动物的基因分型快速其次是建立大脑神经元原代培养

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Neuroscience

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Summary

我们描述了标签和基因分型新生小鼠,并从中产生的主要神经文化的过程。基因分型是快速,有效和可靠的,并且允许进行自动核酸提取。这是为neonatally致死小鼠和其文化,需要事先完成基因分型的特别有用的。

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Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

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Abstract

哺乳动物神经元的形态和功能的高分辨率分析往往需要个体动物随后的神经元的原代培养的分析的基因分型。我们描述了一套程序:标记新生小鼠进行基因分型,快速基因分型,并建立从这些小鼠脑的神经元的低密度培养物。个别小鼠通过纹身,其允许长期持久的识别到成年标记。基因分型通过所述协议是快速和有效的,并且允许进行核酸具有良好的可靠性的自动提取。这是根据情况下有足够的时间对常规的基因分型是不可用, 例如 ,是有用的在于从新生致死遭受小鼠。在低浓度,这使得成像实验以高的空间分辨率产生原代神经元培养物。这种培养方法需要胶质滋养层的准备之前,神经元电镀。在protocol是其全部施加到运动障碍DYT1肌张力障碍(ΔE-torsinA敲除小鼠)的小鼠模型中,与神经元培养物从这些小鼠的海马,大脑皮质和纹状体制备。该协议可以被应用到小鼠与其他的基因突变,以及对其他物种的动物。此外,可用于分离子项目的协议的各个组件。因此,该协议将有广泛的应用,不仅在神经科学,而且在生物科学和医学等领域。

Introduction

遗传疾病的啮齿动物模型已被证明在建立正常蛋白质和核酸,以及在这些缺陷的病理生理后果的生理功能非常有用。举出缺陷型为参与关键的细胞功能的蛋白质的小鼠,以及病症如阿耳茨海默氏病的小鼠模型。然而,某些遗传操作可导致新生儿杀伤力不久或在出生后几天。在这些情况下,原代细胞培养物,因为活细胞可以从死亡前的胚胎或新生儿幼仔得到的重要工具,它们可以保持在至少几个星期的体外 ,并在这段时间内的早期神经元发育,可接着生化,功能和形态的实验。对于主要培养物,也可以是有益的直接制版的神经元密度低;这使得可以以可视化的个别胞体,树突,轴突轴和神经TERMINALS在高的空间分辨率。然而,神经元在低浓度的存活和分化通常要求它们被镀上一个胶质饲养层,共培养的神经胶质细胞在不存在与它们由胶质1空调物理接触,或在培养基中培养。

低密度的神经元培养物的对神经胶质饲养层的机构可以是依赖于快速和可靠的基因分型预先 - 在几个小时在对比几天。速度是特别重要的神经基因型需要被匹配到预先制备的胶质饲养层时。作为更实际的例子,它可能有必要决定哪些其中基因型的幼仔在产生培养物的使用,以优化实验的效率。

在这里,我们证明了工作的协议,已被用于快速,简单和可靠的小鼠基因分型在以前的出版物2-6。鼠标的尾巴,市售的试剂盒的使用。这个协议包括从组织单步提取核酸,并且既不需要一个核酸纯化步骤,也不使用终止缓冲液(“停止溶液”)。这种基因分型方法的可靠性是通过提出的一系列试验的结果时,差异被相对于该样品的起始量,动物的年龄和PCR扩增子的长度引入的说明。该套件提供了自动提取和可靠性的优势。

为求是全面,使用纹身长期鉴定基因型小鼠的也证实。纹身是通过将纹身油墨对皮肤的真皮(表皮下)实现7。的过程被描述为纹身新生儿或1日龄小鼠的爪垫,虽然纹身可以应用到身体的其他部位,如尾和脚趾,并以动画所有年龄段的ALS。另外,程序将被证明为在低密度电镀和培养小鼠的神经元,是根据不同类型的神经胶质饲养层2,8的优化制剂。

我们使用继承神经系统疾病DYT1肌张力障碍的遗传小鼠模型-造成的基因TOR1A突变为常染色体显性运动障碍(c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del)9。所编码的蛋白质,torsinA,属于(AAA +)蛋白质家族,其成员通常执行伴侣样的功能,帮助在“与不同的细胞活性相关的ATP酶”:蛋白质折叠,蛋白质复合物的拆卸,膜运输,和囊泡融合10-13。该突变导致一个在框内缺失谷氨酸的密码子的,并可能导致“早发性全身性肌张力障碍分离的”14,15的表现。但是,路径负责这种疾病ophysiological机制仍然知之甚少。在一个敲入小鼠模型中,该突变体等位基因是TOR1A tm2Wtd,以下简称TOR1AΔE提及。杂ΔE-torsinA基因敲除小鼠是可行和基因模仿人类患者的肌张力障碍DYT1,而纯合子基因敲除小鼠出生后16,17死,与延迟到出生后死亡受遗传背景的18。纯合敲除小鼠的早期死亡的必要条件是动物两者的基因分型,并建立的神经元培养物的迅速完成。作为分型的另一个例子,Tfap2a(转录因子AP-2α,活化增强子结合蛋白2α)将被使用。由该基因编码的蛋白质是在调节多种细胞过程,诸如增殖,分化,存活和凋亡19重要。

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Protocol

注:在本研究中进行的所有动物的程序批准了美国爱荷华大学的机构动物护理和使用委员会。

利用小鼠的纹身爪垫1.长期鉴定

  1. 固定用爪子垫(足底面)一爪子对着实验者。持用拇指和食指的爪子。要小心,不要捏爪子。
    注:稳定的固定化是很重要的,以确保该纹身颜料放入爪垫的真皮,并因此是永久性7。
  2. 拭爪垫,用70%的乙醇在纱布海绵或拭子。
  3. 涂抹护肤油以一个棉签,轻轻按压脚掌垫几次面的提示。只使用少量皮肤油;当存在时大量,它将阻止纹身颜料到达皮肤。
  4. 浸纹身针的顶端到纹身油墨之前以纹身。使用清洁的,无菌和锋利纹身针,以减少疼痛和感染的可能性,并且还增加了纹身效率。
  5. 而爪垫表面覆盖有皮肤油,垂直和轻轻按纹身针尖对在爪垫的中心的皮肤,和多次喷射墨。见表材料/设备关于电动纹身系统的信息。
  6. 喷70%乙醇的纱布海绵,轻轻按压在足去除多余的纹身色素在皮肤表面,并检查纹身的质量。检查爪垫中间有一个黑暗,圆斑不同于正常皮肤色素沉着。如果纹身是没有黑暗,或方便查看足够大,重复之前的步骤纹身。

2.使用快速PCR基因分型基因分型试剂盒新生小鼠

  1. 消毒的小鼠尾巴用70%乙醇的远端,切割5mm或更小的尾部倾斜,并将其传输到用于PCR的类型的8条管的管。使用未使用刀片的每个小狗避免样本之间的交叉污染。或者,使用剪刀,但是在这种情况下,小心地和彻底地除去剩余的组织上用70%的乙醇中的刀片。检查出血。如果发生出血,施加压力的尾部用纱布海绵切割部分直到出血停止。
  2. 添加200μl的DNA提取溶液到含有样品每个PCR管中。见表材料/设备及其有关的工具包组成和信息。
  3. 将管条置于PCR热循环仪,并且使用下面的程序开始了DNA提取:1个循环的55℃10分钟,1个循环,在95℃进行10分钟,并保持在4℃。
    注意:这是在稍后用于PCR相同的PCR热循环仪。
  4. 经过DNA提取完成后,从热循环仪取出一管带次颠倒5次。
  5. 转印各试样的4微升溶液(DNA提取物),以未使用的8管带的管,和与混合:10微升2X PCR预拌二,2微升混合正向&反向引物(建议在0.5μM; 见表材料/设备的序列),和4微升不含核酸酶的H 2 O为每一个试样。使用台式离心机旋短暂( 例如,3秒)。置于冰上在任何时候都管处理时除外。
  6. 进行热循环。见 表材料/设备的热程序。
  7. 检测扩增的DNA产物。装载从PCR(20微升)的总反应溶液直接进琼脂糖凝胶的孔中。加载分子量标记到一个单独的井。施加电场。
  8. 取得频带的荧光图像在紫外光下。

鼠脑神经元3.原代培养S上胶质滋养层

注意:程序脑解剖和细胞解离(3.1)是共同的所有后续步骤。对于小鼠胶质细胞培养的过程(3.2),大鼠神经胶质培养物(3.3),和小鼠的神经元培养物(3.4)分别描述之后。

  1. 脑解剖和细胞Dissocaiation
    1. 牺牲一只小鼠或大鼠幼崽断头,迅速 ​​取出大脑,并放置到Hanks'液( 见表1对组合物)+ 20%在35毫米的培养皿的胎牛血清(FBS)(保持在冰上)。
    2. 划破中线大脑分成两个半球。从大脑的每个半球除去感兴趣的区域( 例如,大脑皮质,纹状体和海马)。从表面去除脑膜和主要血管。切开大脑区域到使用手术刀片4-10薄片。
    3. 冲洗脑切片在一个15毫升的离心管中,一次机智ħHanks液+ 20%FBS中,然后3次,用Hanks液( 无血清)(所有4℃)。冲洗,加入5-10毫升溶液,让大脑切片沉降在管的底部,抽吸从顶部的溶液,并加入新鲜的溶液中。通过抽吸液完成清洗过程。
    4. 滤波器2毫升含胰蛋白酶消化溶液( 见表1对组合物)使用3毫升注射器和一个0.2微米的注射器过滤器,和直接添加滤液到含有脑片管。让胰蛋白酶消化进行在室温13分钟。
    5. 通过吸大部分,然后加入7-10毫升Hanks液+ 20%FBS(4℃)的第一中和胰蛋白酶溶液。
    6. 用Hanks冲洗脑切片,两次'溶液+ 20%FBS中,然后三次用Hanks液( 无血清)(所有4℃)。通过吸取SOLUT完成漂洗程序离子。
    7. 过滤2毫升解离溶液( 见表1对组合物)使用3毫升注射器和一个0.2微米的注射器过滤器,和直接添加滤液到管与脑切片。
    8. 机械轻轻研制过程10-20次,直到可见组织块消失分离的细胞。用棉花塞住,火抛光的巴斯德吸管,避免研磨过程中制作气泡。
    9. 等待3分钟的小片安定下来。
    10. 传送大部分的溶液(〜1.5毫升,留下一些溶液在底部)到包含3毫升Hanks液+ 20%FBS中的溶液(4℃)一个15毫升的离心管中,用棉花塞住,拒爆─抛光的巴斯德吸管。不转移的所有解决方案,因为包含任何沉积物的底部典型地导致在培养的劣化。
    11. 离心13分钟到185克(〜1100转),在4℃。
    12. 吸出上清液轻轻地,加入1毫升预热的电镀液(37℃),以沉淀,并轻轻吹打使用棉栓,火抛光的巴斯德吸管数次重悬它。
      注:三种不同类型的电镀介质用于不同培养用途:镀介质-1小鼠的神经胶质细胞,镀介质-2小鼠的神经元,和电镀介质-3鼠神经元和神经胶质细胞( 见表1的组合物) 。
    13. 取出10微升该细胞悬浮液,用10微升的0.4%台盼蓝溶液混合,并测量活细胞密度,使用一个血球或自动细胞计数器。
  2. 鼠标胶质细胞培养
    1. 洗盖玻片,以帮助建立小鼠细胞的健康文化。
      1. 沉浸盖玻片(圆形,直径12mm)在70%硝酸中的玻璃培养皿。使用铝箔避光,并将其放置在轨道摇床O / N。
      2. 冲洗玻璃coversliPS在培养皿至少三次蒸馏水。沉浸其中在蒸馏水中。放在轨道摇床O / N的菜。
      3. 干上了生物安全柜用Whatman150毫米滤纸盖玻片。
      4. 高压灭菌盖玻片。
      5. 放置盖玻片入24孔培养皿。
    2. 按照步骤1和2标签和基因型新生小鼠。
    3. 获得来自小鼠幼仔的脑细胞,根据步骤3.1。
      注:使用大脑皮层的是典型的准备鼠标胶质滋养层。然而,其他的大脑区域,例如海马和纹状体,将细胞密度的适当调整后的工作,由于不同的号码,并从不同的区域的细胞的产率。
    4. 添加〜4毫升预热镀介质-1至最终细胞悬浮液(约1毫升)中。对于预热的培养基,放置在培养箱中的溶液(5%CO 2 -95%O 2,37℃)O / N,以允许的温度和pH值下保持稳定。
    5. 细胞悬液转移到一个未涂覆的T25培养瓶中,用棉花塞住,火抛光的巴斯德吸移管。放置在所述培养箱中的烧瓶中。
    6. 在第1天在体外 (DIV),冲洗培养的细胞在T25烧瓶中以电镀两次培养基-1(4℃)。将烧瓶放回培养箱。执行由抽吸烧瓶完全用巴氏吸管内侧的介质,加入约5毫升的新鲜培养基,并轻轻倾斜烧瓶几次以旋涡运动漂洗。
    7. 在6-9 DIV,( 即,一天胰蛋白酶消化前和电镀盖玻片上,在步骤3.2.8-3.2.13),放置100微升涂层材料与细胞外基质蛋白(见表材料/设备有关的评论涂层材料)上的盖玻片在培养皿,然后将培养皿在培养箱中。
    8. 在7-10 DIV,当细胞是20-40%汇合(空间连续),trypsinize它们。
      1. 冲洗烧瓶一次,通过吸烧瓶内的所有的溶液并加入〜13毫升的Hanks'液(4℃),轻轻倾斜烧瓶多次在一个旋涡运动,并完全吸出溶液。
      2. 加入40微升DNA酶溶液(终浓度,750单位/ ml)到4ml胰蛋白酶-EDTA溶液,通过0.2μm的注射器过滤该溶液,并直接添加滤液至细胞在烧瓶中。
      3. 让胰蛋白酶消化进行13分钟,在37℃的培养箱中培养。
      4. 加入2毫升100%FBS(4℃)至烧瓶中和胰蛋白酶溶液。
      5. 传送胰蛋白酶细胞用5至10毫升吸管一个15毫升的离心管中,加入Hank氏溶液+ 20%〜4毫升FBS的(4℃),离心〜185克和4℃下进行13分钟,并吸出上清液。
    9. 重悬沉淀在1ml预WÄRME的ð电镀介质-1。
    10. 根据步骤3.1.13测量细胞的密度。
    11. 吸出涂覆材料完全从玻璃盖玻片,并且板〜50微升的重新悬浮的神经胶质细胞的盖玻片上。
      注:这些细胞将建立胶质滋养层。
    12. 放置在培养皿中孵化盖玻片。
    13. 20-60分钟后,加入1 ml预热的镀介质-1向每个孔中,然后将培养皿放回培养箱中。注意:当镀介质被加入,这将是有帮助的,以使用另一个吸管压下盖玻片(在没有镀细胞)的外周,从而使盖玻片不会在培养基中漂浮。
    14. 在1 DIV胶质饲养层( 即,在玻璃盖玻片)的,用1ml更换介质预热镀介质-1,由抽吸所有的孔中的溶液中,然后用新鲜的培养基填充它。
    15. 在2-3 DIV胶质饲养层的CEL时LS是80-100%汇合时,加有丝分裂抑制剂(10μl的5-氟-2'-脱氧尿苷+尿苷的混合物;终浓度为81.2和204.8μM,分别地)到每个孔中,以抑制DNA复制,因此,以抑制神经胶质细胞的增殖。
    16. 在7-9 DIV,当细胞是90-100%汇合(胶质饲养层上镀敷的神经元前1-2小时),以取代所述培养基预热镀介质-2(37℃)。
      注:神经元将被镀在同一天,使用步骤3.4。
  3. 神经胶质文化
    1. 涂覆T25培养瓶用相同的涂层材料。
      注意:这是必要的,在步骤3.3.5以后除去非粘附细胞。
      1. 加入2.0毫升涂层材料至该烧瓶中,并将其放置在所述培养箱中的烧瓶中。
      2. 后2-3小时,完全吸出涂​​覆材料,使得烧瓶中的地板变干燥。
    2. 获取细胞从大鼠幼仔,根据步骤3.1。
      注:海马的CA3-CA1区用于制备大鼠胶质饲养层。然而,其他的大脑区域,例如大脑皮质和纹状体,将调整为在细胞密度由于不同数量和不同区域的细胞的产率的差异后工作。
    3. 添加〜4毫升预热镀介质-3至最终细胞悬浮液(约1毫升)中。
    4. 细胞悬液转移到涂覆的T25培养瓶中,用棉花塞住,火抛光的巴斯德吸移管。将烧瓶中的培养恒温箱(5%CO 2 -95%O 2,37℃)。
    5. 在2-3 DIV,当细胞是20-40%汇合时,除去非粘附或弱粘附细胞,通过关闭盖子紧紧,摇动烧瓶大力〜10倍,抽吸该溶液,并加入4-5镀毫升介质-3(4℃)。重复此步骤一次。检查整个烧瓶地板的培养细胞( 例如,用相差显微镜),以确认那些出现神经元( 那些的量,电池主体的外边缘出现相亮)被完全除去。根据需要重复该过程经常以除去这些细胞,然后将烧瓶返回到培养箱中。
      注:实力和“奶昔”要求可能会有所不同个体之间的实验者的总数。重要的是不保持奶昔的总数的一组数字,但证实神经元样细胞被消除。
    6. 在6-8 DIV,当细胞是90-100%汇合时,通道中的神经胶质细胞通过胰蛋白酶它们​​作为在步骤3.2.8。
    7. 离心后,重悬沉淀在1ml电镀介质-3(4℃)中,加10镀介质-3(4℃)中的溶液中,胰蛋白酶消化细胞转移到未涂覆的T75烧瓶中,并将其培养在孵化器。
      注:鼠的神经胶质细胞将传代两次;与此相反的小鼠的神经胶质细胞ARË代只有一次,因为他们成为多次传代后,不健康的。大鼠神经胶质细胞将传代以未涂覆的任何涂层材料T75烧瓶。该涂层允许大鼠神经胶质细胞生长太快而产生许多纤毛细胞(推定的室管膜细胞),这将在后面恶化的神经元的培养条件。
    8. 在烧瓶中17-19 DIV胶质培养物( 即,传代和1天胰蛋白酶消化前和通过步骤3.3.9-3.3.14镀到盖玻片后11天),将100微升的涂覆材料上未洗涤盖玻片(圆形,直径12mm)在培养皿中,然后将培养皿在培养箱中。
      注:对于神经胶质文化的差异并没有注意到,在培养结果有或没有清洗的盖玻片。
    9. 在烧瓶18-20 DIV胶质文化( 传代12天后),通过胰蛋白酶培养细胞准备胶质滋养层,根据STEP 3.2.8。
    10. 在离心过程中,从玻璃盖玻片完全吸出涂​​料。
    11. 离心后,重悬沉淀在1ml电镀介质-3(4℃)的,并测量细胞密度,根据步骤3.1.13。
    12. 调整胶质密度至10 4活细胞/ ml,和板100微升胶质细胞悬浮在涂覆的玻璃盖玻片上。
      注:这些细胞将建立胶质滋养层。
    13. 放置培养皿用盖玻片放入培养箱为20-60分钟。
    14. 加入1毫升镀介质-3(4℃)至各孔中,然后将培养皿放回培养箱中。
    15. 在3-4 DIV胶质饲养层,当在盖玻片细胞是40-80%汇合时,加入1毫升预热的生长培养基( 见表1对组合物),包含胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(阿糖胞苷,4μM终浓度)来停止神经胶质细胞的增殖。板块神经s的7-9 DIV胶质饲养层时,细胞是60-80%汇合时,使用步骤3.4。
  4. 鼠标神经细胞
    1. 按照步骤1和2标签和基因型新生小鼠。
    2. 使用鼠标幼崽步3.1。
    3. 调整的活细胞悬浮液的密度,以〜2.0×10 5细胞/ ml的用预温热镀介质-2-电镀对小鼠的神经胶质细胞,或使用电镀介质-3-电镀对大鼠神经胶质细胞。
    4. 板中的细胞中的胶质饲养层上,通过轻轻地加入细胞悬浮液到每个培养基良好。注:细胞悬浮液中添加的量将通过细胞的目标数在培养井来确定。例如,板〜60微升细胞悬浮液以达到12000个细胞/孔。
    5. 需要注意的是无解的变化是必要的神经元​​镀后。要小心,以避免从孔中的溶液蒸发超过文化的过程中,通过加湿里面Øf显示培养孵化器。

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Representative Results

作为该协议的应用的一个例子,有代表性的结果示于通过纹身,可靠的基因分型的各种实验条件下标记的小鼠,并且对神经胶质饲养层建立初级神经元培养物。

纹身

新生幼仔被标记上( 图1中“新生儿”),使用纹身系统的爪垫。标签保持3周清晰可见('3周龄')和32周龄('32周龄')。个别小鼠可通过在四只爪子(编号1-16)的纹身的组合,并且通过对动物笼,或更复杂的编号方案中的信息被唯一标识(未示出)。

基因分型

基因分型的一个代表性例子表示( 图2)。野生型的TOR1A基因(TOR1A (TOR1A + /ΔE)和纯合(TOR1AΔE/ΔE)ΔE-torsinA敲入小鼠是从基因组DNA,从尾部夹子新生幼崽的分离扩增。基因分型在这个具体的例子是基于一个单一的34碱基对loxP序列中的突变体等位基因TOR1A新霉素抗性盒16,18的成功的Cre重组和删除后的存在。

基因组DNA用最少的手工操作时间萃取,许多样品进行同时处理。提取量保持恒定,因此,音量的没有调整是必要的,以适应变化的测试条件。基因分型的可靠性是根据四个条件测试,详情如下。

首先,在开始组织的量的差异的影响进行了检查( 图3)。不同长度的尾巴是从杂合ΔE-torsinA敲入小鼠(TOR1A + /ΔE)在断奶年龄(〜3周)制备。的2〜5mm的尾长,通常建议在基因分型的协议的范围内,得到高品质的同基因型的结果。两个频带对应于野生型和突变的等位基因(TOR1A +TOR1AΔE,分别)。

第二,可变性在动物年龄的影响进行了研究( 图4)。尾巴 ​​从新生儿,3周龄获得和〜24周龄杂ΔE-torsinA基因敲除小鼠(TOR1A + /ΔE)。纯合子不使用,因为他们死了好几天出生后16-18。对于野生型在两个预期频带和突变TOR1A基因是无 ​​论动物年龄( 图4A)中可见。在野生叔使用第二基因,Tfap2a 19这一结果的普遍适用性进行了测试YPE小鼠(Tfap2a + / +)( 图4B)。

第三,在PCR扩增子的长度差异的影响进行了测试( 图5)。为了这个目的,合成了对于给定的基因不同的引物对,使得所述扩增的DNA是不同的碱基对长度。该Tfap2a基因一致而不同的扩增子的长度进行检测。

第四,两个DNA的提取方法进行了比较( 图6)。在一种方法中,带材的PCR管并在PCR仪中使用(在步骤2中描述的)。这是自动的,平行的多管的提取方法( 图6中“自动”)。因为多个管道可以在带形式同时处理,和一个PCR机器一起使用的程序在4个温度步骤来操作,没有必要来传输管,手动提取过程中改变温度,或使用多条设备。因此,它是很容易处理许多试样。此基于手工,单管萃取('手动'在图6)与第二方法进行了比较。这将使用单独的PCR管及独立非-PCR机(热块和水浴场)DNA的提取过程中控制温度。在这种情况下,多个单一管移至新的温度的每一步之后,需要多个温度控制装置。在两种情况下,TOR1A基因在野生型,杂合子和纯合子ΔE-torsinA敲除在小鼠中( 图6A)进行了分析,并在Tfap2a基因在野生型小鼠( 图6B)进行分析。这两种提取协议取得了相当的基因分型结果。

总之,在图3图6显示的结果表明,该基因分型的方法是健壮的,尽管Va的实现可靠和可再现的结果riations在组织量,动物的年龄,扩增子的长度,并用于提取协议。

神经细胞

对于鼠标胶质饲养层上培养神经元的鼠标,手续的顺序是:(纹身新生小鼠的基因分型→胶质文化→)胶质文化→纹身新生小鼠的基因分型→神经元文化→神经元的文化。对于神经胶质饲养层上建立的培养中,括号中的程序都被跳过。

我们研究了预种子胶质滋养层对神经元的存活和成长的支持作用。神经元是从CA3-CA1区海马,大脑皮质的运动区,和新生的野生型小鼠的纹状体获得。它们铺板在已被获得从海马的CA3-CA1区和前神经元电镀接种鼠胶质饲养层上的低密度,根据在图7所示的方案(的程序简化摘要)。低密度培养物是最佳的个别枝晶的成像,胞体4,6,神经末梢在高空间分辨率2,3,5,8和轴突轴5。海马细胞(含两个神经元和神经胶质细胞)接种在涂覆的玻璃盖玻片上,无论是与( 图8A)或没有预先建立的胶质饲养层( 图8B,C),并用相位对比光学观察。在一个几乎汇合胶质饲养层的情况下,神经元(在每个面板中,一个箭头表示一个代表性的神经元)的相对分散3和7天电镀(天体外 ,DIV)( 图8A)之后。它们也显示出良好的健康标志,例如,为澄清余量神经元胞体的,扩展的树突,缺乏聚集胞体的,和缺乏捆绑神经突(高倍率IMAG在插图ES)。在14 DIV,这些神经元形成密集的网络特点是长突起(树突和轴突)。需要注意的是神经胶质增生受到抑制神经细胞接种前,通过添加含有丝分裂抑制剂阿糖胞苷(步骤3.3.15)生长培养基。

与此相反,在不存在的胶质饲养层在镀敷的海马神经元的时间,将培养的海马神经元的生长受损,甚至在没有阿糖胞苷的。在3 DIV,神经胶质细胞(包括在新镀海马细胞)还没有形成汇合片(星号在图8B的顶板)。的培养物显示出几个迹象表明不适合高分辨率成像研究,例如,没有相应的神经胶质细胞(星号)宽的区域,聚集胞体的存在和在某些领域捆绑突起的存在(数据未示出)。 7 DIV,神经胶质细胞形成了融合成大片状( 图8C的中间面板)。 Howev呃神经元数量较少时相比,所述神经元被镀上一个预先建立的胶质饲养层。幸存的神经元也缺乏长期,网络形成突起(插图)。胶质细胞在曲率和厚度比在饲养层培养更多的异类,从而出现相光明。为了测试抑制神经胶质增殖对神经元的影响,我们采用阿糖胞苷含有生长培养基中。当阿糖胞苷溶液中加入于3或7 DIV和培养细胞直到14 DIV和在这天( 图8BC,底部面板)观察到的,神经胶质细胞所覆盖最盖玻片表面。然而,神经元仍然数量很少,特别是当阿糖胞苷施加在7 DIV。幸存的神经元只有很短的过程,并没有广泛的连接。因此,后期除了阿糖胞苷允许一个统一的胶质层形成,但并没有促进神经元的存活或轴突延伸;而不受控制的神经胶质细胞生长对神经元的有害作用。

这些数据表明,胶质饲养层是对神经元接种于低密度的存活和生长的关键,并且该胶质层必须存在于神经元电镀,而不是购买的神经元培养中的时间。类似的结果用大脑皮质的培养物( 图9)和纹状体的神经元( 图10)获得。

关于神经元的存活的定性观察进行定量分析证实。具体地,存活的神经元在14格的数量进行计数,根据该培养物的相差图像( 图11)。的数目是最大的神经元培养上的胶质饲养层( ,镀胶质饲养层上)。的数目是低的神经元在缺乏胶质饲养层的培养的情况下。当细胞在治疗阿糖胞苷数目减少甚至进一步以后的时间。这些差异有统计学显著,并指出,在所有三个大脑区域获得神经元的文化。

存活细胞的种类被确定在14格在小鼠海马培养物铺板在大鼠海马饲养层上。使用抗神经元标记物,微管相关蛋白2(MAP2)进行双免疫细胞化学,和星形细胞神经胶质细胞标记物,神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。将细胞与扩展工艺为阳性MAP2,而细胞中底层胶质饲养层呈阳性反应,GFAP(2代表图像字段, 图12A)。这种染色不是第一和第二抗体的特定组合的一个工件,因为当一组不同的第二抗体的使用( 图12B)相同的图案而获得。

相反,当同样的染色PERFORmed指上仅由胶质饲养层, 即,在不存在添加的小鼠细胞(2代表图像字段, 图13A)的培养物,没有细胞呈阳性反应,MAP2。饲养层的细胞始终阳性GFAP。对于阴性对照,初级抗体从所述免疫细胞化学过程( 图13B)被删去。这些样品中没有检测到染色,虽然细胞存在,从透射光光学器件(微分干涉对比,DIC)和用Hoechst染料核染色作为明显。因此,在MAP2和GFAP通道的非特异性染色很弱。

这些免疫细胞化学数据也定量分析( 图14)。在每个8比特图像,亮度进行测定,并沿一条线标绘。叠加图显示MAP2染色时,小鼠细胞(神经元含样本)是在胶质滋养层培养(神经元+,胶质+,一次抗体(1°抗体)+),而这样的染色在单独胶质饲养细胞的培养物(神经元是不存在 - ,胶质+ 1°抗体+)。在没有一抗阴性对照,染色是可以忽略的单独胶质饲养细胞的培养物(神经元 - ,胶质+ 1°抗体 - )。 GFAP染色表观在胶质饲养层,不管小鼠细胞是否铺板(神经元+神经胶质+ 1°抗体+)或不(神经元 - ,胶质+ 1°抗体+)。再次,染色的阴性对照是可忽略的(神经 - ,神经胶质+ 1°抗体 - )。这些结果表明,神经胶质饲养层是由主要的星形胶质细胞,而神经元在场只有当加入的小鼠细胞。他们还指出,目前在这些文化中的神经元从小鼠起源完全。

在线视频的部分结果也显示镀上胶质滋养层,培养的神经元的DIC和MAP2图像博个从野生型小鼠的CA3-CA1海马区制备。

用于细胞培养的详细的控制,所以建议以测量活细胞的密度,这两个用于评估脑解剖和细胞解离的步骤的总体质量,以及用于在预先确定的密度电镀细胞。下面列出的是四组的典型密度测量。但是请注意,这些数字可根据培养条件和试剂而变化。例如,来自同一供应商,甚至不同批次血清的影响的结果。因此,这些数字应该被认为是一个通用指标,而不是绝对的指引。

用于蜂窝解离(步骤3.1.13),用于从一个小狗获得的活细胞密度的典型值是:〜2×10 5个细胞/ ml(小鼠运动皮层和鼠标CA3-海马CA1区),〜5×10 5个细胞/ ml的(小鼠大脑皮层和大鼠CA3-海马CA1区),以及约1×10 6 CELLS /毫升(小鼠纹状体)。在所有这些情况下,活细胞的级分分别为> 90%(生存能力,定义为活细胞的数目,以该细胞的总数的比率)。运动皮层被松散地定义为大脑皮层中飘出立即背侧纹状体20的区域。海马文化,海马CA3的CA1和适当的区域是首选。整个海马还包括齿状回,列入其中,导致形成的颗粒细胞的大量神经末梢,并引入异质性突触性质21。纹状体培养包括尾状核和苍白球,但不包括伏隔核,或在附近的结构内侧或外侧隔核。

对小鼠的神经胶质培养物(步骤3.2.11)中,接种密度为〜万神经胶质细胞上的每个12毫米的圆形盖玻片,用〜50微升细胞悬浮液在〜2 x的密度10 5细胞/ ml。通常在上清液测得的密度是相对恒定的,并且不需要调整。转换的密度在不同的地区,有用的信息是,盖玻片有一个直径为1.20厘米,1.13 平方厘米的面积。因此,〜10,000个细胞/盖玻片=〜8800细胞/ cm 2上的盖玻片。

大鼠神经胶质培养物(步骤3.3.12)中,接种密度为每12毫米的圆形盖玻片〜1000的神经胶质细胞,用约100微升细胞悬浮液以〜1×10 4个细胞/ ml的密度。因此,1000个细胞/盖玻片=〜900细胞/ cm 2上的盖玻片。

低密度小鼠的神经元培养物(步骤3.4.4)中,铺板密度范围每一个24孔板的井间2000和48000细胞。电镀对大鼠神经胶质细胞的神经元时,典型值为:10,000-24,000细胞/孔的大脑皮质神经元,12,000-24,000细胞/孔CA3-CA1海马神经元和24,000-48,000细胞/孔为纹状体神经元。当在小鼠的神经胶质细胞电镀,数量减少, 例如 ,2000个细胞/孔于CA3-CA1海马神经元。作为一个方面说明,电镀大鼠CA3-CA1海马神经元对神经胶质滋养层,镀层密度为1,000-6,000细胞/孔。用于变换的密度在一个井到密度上的盖玻片中,有用的信息是,内部井底部直径为1.56厘米,其面积为1.91 平方厘米。因此,例如,12000个细胞/孔= 7100个细胞/盖玻片= 6300细胞上的盖玻片/ cm 2以下。这些密度被选择以用于高分辨率细胞成像培养相对稀疏的神经元的目的。研究人员应该选择他们认为最适合他们的实验目的号码。

图1
图小鼠1纹身爪垫。ñewborn小鼠被文身的爪垫标记。他们经过纹身(新生儿),立即拍照,在3周龄(3周龄),并在32周龄(32周龄)。标签保持整个成年期容易看到。图像取自不同的动物。他们不是在同一比例显示。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.基因分型的野生型(TOR1A + / +),杂合子(TOR1A + /ΔE)和纯合(TOR1AΔE/ΔE)ΔE-torsinA敲除小鼠的 TOR1A基因等位基因的野生型和突变分析形式,使用DNA提取新生幼仔的尾部。牛逼AIL提示为〜4毫米的长度。使用SYBR安全DNA凝胶染色DNA染色。见材料/设备表有关的引物和热循环程序TOR1A基因的信息。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.在检测变异在起始材料的量的范围内的基因组DNA。不同长度的尾部尖端被使用。受试动物为3周龄,杂ΔE-torsinA基因敲除小鼠(TOR1A + /ΔE)。泳道代表了尾巴的长度为2,3,4和5毫米,一式两份(左起)。尾部尖端分别从不同的小鼠获得。在最左边的车道分子量大小标记代表DNA长度为s100个碱基对TEPS。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.检测基因组DNA中的变化在动物年龄的情况下。 (A)TOR1A基因。 道表示从杂ΔE-torsinA基因敲除小鼠(TOR1A + /ΔE)在以下几个阶段获得的尾巴提示:新生儿,3周龄和24〜周龄(一式两份左起)(B)。 Tfap2a基因。道表示从野生型(Tfap2a + / +)小鼠在以下几个阶段获得的尾巴提示:新生儿,3周龄和24〜周龄(一式两份左起)。这两个基因均从尾巴〜4mm长扩增。预期PCR片段是498基点。 PCR程序WA S中的相同用于TOR1A基因。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5.在检测中的变化的PCR扩增子的长度的范围内的基因组DNA的 Tfap2a基因用的498 bp的PCR扩增子长度(左泳道),983碱基对(中间泳道)和1990碱基对(右泳道)的分析重复。该基因从3周龄的小鼠尾巴扩增。在凝胶的最左边和最右边的泳道分子量大小标记表示的DNA的长度在步骤100和200个碱基对,分别。见材料/设备表有关引物扩增不同的信息。 879fig5highres.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图6
图6.检测中的变化的DNA提取方法的上下文中的基因组DNA。结果为手动,单管萃取(手动)和自动化,并行多管提取方法(自动)进行了比较。后者的方法,使用在本报告中。基因从尾巴〜4毫米的长度,从新生儿收集扩增。(A)的 TOR1A基因ΔE-torsinA的初生幼仔敲入小鼠。泳道代表的DNA从野生型(手动和自动),杂合子(手动和自动),以及纯合子小鼠(手动和自动)(左起)萃取。(B)的 Tfap2a基因在3周龄的野生型小鼠。预期PCR片段是498基点。jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图7
图7.简化,程序示意图电镀小鼠的神经元对小鼠(A)和大鼠(B)的胶质饲养层的编号( 体外天)是指累积天后胶质细胞在培养第一镀瓶。他们只是作为一个粗略的估计。对于具体细节,请参见程序部分。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8
图8.支持性作用胶质饲养层对海马神经元的低密度培养物生长的。神经元新生,野生型小鼠的海马的CA3-CA1区中获得的。(A)的小鼠海马细胞接种在涂覆的玻璃盖玻片上,其已预先接种有从海马的CA3-CA1区而获得的大鼠神经胶质饲养层。神经细胞均匀地分散在一个健康的方式。培养物在3,7和14格观察(B,C)的小鼠海马细胞接种在涂覆的玻璃盖玻片上,其没有预先建立的饲养层。培养物在3 DIV(顶面板中B)和7 DIV(中间面板中℃)未经阿糖胞苷治疗观察。在其它组培养物,将细胞以3格(底部面板中B)和7 DIV(底部面板中℃)分别用阿糖胞苷,并在14格遵守。所有图像表示来自同一小狗,其神经细胞铺板在同一天获得的姊妹培养物。详见说明书。对于每个面板,前充足的神经元是由白色箭头指示和放大在插图。神经元有细胞体的外围由相差光学观看时,会出现明亮,而且他们也有厚厚的过程。星号表示没有神经胶质细胞领域。使用相衬光学与20X物镜(0.45数值孔径)的培养物直播成像上的倒置显微镜没有中间的镜头( 在1个)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图9
胶质饲养层上大脑皮质神经元的低密度培养物生长的图9.支持性的效果。类似的结果如在图8中 ,但与来自C的马达区域而获得的神经元erebral皮层。在标签AC对应于图8的条件。 请点击此处查看该图的放大版本。

图10
图10.胶质饲养层上以低密度培养纹状体神经元的生长支持性的效果。类似的结果, 如图89中 ,但与来自纹状体获得的神经元。在标签AC对应于图8的条件。 请点击此处查看该图的放大版本。

图11.胶质饲养层上的神经元存活的支持性的效果。存活的神经元的数量在图8所示的实验进行计数,使用由相衬显微镜获得的图像。为14格图象显示在这里再次,但与箭头指向计数神经元的例子。条形图显示了每个图像场(449.0微米×335.5微米)的神经元的数量(平均值±平均值的标准误差,每组7-24字段每个培养条件)。星号指示统计学显著差异'胶质饲养层( - ),阿糖胞苷3 DIV“和”神经胶质饲养层( - ),阿糖胞苷7 DIV'从'胶质饲养层(+)'(* P <0.05,** P <0.01,非配对t检验 )。上面的条的数字表示的多个图象场的蒙太奇测定的神经元密度。图像进行使用20X物镜获得的。为了避免采集偏压,所有图像都沿着一个完整的垂直带材获得,从顶部至盖玻片的底部,并穿过盖玻片的近似中心。各个图像有一些重叠( 例如,1/6至一个图象场的1/4的顶部和底部)。两种方法被用于分析。在1,神经元在交替的图像,以确保单个神经元并没有计算在内多于一次计数。将所得的数字被用来生成柱状图。在第二种方法中,一个单一的蒙太奇被从各个图像创建。使用Photoshop使用Microsoft图像编辑器复合或手动他们被缝合。该蒙太奇也排除了同一神经元的倍数计。由此产生的数列以上的酒吧。在两种方法中,在盖玻片周围宽区域不包含任何细胞被排除在外。如果他们有这似乎明亮胞体细胞计数为神经细胞用相差显微镜,以及扩展的细胞过程。 请点击此处查看该图的放大版本。

图12
图12.免疫细胞识别细胞类型的神经元培养物。该培养条件对应于图8A的左下的图像。神经元是从野生型小鼠的海马的CA3-CA1区获得的,并接种在野生型大鼠海马的CA3-CA1区产生的胶质饲养层。通过免疫细胞化学对神经元标志MAP2和星形细胞神经胶质细胞标志物GFAP培养细胞进行了分析。微分干涉对比(DIC)显微镜用于揭示成像领域的一般形态,14-17神经元天后接种胶质滋养层上。(A)三色染色,包括与核标记的Hoechst 33342染料复染。两个代表图像字段被示出。(B)的两色染色,用偶联有不同的荧光第二抗体的不同组合。 125氯化钠,2氯化钾,2-氯化钙2,2的MgCl 2,30 D-葡萄糖,25 HEPES,pH 7.4中:在这些实验中,将培养的细胞在台氏溶液(含有,以mM分别用4%多聚甲醛和4%的蔗糖用5M NaOH调节,〜310毫渗透摩尔浓度不调整)处理30分钟,在4℃。被用台氏液后,将它们透用0.1%的Triton X-100在台氏液10分钟。它们被再次用台氏液包被,然后用2%正常山羊血清的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(封闭溶液)在室温60分钟。随后他们与兔子聚处理克隆抗MAP2抗体(AB5622; 400X稀释在封闭溶液中),和小鼠单克隆抗GFAP鸡尾酒(NE1015; 1000倍稀释)的O / N(15-21小时),在4℃。以下用PBS洗涤,将细胞与山羊抗兔和抗小鼠IgG抗体(在封闭溶液稀释500倍)缀合的Alexa Fluor 405,将Alexa Fluor 488(1000倍)或的Alexa Fluor 568染料(500×)60分钟RT。它们用PBS洗涤,并直接在PBS观察。在某些文化中,在上述过程的最后一次洗涤后,将细胞在RT治疗用Hoechst 33342在PBS 0.5微克/毫升10分钟,观察前,用PBS。 请点击此处查看本一个更大的版本数字。

图13
图13. IMMU染色用胶质饲养层培养物nocytochemical鉴定细胞类型。大鼠胶质饲养层的姐妹培养物如在图12中 ,但没有小鼠神经元的电镀。(A)的图12A中描述的免疫细胞化学方法。两个代表图像字段被示出。使用在A中描述的免疫细胞化学方法胶质饲养层(B)的染色,但与初级抗体被删去。相同的摄像条件下取得的在图12A13A,B中的所有MAP2的图像,并显示在相同的图像的对比度,以允许强度的比较。相同的方法用于在图12A13A,B,GFAP图像。胶质饲养层培养物上成像的同一天,在图12中的培养物。因此,胶质饲养层中13是在体外的时间相同数量的培养。 请点击此处查看该图的放大版本。

图14
图14.强度免疫细胞化学染色的。线被描绘在图12图13所示的图像,并且沿着这些强度作图。插图显示图12A的第一行中的图像。这三个条件是:鼠细胞(含有神经元)的1)上的大鼠饲养层和染色与初级抗体(神经元+神经胶质+ 1°抗体+)电镀,2)胶质饲养层只(无神经电镀)和染色与初级抗体(神经 - ,神经胶质+ 1°抗体+),和3)胶质饲料呃层(不使用神经元电镀)和染色无一抗(神经元 - 胶质细胞+,1°抗体 - )。神经元染色(MAP2)的存在,只有当鼠标细胞铺板(条件1与2),和神经胶质染色(GFAP)存在于这两组培养物(条件1与2)。免疫细胞化学染色具体到初级抗体(1条件与3)。 请点击此处查看该图的放大版本。

SOLUTIONS
TAE缓冲液(50倍 ​​溶液)
三基地,486克
冰醋酸,114.2毫升
的0.5M EDTA,pH 8.0中,加入200ml
加蒸馏水使总体积为2升
弥补在化学通风橱中。
稀释后使用50倍。
汉克斯的解决方案
Hanks平衡盐,无氯化钙,硫酸镁和碳酸氢钠(1升)
的NaHCO 3中 ,350毫克(终浓度4.17毫摩尔)
HEPES,2.38克(最终浓度为10mM)
调整使用5 M氢氧化钠pH值7.4。
调节渗透压用蔗糖310毫渗量(渗透压趋于〜290毫渗量无任何调整)。
加蒸馏水使总体积为1升
消解液(胰蛋白酶治疗脑组织)
氯化钠,800.6毫克(最终浓度,137毫摩尔)
氯化钾,37.3毫克(F伊纳勒浓度,5毫摩)
的Na 2 HPO 4·(7H 2 O),187.6毫克(最终浓度,7毫摩尔)
HEPES,595.8毫克(终浓度,25毫摩尔)
葡萄糖,97.3毫克(最终浓度,5.4毫摩尔)
调整使用5 M氢氧化钠pH值7.2。
渗透压趋于〜310毫渗量没有任何调整。
加蒸馏水使总体积至100ml。
右使用前,加入20毫克的胰蛋白酶的DNA酶和20微升(10毫克/毫升终浓度)至2ml的消化溶液(750单位/ ml最终浓度)。
解离溶液(对于脑组织的机械解离)
汉克斯的解决方案
硫酸镁4·(7H 2 O),295.1毫克(最终concentrati上,11.97毫米)
使用蔗糖渗透压调节到310毫渗量。
总体积为100毫升
右键使用前,加入20微升的DNA酶2毫升分离溶液(750单位/毫升终浓度)。
镀用培养基-1(对于小鼠的神经胶质细胞)
Dulbecco氏改进的Eagle培养基(DMEM),449.5毫升
MITO +血清扩展,0.5毫升
FBS的50毫升
总成交量为500毫升
镀剂培养基-2(对于小鼠神经元)
的Neurobasal-A,485毫升
B27,将10毫升
含有GlutaMAX-I中,加入5ml(最终浓度为2mM)
总成交量为500毫升
镀介质-3(大鼠神经元和神经胶质细胞)
最小必需培养基(MEM,不含酚红)
葡萄糖,2.5克(最终浓度,27.8毫摩尔)
的NaHCO 3中 ,100毫克(终浓度,2.38毫摩尔)
转铁蛋白,50毫克
FBS的50毫升
含有GlutaMAX-I中,加入5ml(最终浓度为2mM)
胰岛素,12.5毫克
总成交量为500毫升
生长培养基(对于大鼠的神经元和神经胶质细胞)
MEM(无酚红)
葡萄糖,2.5克(最终浓度,27.8毫摩尔)
的NaHCO 3中 ,100毫克(终浓度,2.38毫摩尔)
转铁蛋白,50毫克
FBS,25毫升
含有GlutaMAX-Ⅰ,1.25毫升(最终浓度,0.5毫摩尔)
B27和NS21 {陈,2008#2399},将10毫升
胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(阿糖胞苷),0.56毫克(最终浓度,4μM)
总成交量为500毫升
一般意见
我们的培养基不包含抗生素,因为它们可以产生对培养的神经胶质细胞和神经元(参照70,71)的细胞毒性作用。这使得它尤其重要的是坚持无菌培养相关的工作程序。
试剂的表的化学品的具体来源。

表1.解决方案

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Discussion

这里介绍的协议包括程序纹身标记/识别小鼠的基因分型,从尾部的提示小鼠,并为培养小鼠大脑的神经元密度低。在一个循环中使用6-8幼仔的实验中,这些过程通常需要约0.5小时,〜4小时和〜2小时,分别在共6-7小时的。这使得实际用于单个实验者完成所有从幼仔的出生到神经元培养物的电镀时所必需的程序 - 在少于单个工作日(除胶质饲养层之前制备的)。

纹身

长期识别动物是必要的育种和这样的科学研究的目的组织学,细胞的功能和动物的行为作为分析。纹身新生动物是有利的,因为它可以迅速地进行,并持续许多动物的生命7,22-25的。牛逼attooing对爪垫可以比脚趾剪取23相对于保持可测试的行为,例如,在悬浮液中或抓握22,26更好,尽管一些研究还没有注意到这样的缺陷( 例如,25)。有母亲拒绝或纹身后拆幼崽没有实例。对于长期的动物识别等方法,查看最近的评论7,23,24。

基因分型

在我们的协议的一个关键特征是使用的快速基因分型方法。虽然类似的基因分型方法,在以前的报告( 例如,27,28)进行了说明,这里所描述的系统具有至少两个改进。首先,它可以在开始组织,动物的年龄,以及扩增子长度的量容忍一定的变化。因此,成功的基因分型可使用小鼠年仅1天和一样古老6月龄来实现,并且可以进行使用范围广泛的引物对。其次,这种方法不需要为提取DNA步骤停止溶液。这消除了过度的管搬运和吹打,并允许用PCR机的过程中并行多管自动化。标本的数量可以按比例增加( 例如 ,96个样本)尚未处理容易且同时进行。还检体类型不限于尾剪辑;可用于其它类型的样品,包括耳冲头,趾剪辑,全早期胚胎,和胎盘组织2-4,29,30。不同种类的动物也可使用。因此,基因分型方法是可靠的(可重复使用低批内方差)和(运行之间或实验室之间的低测定间方差)重现性好,具有高的可扩展性的优点。

请注意,一些谨慎是必需取得成果的预期质量。首先,DNA提取中,一个大的变化,在协议可降解的结果。例如,一个显著减少在DNA提取溶液的体积( 例如,从200到100微升,在步骤2.2)仍然允许基因分型,但它可以降低可靠性并导致变化PCR结果。在这种情况下,建议减少的DNA提取物的体积从4到2微升,与增加氧化氢 ​​的量从2至4微升,以补偿在PCR反应期间(步骤2.5)的体积变化。第二,在DNA提取结束时,该溶液可用于PCR立即未经离心在大多数情况下,虽然尾部将保留其整体结构,不会被完全分解。然而,该管的描述反演是用于从组织(步骤2.4)解离的基因组DNA的目的是必不可少的。同样重要的是要使用的顶部,溶液的清晰部分,不包括碎片在试管的底部,因为列入后者会导致不确定的PCR结果。这些步骤将是有效的以最小的时间和精力。同样良好的结果可以通过积极地涡旋样品(代替反转的)来获得,随后通过离心分离,将上清液的用法。第三,在DNA提取后,将DNA可以存储长期( 例如,>两周)。建议离心使用微量( 例如 3,000-13,000克于4℃,2分钟),将上清液转移到新的管中,并把它们存储在-80℃的溶液中。当所存储的提取物是要用于基因分型,短暂离心样品解冻后,用上清。

神经细胞

我们的协议的另一个关键特征是使用一个胶质饲养层,建立的神经元培养物在低的铺板密度。通常情况下,在哺乳动物脑的神经元的原代培养物,将细胞铺板具有相对高的密度,对涂覆的盖玻片未经胶质升饲养层( 例如,31-39)。当神经细胞的铺板密度使用这种方法减少了,初始缺乏胶质片导致不良的神经元生长和枝状延伸部(板B,C图8-10),如先前报道40-42,可能是由于胶质穷生长43,44。

成功的,低密度的神经元培养物可通过至少三种广义类型的方法来产生。在一个方法中,Neurobasal介质被用作培养基。这使得有可能在没有胶质饲养层的培养的神经元,并且可以用于低密度的神经元培养物45,46。在第二种方法('银行家型“和它的变形例),神经胶质细胞共培养在相同的良好的神经元,但在物理上是由它们分离。在这种情况下的神经胶质细胞提供“营养支持”神经元不直接接触它们1,41,42,47-49。在第三种方法中,神经元被镀上,支持神经元生长( 例如,50-53)( 图8-10)预先建立的胶质饲养层。具体地,小鼠脑的神经元被镀上从小鼠8,34,54或大鼠41,55,56制备的胶质饲养层。

我们优选的最后的三种方法来低密度培养物,因为所述的Neurobasal培养基可影响神经元存活57,星形神经胶质细胞将是必要的,调节神经功能8.58,以及神经元和神经胶质细胞之间的物理接触可以是重要的。本程序为小鼠和大鼠神经胶质细胞的培养是相似的59,60,但是我们已经修改他们略微以适应更迅速的体外生长的大鼠与小鼠的神经胶质细胞。该程序的老鼠细胞培养的61-63进行了修改。使用胶质馈线Laye的的r表示低密度的神经元培养物使得必须进行快速的基因分型,以饲养层的基因型相匹配的幼仔'出生和新生儿死亡或培养窗口的结束之间的周期内的神经元(1 -2产后天)。

上的胶质饲养层的低密度培养也是一个重要的方法,当一个试图在脑中( 例如,去甲肾上腺素释放蓝斑和多巴胺释放黑质)小核培养神经元。那些晶核仅含有少量的神经元和将不可避免地产生的低密度培养物64-67。

初级培养物中的来自海马,大脑皮质的电动机区和小鼠的纹状体的CA3-CA1区实验室常规制备。同样的程序可以用于制备神经元培养物,代表其他脑区域,例如整个海马(包括UDING齿状回)和整个大脑皮层。从大脑区域的大鼠的神经元,如海马和蓝斑是在类似的方式进行培养,使用鼠胶质饲养层。这些培养的神经元通常使用在1-4周的体外 ,与根据实验的目的的培养物的确切年龄。值得注意的是,一些神经元上的胶质饲养层培养可以为10周以上34,68生存。

低密度的神经元培养物中的一个潜在的问题是,神经元属性可以是从那些在高密度的培养物,或在原位神经元不同。这些系统的比较提供研究如何神经元发育和成熟受多种因素的影响,如神经元的密度,从神经元分泌的可溶性因子,神经元到神经元接触,和胶质神经元的相互作用一个有趣的机会。

综上所述,tattooi纳克基于鼠标标记是持久的,基因分型的方法是迅速,和培养方法允许电镀小鼠的神经元,在低的密度。这里所描述的协议可以在其全部可应用于其它动物物种窝藏其他遗传突变。此外,可用于其他目的的协议的各个步骤。因此,协议可以在广泛的应用阵列基于实验者的需要使用。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

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