציפוי בתאי גליה חולדה.
    4. צלחת התאים בשכבת מזין גליה, על ידי הוספה בעדינות את ההשעיה התא הבינוני התרבות של כל אחד. הערה: הנפח של ההשעיה התא שיש להוסיף שייקבע על ידי מספר היעד של תאים בתרבות היטב. לדוגמא, צלחת ~ 60 μl של השעיה תא להשיג 12,000 תאים / טובה.
    5. שים לב שלא חלו שינויי פתרון נחוצים לאחר נוירונים הם מצופים. להיות זהיר, כדי למנוע אידוי של הפתרון מהבארות במהלך התרבות, על ידי humidifying o בתוךf תרבות החממה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדוגמא ליישום של פרוטוקול זה, תוצאות נציג מוצגות לתיוג עכברים על ידי קעקוע, genotyping אמין תחת תנאי ניסוי שונים, והקמת תרבויות עצביות עיקריות בשכבות מזין גליה.

קִעקוּעַ

יילוד גורים תויגו על כריות כף הרגל באמצעות מערכת קעקוע ("יילוד" באיור 1). התוויות נשארו גלויות לעין בשעה 3 שבועות ("3 שבועות בן") וגיל 32 שבועות ('32 -week-ישן "). העכברים הבודדים יכולים להיות מזוהים באופן ייחודי על ידי שילוב של קעקועים על ארבע כפות הרגליים (מספרי 1-16) ועל ידי המידע על כלוב בעלי החיים, או תוכניות מספור מורכבות יותר (לא מוצג).

Genotyping

דוגמא מייצגת אחת genotyping מוצג (איור 2). גן Tor1a של wild-type (Tor1a (Tor1a + / ΔE) והומוזיגוטים (Tor1a ΔE / ΔE) עכברים לדפוק בΔE-torsinA היו מוגבר מהדנ"א הגנומי המבודדים מקטעי זנב של גורים שזה עתה נולד. Genotyping בדוגמא ספציפית זו מבוסס על הנוכחות של אתר loxP 34-בסיס-זוג אחד באלל מוטנטי Tor1a לאחר רקומבינציה המוצלחת Cre ומחיקה של 16,18 קלטת התנגדות neomycin.

הדנ"א הגנומי הופק עם ידיים על השקעה מינימאליות של זמן, ודוגמאות רבות עובדו בו-זמנית. כרכי החילוץ נשמרו קבועים, ולכן אין התאמה של עוצמת הקול הייתה צורך להתאים את השינויים בתנאים שנבדקו. האמינות של genotyping נבדקה תחת ארבעה תנאים, כפי שיפורט להלן.

ראשית, את ההשפעה של הבדלים בסך של החל הרקמה נבדקה (איור 3). זנבות של אורכים שונים היוהוכן מΔE-torsinA הטרוזיגוטיים (Tor1a + / ΔE) לדפוק בעכברים בגיל גמילה (~ 3 שבועות). אורכי זנב של 2 עד 5 מ"מ, הטווח המומלץ בדרך כלל בפרוטוקולי genotyping, נתנו את אותה תוצאת genotyping באיכות גבוהה. שתי הלהקות מתאימות לwild-type ואללים שעברו מוטציה (Tor1a + וTor1a ΔE, בהתאמה).

שנית, את ההשפעות של השתנות בגיל בעלי חיים נבדקו (איור 4). זנבות התקבלו מ, 3 שבועות בן יילוד ו~ 24 שבועות בן ΔE-torsinA הטרוזיגוטיים לדפוק בעכברים (Tor1a + / ΔE). Homozygotes לא היה רגיל, כי הם מתים כמה ימים לאחר לידת 16-18. שתי הלהקות הצפויות לwild-type וגני Tor1a מוטציה נראו ללא קשר לגיל של בעלי חיים (איור 4 א). התחולה הכללית של תוצאה זו נבדקה באמצעות גן שני, Tfap2a 19 בפרא-tעכברי ype (Tfap2a + / +) (איור 4).

שלישית, את ההשפעות של הבדלים באורך של amplicons PCR נבדקו (איור 5). לצורך כך, זוגות פריימר שונים היו מסונתזים לגן מסוים, כך שDNAs המוגבר הם באורכים זוג בסיס שונים. גן Tfap2a זוהה באופן עקבי עם אורכים שונים amplicon.

רביעית, שתי שיטות מיצוי DNA הושוו (איור 6). בשיטה אחת, צינורות רצועת PCR וCycler תרמית PCR שמשו (כמתואר בשלב 2). זה אוטומטי שיטה, מקבילה רב-צינור שאיבה ('אוטו' באיור 6). מאחר שניתן טיפלו צינורות מרובים בו זמנית בפורמט רצועה, ומכונת PCR משמשת עם תכנית לפעול בארבעה שלבי טמפרטורה, אין צורך להעביר את הצינורות, באופן ידני לשנות את הטמפרטורה במהלך החילוץ או להשתמש בחלקים מרוביםשל ציוד. כך קל תהליך דגימות רבות. זה בהשוואה לשיטה השנייה מבוסס על מיצוי ('ידני' באיור 6) ידני, חד-צינור. זה משתמש בצינורות בודדים PCR ומכונות שאינם PCR נפרדים (בלוקים חום ואמבטיות מים) כדי לשלוט בטמפרטורה במהלך מיצוי DNA. במקרה זה, צינורות מרובים, אחד הועברו לטמפרטורה חדשה לאחר כל שלב, הדורשים מנגנוני שליטה בטמפרטורה מרובים. בשני המקרים, גן Tor1a נותח בwild-type, הטרוזיגוטיים וΔE-torsinA לדפוק בעכברים (איור 6 א) הומוזיגוטים, ואת גן Tfap2a נותח בעכברי wild-type (איור 6). שני פרוטוקולי החילוץ הניבו תוצאות genotyping שווה ערך.

לסיכום, התוצאות שהוצגו באיורים 3-6 להוכיח כי שיטת genotyping היא איתנה, להשגת תוצאות אמינות ושחזור למרות variations בכמות רקמה, גיל חיה, אורך amplicon, ופרוטוקול החילוץ בשימוש.

תרבויות עצביות

לנוירונים culturing עכבר על שכבת מזין גליה עכבר, סדר הנהלים הוא: (עכברי קעקוע יילוד → genotyping לתרבות גליה →) תרבות גליה → קעקוע העכברים → genotyping יילוד לתרבות עצבית → התרבות עצבית. לתרבויות הוקמו על שכבת מזין גליה חולדה, הנהלים בסוגריים דלגו.

אנחנו בחנו את ההשפעה התומכת של שכבת מזין גליה מראש זרע על הישרדות וצמיחה עצביות. נוירונים התקבלו מאזור CA3-CA1 של ההיפוקמפוס, האזור המוטורי של קליפת מוח, וסטריאטום של עכברים ילודים wild-type. הם היו מצופים בצפיפות נמוכה בשכבה מזין גליה עכברוש שהתקבל מאזור CA3-CA1 של ההיפוקמפוס וזורע לפני ציפוי עצבי, בהתאם להתכנית שמודגמת באיור 7 (סיכום פשוטה של הנהלים). תרבויות בצפיפות נמוכה הן אופטימליות עבור ההדמיה של דנדריטים הבודדים, somata 4,6, מסוף עצב 2,3,5,8 ופירי axonal 5 ברזולוציה מרחבית גבוהה. התאים בהיפוקמפוס (המכיל שני תאי עצב ותאי גליה) היו מצופים על coverslips זכוכית המצופה, או עם (איור 8) או בלי שכבת מזין גליה שנקבעה מראש (איור 8 ', ג) ונצפו עם אופטיקה שלב ניגודיות. בנוכחות שכבה המזינה גליה כמעט מחוברות, תאי העצב (בכל פנל, ראש חץ מצביע על תא עצב נציג אחד) פוזרו יחסית 3 ו- 7 ימים לאחר ציפוי (ימים במבחנה, DIV) (איור 8). הם גם הראו סימנים לבריאות טובה, כמו שוליים ברורים של somata העצבי, דנדריטים מורחבים, חוסר somata התקבץ, וחוסר neurites ארוזות (מתאר לעצמי גבוה ההגדלהes בריבועים). בגיל 14 DIV, נוירונים אלה יצרו רשת צפופה מתאפיינת בneurites (דנדריטים ואקסונים) הארוכים. שים לב כי התפשטות גליה הייתה עצורה לפני נוירונים היו מצופים, על ידי הוספת מצע גידול המכיל ARAÇ מעכב mitotic (שלב 3.3.15).

בניגוד לכך, בהיעדר שכבת מזין גליה בעת ציפוי תאי עצב בהיפוקמפוס, הצמיחה של תאי העצב בהיפוקמפוס התרבותיים נפגעה, גם בהיעדרו של ARAÇ. בשעת 3 DIV, תאי גליה (הכלולים בתאים בהיפוקמפוס בציפוי החדש) לא יצרו גיליון ומחוברות (כוכבית בפנל העליון של איור 8 ב). התרבויות הראו כמה סימנים לכך שהם אינם מתאימים לבדיקות הדמיה ברזולוציה גבוהה, כגון אזורים רחבים ללא תאי גליה בסיס (כוכבית), הנוכחות של somata התקבץ ואת הנוכחות של neurites ארוזות באזורים מסוימים (מידע לא מוצג). על ידי 7 DIV, תאי גלייה יצרו גיליון מחוברות (פנל באמצע של איור 8C). Howevאה, נוירונים היו פחות במספר מאשר כאשר נוירונים היו מצופים בשכבת מזין גליה שנקבע מראש. הנוירונים ששרדו גם חסרי neurites הארוכה, יוצרי רשת (הבלעה). תאי גליה היו יותר הטרוגנית בעקמומיות ועובי מאלו שבתרבות שכבת מזין, ובכך המופיעים שלב-בהיר. על מנת לבחון את ההשפעות של דיכוי התפשטות גליה על נוירונים, אנחנו מוחלים ARAÇ המכיל מדיום גידול. כאשר ARAÇ נוספו על 3 או 7 DIV והתאים בתרבית עד 14 DIV ונצפו ביום זה (איור 8 'ו- C, לוחות תחתון), ותאי גלייה כיסו את רוב פני השטח coverslip. עם זאת, תאי העצב היו עדיין מעטים, במיוחד כאשר ARAÇ יושם ב -7 DIV. היו לי הנוירונים ששרדו רק תהליכים קצרים ולא היו קשורים באופן נרחב. לפיכך, התוספת המאוחרת של ARAÇ אפשרה שכבת גליה אחידה לטופס אך לא קדמה את הכדאיות עצבית או הארכת neurite; ולא צמיחה בלתי מבוקרת גליההייתה השפעה מזיקה לתאי עצב.

נתונים אלה מראים כי שכבת מזין גליה היא קריטית להישרדות והצמיחה של נוירונים מצופים בצפיפות נמוכה, וכי שכבת גליה חייבת להיות נוכחת בעת הציפוי עצבי ולא במאוחר בתרבות עצבית. תוצאות דומות התקבלו בתרביות של קליפת המוח במוח (איור 9) ותאי עצב striatal (איור 10).

התצפית האיכותית על הישרדות עצבית אושרה על ידי ניתוח כמותי. באופן ספציפי, מספר הנוירונים ששרדו בגיל 14 DIV נספר, המבוסס על תמונות שלב בניגוד לתרבויות (איור 11). המספר היה הגדול ביותר לנוירונים בתרבית על שכבת מזין גליה (כלומר., מצופים בשכבת מזין גליה). המספר היה נמוך יותר במקרה של נוירונים בתרבית בהיעדר שכבת מזין גליה. המספר צומצם עוד יותר כאשר טופלו התאים עם ARAÇ בהזמן מה לאחר מכן. הבדלים אלה היו משמעותיים מבחינה סטטיסטית, ונרשמו בתרבויות של נוירונים המתקבלים מכל שלושת האזורים במוח.

הסוגים של תאים ששרדו זוהו בגיל 14 DIV בעכבר תרבויות בהיפוקמפוס מצופות בשכבת המזין בהיפוקמפוס חולדה. Double-immunocytochemistry בוצע באמצעות נוגדנים נגד הסמן העצבי, חלבון microtubule הקשורים 2 (MAP2), וסמן תא גליה astrocytic, חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP). התאים עם תהליכים ממושכים היו חיוביים לMAP2, ואילו התאים בשכבת מזין גליה הבסיסית היו חיוביים לGFAP (שני שדות נציג תמונה, איור 12 א). צביעה זו לא הייתה תוצר של שילוב ספציפי של נוגדנים ראשוניים ומשניים, כי אותו הדפוס הושג כאשר קבוצה של נוגדנים משני שונה שימשה (איור 12 ב).

בניגוד לכך, כאשר אותו ההכתמה הייתה performed על התרבויות ובו רק שכבת גליה מזין, כלומר, בהיעדרם של תאים הוסיפו עכבר (שני שדות תמונה מייצגים, איור 13 א), לא תאים היו חיוביים לMAP2. התאים של שכבת המזין היו באופן עקבי חיוביים עבור GFAP. לביקורת שלילית, שני הנוגדנים העיקריים הושמטו מהליך immunocytochemical (איור 13 ב). לא מכתים התגלה בדגימות אלה, למרות שהתאים היו נוכחים, כפי שעולה אופטיקה האור המועברת (התערבות ההפרש לעומת זאת, DIC) והכתמה גרעינית עם צבע Hoechst. לפיכך, מכתים לא ספציפי בערוצי MAP2 וGFAP היה חלש מאוד.

נתונים אלה immunocytochemical גם נותחו כמותית (איור 14). בכל תמונה של 8 ביט, עוצמת נמדדה וזממה לאורך קו. חלקות מעולפות לחשוף צביעת MAP2 כאשר תאי עכבר (דגימות המכילות תאי עצב) היו בתרבית על שכבת מזין גליה (Neuron +,+ גליה, נוגדן ראשוני (1 ° Ab) +), ואילו צביעה כגון נעדרה בתרביות של תאי מזין גליה לבד (Neuron -, + גליה, 1 ° Ab +). בבקרה שלילית ללא נוגדנים ראשוניים, מכתים היה זניח בתרביות של תאי מזין גליה לבד (Neuron -, + גליה, 1 ° Ab -). צביעת GFAP הייתה ברורה בשכבת מזין גליה, ללא קשר לשאלה אם תאי עכבר היו מצופים (Neuron +, + גליה, 1 ° Ab +) או לא (Neuron -, + גליה, 1 ° Ab +). שוב, צביעה בבקרה השלילית הייתה זניחה (Neuron -, + גליה, 1 ° Ab -). תוצאות אלו מראות כי שכבת מזין גליה עכברוש הייתה מורכבת בעיקר של האסטרוציטים, וכי תאי העצב נכחו רק כאשר תאי עכבר נוספו. הם גם מצביעים על כך שתאי העצב קיימים בתרבויות אלה מקורו אך ורק מעכבר.

תוצאות סעיף של הווידאו המקוון מראה גם את תמונות דסק"ש וMAP2 של נוירונים בתרבית מצופים בשכבת מזין גליה, boה הכינה מהאזור בהיפוקמפוס CA3-CA1 של עכברי wild-type.

לשליטה מפורטת של תרבית תאים, מומלץ למדוד את הצפיפות של תאי חיים, הן להערכת האיכות הכללית של נתיחת המוח וצעדי ניתוק סלולריים, ולציפוי התאים בצפיפות שנקבעה מראש. להלן ארבעה סטים של מדידות צפיפות אופייניות. שימו לב, עם זאת, כי מספרים אלה יכולים להשתנות בהתאם לתנאי תרבות וחומרים כימיים. לדוגמא, אפילו הרבה שונה של סרום מאותו הספק יכול להשפיע על התוצאות. לפיכך, יש לשקול את המספרים האלה מחוון כללי, ולא קו מנחה מוחלט.

לניתוק סלולארי (שלב 3.1.13), ערכים אופייניים לצפיפות תאי חיים המתקבלת מגור אחד הם: ~ 2 x 10 5 מיליליטר תאים / (הקורטקס מוטורי עכבר וההיפוקמפוס-CA1 CA3 העכבר), ~ 5 x 10 5 תאים / מיליליטר (עכבר קליפת מוח וההיפוקמפוס עכברוש CA3-CA1), ו~ 1 x 10 6 גמיליליטר / אמות (סטריאטום עכבר). בכל המקרים הללו, שברי תאי חיים היו> 90% (כדאיות, מוגדרים כיחס בין מספר תאי חיים לזה של המספר הכולל של תאים). הקורטקס המוטורי מוגדר באופן רופף כאזור של קליפת המוח ששקרים מייד הגבה לסטריאטום 20. לתרבויות בהיפוקמפוס, אזורי CA3 וCA1 של ההיפוקמפוס נכון עדיפים. כל ההיפוקמפוס בנוסף כולל gyrus המשונן, הכללת שמוביל להיווצרות של מסוף עצב הגדול של תאי גרגיר ומציג ההטרוגניות בנכסים הסינפטי 21. תרבות striatal כוללת pallidus caudate-putamen וגלובוס, אך אינו כוללת גרעין הנסמך, או המדיאלי או גרעינים במחיצה לרוחב במבנים הסמוכים.

לתרבות גליה עכבר (שלב 3.2.11), צפיפות הציפוי היא ~ 10,000 תאי גלייה על כל coverslip העגול 12 מ"מ, באמצעות ~ 50 μl של השעיה תא בצפיפות של ~ 2 x10 5 תאים / מיליליטר. בדרך כלל הצפיפות נמדדת בsupernatant היא קבועה יחסית ואינה דורשת התאמה. כדי להמיר את הצפיפות על פני שטחים שונים, המידע השימושי הוא שיש לו את coverslip בקוטר של 1.20 סנטימטר ושטח של 1.13 סנטימטר 2. לפיכך, ~ 10,000 תאים / coverslip = ~ 8800 תאים / 2 סנטימטר על coverslip.

לתרבות עכברוש גליה (שלב 3.3.12), צפיפות הציפוי היא ~ 1000 תאים גלייה על כל coverslip העגול 12 מ"מ, באמצעות השעיה תא ~ 100 μl בצפיפות של ~ 1x10 4 תאים / מיליליטר. לפיכך, 1,000 תאים / coverslip = ~ 900 תאים / 2 סנטימטר על coverslip.

לתרבות העצבית עכבר בצפיפות נמוכה (צעד 3.4.4), ציפוי הצפיפות נעה בין 2,000 ל -48,000 תאים לכל גם צלחת 24 גם. ערכים אופייניים כאשר ציפוי תאי עצב ובתאי גלייה החולדה הם: 10,000-24,000 תאים / גם לנוירונים בקליפת המוח מוח, 12,000-24,000 תאים / גם לתאי עצב בהיפוקמפוס CA3-CA1 ו- 24,000-48,000 תאים / גם לנוירונים striatal. כאשר ציפוי על תאי גלייה עכבר, המספר מופחת, למשל, 2,000 תאים / גם לתאי עצב בהיפוקמפוס CA3-CA1. בתור הערה צדדית, לציפוי תאי עצב בהיפוקמפוס החולדה CA3-CA1 על שכבת מזין גליה חולדה, ציפוי הצפיפות היא 1,000-6,000 תאים / טובה. להמרת הצפיפות ולצפיפות על coverslip, המידע השימושי הוא שהקוטר הפנימי גם בתחתית הוא 1.56 סנטימטר והאזור שלה הוא 1.91 2 סנטימטר. כך, למשל, 12,000 תאים / טובים = 7,100 תאים / coverslip = 6,300 תאים / 2 סנטימטר על coverslip. צפיפויות אלה נבחרו במטרה נוירונים culturing הדלילים יחסית להדמיה סלולרית ברזולוציה גבוהה. חוקרים צריכים לבחור המספרים שלהם בצורה הטובה ביותר שיתאימו למטרות הניסוי שלהם.

איור 1
איור 1. כפות רגלי קעקועים של עכברים. Nעכברי ewborn תויגו על ידי קעקוע כפות הרגלי. הם צולמו מייד לאחר קעקוע (שזה עתה נולד), בשעה 3 שבועות של גיל (3 שבועות בן) ובגיל 32 שבועות (32 שבועות בן). התוויות נשארו גלויות בקלות לאורך בגרות. תמונות נלקחו מבעלי חיים שונים. הן לא מופיעות באותו קנה המידה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. Genotyping של wild-type (Tor1a + / +), הטרוזיגוטיים (Tor1a + / ΔE) והומוזיגוטים (Tor1a ΔE / ΔE) ΔE-torsinA לדפוק בעכברים. אללים של גן Tor1a נותחו בwild-type ומוטנטי צורות, DNA באמצעות מופקים מהזנבות של גורים שזה עתה נולד. Tטיפים ail היו ~ 4 מ"מ האורך. DNA היה מוכתם באמצעות SYBR בטוח DNA ג'ל כתם. ראה הטבלה של חומרים / ציוד למידע על פריימרים ותכנית רכיבה תרמית לגן Tor1a. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. איתור של הדנ"א הגנומי בהקשר של שונות בסך של חומר מוצא. טיפים זנב באורכים שונים היה בשימוש. בעלי חיים שנבדקו היו 3 שבועות בן, הטרוזיגוטיים ΔE-torsinA לדפוק בעכברים (Tor1a + / ΔE). נתיבים מייצגים את אורכי הזנב של 2, 3, 4 ו -5 מ"מ, בשני עותקים (משמאל). הטיפים הזנב התקבלו מעכברים שונים. סמני גודל משקל מולקולרי בנתיב השמאלי ביותר מייצגים DNA אורכים ביםteps של 100 זוגות בסיסים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. איתור של הדנ"א הגנומי בהקשר של שונות בגיל בעלי חיים. גן () Tor1a. נתיבים מייצגים טיפים זנב שהתקבלו בעכברי ΔE-torsinA הטרוזיגוטיים לדפוק ב( Tor1a + / ΔE) בשלבים הבאים: היילוד, 3 שבועות ישנים, ו~ 24 שבועות-ישן (בכפילויות משמאל) (B). Tfap2a גן. נתיבים מייצגים טיפים זנב מתקבלים מwild-type (+ / + Tfap2a) עכברים בשלבים הבאים: יילוד, 3 שבועות בן, ו~ 24 שבועות-ישן (בכפילויות משמאל). שני הגנים היו מוגברים מזנבות ~ 4 מ"מ האורך. בר PCR הצפוי הוא 498 נ"ב. Wa תכנית PCR זה אותו הדבר כמו זה המשמש לגן Tor1a. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. איתור של הדנ"א הגנומי בהקשר של שינוי באורך של amplicon PCR. גן Tfap2a נותח עם אורכי PCR amplicon של 498 נ"ב (נתיבים שמאליים), 983 נ"ב (נתיבים באמצע) ונ"ב 1990 (נתיבים מימין) ב כפילויות. הגן היה מוגבר מזנבות של עכברים 3 שבועות בן. סמני גודל משקל מולקולרי בנתיבים השמאליים ביותר והימניים ביותר של ג'ל מייצגים אורכי DNA בצעדים של 100 ו -200 זוגות בסיסים, בהתאמה. ראה הטבלה של חומרים / ציוד לקבלת מידע על פריימרים לamplicons שונה. "Target =" 879fig5highres.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. איתור של הדנ"א הגנומי בהקשר של שונות בשיטת מיצוי DNA. תוצאות למדריך, הפקה חד-צינור (ידני) ו, השיטות האוטומטיות מקבילות חילוץ רב-צינור (האוטומטית) הן בהשוואה. השיטה השנייה שימשה לאורך דוח זה. גנים היו מוגברים מזנבות ~ 4 מ"מ אורך, שנאסף מיילודים. (א) גן Tor1a בגורים שזה עתה נולד של ΔE-torsinA לדפוק בעכברים. נתיבים מייצגים DNAs שחולץ מן wild-type (ידני ואוטומטי), הטרוזיגוטיים (ידני ואוטומטי), ועכברים הומוזיגוטים (ידניים ואוטומטי) (משמאל). (ב) גן Tfap2a בעכברי wild-type 3 שבועות בן. בר PCR הצפוי הוא 498 נ"ב."Target =" jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. פשוט, איור סכמטי של נהלים לציפוי תאי עצב עכבר על עכבר () וחולדה (B) שכבות מזין גליה. המספרים של ימים (ימים במבחנה) מתייחס לימים מצטברים לאחר תאי גליה הם מצופים ראשון בתרבות צלוחיות. הם משמשים רק כהערכה גסה. לפרטים מעשיים, לראות את נהלי סעיף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8
8. השפעה תומכת איורשל שכבת מזין גליה על צמיחה של תאי עצב בהיפוקמפוס בתרבות בצפיפות נמוכה. נוירונים התקבלו מאזור CA3-CA1 של ההיפוקמפוס של wild-type עכברים, שזה עתה נולד. תאים בהיפוקמפוס () עכבר היו מצופים על coverslips זכוכית המצופה, ש היה מראש שנזרע עם שכבת מזין גליה עכברוש המתקבלת מאזור CA3-CA1 של ההיפוקמפוס. נוירונים היו מפוזרים באופן שווה באופן בריא. תרבויות נצפו בבית 3, 7 ו -14 DIV. התאים בהיפוקמפוס (B, C) ​​עכבר היו מצופים על coverslips הזכוכית המצופה, שלא היה לי שכבת מזין שנקבע מראש. תרבויות נצפו ב -3 DIV (פנל העליון בB) ו -7 DIV (פנל באמצע בC) ללא טיפול ARAÇ. בקבוצות אחרות של תרבויות, טופלו התאים עם ARAÇ ב 3 DIV (פנל תחתון בB) ו -7 DIV (פנל תחתון בC), ונצפו בגיל 14 DIV. כל התמונות מייצגות את תרבויות האחות מתקבלות מאותו הגור, שנוירונים היו מצופים באותו היום. ראה טקסט לקבלת פרטים. לכל לוח, לשעברשפע של נוירון הוא הצביע על ידי ראש חץ לבן ומוגדל בהבלעה. יש נוירונים גופי תא ההיקפיים מופיע בהיר כאשר נצפים על ידי אופטיקה שלב בניגוד, ויש להם גם תהליכים עבים. כוכבית מצביעה אזורים ללא תאי גליה. התרבויות היו צילמו בשידור חי במיקרוסקופ הפוכה באמצעות אופטיקה שלב בניגוד עם 20X עדשה אובייקטיבית (צמצם מספרי של 0.45) ללא עדשת ביניים (כלומר, ב1x). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 9
איור 9. השפעה תומכת של שכבת מזין גליה על צמיחה של תאי עצב בקליפת המוח מוח בתרבות בצפיפות נמוכה. תוצאות דומה כמו באיור 8, אבל עם נוירונים המתקבלים מאזור המנוע של גקליפת erebral. תנאי תוויות AC מתאים לאלה שבאיור 8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 10
איור 10. השפעה תומכת של שכבת מזין גליה על צמיחה של נוירונים striatal בתרבות בצפיפות נמוכה. תוצאות דומה כמו באיורים 8 ו -9, אבל עם נוירונים המתקבלים מסטריאטום. תנאי תוויות AC מתאים לאלה שבאיור 8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 11. השפעה תומכת של שכבת מזין גליה על הישרדות עצבית. מספר הנוירונים ששרדו נספר בניסויים שמוצגים באיור 8, באמצעות תמונות שנרכשו על ידי מיקרוסקופ שלב ניגודיות. תמונות במשך 14 DIV מוצגות כאן שוב, אבל עם ראשי חץ מצביעות על דוגמאות של נוירונים נספרו. גרף העמודות מציגה את מספר הנוירונים לשדה תמונה (449.0 x 335.5 מיקרומטר מיקרומטר) (ממוצע ± סטיית ההתקן של הממוצע, n = 7-24 שדות לכל מצב תרבות). כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים סטטיסטי של 'שכבת מזין גליה (-), ARAÇ על 3 DIV' ו 'שכבת מזין גליה (-), ARAÇ על 7 DIV' מ 'שכבת גליה מזין (+)' (* p <0.05, ** p <0.01, -test t של סטודנט מזווג). המספרים מעל הסורגים לציין את הצפיפות העצבית שנמדדה במצרפי תמונות של שדות תמונה מרובים. תמונות היונרכש באמצעות עדשה אובייקטיבית 20X. כדי למנוע הטיה רכישה, כל התמונות נרכשו לאורך רצועה אנכית מלאה, מהחלק העליון לחלק התחתון של coverslip ועוברות במרכז המשוער של coverslip. היו לי תמונות בודדות חפיפה (לדוגמא, 1/6 ל1/4 של שדה תמונה בחלק העליון והתחתון). שתי שיטות שמשו לניתוח. באחד, נוירונים נספרו בלסירוגין תמונות על מנת להבטיח כי נוירונים בודדים לא נפקדו יותר מפעם אחת. המספרים וכתוצאה מכך השתמשו כדי ליצור את גרף העמודות. בשיטה השנייה, מונטאז 'בודד נוצר מהתמונות בודדות. הם תפורים באמצעות מיקרוסופט התמונה מורכבת עורך או באופן ידני באמצעות פוטושופ. מצרפי גם לא נכללו סעיפים מרובים של אותו נוירונים. המספרים וכתוצאה מכך מופיעים מעל לסורגים. בשתי השיטות, אזורים נרחבים בפריפריה coverslip שלא הכיל את כל תאים לא נכללו. תאים נספרים כנוירונים אם היו להם גופי תא שהופיעו בהירעל ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד, כמו גם תהליכים תאיים מורחבים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 12
איור 12. זיהוי Immunocytochemical של סוגי תאים בתרבויות עצביות. מצב התרבות תואם את התמונה השמאלית-התחתונה של 8A איור. נוירונים התקבלו מאזור CA3-CA1 של ההיפוקמפוס של wild-type עכברים, ומצופים בשכבת מזין גליה שנוצרה מאזור CA3-CA1 של ההיפוקמפוס של חולדות wild-type. התאים בתרבית נותחו על ידי immunocytochemistry לMAP2 הסמן העצבי, וGFAP סמן תא גליה astrocytic. התערבות ההפרש לעומת זאת מיקרוסקופ (DIC) שימש כדי לחשוף את המורפולוגיה הכללית של השדות צילמו, 14-17ימים לאחר נוירונים היו מצופים בשכבת מזין גליה. מכתים () שלושה צבעים, כולל counterstaining עם הסמן הגרעיני Hoechst 33342 צבע. שני שדות תמונת נציג מוצגים. מכתים (B) שני צבעים, עם שילובים שונים של נוגדנים משני מצומדות עם fluorophores שונה. בניסויים אלה, התאים בתרבית היו קבועים עם 4% paraformaldehyde ו -4% סוכרוז בתמיסה של Tyrode (המכיל, במ"מ: 125 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 30 D-גלוקוז, 25 HEPES, pH 7.4 מותאם עם 5 M NaOH, ~ 310 mOsm ללא התאמה) במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר שנשטף עם הפתרון של Tyrode, הם permeabilized עם 0.1% Triton X-100 בפתרון של Tyrode במשך 10 דקות. הם נשטפו שוב עם הפתרון של Tyrode ולאחר מכן חסמו עם 2% עזים בסרום נורמלי בפוספט שנאגרו מלוח (PBS) (פתרון חסימה) במשך 60 דקות ב RT. לאחר מכן התייחסו אליהם בפולי הארנבנוגדן משובט נגד MAP2 (AB5622; 400x דילול בחסימת פתרון), וחד שבטי עכבר קוקטייל אנטי-GFAP (NE1015; 1,000x דילול) O / N (שעות 15-21) בשעה 4 ° C. בעקבות שטיפות עם PBS, התאים הודגרו עם עז נגד ארנב ונוגדן אנטי העכבר IgG מצומדות עם אלקסה פלואוריד 405 (דילול 500x בפתרון חסימה), Alexa פלואוריד 488 (1,000x) או לצבוע אלקסה פלואוריד 568 (500x) עבור 60 דקות ב RT. הם נשטפו עם PBS ונצפו ישירות בPBS. בתרבויות מסוימות, לאחר השטיפה הסופית בתהליך המתואר לעיל, טופלו התאים עם Hoechst 33342 ברמה של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS במשך 10 דקות ב RT, ושטפו עם PBS לפני התצפית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.

איור 13
איור 13. אימונוגלובולינזיהוי nocytochemical של סוגי תאים בתרביות שכבת מזין גליה. תרבויות אחות של שכבות מזין גליה עכברוש כמו באיור 12, אך ללא הציפוי של תאי עצב עכבר. () מכתים באמצעות נהלי immunocytochemical המתוארים באיור 12 א. שני שדות תמונת נציג מוצגים. מכתים (B) של שכבת מזין גליה באמצעות נהלי immunocytochemical המתוארים ב, אבל עם הנוגדנים העיקריים הושמטו. כל תמונות MAP2 ב12A דמויות ו -13 א, ב 'נרכשו באותם תנאי ההדמיה, ומוצגות בו בניגוד לתמונה לאפשר השוואה של עוצמה. אותו ההליכים שמשו לתמונות GFAP ב12A דמויות ו -13 א, ב '. תרבות שכבת מזין גליה הייתה צילמה באותו היום כתרבויות באיור 12. כך שכבות מזין גליה ב -13 היו בתרבית במבחנה לאותה הכמות של זמן. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 14
איור 14. עוצמה של מכתים immunocytochemical. קווים צוירו על התמונות מוצגות באיורים 12 ו -13, ואת עוצמת לאורך אלה הייתה להתוות. ריבועים להציג תמונות בשורה העליונה של איור 12 א. שלושה התנאים היו: 1) ציפוי של תאי עכבר (נוירונים מכילים) על שכבת מזין חולדה וצביעה עם הנוגדנים הראשוניים (Neuron +, + גליה, 1 ° Ab +), 2) שכבת מזין גליה (לא ציפוי עצבי בלבד) וצביעה עם הנוגדנים הראשוניים (Neuron -, + גליה, 1 ° Ab +), ו -3) feed גליהאה שכבה (לא ציפוי עצבי) בלבד וצביעה ללא נוגדנים ראשוניים (Neuron -, + גליה, 1 ° Ab -). צביעה עצבית (MAP2) הייתה נוכחת רק כאשר תאי עכבר היו מצופים (תנאים 1 לעומת 2), ומכתימים גליה (GFAP) היה נוכח בשני הסטים של תרבויות (תנאי 1 לעומת 2). מכתים immunocytochemical היה ספציפי לשני נוגדנים הראשוניים (תנאי 1 לעומת 3). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פתרונות
חיץ טה (50x פתרון)
בסיס טריס, g 486
חומצה אצטית קרחונית, 114.2 מיליליטר
0.5 M EDTA, pH 8.0, 200 מיליליטר
הוסף מים מזוקקים להביא נפח הכולל עד 2 L
איפור במנדף הכימי.
לדלל פי 50 לפני השימוש.
הפתרון 'הנקס
מלחים מאוזן "הנקס, ללא סידן כלוריד, מגנזיום סולפט וסודה לשתייה (לL 1)
NaHCO 3, 350 מ"ג (ריכוז סופי 4.17 מ"מ)
HEPES, 2.38 גר '(ריכוז סופי, 10 מ"מ)
התאם לpH 7.4 באמצעות 5 M NaOH.
התאם osmolarity 310 mOsm באמצעות סוכרוז (osmolarity נוטה ~ 290 mOsm ללא כל התאמה).
הוסף מים מזוקקים להביא נפח הכולל עד 1 ליטר
פתרון עיכול (לטיפול טריפסין של רקמת המוח)
NaCl, 800.6 מ"ג (ריכוז סופי, 137 מ"מ)
KCl, 37.3 מ"ג (וריכוז INAL, 5 מ"מ)
Na 2 HPO 4 · (7H 2 O), 187.6 מ"ג (ריכוז סופי, 7 מ"מ)
HEPES, 595.8 מ"ג (ריכוז סופי, 25 מ"מ)
גלוקוז, 97.3 מ"ג (ריכוז סופי, 5.4 מ"מ)
התאם לpH 7.2 באמצעות 5 M NaOH.
Osmolarity נוטה ~ 310 mOsm ללא כל התאמה.
הוסף מים מזוקקים להביא נפח הכולל עד 100 מיליליטר.
ממש לפני השימוש, להוסיף 20 מ"ג של טריפסין (ריכוז סופי של 10 מ"ג / מיליליטר) ו -20 μl של DNase (ריכוז סופי של 750 יחידות / מיליליטר) עד 2 מיליליטר של תמיסת עיכול.
פתרון דיסוציאציה (לניתוק מכאני של רקמת המוח)
הפתרון 'הנקס
MgSO 4 · (7H 2 O), 295.1 מ"ג (concentrati הסופיב, 11.97 מ"מ)
התאם osmolarity 310 mOsm באמצעות סוכרוז.
נפח כולל הוא 100 מיליליטר.
ממש לפני השימוש, להוסיף 20 μl של DNase (ריכוז סופי של 750 יחידות / מיליליטר) עד 2 מיליליטר של תמיסת דיסוציאציה.
ציפוי בינוני-1 (לתאי גליה עכבר)
הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM), 449.5 מיליליטר
MITO + סרום Extender, 0.5 מיליליטר
FBS, 50 מיליליטר
נפח כולל הוא 500 מיליליטר.
בינוני 2 ציפוי (לנוירונים עכבר)
Neurobasal-A, 485 מיליליטר
B27, 10 מיליליטר
Glutamax-I, 5 מיליליטר (ריכוז סופי, 2 מ"מ)
נפח כולל הוא 500 מיליליטר.
בינוני-3 ציפוי (לתאי עצב ותאי גליה חולדה)
מדיה מינימום חיונית (MEM, ללא פנול אדום)
גלוקוז, 2.5 גר '(ריכוז סופי, 27.8 מ"מ)
NaHCO 3, 100 מ"ג (ריכוז סופי, 2.38 מ"מ)
Transferrin, 50 מ"ג
FBS, 50 מיליליטר
Glutamax-I, 5 מיליליטר (ריכוז סופי, 2 מ"מ)
אינסולין, מ"ג 12.5
נפח כולל הוא 500 מיליליטר.
מדיום גידול (לתאי עצב ותאי גליה חולדה)
ממ (ללא פנול אדום)
גלוקוז, 2.5 גר '(ריכוז סופי, 27.8 מ"מ)
NaHCO 3, 100 מ"ג (ריכוז סופי, 2.38 מ"מ)
Transferrin, 50 מ"ג
FBS,25 מיליליטר
Glutamax-אני, 1.25 מיליליטר (ריכוז סופי, 0.5 מ"מ)
{חן, 2008 # 2399}, 10 מיליליטר B27 או NS21
β-D-arabinofuranoside ציטוזין (ARAÇ), 0.56 מ"ג (ריכוז סופי, 4 מיקרומטר)
נפח כולל הוא 500 מיליליטר.
הערות כלליות
התקשורת והתרבות שלנו אינה מכילה אנטיביוטיקה משום שהם יכולים להפעיל את השפעה רעילה לתאים בתאים בתרבית תאי עצב וגליה (התייחסות 70, 71). זה עושה את זה חשוב במיוחד לדבוק סטרילי נהלים בעבודה הקשורים לתרבות.
ראה הטבלה של חומרים כימיים למקורות מפורטים של כימיקלים.

פתרונות 1. טבלה

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן כולל נהלים לקעקוע לתייג / לזהות עכברים, לgenotyping עכברים מטיפי זנב, ולתאי עצב במוח עכבר culturing בצפיפות נמוכה. בסיבוב ניסויים באמצעות 6-8 גורים אחד, נהלים אלה בדרך כלל דורשים ~ 0.5 שעות, ~ 4 שעות ו~ 2 שעות, בהתאמה, על סך של 6-7 שעות. זה עושה את זה מעשי לניסוי אחד כדי להשלים את כל ההליכים הנדרשים מעת הלידה "הגורים לציפוי של תרבויות עצביות - בתוך פחות מיום עבודה אחד (למעט הכנה המוקדמת של שכבות מזין גליה).

קִעקוּעַ

זיהוי לטווח ארוך של בעלי חיים הוא הכרחי לצורך הרבייה ומחקרים המדעיים כגון ניתוחים של היסטולוגיה, תפקוד תא והתנהגות בעלי חיים. קעקוע בעלי חיים שזה עתה נולדו יש יתרון משום שניתן לבצע את זה במהירות ובנמשך הרבה בחייו של בעל החיים 7,22-25. Tattooing על כריות כף הרגל יכול להיות טוב יותר מבוהן גזיר 23 ביחס לשמירה על התנהגויות הניתנות לבדיקה, למשל בהשעיה או מרתק 22,26, אם כי חלק מהמחקרים לא ציינו ליקויים (למשל, 25). לא היו מקרים של אמהות דחייה או קניבליזציה גורים לאחר הקעקוע. לשיטות אחרות של זיהוי לטווח הארוך של בעלי חיים, ראה סקירות האחרונות 7,23,24.

Genotyping

תכונה קריטית בפרוטוקול שלנו היא השימוש בשיטת genotyping מהיר. למרות ששיטות genotyping דומות תוארו בדוחות קודמים (למשל, 27,28), יש לו את המערכת המתוארת כאן לפחות שני שיפורים. ראשית, היא יכולה לסבול וריאציות מסוימות בכמות רקמה מתחילה, גיל של בעלי חיים, ואורך amplicon. לפיכך, genotyping המוצלח יכול להיות מושגים באמצעות עכברים צעירים כמו יום 1 וישנים כמו בן 6 חודשים, ויכול להתבצע באמצעותמגוון רחב של זוגות פריימר. שנית, שיטה זו אינה דורשת להפסיק פתרון עבור שלב מיצוי DNA. זה מבטל טיפול צינור מוגזם וpipetting, ומאפשר אוטומציה רב-צינור מקבילה של התהליך עם מכונת PCR. מספר הדגימות ניתן לשנותם (לדוגמא, 96 דגימות) עדיין מעובדות בקלות ובבו-זמנית. גם סוג הדגימה אינו מוגבל לסרטוני זנב; סוגי מדגם אחרים שיכולים לשמש כוללים אגרופים אוזן, קטעי הבוהן, עוברים מוקדמים כולו, וברקמות שליה 2-4,29,30. יכולים לשמש גם מינים של בעלי חיים שונים. כך נהלי genotyping הם אמין (הדיר עם שונות התוך assay נמוכות) ושחזור (נמוכים שונות הבין-assay בין ריצות או בין מעבדות), ויש את היתרון של מדרגיות גבוהה.

שים לב שחלק הזהירות נדרשת להשגת האיכות הצפויה של תוצאות. ראשית, במהלך חילוץ DNA, וריאציה גדולה בפרוטוקול יכולה לבזות את התוצאות.לדוגמא, הפחתה משמעותית בהיקף הפקת DNA הפתרון (לדוגמא, 200-100 μl בשלב 2.2) עדיין מאפשרת genotyping, אבל זה יכול להפחית את האמינות ולגרום לשינוי בתוצאות PCR. בתנאים כאלה, מומלץ להפחית את עוצמת הקול של תמצית ה- DNA 4-2 μl, ולהגביר את עוצמת הקול של H 2 O 2-4 μl כדי לפצות על השינוי העוצם הקול במהלך PCR תגובות (שלב 2.5). שנית, בסוף מיצוי DNA, הפתרון יכול לשמש לPCR באופן מיידי ללא צנטריפוגה ברוב המקרים, למרות שהזנב יהיה לשמור על המבנה הכללי שלה ולא להיות מפורק לחלוטין. עם זאת, ההיפוך שתואר של הצינורות הוא חיוני לצורך מתנער הדנ"א הגנומי מהרקמות (שלב 2.4). כמו כן, חשוב להשתמש בחלק העליון, חלק ברור של הפתרון, לא כולל הפסולת בחלק התחתון של הצינור, בגלל הכללה של זה האחרון תוביל לתוצאות PCR חד משמעיות. אלהצעדים יהיו יעילים במינימום זמן ומאמץ. באותה מידה ניתן להשיג תוצאות טובות על ידי פעיל vortexing הדגימה (במקום של התנוחות ההפוכות) ואחריו צנטריפוגה ושימוש בsupernatant. שלישית, לאחר מיצוי DNA, DNA יכול להיות מאוחסן במשך זמן ארוך (לדוגמא,> שבועיים). מומלץ צנטריפוגות את הפתרון באמצעות microcentrifuge (למשל, 3,000-13,000 g בC ° 4 למשך 2 דקות), להעביר את supernatants לצינורות חדשים, ולאחסן אותם ב -80 ° C. כאשר התמצית המאוחסנת היא לשמש לגנוטיפ, צנטריפוגות בקצרה את הדגימה לאחר הפשרה, ולהשתמש בsupernatant.

תרבויות עצביות

תכונה קריטית נוספת של הפרוטוקול שלנו היא השימוש בשכבת מזין גליה להקים תרבויות עצביות בצפיפות נמוכה ציפוי. בדרך כלל, בתרבויות העיקריות של נוירונים במוח של יונקים, התאים מצופה בצפיפות גבוהה יחסית, על coverslips המצופה ללא גליהשכבת l מזין (למשל, 31-39). כאשר צפיפות הציפוי של תאי עצב מופחת באמצעות שיטה זו, החוסר הראשוני של גיליון גליה מוביל לצמיחה עניה עצבית והארכה דנדריטים (B פנלים, C באיורים 8-10), כפי שדווח בעבר 40-42, ככל הנראה בשל גליה עניה 43,44 צמיחה.

יכולות להיות שנוצרו תרבויות עצביות מוצלחות, בצפיפות נמוכה על ידי לפחות שלושה סוגים רחבים של שיטות. בגישה אחת, Neurobasal בינוני משמש כמדיום לתרבות. זה מאפשר לנוירונים תרבות בהעדר שכבת מזין גליה, וניתן להשתמש בם לתרבויות עצביות בצפיפות נמוכה 45,46. בגישה שנייה ("בנקר-סוג 'והשינוי שלה), ותאי גלייה הם שיתוף תרבותיים עם נוירונים באותה טובה אבל מופרדים פיזית מהם. בהקשר זה תאי גליה לספק "תמיכה תזונתית" לתאי עצב ללא פנייה אליהם באופן ישיר1,41,42,47-49. בגישה השלישית, נוירונים הם מצופים בשכבת מזין גליה שנקבעה מראש התומכת בצמיחה עצבית (למשל, 50-53) (איורים 8-10). באופן ספציפי, תאי עצב במוח העכבר הם מצופים בשכבת מזין גליה מוכנה מעכברים או חולדות 8,34,54 41,55,56.

אנחנו מעדיפים שעבר של שלוש גישות לתרבות בצפיפות נמוכה, משום שNeurobasal בינוני יכול להשפיע על הישרדות עצבית 57, תאי גלייה astrocytic יהיו חיוניים בויסות פונקציות עצביות 8,58, והמגע הפיזי בין תאי עצב ותאי גליה יכול להיות חשוב. הנהלים לculturing תאי עכבר וחולדת גליה דומים 59,60, אבל יש לנו שונה אותם מעט כדי להתאים לצמיחה במבחנה המהירה יותר של עכברוש לעומת תאי גליה עכבר. הנהלים לתרבית תאי חולדה שונו 61-63. השימוש בLaye מזין גליהr לתרבויות עצביות בצפיפות נמוכה הופך אותו הצורך לבצע genotyping המהיר, על מנת להתאים את הגנוטיפ של שכבת מזין לזה של תאי העצב בתקופה שבין הלידה 'הגורים ומות הילוד או סוף חלון התרבות (1 -2 ימים לאחר לידה).

תרבות בצפיפות נמוכה על שכבת מזין גליה היא גם שיטה חשובה כאשר מנסה נוירונים תרבות של גרעינים קטנים במוח (למשל, coeruleus הלוקוס משחרר נוראפינפרין, וnigra substantia שחרור דופמין). גרעינים אלו מכילים רק מספר קטן של תאי עצב ובסופו יניבו תרבויות בצפיפות נמוכה 64-67.

תרבויות עיקריות מוכנות באופן שיגרתי במעבדה שלנו מאזור CA3-CA1 של ההיפוקמפוס, האזור המוטורי בקליפת המוח וסטריאטום של עכברים. אותו הנהלים ניתן להשתמש כדי להכין את התרבויות עצביות המייצגים אזורים אחרים במוח, למשל כל היפוקמפוס (כולל מע"מuding gyrus המשונן) וכל קליפת המוח. הנוירונים עכברוש מאזורים במוח כגון ההיפוקמפוס וcoeruleus הלוקוס בתרבית באופן דומה, שימוש בשכבת מזין גליה חולדה. נוירונים בתרבית אלה משמשים בדרך כלל בשבועות 1-4 במבחנה, עם הגיל של התרבות בהתאם למטרת הניסוי המדויק. יש לשים לב שלכמה נוירונים בתרבית על שכבת מזין גליה יכולים לשרוד במשך יותר מ -10 שבועות 34,68.

בעיה פוטנציאלית אחת תרבויות עצביות בצפיפות נמוכה היא שהמאפיינים עצביים יכולים להיות שונים מאלה בתרבויות בצפיפות גבוהה או בתאי עצב באתר. השוואה של מערכות אלה מספקת הזדמנות מעניינת ללמוד איך עצבי פיתוח והתבגרות מושפעים מגורמים רבים, כגון צפיפות העצבית, הגורמים המסיסים מופרשים מתאי עצב, קשר נוירון לנוירון, ואינטראקציות גליה-עצבית.

לסיכום, tattooiתיוג עכבר מבוסס ng הוא ארוך טווח, שיטת genotyping היא מהירה, ושיטת התרבות מאפשרת לציפוי תאי עצב עכבר בצפיפות נמוכה. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מיושם במלואו לבעלי חיים אחרים מחסה מוטציות גנטיות אחרות. יתר על כן, צעדים בודדים של הפרוטוקול יכולים לשמש למטרות אחרות. כך הפרוטוקול ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים הבוסס על צרכי הנסיינים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793 (2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034 (2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245 (2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. e626 (2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. e3844 (2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87, (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895 (2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. e2373 (2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. e2389 (2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. e3634 (2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. e3965 (2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. e3257 (2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. e2111 (2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633 (2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics