Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

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Neuroscience

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Summary

Wir beschreiben Verfahren für die Kennzeichnung und Genotypisierung neugeborenen Mäusen und Erzeugung primären neuronalen Kulturen von ihnen. Die Genotypisierung ist schnell, effizient und zuverlässig und ermöglicht die automatisierte Nukleinsäureextraktion. Dies ist besonders nützlich für neonatal letale Mäusen und Kulturen, die vor Abschluss der Genotypisierung erfordern.

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Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

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Abstract

Hochauflösende Analyse der Morphologie und Funktion von Säuger-Neuronen erfordert oft die Genotypisierung von Einzeltieren, gefolgt von der Analyse der Primärkulturen von Neuronen. Wir beschreiben eine Reihe von Verfahren für: Etikettieren neugeborenen Mäusen die genotypisiert werden, schnelle Genotypisierung und die Einrichtung mit niedriger Dichte Kulturen von Nervenzellen im Gehirn von diesen Mäusen. Einzelne Mäuse werden von Tätowierungen, die für langfristigen Identifikations dauerhaft in das Erwachsenenalter ermöglicht markiert. Genotypisierung von dem beschriebenen Protokoll ist schnell und effizient und ermöglicht eine automatisierte Extraktion von Nukleinsäure mit guter Zuverlässigkeit. Dies ist unter Umständen, wenn genügend Zeit für herkömmliche Genotypisierung nicht verfügbar ist, beispielsweise nützlich, in Mäusen, die aus Neugeborenen-Letalität leiden. Primären neuronalen Kulturen werden bei niedriger Dichte, die Abbildungsexperimente mit hoher räumlicher Auflösung ermöglicht erzeugt. Diese Kulturverfahren erfordert die Herstellung von glial-Feeder-Schichten vor dem neuronalen Plattierung. Die protocol ist in seiner Gesamtheit an einem Mausmodell für die Bewegungsstörung DYT1 Dystonie (& Dgr; E-Torsina Knock-in-Mäusen) aufgebracht und Neuronenkulturen werden von Hippocampus, Kortex und Striatum dieser Mäuse hergestellt. Dieses Protokoll kann auf Mäuse mit anderen genetischen Mutationen, um andere Tierarten angewendet werden, wie gut. Ferner können einzelne Komponenten des Protokolls isoliert Teilprojekte verwendet werden. Dabei dient dieses Protokoll haben breite Anwendungen, nicht nur in den Neurowissenschaften, aber auch in anderen Bereichen der biologischen und medizinischen Wissenschaften.

Introduction

Nagetiermodellen von genetischen Krankheiten als nützlich bei der Schaffung der physiologischen Funktionen von normalen Proteinen und Nukleinsäuren sowie die pathophysiologischen Folgen von Defekten in diesen erwiesen. Beispiele umfassen Mäuse für Proteine ​​in zelluläre Schlüsselfunktionen beteiligt defizient sowie Mausmodelle von Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit. Allerdings können bestimmte genetische Manipulationen an neonatale Letalität kurz oder ein paar Tage nach der Geburt führen. In diesen Fällen sind die primären Zellkulturen ein wichtiges Werkzeug, da lebende Zellen können aus den embryonalen oder neonatalen Welpen vor dem Tod erhalten werden, können sie für wenigstens einige Wochen in vitro gehalten werden, und während dieser Zeit frühe neuronale Entwicklung kann gefolgt werden biochemische, morphologische und funktionelle Experimente. Für die Primärkulturen, kann es vorteilhaft sein, die Nervenzellen bei niedriger Dichte Platte; dies macht es möglich, die einzelnen Zellkörper, Dendriten, Axonen und Nervenwellen termi visualisierennale mit hoher räumlicher Auflösung. Jedoch das Überleben und die Differenzierung von Neuronen bei niedriger Dichte erfordert typischerweise, dass sie auf einer glialen Feeder-Schicht plattiert sind, co-kultiviert mit Glia-Zellen in Abwesenheit von physikalischen Kontakt mit ihnen oder in einem Medium kultiviert, durch Glia 1 konditioniert.

Die Einrichtung von niedriger Dichte neuronalen Kulturen auf Gliazellen Feeder-Schichten kann abhängig von schnellen und zuverlässigen Genotypisierung voraus sein - innerhalb von ein paar Stunden im Gegensatz zu ein paar Tagen. Geschwindigkeit ist besonders wichtig, wenn das neuronale Genotyp muss derjenigen einer glialen Nährschicht vorher vorbereitet angepaßt werden. Als ein praktisches Beispiel kann es notwendig sein, zu entscheiden, welche backs dem Genotyp in Erzeugen Kulturen zu verwenden, um die Effizienz eines Experiments zu optimieren.

Hier zeigen wir die Arbeitsprotokoll, das für die schnelle, vereinfachte und zuverlässige Maus Genotypisierung in früheren Publikationen 2-6 verwendet wurde. Mäuseschwänzen undein im Handel erhältlicher Kit verwendet. Dieses Protokoll umfasst einstufigen Extraktion von Nukleinsäuren aus dem Gewebe und erfordert weder eine Nukleinsäure-Reinigungsschritt noch der Einsatz eines Aufhebungspuffer ("Stop-Lösung"). Die Zuverlässigkeit dieser Genotypisierungsverfahrens wird erreicht, indem die Ergebnisse einer Reihe von Tests, wenn Unterschiede in Bezug auf die Ausgangsmenge der Proben, dem Alter der Tiere und die Länge der PCR-Produkte eingebracht dargestellt. Dieses Kit bietet die Vorteile der automatischen Extraktion und Zuverlässigkeit.

Aus Gründen der als umfassende, ist die Verwendung von Tätowieren für langfristige Identifikations der genotypisiert Mäusen demonstriert. Tätowieren wird durch Anlegen Tätowierfarbe in die Dermis der Haut (unter der Epidermis) erreicht 7. Es wird ein Verfahren für die Tätowierung Fußballen von Neugeborenen oder 1 Tag alten Mäusen beschrieben, obwohl Tätowierungen kann auch auf andere Teile des Körpers, wie zum Beispiel Schwänze und Zehen angewendet werden, und animals aller Altersgruppen. Darüber hinaus werden Verfahren für die Beschichtung und das Kultivieren der Maus-Neuronen bei einer niedrigen Dichte nachgewiesen werden, basierend auf einer optimierten Herstellung von verschiedenen Arten von glial-Feeder-Schichten 2,8.

Wir verwenden einen genetischen Mausmodell des geerbten neurologische Erkrankung DYT1 Dystonie - eine autosomal-dominante Bewegungsstörung durch eine Mutation im Gen verursacht TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. Das codierte Protein, Torsina, gehört zu den "ATPasen mit verschiedenen Zellaktivitäten verbunden" (AAA +) Proteinfamilie, deren Mitglieder in der Regel durchführen Chaperon-ähnliche Funktionen, Unterstützung bei: Proteinentfaltung, Protein-Komplex Demontage, Membrantransport und Vesikelfusion 10-13. Die Mutation führt zu einer in-frame-Deletion eines Codons, das für Glutaminsäure, und kann eine Manifestation der "early-onset generali isoliert Dystonie '14,15 führen. Jedoch ist die Pfadophysiological Mechanismen für diese Erkrankung verantwortlich bleiben weitgehend unverstanden. In einer Knock-in-Maus-Modell ist der mutierte Allel Tor1a tm2Wtd, im folgenden als Tor1a AE erwähnt. Heterozygote AE-Torsina knock-in Mäuse sind lebensfähig und genetisch imitieren menschlichen Patienten mit DYT1 Dystonie, während homozygote Knock-in Mäusen nach der Geburt sterben, 16,17, mit der Latenzzeit zu postnatalen Tod von genetischen Hintergrund 18 betroffen. Der frühe Tod von homozygoten Knockout-Mäusen erforderlich, daß sowohl die Genotypisierung von Tieren und die Einrichtung von neuronalen Kulturen schnell abgeschlossen. Als weiteres Beispiel für die Genotypisierung Tfap2a (Transkriptionsfaktor AP-2α, Aktivieren Enhancer bindendes Protein 2α) verwendet. Das durch dieses Gen kodierte Protein ist in der Regulierung mehrerer zellulärer Prozesse, wie Proliferation, Differenzierung, Überleben und Apoptose 19 wichtig.

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Protocol

HINWEIS: Alle in dieser Studie durchgeführten Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Iowa zugelassen.

1. Langfristige Bezeichnung Mäuse Mit Tätowieren den Fußballen

  1. Immobilisieren eine Pfote mit der Pfote Pads (Fußsohle) mit Blick auf den Experimentator. Halten Sie die Pfote mit dem Daumen und dem Zeigefinger. Achten Sie darauf, die Pfote zu kneifen.
    HINWEIS: Stabil Immobilisierung ist darauf zu achten, dass die Tattoo-Pigment in die Dermis der Pfote Pads platziert und damit dauerhaft 7.
  2. Wischen Sie die Pfotenpolster mit 70% Ethanol auf einem Gaze-Schwamm oder Tupfer.
  3. Bewerben Hautöl zu einem Wattestäbchen, und drücken Sie vorsichtig die Spitze gegen die Oberfläche der Pfote Pad mehrmals. Verwenden Sie nur eine kleine Menge von Hautöl; wenn sie in großen Mengen, es wird die Tätowierpigment vom Erreichen der Haut zu verhindern.
  4. Tauchen Sie die Spitzen der Tattoo-Nadeln in der Tätowierfarbe gerade vorzum Tätowieren. Verwenden Sie saubere, keimfreie und scharfe Tätowiernadeln, um die Schmerzen und die Möglichkeit einer Infektion zu verringern, und auch um die Tätowierung Effizienz zu steigern.
  5. Während die Pfotenpolster Oberfläche mit der Haut Öl bedeckt ist, drücken Sie die Tattoo-Nadelspitzen vertikal und leicht auf der Haut in der Mitte der Pfote Pad, und spritzen die Tinte mehrere Male. Siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Informationen über elektrische Tätowierung-System.
  6. Spray 70% Ethanol auf einem Gaze-Schwamm, drücken Sie sie vorsichtig gegen die Pfote zu zusätzlichen Tätowierungspigmente auf der Hautoberfläche zu entfernen, und überprüfen Sie die Qualität der Tätowierung. Prüfen, ob die Mitte des Pfotenpolster hat einen dunklen, runden Fleck, die von der normalen Pigmentierung der Haut unterscheidet. Wenn das Tattoo nicht dunkel oder groß genug für die einfache Anzeige, wiederholen Sie die vorherigen Schritte Tätowieren.

2. Genotypisierung Neugeborene Mäuse mit einem schnellen PCR Genotypisierung Kit

  1. Desinfizieren des distalen Endes eines Maus Schwanz mit 70% Ethanol, schneiden 5 mm oder weniger der Schwanzkippen und sie auf einem Rohr aus einem 8er Streifen des Typs, für die PCR verwendet. Verwenden Sie eine unbenutzte Rasierklinge für jeden Welpen um eine Kreuzkontamination zwischen Proben zu vermeiden. Alternativ dazu können eine Schere, aber in diesem Fall sorgfältig durch das verbleibende Gewebe an die Klingen unter Verwendung von 70% Ethanol. Prüfen Sie, ob Blutungen. Wenn die Blutung auf, Druck auf die ausgeschnittenen Bereich des Schwanzes mit einem Gaze-Schwamm, bis Blutung aufgehört hat.
  2. Fügen Sie 200 ul der DNA-Extraktionslösung zu jedem PCR-Röhrchen mit einer Probe. Siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für seine Zusammensetzung und Informationen über das Set.
  3. Das Röhrchen Streifen in einen PCR-Thermocycler und Beginn der DNA-Extraktion, mit dem folgenden Programm: 1 Zyklus bei 55 ° C für 10 min, 1 Zyklus bei 95 ° C für 10 Minuten, und Halten bei 4 ° C.
    Anmerkung: Dies ist das gleiche PCR-Thermocycler, die später für die PCR verwendet.
  4. Nachdem die DNA-Extraktion beendet ist, entfernen Sie das Rohr Streifen aus dem Thermocycler einnd invertieren 5mal.
  5. Überweisung 4 ul der Lösung (DNA-Extrakt) jeder Probe auf einer unbenutzten Röhre eines 8-Röhrenstreifen und mischen mit: 10 ul 2X PCR Ready Mix II, 2 ul vorne und Reverse-Primer gemischt (bei empfohlen 0,5 uM, siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Sequenzen) und 4 ul Nuklease-freies H 2 O, für jede Probe. Spin kurz (zB 3 sec) mit einer Tischzentrifuge. Halten Sie das Röhrchen auf Eis zu allen Zeiten außer bei der Handhabung.
  6. Führen Temperaturwechsel. Sehen Tabelle der Materialien / Ausrüstung für die thermische Programm.
  7. Detektieren die amplifizierte DNA-Produkte. Laden die gesamte Reaktionslösung aus der PCR (20 & mgr; l), die direkt in ein Bohrloch eines Agarosegels. Laden Sie die Molekulargewichtsmarker in eine separate gut. Anwenden eines elektrischen Feldes.
  8. Erwerben Fluoreszenzbilder der Banden unter UV-Licht.

3. Primär Kultur der Maus Gehirn Neurons auf Gliazellen Feeder Layer-

HINWEIS: Die Vorgehensweisen zum Gehirn Dissektion und Dissoziation Zelle (3,1) sind, die für alle nachfolgenden Verfahren. Die Verfahren für die Maus Gliakulturen (3.2), Ratte Gliakulturen (3.3) und eine Maus neuronalen Kulturen (3.4) werden separat danach beschrieben.

  1. Gehirn Dissection and Cellular Dissocaiation
    1. Opfere eine Maus oder Ratte Welpen durch Enthauptung, schnell zu entfernen, das Gehirn, und legen Sie sie in Hanks-Lösung (siehe Tabelle 1 für Zusammensetzung) + 20% fötalem Rinderserum (FBS) in einem 35-mm-Schale (auf Eis gehalten).
    2. Schneiden Sie das Gehirn durch die Mittellinie in zwei Hemisphären. Entfernen der Region von Interesse (zB Großhirnrinde, Striatum und Hippocampus) von jeder Hemisphäre des Gehirns. Entfernen Sie die Hirnhaut und großen Blutgefäßen von der Oberfläche. Schneiden Sie die Hirnregion, in 4-10 dünne Scheiben mit einem Skalpell.
    3. Spülen Sie die Hirnschnitten in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen, einmal Witzh Hanks-Lösung + 20% FBS, dann 3-mal mit der Hanks-Lösung (dh ohne Serum) (alle bei 4 ° C). Zu spülen, fügen Sie 5-10 ml Lösung, lassen Sie den Hirnschnitten am Boden des Röhrchens zu regeln, saugen die Lösung von oben, und fügen Sie eine frische Lösung. Beenden Sie den Spülvorgang durch Absaugen der Lösung.
    4. Filter 2 ml der Trypsin-haltigen Aufschlußlösung (siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung) unter Verwendung einer 3 ml Spritze und einer 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter, und geben das Filtrat direkt in die Röhrchen mit den Gehirnschnitten. Lassen Sie die Trypsinierung fahren Sie für 13 Minuten bei Raumtemperatur.
    5. Neutralisieren die Trypsinlösung zuerst durch Absaugen meiste davon und dann durch Zugabe von 7-10 ml Hanks-Lösung + 20% FBS (4 ° C).
    6. Spülen der Gehirnscheiben, zweimal mit Hanks-Lösung + 20% FBS, und dann dreimal mit der Hanks-Lösung (ohne Serum) (alle bei 4 ° C). Beenden Sie den Spülvorgang durch Absaugen der solutIonen.
    7. Filter 2 ml der Dissoziationslösung (siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung) unter Verwendung einer 3 ml Spritze und einer 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter, und geben das Filtrat direkt in der Röhre mit den Gehirnschnitten.
    8. Mechanisch distanzieren die Zellen durch leichtes Verreiben 10-20 mal, bis sichtbare Gewebestücke verschwinden. Verwenden Sie ein Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette und vermeiden Sie Luftblasen beim Zerreiben.
    9. Warten Sie 3 min für Kleinteile, sich niederzulassen.
    10. Übertragen der Mehrzahl der Lösung (~ 1,5 ml, so dass einige Lösung an der Unterseite) in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, das 3 ml Hanks-Lösung + 20% FBS-Lösung (4 ° C) enthält, wobei die baumwollsteckt, Feuer- polierten Pasteurpipette. Die gesamte Lösung nicht übertragen, da die Aufnahme eines Sediment am Boden führt typischerweise zu einer Verschlechterung der Kultur.
    11. Zentrifuge für 13 Minuten bei ~ 185 g (~ 1100 rpm) bei 4 ° C.
    12. Saugen Sie den Überstand vorsichtig,1 ml vorgewärmten Plattierungsmedium (37 ° C) zu dem Pellet und resuspendieren durch vorsichtiges Pipettieren mehrmals mit dem Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette.
      HINWEIS: Drei verschiedene Arten von Plattenmedien sind für verschiedene Kultur zwecke Plattierungsmedium-1 für Maus Gliazellen Plattierungsmedium-2 für Maus-Neuronen und Plattierungsmedium-3 Rattenneuronen und Gliazellen (siehe Tabelle 1 für Zusammensetzungen) .
    13. Nehmen Sie 10 ul der Zellsuspension, mischen Sie es mit 10 ul 0,4% Trypanblau-Lösung, und messen die Dichte der lebenden Zellen, entweder mit einer Zählkammer oder eines automatisierten Zellzählers.
  2. Maus Gliakulturen
    1. Waschen Sie die Deckgläser, zur Schaffung gesunder Kulturen von Mauszellen.
      1. Tauchen Deckgläser (rund, Durchmesser 12 mm) in 70% iger Salpetersäure in einer Glaspetrischale. Vor Licht mit Aluminiumfolie, und legen Sie sie auf einem Rundschüttler O / N.
      2. Spülen Sie die Glas coverslips in der Petrischale mindestens dreimal mit destilliertem Wasser. Tauchen Sie sie in destilliertem Wasser. Die Schale auf einem Orbitalschüttler O / N.
      3. Trocknen Sie die Deckgläser auf einem Whatman 150 mm Filterpapier in der biologischen Sicherheitsschrank.
      4. Autoklavieren Sie die Deckgläser.
      5. Legen Sie die Deckgläser in 24-Well-Kulturschale.
    2. Label und Genotyp neugeborenen Mäusen nach Schritt 1 und 2.
    3. Erhalten die Gehirnzellen der Maus Welpen gemäß Schritt 3.1.
      HINWEIS: Die Verwendung der Großhirnrinde ist typisch für die Vorbereitung der Maus Glia-Feeder-Schicht. Aber auch andere Gehirnregionen, wie Hippocampus und Striatum, wird nach dem Einstellen der Zelldichte aufgrund von unterschiedlichen Anzahlen und Ausbeuten von Zellen aus verschiedenen Regionen arbeiten.
    4. Hinzufügen ~ 4 ml vorgewärmtem Plattierungsmedium-1 an die Zellsuspension (ca. 1 ml). Zum Vorwärmen Kulturmedien, legen Sie die Lösung in der Kulturbrutschrank (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, umermöglichen, dass die Temperatur und der pH-Wert zu stabilisieren.
    5. Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein unbeschichtetes T25 Kulturflasche, mit dem Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette. Der Kolben wird in der Kulturbrutschrank.
    6. An 1 Tag in vitro (DIV), spülen Sie die kultivierten Zellen in der T25-Flasche zweimal mit Plattierungsmedium-1 (4 ° C). Stellen Sie den Kolben wieder in den Inkubator. Führen Spülen durch Ansaugen des Mediums in den Kolben vollständig mit einer Pasteur-Pipette, indem ~ 5 ml frisches Medium und leichtes Kippen der Kolben mehrmals in einer Wirbelbewegung.
    7. Bei 6-9 DIV, (dh einen Tag vor der Trypsinisierung und Plattieren auf Deckgläsern in Schritten 3.2.8-3.2.13), legen Sie 100 ul des Beschichtungsmaterials mit extrazellulären Matrixproteinen (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Kommentare das Beschichtungsmaterial) auf die Deckgläser in der Kulturschale und legen Sie die Kulturschale in der Kulturbrutschrank.
    8. Bei 7-10 DIV, wenn die Zellen 20-40% konfluent (räumlich kontinuierlich), trypsinieren ihnen.
      1. Die Flasche einmal spülen, durch Ansaugen die gesamte Lösung im Kolben und Hinzufügen von ~ 13 ml Hanks-Lösung (4 ° C) vorsichtig den Kolben kippen mehrmals in einer Wirbelbewegung, und saugen Sie die Lösung vollständig.
      2. In 40 ul DNase-Lösung (Endkonzentration 750 Einheiten / ml) bis 4 ml Trypsin-EDTA-Lösung, die heiße Lösung durch einen 0,2 um Spritzenfilter, und fügen Sie das Filtrat direkt zu den Zellen in der Flasche.
      3. Lassen Sie die Trypsinisierung gehen für 13 min bei 37 ° C im Brutschrank.
      4. Neutralisierung der Trypsinlösung durch Zugabe von 2 ml 100% FBS (4 ° C) in den Kolben.
      5. Übertragen Sie die Zellen mit Trypsin in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit einem 5- bis 10-ml-Pipette ~ 4 ml Hanks-Lösung + 20% FBS (4 ° C), Zentrifuge bei ~ 185 g und 4 ° C für 13 min , und saugen Sie den Überstand.
    9. Das Pellet in 1 ml vorge warmed Plattierungsmedium-1.
    10. Messung der Dichte der Zellen entsprechend Schritt 3.1.13.
    11. Absaugen Beschichtungsmaterial vollständig von den Deckgläsern, und Platten ~ 50 & mgr; l der resuspendierten Gliazellen auf Deckgläsern.
      HINWEIS: Diese Zellen werden die Glia-Feeder-Schicht herzustellen.
    12. Legen Sie die Kulturschale mit Deckgläsern in den Inkubator.
    13. 20-60 Minuten später, 1 ml vorgewärmtes Plattierungsmedium-1 in jede Vertiefung, und die Schale wieder in den Inkubator. Anmerkung: Während das Plattenmedium zugegeben wird, wird es hilfreich sein, eine andere Pipette zu verwenden, um nach unten drücken, der den Umfang des Deckplättchens (wo es keine plattierten Zellen), so daß das Deckglas nicht in dem Medium schwimmt.
    14. Bei 1 DIV der Glia-Feeder-Schicht (dh auf dem Deckglas), ersetzen Sie das Medium mit 1 ml vorgewärmten Plattierungsmedium-1, durch Ansaugen die gesamte Lösung in einem gut und dann mit frischem Medium zu füllen.
    15. Bei 2-3 DIV der Glia-Feeder-Schicht, wenn die celLS 80-100% konfluent, fügen mitotischen Inhibitor (10 & mgr; l einer Mischung aus 5-Fluor-2'-deoxyuridin + Uridin; Endkonzentrationen von 81,2 und 204,8 & mgr; M) in jede Vertiefung, um die DNA-Replikation und somit zu hemmen drücken Glia-Zellen-Proliferation.
    16. 7-9 DIV, wenn die Zellen 90-100% konfluent (1-2 h vor dem Plattieren Neuronen auf der glial feeder layer) Ersetzen des Kulturmediums mit vorgewärmter Plattierungsmedium-2 (37 ° C).
      HINWEIS: Die Neuronen werden am selben Tag plattiert werden, unter Anwendung von Schritt 3.4.
  3. Rat Gliakulturen
    1. Coat eine T25 Kulturflasche mit dem gleichen Beschichtungsmaterial.
      Hinweis: Dies ist für die spätere Entfernung der nicht-adhärenten Zellen in Schritt 3.3.5 notwendig.
      1. 2,0 ml des Beschichtungsmaterials in den Kolben, und setzen Sie den Kolben in der Kulturbrutschrank.
      2. Nach 2-3 Stunden, saugen Sie den Beschichtungsmaterial vollständig, so dass der Boden der Flasche trocken wird.
    2. Besorgen Sie sich die Zellenaus den jungen Ratten, gemäß dem Schritt 3.1.
      HINWEIS: Die Region CA3-CA1 des Hippocampus wird zur Herstellung der Ratten glial Nährschicht verwendet. Aber auch andere Gehirnregionen, wie dem cerebralen Cortex und Striatum wird bereinigt um Unterschiede in der Zelldichte aufgrund der unterschiedlichen Anzahlen und Ausbeuten von Zellen aus verschiedenen Regionen arbeiten.
    3. Hinzufügen ~ 4 ml vorgewärmtem Plattierungsmedium-3 zu der Zellsuspension (ca. 1 ml).
    4. Übertragen Sie die Zellsuspension in die beschichteten T25 Kulturflasche, mit dem Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette. Der Kolben wird in der Kulturbrutschrank (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C).
    5. Bei 2-3 DIV, wenn die Zellen 20-40% konfluent waren, entfernen nicht adhärenten oder schwach haftenden Zellen, durch Schließen des Deckels dicht unter Schütteln heftig ~ 10 mal, Absaugen der Lösung und Zugabe von 4-5 ml des Überzuges Medium-3 (bei 4 ° C). Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal. Untersuchen Sie die kultivierten Zellen über die gesamte Kolbenboden (zBVerwendung von Phasenkontrastmikroskop) zu bestätigen, dass die, die neuronale (dh solche, bei denen der äußere Rand des Zellenkörpers wird phasen hell dargestellt) vollständig entfernt werden. Wiederholen den Vorgang so oft wie nötig, um diese Zellen zu entfernen, und anschließend wurde der Kolben zurück in den Inkubator.
      HINWEIS: Die Festigkeit und die Gesamtzahl der "Shakes" erforderlich ist, kann zwischen den einzelnen Experimentatoren abweichen. Das Wichtigste ist, nicht auf die Gesamtzahl der Shakes auf eine festgelegte Anzahl zu halten, aber um zu bestätigen, dass die Neuronen-ähnliche Zellen eliminiert werden.
    6. Bei 6-8 DIV, wenn Zellen sind 90-100% konfluent, Durchgang die Gliazellen durch Trypsinierung sie wie in Schritt 3.2.8.
    7. Nach der Zentrifugation das Pellet in 1 ml Plattierungsmedium-3 (4 ° C), 10 ml Plattierungsmedium-3 (4 ° C), übertragen die trypsiniert Zellen einem unbeschichteten T75-Kolben und Kultur sie Inkubator.
      HINWEIS: Ratte Gliazellen zweimal passagiert werden; im Gegensatz die Maus Gliazellen are agiert nur einmal, weil sie ungesund nach mehreren Durchgängen werden. Ratten-Gliazellen in T75-Flaschen, die nicht mit irgendeinem Überzugsmaterial überzogen werden passagiert werden. Die Beschichtung ermöglicht Ratte Gliazellen, zu schnell zu wachsen und liefern viele Geißelzellen (vermeintlichen Ependymzellen), die später die neuronale Kulturbedingungen verschlechtern wird.
    8. Bei 17 bis 19 DIV glialer Kultur in einem Kolben (dh 11 Tage nach der Passage und einen Tag vor Trypsinierung und Ausplattieren auf Deckgläser durch Schritte 3.3.9-3.3.14), legen Sie 100 ul des Beschichtungsmaterials auf ungewaschenen Deckgläser ( rund, Durchmesser 12 mm) in der Kulturschale und legen Sie die Kulturschale in der Kulturbrutschrank.
      HINWEIS: Bei Ratten Gliakulturen eine Differenz nicht in den Kulturergebnisse mit oder ohne Waschen der Deck bemerkt.
    9. Bei 18-20 DIV glialer Kultur in einem Kolben (dh 12 Tage nach Passagieren), bereiten Sie die Glia-Feeder-Schicht durch Trypsinisierung der kultivierten Zellen, nach step 3.2.8.
    10. Während der Zentrifugation absaugen Beschichtungsmaterial vollständig von den Deckgläsern.
    11. Nach der Zentrifugation das Pellet in 1 ml Plattierungsmedium-3 (4 ° C), und Messen der Zelldichte, gemäß Schritt 3.1.13.
    12. Stellen Sie den glial Dichte bis 10 4 lebenden Zellen / ml, und die Platte 100 ul des glialen Zellsuspension auf die beschichteten Glasplättchen.
      HINWEIS: Diese Zellen werden die Glia-Feeder-Schicht herzustellen.
    13. Legen Sie die Kulturschale mit Deckgläsern in den Inkubator für 20-60 min.
    14. 1 ml der Plattierungsmedium-3 (4 ° C) in jede Vertiefung und die Schale wieder in den Inkubator.
    15. Bei 3-4 DIV der Glia-Feeder-Schicht, wenn die Zellen auf dem Deckglas sind 40-80% konfluent, 1 ml der vorgewärmten Nährmedium (siehe Tabelle 1 für Zusammensetzung), die Cytosin-β-D-arabinofuranosid enthält ( AraC Endkonzentration von 4 & mgr; M) bis glial-Zellproliferation anzuhalten. Platte Neurons 7-9 DIV der glial-Feeder-Schicht, wenn die Zellen 60-80% konfluent waren, unter Anwendung von Schritt 3.4.
  4. Maus Neuronale Kulturen
    1. Label und Genotyp neugeborenen Mäusen nach Schritt 1 und 2.
    2. Verwenden Sie die Maus Welpen für Schritt 3.1.
    3. Einstellung der Intensität des Lebendzellsuspension auf ~ 2,0 × 10 5 Zellen / ml mit vorgewärmten Plattierungsmedium-2 für die Beschichtung auf der Maus Gliazellen oder Verwendung Plattierungsmedium-3 für die Plattierung auf Ratten-Gliazellen.
    4. Platte die Zellen auf der Glia-Feeder-Schicht, indem Sie vorsichtig Zugabe der Zellsuspension in das Kulturmedium von jedem gut. Hinweis: Das Volumen der Zellsuspension zugegeben werden durch die Zielzahl der Zellen in einer Kulturvertiefung bestimmt werden. Zum Beispiel Platte ~ 60 ul Zellsuspension zu 12.000 Zellen / Vertiefung zu erzielen.
    5. Beachten Sie, dass keine Lösung Änderungen sind erforderlich, nachdem die Neuronen überzogen. Seien Sie vorsichtig, um die Verdampfung der Lösung aus den Vertiefungen vermeiden, im Laufe der Kultur, durch Befeuchten des Inneren of der Kulturbrutschrank.

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Representative Results

Als ein Beispiel für die Anwendung dieses Protokolls, sind repräsentative Ergebnisse für die Markierung von Mäusen durch Tätowierungen, zuverlässig Genotypisierung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen und mit primären neuronalen Kulturen glial-Feeder-Schichten gezeigt.

Tätowierung

Neugeborene Welpen wurden auf den Fußballen mit einem Tätowierung-System ("Newborn" in Abbildung 1) gekennzeichnet. Die Etiketten blieben 3 Wochen deutlich sichtbar ("3-Wochen-alten") und 32 Wochen alt ('32 wöchigen alten). Die einzelnen Mäusen kann eindeutig durch eine Kombination von Tätowierungen auf den vier Pfoten (1-16) und von der Information über den Tierkäfig, oder komplexere Nummerierungsschemata identifiziert werden kann (nicht gezeigt).

Genotypisierung

Ein repräsentatives Beispiel für das Genotypisieren dargestellt (Abbildung 2). Die Tor1a Gen des Wildtyps (Tor1a (Tor1a + / AE) und homozygot (Tor1a AE / AE) AE-Torsina Knock-in Mäusen aus der genomischen DNA aus Schwanzclips von neugeborenen Welpen isoliert verstärkt. Genotypisierung in diesem spezifischen Beispiel ist auf die Anwesenheit eines einzigen 34-Basenpaar-loxP-Stelle in dem mutierten Allel Tor1a nach erfolgreicher Cre Rekombination und Deletion eines Neomycin-Resistenz-Kassette 16,18 basiert.

Genomische DNA wurde mit minimalem Handhabungszeit extrahiert und viele Proben gleichzeitig verarbeitet werden. Die Extraktionsvolumina konstant gehalten wurden, und daher keine Einstellung des Volumens war notwendig, um die Änderungen in den Bedingungen getestet aufzunehmen. Die Zuverlässigkeit der Genotypisierung wurde unter vier Bedingungen getestet, wie unten beschrieben.

Zuerst wurde die Wirkung von Unterschieden in der Höhe der Ausgangsgewebe (Figur 3) untersucht. Tails unterschiedlicher Länge wurdenaus der heterozygot AE-Torsina Knock-in Mäusen (Tor1a + / AE) bei der Entwöhnung Alter (ca. 3 Wochen) vorbereitet. Schwanzlängen von 2 bis 5 mm, der Bereich in der Regel in Genotypisierung Protokolle empfohlen, gab die gleiche Genotypisierung Ergebnis von hoher Qualität. Die beiden Banden entsprechen dem Wildtyp und mutierten Allelen (Tor1a + und Tor1a AE, respectively).

Zweitens wurden die Auswirkungen der Schwankungen in der Tieralter (4), untersucht. Tails wurden von Neugeborenen, 3 Wochen alten erhalten und ~ 24 Wochen alten heterozygot AE-Torsina Knock-in Mäusen (Tor1a + / AE). Homozygoten wurden nicht verwendet, weil sie sterben, einige Tage nach der Geburt 16-18. Die beiden erwarten Bänder für Wildtyp und mutierte Tor1a Gene wurden unabhängig von Alter der Tiere (4A) sichtbar. Die allgemeine Anwendbarkeit dieses Ergebnis wurde mit einem zweiten Gen, Tfap2a 19 in Wild t getestetyp Mäusen (Tfap2a + / +) (4B).

Drittens wurden die Auswirkungen von Unterschieden in der Länge der PCR-Produkte (5) getestet. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Primerpaare für einen gegebenen Gens synthetisiert, so dass die amplifizierten DNAs unterschiedlicher Basenpaarlängen. Die Tfap2a Gen wurde konsequent mit unterschiedlichen Amplikonlängen erkannt.

Viertens, wurden zwei DNA-Extraktionsverfahren (Figur 6) verglichen. In einem Verfahren wurden PCR Streifen Rohre und die PCR-Thermocycler verwendet (siehe Schritt 2). Dies ist eine automatisierte, parallele Mehrröhren-Extraktions-Verfahren ("Auto" in Abbildung 6). Da mehrere Rohre gleichzeitig in Streifenformat gehandhabt werden, und eine PCR-Maschine mit einem Programm in vier Temperaturstufen betrieben werden verwendet, gibt es keine Notwendigkeit, um die Rohre zu übertragen, manuelle Ändern der Temperatur während der Extraktion, bei Verwendung mehrerer Stückeder Ausrüstung. Somit ist es einfach, viele Proben zu verarbeiten. Dies wurde mit der zweiten Methode, die auf manuelle, Einrohr-Extraktion ('Manual' in Abbildung 6) verglichen. Dies nutzt einzelne PCR-Gefäße und Nicht PCR-Maschinen (Wärmeblöcke und Wasserbäder) zu Temperatur bei der DNA-Extraktion zu kontrollieren. In diesem Fall wurden mehrere, einzelne Rohre auf eine neue Temperatur nach jedem Schritt bewegt wird, die mehrere Temperatursteuervorrichtungen. In beiden Fällen wurde die Tor1a Gen in Wildtyp, heterozygoten und homozygoten & Dgr; E-Torsina Knock-in-Mäusen (6A) analysiert und die Tfap2a Gen in Wildtyp-Mäusen (6B) analysiert. Die beiden Extraktionsprotokolle ergab gleichwertige Genotypisierung Ergebnisse.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse in den Figuren 3 bis 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Genotypisierung Verfahren ist robust, Erreichen einer zuverlässigen und reproduzierbaren Ergebnissen trotz variations in Gewebemenge, Alter der Tiere, Amplikonlänge, und das verwendete Extraktionsprotokoll.

Neuronenkulturen

Zur Kultivierung von Nervenzellen der Maus an der Maus Glia-Feeder-Schicht, die Reihenfolge der Verfahren ist: (Tätowieren neugeborenen Mäusen → Genotypisierung für Gliazellen Kultur →) Gliazellen Kultur → Tätowierung neugeborenen Mäusen → Genotypisierung für neuronale Kultur → neuronalen Kultur. Für Kulturen an der Ratte Glia-Feeder-Schicht aufgebaut, sind die Verfahren in Klammern übersprungen.

Wir untersuchten die stützende Wirkung des vorge seeded glial Feeder-Schicht auf das neuronale Überleben und Wachstum. Neuronen wurden aus der CA3-CA1-Region des Hippocampus, dem Antriebsbereich des zerebralen Cortex und Striatum von neugeborenen Wildtyp-Mäusen erhalten. Sie wurden in geringer Dichte auf Ratten Gliazellen Feeder-Schicht, die aus der CA3-CA1-Region des Hippocampus erhalten und ausgesät vor neuronalen Beschichtung überzogen worden war, nachdie in 7 dargestellte Schema (vereinfachte Zusammenfassung der Verfahren). Low-Density-Kulturen sind optimal für die Bildgebung von einzelnen Dendriten somata 4,6, Nervenenden 2,3,5,8 und axonalen Wellen 5 mit hoher räumlicher Auflösung. Die Hippocampus-Zellen (die beide Neuronen und Gliazellen) wurden auf Deckgläsern ausplattiert, entweder mit (8A) oder ohne eine vorher festgelegte glial Feeder-Schicht (8B, C) ​​und mit einem Phasenkontrastoptik beobachtet. In Gegenwart eines nahezu konfluenten glial Nährschicht, die Neuronen (in jeder Platte, eine Pfeilspitze zeigt ein Vertreter Neuron) wurden relativ dispergiert 3 und 7 Tage nach der Plattierung (Tage in vitro, DIV) (8A). Sie zeigten auch Anzeichen für eine gute Gesundheit, wie zum Beispiel mit deutlichem Abstand der neuronalen Somata, erweitert Dendriten, einem Mangel an geclusterten Somata, und ein Mangel an gebündelten Neuriten (hoher Vergrößerung images in Einschübe). Am 14. DIV bildeten diese Neuronen ein dichtes Netz, gekennzeichnet durch lange Neuriten (Dendriten und Axone). Beachten Sie, dass Glia-Proliferation gehemmt wurde vor Neuronen wurden überzogen, durch Zugabe von Wachstumsmedium, das die Mitoseinhibitor AraC (Schritt 3.3.15).

Im Gegensatz dazu wird in der Abwesenheit der glial-Feeder-Schicht zum Zeitpunkt des Plattierens Hippocampusneuronen, das Wachstum der kultivierten hippocampalen Neuronen beeinträchtigt wurde, selbst in Abwesenheit von AraC. Bei 3 DIV haben Gliazellen (in den neu vergoldet Hippocampus-Zellen enthalten) nicht gebildet eine konfluente Blatt (Stern im oberen Teil der Abbildung 8B). Die Kulturen zeigten verschiedene Zeichen, die nicht für die hochauflösende bildgebende Verfahren, wie beispielsweise große Flächen ohne darunterliegende Gliazellen (Sternchen) geeignet sind, das Vorhandensein von gruppierten somata und das Vorhandensein von gebündelten Neuriten in einigen Bereichen (Daten nicht gezeigt). Mit 7 DIV, gebildet Gliazellen eine konfluente Blatt (Mitteltafel des 8C). However waren Neuronen in Reihe weniger als wenn die Neuronen wurden auf einer vorher festgelegten glial-Feeder-Schicht ausgestrichen. Die überlebenden Neuronen fehlten auch lange, netzwerkbildenden Neuriten (kleines Bild). Die Gliazellen wurde heterogener der Krümmung und Dicke als die in der Feeder-Schicht Kultur hat und somit phasen hell. Um die Wirkungen der Unterdrückung gliale Proliferation auf Neuronen zu testen, verwendeten wir AraC enthaltenden Wachstumsmedium. Wenn AraC wurde auf 3 oder 7 DIV zugegeben und die Zellen wurden kultiviert, bis 14 DIV und an diesem Tag (8B und C, Bodentafeln) beobachtet, die Gliazellen meisten der Deckfläche bedeckt. Jedoch waren die Neuronen noch wenige, besonders wenn AraC wurde bei 7 DIV angelegt. Die überlebenden Neuronen hatte nur kurze Prozesse und wurden nicht ausgiebig verbunden. Somit ist die späte Zugabe von AraC erlaubt eine gleichmäßige Schicht zu bilden Gliazellen aber neuronale Lebensfähigkeit oder Neuritenextension nicht zu fördern; sondern die unkontrollierte glialen Wachstumshatten nachteilige Wirkungen auf Neuronen.

Diese Daten zeigen, dass die Gliazellen Nährschicht ist entscheidend für das Überleben und das Wachstum von Neuronen in geringer Dichte plattiert und dass der glial Schicht muß zum Zeitpunkt des neuronalen Plattierung anstatt später während der neuronalen Kultur vorliegen. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von Kulturen von cerebralen kortikalen (Figur 9) und striatalen Neuronen (Figur 10) erhalten.

Die qualitative Beobachtung über das neuronale Überleben wurde durch quantitative Analyse bestätigt. Insbesondere wird die Zahl der überlebenden Neuronen in 14 DIV wurde gezählt, basierend auf Phasenkontrastbilder der Kulturen (Figur 11). Die Zahl war am größten für Neuronen kultiviert auf einem Gliazellen Feeder-Schicht (dh., Auf der Glia-Feeder-Schicht überzogen). Die Anzahl war niedriger in dem Fall der Neuronen in Abwesenheit einer Feeder-Schicht kultiviert Gliazellen. Die Anzahl wurde sogar noch weiter reduziert, wenn die Zellen mit AraC bei einem behandeltenspäteren Zeitpunkt. Diese Unterschiede waren statistisch signifikant, und wurden in Kulturen von Neuronen aus allen drei Gehirnregionen erhalten bemerkt.

Die Arten von überlebenden Zellen wurden in 14 DIV in der Maus hippocampalen Kulturen plattiert auf der Ratten-Hippocampus-Feeder-Schicht identifiziert. Doppel Immunzytochemie wurde durchgeführt unter Verwendung von Antikörpern gegen den neuronalen Marker, Mikrotubulus-assoziiertes Protein 2 (MAP2) und die Gliazellen Astrozyten Marker, glial fibrillary acidic protein (GFAP). Die Zellen mit verlängertem Prozesse waren positiv für MAP2, während die Zellen in der unterliegenden glial Nährschicht waren positiv für GFAP (zwei repräsentativen Bildfeldern, Figur 12A). Diese Färbung war kein Artefakt einer bestimmten Kombination von primären und sekundären Antikörper, da das gleiche Muster wurde erhalten, wenn eine andere Gruppe von sekundären Antikörper verwendet (Figur 12B).

Im Gegensatz dazu, wenn das gleiche Färbung perfo wurdeauf die Kulturen, die nur aus einer Glia-Feeder-Schicht, das heißt, in Abwesenheit von zugesetztem Mauszellen (zwei repräsentativen Bildfelder 13A) Rmed waren keine Zellen, die positiv für MAP2. Die Zellen der Feeder-Schicht waren konsistent für GFAP positiv. Für eine negative Kontrolle wurden beide primäre Antikörper aus dem immunzytochemische Verfahren (13B) weggelassen. Keine Färbung wurde in diesen Proben festgestellt, obgleich Zellen vorhanden waren, wie sich aus den übertragenen Lichtoptik (Differentialinterferenzkontrast, DIC) und eine Kernfärbung mit Hoechst-Farbstoff. Somit unspezifische Färbung in den MAP2 und GFAP Kanäle sehr schwach war.

Diese Daten wurden immunzytochemische auch quantitativ analysiert (Abbildung 14). In jedem 8-Bit-Bild wurde Intensität gemessen und entlang einer Linie aufgetragen. Überlagerte Plots zeigen MAP2 Färbung bei der Maus-Zellen (Proben, die Nervenzellen) waren auf einer glialen Feeder-Schicht gezüchtet (Neuron +,Glia +, primären Antikörpers (1 ° Ab) +), während eine solche Färbung war abwesend in Kulturen von Glia-Feeder-Zellen alleine (Neuron -, Glia + 1 ° Ab +). In einer Negativkontrolle ohne primären Antikörper, war vernachlässigbar Färbung in Kulturen von Glia-Feeder-Zellen alleine (Neuron -, Glia + 1 ° Ab -). GFAP-Färbung zeigte sich in den glial-Feeder-Schicht, egal ob Mauszellen wurden plattiert (Neuron +, Glia + 1 ° Ab +) oder nicht (Neuron -, Glia + 1 ° + Ab). Auch Färbung in der negativen Kontrolle war vernachlässigbar (Neuron -, Glia + 1 ° Ab -). Diese Ergebnisse zeigen, daß die Ratten-Gliazellen Nährschicht wurde hauptsächlich aus Astrozyten besteht, und dass die Neuronen vorhanden waren nur bei Mauszellen zugegeben. Sie zeigen auch, dass die in diesen Kulturen vorhandenen Neuronen aus der Maus stammen ausschließlich.

Die Ergebnisse Abschnitt des Online-Video zeigt auch die DIC und MAP2 Bilder von kultivierten Neuronen auf einem Gliazellen Feeder-Schicht, überzogen both erstellt von der CA3-CA1 Region des Hippocampus von Wildtyp-Mäusen.

Die detaillierte Steuerung der Zellkultur, ist es empfehlenswert, sowohl für die Beurteilung der allgemeinen Qualität des Gehirnsezierung und zellulären Dissoziationsstufen, und Ausplattieren der Zellen auf der vorbestimmten Dichte an die Dichte der lebenden Zellen zu messen. Im Folgenden sind vier Sätze von typischen Dichtemessungen. Man beachte jedoch, dass diese Zahlen in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen und Reagenzien variieren. Beispielsweise können auch verschiedene Chargen von Serum des gleichen Herstellers, die Ergebnisse beeinflussen. Somit sollten diese Zahlen als ein allgemeiner Indikator, anstatt eine absolute Leitlinie.

Für Mobil Dissoziation (Schritt 3.1.13), typische Werte für die Lebendzelldichte von einem Welpen erhalten sind: ~ 2 x 10 5 Zellen / ml (Maus Motorkortex und Maus-CA3 Hippocampus CA1), ~ 5 × 10 5 Zellen / ml (Maus Hirnrinde und Ratten-CA3 Hippocampus CA1) und ~ 1 × 10 6 cEllen / ml (Maus Striatum). In allen diesen Fällen waren die Fraktionen von lebenden Zellen> 90% (Lebensfähigkeit, definiert als das Verhältnis der Anzahl von lebenden Zellen zu der Gesamtzahl der Zellen). Für den motorischen Cortex wird lose in den Bereich der Großhirnrinde, der unmittelbar an das Striatum 20 liegt dorsal definiert. Für Hippocampus-Kulturen, die richtige bevorzugt sind die CA3 und CA1 Regionen des Hippocampus. Die ganze Hippocampus zusätzlich den Gyrus dentatus, deren Zusatz zur Bildung von großen Nervenenden von Körnerzellen einführt Heterogenität in synaptischen Eigenschaften 21. Das Striatum enthält die Kultur Caudate-Putamen und Globus pallidus, aber berücksichtigt nicht den Nucleus accumbens oder mediale oder laterale Septumkernen in den benachbarten Strukturen.

Für Maus glial Kultur (Schritt 3.2.11), ist die Dichte der Schicht ~ 10.000 Gliazellen auf jeder 12-mm runde Deckglas, mit ~ 50 & mgr; l der Zellsuspension in einer Dichte von ca. 2 x10 5 Zellen / ml. Gewöhnlich wird die Dichte in dem Überstand gemessen, relativ konstant ist und keine Einstellung erfordern. Um die Dichte über verschiedene Bereiche umzuwandeln, ist der nützliche Informationen, die das Deckglas mit einem Durchmesser von 1,20 cm und einer Fläche von 1,13 cm 2. So ~ 10.000 Zellen / Deck = ~ 8.800 Zellen / cm2 auf einem Deckglas.

Für Ratten-Gliazellen Kultur (Schritt 3.3.12), ist die Dichte der Schicht ~ 1.000 Gliazellen auf jeder 12-mm runde Deckglas, mit ~ 100 & mgr; l der Zellsuspension in einer Dichte von ~ 1x10 4 Zellen / ml. Daher 1.000 Zellen / Deck = ~ 900 Zellen / cm2 auf einem Deckglas.

Für Low-Density-Maus neuronalen Kultur (Schritt 3.4.4), reicht die Beschichtung Dichte zwischen 2.000 und 48.000 Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. Typische Werte beim Plattieren Neuronen auf Ratten Gliazellen sind: 10,000-24,000 Zellen / Loch für zerebrale kortikale Neuronen, 12,000-24,000 Zellen / Loch für CA3-CA1 Neuronen im Hippocampus und 24,000-48,000 Zellen / Loch für striatale Neuronen. Wenn Plattierung auf Maus Gliazellen, reduziert die Zahl, zB 2000 Zellen / Well für CA3-CA1 Neuronen im Hippocampus. Als Randbemerkung, für die Beschichtung Ratte CA3-CA1 Neuronen im Hippocampus auf einer Ratte Gliazellen Feeder-Schicht, ist die Beschichtungs-Dichte 1.000-6.000 Zellen / Well. Zur Umwandlung der Dichte in einem gut zur Dichte auf einem Deckglas, das nützliche Informationen, die die interne und Durchmesser am Boden beträgt 1,56 cm, und seine Fläche beträgt 1,91 cm2. So kann zum Beispiel, 12.000 Zellen / Well = 7100 Zellen / Deck = 6300 Zellen / cm2 auf einem Deckglas. Diese Dichten wurden mit dem Ziel der Kultivierung relativ spärlichen Neuronen für hochauflösende zelluläre Bildgebung gewählt. Forscher sollten ihre Zahlen, die am besten ihre experimentellen Ziele passen zu wählen.

Figur 1
Abbildung 1. Tätowiert Fußballen von Mäusen. Newborn Mäuse wurden durch Tätowieren den Fußballen gekennzeichnet. Sie wurden sofort nach dem Tätowieren (Neugeborenen) fotografiert, bei 3 Wochen alt (3 Wochen alt) und bei 32 Wochen alt sind (32 Wochen alt). Die Etiketten blieb im Erwachsenenalter gut sichtbar. Die Bilder wurden von verschiedenen Tieren. Sie sind nicht auf dem gleichen Maßstab dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Die Genotypisierung von Wildtyp (Tor1a + / +), heterozygote (Tor1a + / AE) und homozygot (Tor1a AE / AE) AE-Torsina Knock-in Mäusen. Die Tor1a Gen-Allele wurden in Wildtyp und Mutante analysiert Formen, unter Verwendung von DNA gewonnen aus den Schwänzen von neugeborenen Jungen. Tail Spitzen waren ca. 4 mm in der Länge. DNA wurde unter Verwendung von SYBR Sichere DNA Gel Stain gefärbt. Siehe Tabelle der Werkstoffe / Ausrüstung für die Informationen über die Primer und PCR-Programms für Tor1a Gens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. Nachweis der genomischen DNA im Rahmen der Änderung der Menge des Ausgangsmaterials. Endstück Spitzen unterschiedlicher Länge verwendet wurden. Versuchstiere 3 Wochen alt waren, heterozygot AE-Torsina Knock-in Mäusen (Tor1a + / AE). Lanes repräsentieren die Schwanzlängen von 2, 3, 4 und 5 mm, in zweifacher Ausfertigung (von links). Die Schwanzspitzen wurden aus verschiedenen Mäusen erhalten. Molekularen Größenmarker in der linken Fahrspur repräsentieren DNA Längen in steps von 100 Basenpaaren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

4
Abbildung 4. Nachweis von genomischer DNA im Rahmen der Variation Alter der Tiere. (A) Tor1a Gens. Lanes repräsentieren Schwanzspitzen aus heterozygoten AE-Torsina Knock-in Mäusen (Tor1a + / AE) auf den folgenden Stufen erhalten: Neugeborene, 3 Wochen alt, und ~ 24 Wochen alten (in Duplikaten von links) (B). Tfap2a Gens. Lanes repräsentieren Schwanzspitzen aus Wildtyp (Tfap2a + / +) Mäusen in den folgenden Stufen erhalten: Neugeborene, 3 Wochen alt, und ~ 24 Wochen alten (in Duplikaten von links). Beide Gene wurden aus Schwänzen ~ 4 mm Länge verstärkt. Das erwartete PCR-Fragment ist 498 bp. Das PCR-Programm wa ist das gleiche wie das für Tor1a Gen verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 5
Figur 5 Nachweis von genomischer DNA im Rahmen der Variation in der Länge des PCR-Fragments. Die Tfap2a Gens wurde mit PCR Amplikon Längen von 498 bp (linke Spuren), 983 bp (Mittelstreifen) und 1990 bp (rechte Spuren) in analysiert Duplikate. Das Gen wurde aus Schwänzen von 3 Wochen alten Mäusen verstärkt. Molekularen Größenmarkern in den äußersten linken und rechten Spur des Gels dar DNA Längen in Schritten von 100 und 200 Basenpaare auf. Siehe Tabelle der Werkstoffe / Ausrüstung für die Informationen über die Primer für unterschiedliche Amplifikate. 879fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 6
Figur 6 Nachweis der genomischen DNA im Zusammenhang mit der Variation der DNA-Extraktionsverfahren. Ergebnisse für den Hand Einrohr-Extraktion (Manual) und die automatisierte, parallele Mehrröhren-Extraktionsverfahren (Auto) verglichen. Letztere Methode wurde in diesem Bericht verwendet. Gene wurden aus Schwänzen ~ 4 mm in der Länge, von Neugeborenen gesammelt amplifiziert. (A) Tor1a Gens in den neugeborenen Jungen von & Dgr; E-Torsina Knock-in-Mäusen. Lanes repräsentieren DNAs aus Wildtyp (manuell und automatisiert), heterozygote (manuell und automatisiert), und homozygote Mäuse (manuell und automatisiert) (von links) extrahiert. (B) Tfap2a Gen in 3 Wochen alten Wildtyp-Mäusen. Das erwartete PCR-Fragment ist 498 bp.jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

7
Abbildung 7 vereinfachte schematische Darstellung von Verfahren zur Plattierung Maus Neuronen auf der Maus (A) und der Ratte (B) der Glia-Feeder-Schichten dar. Die Anzahl von Tagen (Tage in vitro) beziehen sich auf die kumulativen Tage nach den glialen Zellen zuerst in Kultur plattiert Kolben. Sie dienen nur als grobe Schätzung. Aus praktischen Details finden Sie in den Prozeduren Abschnitt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

8
Abbildung 8. Unterstützende Wirkungglialer Feeder-Schicht auf das Wachstum von Neuronen im Hippocampus in einer Low-Density-Kultur. Die Neuronen wurden aus der CA3-CA1 Region des Hippocampus von Neugeborenen, Wildtyp-Mäusen erhalten. (A) Maus-Hippocampus-Zellen wurden auf beschichteten Glasplättchen, das vernickelt war mit einer Ratte Gliazellen Feeder-Schicht von der CA3-CA1-Region des Hippocampus erhalten vor, ausgesät. Neuronen wurden gleichmäßig in einer gesunden Weise verteilt. Kulturen wurden 3, 7 und 14 DIV beobachtet. (B, C) ​​Maus hippocampale Zellen wurden auf Deckgläsern, die keine vorgegebenen Zuführungsschicht hatte plattiert. Die Kulturen wurden bei 3 DIV (oben in B) und 7 DIV (mittleres Feld in C) ohne AraC Behandlung beobachtet. In anderen Sätze von Kulturen wurden die Zellen mit AraC bei 3 DIV (unteres Feld in B) und 7 DIV (unteres Feld in C) behandelt und bei 14 DIV beobachtet. Alle Bilder stehen für die Schwester Kulturen aus der gleichen Welpe, dessen Neuronen wurden am gleichen Tag vergoldet erhalten. Details siehe Text. Für jedes Feld, ein Exreichlich eines Neurons wird durch eine weiße Pfeilspitze angedeutet und in einem Einsatz vergrößert. Neuronen Zellkörpern, deren Umfang hell erscheint, wenn durch Phasenkontrast-Optik betrachtet, und sie haben auch dicke Prozesse. Sternchen zeigen Gebieten ohne Gliazellen. Die Kulturen wurden live auf einem inversen Mikroskop mit Phasenkontrast-Optik mit 20-fach Objektivlinse (numerische Apertur 0,45) ohne Zwischenlinse abgebildet (dh bei 1x). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 9. Stützwirkung glial Nährschicht auf das Wachstum von cerebralen kortikalen Neuronen in einem Niedrigdichtekultur. Ähnliche Ergebnisse wie in Figur 8, jedoch mit Neuronen aus dem Antriebsbereich von c erhalteneerebral Kortex. Die Bedingungen, unter Etiketten AC entsprechen den in Abbildung 8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 10. Stützwirkung glial Nährschicht auf das Wachstum von striatalen Neuronen in einem Niedrigdichtekultur. Ähnliche Ergebnisse wie in den 8 und 9, jedoch mit Neuronen des Striatums erreicht. Die Bedingungen, unter Etiketten AC entsprechen den in Abbildung 8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 11. Stützwirkung glial Nährschicht auf neuronales Überleben. Die Anzahl der überlebenden Neuronen in der in Figur 8 gezeigten Experimenten gezählt, unter Verwendung von Bildern durch Phasenkontrastmikroskopie erfasst. Bilder für 14 DIV sind auch hier gezeigt, aber mit Pfeilspitzen, die auf Beispiele gezählt Neuronen. Das Balkendiagramm zeigt die Anzahl der Neuronen pro Bildfeld (449,0 x 335,5 & mgr; m um) (± Standardfehler des Mittelwerts bedeuten, n = 7-24 Felder für jeden Kulturbedingungen). Sternchen zeigen statistisch signifikante Unterschiede zu "Gliazellen Feeder-Schicht (-), AraC auf 3 DIV" und "Gliazellen Feeder-Schicht (-), AraC auf 7 DIV 'von' Gliazellen Feeder-Schicht (+)" (* p <0,05, ** p <0.01, ungepaarten Student-t-Test). Die Zahlen über den Balken zeigen die neuronale Dichte in Montagen aus mehreren Bildfeldern gemessen. Bilder wurdenerworben mit einem 20X Objektiv. Zum Erwerb Verzerrungen zu vermeiden, wurden alle Bilder auf einer vollständigen vertikalen Streifen an der Unterseite eines Deckglas erworben, von oben und durch die ungefähre Mitte des Deckglases. Einzelne Bilder hatten eine gewisse Überlappung (beispielsweise 1/6 bis 1/4 eines Bildfeld oben und unten). Zwei Verfahren wurden für die Analyse verwendet. In einem wurden Neuronen in abwechselnden Bildern, um sicherzustellen, dass die einzelnen Neuronen wurden nicht mehr als einmal gezählt gezählt. Die daraus resultierenden Zahlen wurden verwendet, um das Balkendiagramm zu generieren. Bei dem zweiten Verfahren wurde eine einzelne Montage aus den einzelnen Bildern. Sie wurden mit dem Microsoft Image Composite Editor oder manuell genäht mit Photoshop. Die Montagen ausgeschlossen auch Mehrfachzählungen aus den gleichen Neuronen. Die daraus resultierenden Zahlen über den Balken angezeigt. Bei beiden Verfahren wurden weiten Bereichen am Deck Peripherie, die keine Zellen enthielten, ausgenommen. Die Zellen wurden wie Nervenzellen gezählt, wenn sie Zellkörper, die hell erschienen wardurch Phasenkontrastmikroskopie, sowie ausgedehnte zelluläre Prozesse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

12
Abbildung 12. Immunzytochemische Identifikation von Zelltypen in neuronalen Kulturen. Der Kulturbedingung entspricht der unteren linken Bild von 8A. Neuronen wurden aus der CA3-CA1 Region des Hippocampus von Wildtyp-Mäusen erhalten, und auf einem Gliazellen Feeder-Schicht von der CA3-CA1-Region des Hippocampus von Wildtyp-Ratten erzeugt überzogen. Die kultivierten Zellen wurden durch Immunzytochemie für die neuronalen Marker MAP2 und astrozytären Gliazellen Marker GFAP analysiert. Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Mikroskopie wurde verwendet, um die allgemeine Morphologie der abgebildeten Felder zeigen, 14-17Tage nach den Neuronen wurden auf der Glia-Feeder-Schicht überzogen. (A) Drei-Farben-Färbung, einschließlich Gegenfärbung mit dem Kernmarker Hoechst 33342 Farbstoff. Zwei repräsentative Bildfelder gezeigt. (B) Zwei-Farben-Färbung, mit unterschiedlichen Kombinationen von sekundären Antikörpern, die mit verschiedenen Fluorophoren konjugiert. 125 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 30 D-Glucose, 25 HEPES, pH 7.4: In diesen Experimenten wurden die kultivierten Zellen mit 4% Paraformaldehyd und 4% Saccharose in Tyrode-Lösung (enthaltend in mM festen mit 5 M NaOH eingestellt, ~ 310 mOsm ohne Einstellung) für 30 min bei 4 ° C. Nachdem sie mit Tyrode-Lösung gewaschen, wurden sie mit 0,1% Triton X-100 in Tyrode-Lösung für 10 min durchlässig gemacht wurden. Sie wurden noch einmal mit Tyrode-Lösung gewaschen und dann blockiert mit 2% normalem Ziegenserum in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) (Blockierungslösung) für 60 min bei RT. Danach werden sie mit dem Kaninchen-poly behandelt wurdenklonalen Anti-MAP2-Antikörper (AB5622; 400x Verdünnung in Blockierungslösung) und monoklonalen Maus-anti-GFAP-Cocktail (NE1015; 1,000x Verdünnung) O / N (15-21 h) bei 4 ° C. Nach Waschungen mit PBS wurden die Zellen mit Ziegen-Anti-Kaninchen- und Anti-Maus-IgG-Antikörper, der mit Alexa Fluor 405 (500x Verdünnung in Blockierungslösung) konjugiert, Alexa Fluor 488 (1,000x) oder Alexa Fluor 568 Farbstoffes (500x) 60 inkubiert min bei RT. Sie wurden mit PBS gewaschen und direkt in PBS beobachtet. In einigen Kulturen nach dem letzten Waschen in den obigen Verfahren werden die Zellen mit Hoechst 33342 bei 0,5 ug / ml in PBS für 10 min bei RT behandelt und mit PBS gewaschen, bevor Beobachtung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Figur.

13
Abbildung 13. Immunocytochemical Identifizierung von Zelltypen in glial Nährschicht Kulturen. Schwester Kulturen der Ratte glial-Feeder-Schichten, wie in 12, jedoch ohne das Plattieren von Maus-Neuronen. (A) Färbung mit dem in 12A beschriebenen immunzytochemische Verfahren. Zwei repräsentative Bildfelder gezeigt. (B) Die Färbung der glial-Feeder-Schicht unter Anwendung der in A beschriebenen immunzytochemische Verfahren, aber mit den primären Antikörper weggelassen. Alle MAP2 Bilder in den 12A und 13A, B wurden unter denselben Bilderzeugungsbedingungen erfasst und werden mit dem gleichen Bildkontrast dargestellt zum Vergleich der Intensität ermöglichen. Die gleichen Verfahren wurden für GFAP Bilder in den 12A und 13A, B verwendet. Die glialen Nährschicht Kultur wurde am selben Tag wie die Kulturen in 12 abgebildet wird. Somit werden die Glia-Feeder-Schichten in 13 wurden in vitro für die gleiche Menge an Zeit kultiviert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

14
Abbildung 14. Die Intensität der immunzytochemische Färbung. Linien auf der in den 12 und 13 gezeigten Bilder gezeichnet, und die Intensität entlang dieser aufgetragen wurde. Einschübe zeigen Bilder in der oberen Reihe von 12A. Die drei Bedingungen waren: 1) Beschichtung von Mauszellen (Neuronen enthalten) auf einer Feeder-Schicht Ratte und Färbung mit den primären Antikörpern (Neuron +, Glia + 1 ° Ab +), 2) der Glia-Feeder-Schicht (keine neuronale Plattierung) und Färben mit den primären Antikörpern (Neuron -, Glia + 1 ° + Ab), und 3) der Glia Vorschuber Schicht nur (keine neuronalen Beschichtung) und Färbung ohne primären Antikörper (Neuron -, Glia + 1 ° Ab -). Neuronale-Färbung (MAP2) war nur vorhanden, wenn der Maus-Zellen (Bedingungen 1 vs. 2) plattiert und Glia-Färbung (GFAP) in beiden Gruppen von Kulturen (Bedingungen 1 vs. 2) vorhanden war. Die immunzytochemische Färbung war spezifisch für beide primären Antikörpern (Bedingungen 1 vs. 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

LÖSUNGEN
TAE-Puffer (50x-Lösung)
Tris-Base, 486 g
Eisessig 114,2 ml
0,5 M EDTA, pH 8,0, 200 ml
Mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 2 l bringen
Make-up in einem Chemieabzug benutzen.
Verdünne 50fach vor Gebrauch.
Hanks-Lösung
Hanks 'Balanced Salts, ohne Calciumchlorid, Magnesiumsulfat und Natriumbicarbonat (1 l)
NaHCO 3, 350 mg (Endkonzentration 4,17 mM)
HEPES, 2,38 g (Endkonzentration 10 mM)
Passen Sie den pH-Wert 7,4 mit 5 M NaOH.
Passen Osmolarität auf 310 mOsm mit Saccharose (Osmolarität neigt dazu, ~ 290 mOsm ohne Anpassung).
Mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l zu bringen
Aufschlusslösung (Trypsin-Behandlung von Hirngewebe)
NaCl, 800,6 mg (Endkonzentration 137 mM)
KCl, 37,3 mg (final Konzentration, 5 mM)
Na 2 HPO 4 · (7H 2 O), 187,6 mg (Endkonzentration 7 mM)
HEPES, 595,8 mg (Endkonzentration 25 mM)
Glucose, 97,3 mg (Endkonzentration 5,4 mM)
Auf pH 7,2 unter Verwendung von 5 M NaOH.
Osmolarität neigt dazu, ~ 310 mOsm ohne Anpassung.
Mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml zu bringen.
Unmittelbar vor Benutzung, fügt 20 mg Trypsin (Endkonzentration 10 mg / ml) und 20 ul DNase (Endkonzentration 750 Einheiten / ml) zu 2 ml Aufschlußlösung.
Dissoziationslösung (mechanische Dissoziation von Hirngewebe)
Hanks-Lösung
MgSO 4 · (7H 2 O), 295,1 mg (final concentratiauf, 11,97 mM)
Passen Osmolarität auf 310 mOsm mit Saccharose.
Das Gesamtvolumen beträgt 100 ml.
Kurz vor Nutzung, fügen Sie 20 ul DNase (Endkonzentration von 750 Einheiten / ml) auf 2 ml Dissoziationslösung.
Plattierungsmedium-1 (für Maus Gliazellen)
Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 449,5 ml
MITO + Serum Extender, 0,5 ml
FBS, 50 ml
Das Gesamtvolumen beträgt 500 ml.
Plattierungsmedium-2 (für Maus Neuronen)
Neurobasal-A, 485 ml
B27, 10 ml
GlutaMAX-I, 5 ml (Endkonzentration 2 mM)
Das Gesamtvolumen beträgt 500 ml.
Plattierungsmedium-3 (für Ratten-Neuronen und Gliazellen)
Minimum Essential Medien (MEM, ohne Phenolrot)
Glucose, 2,5 g (Endkonzentration, 27,8 mM)
NaHCO 3, 100 mg (Endkonzentration 2,38 mM)
Transferrin, 50 mg
FBS, 50 ml
GlutaMAX-I, 5 ml (Endkonzentration 2 mM)
Insulin, 12,5 mg
Das Gesamtvolumen beträgt 500 ml.
Wachstumsmedium (für Ratten-Neuronen und Gliazellen)
MEM (ohne Phenolrot)
Glucose, 2,5 g (Endkonzentration, 27,8 mM)
NaHCO 3, 100 mg (Endkonzentration 2,38 mM)
Transferrin, 50 mg
FBS,25 ml
GlutaMAX-I, 1,25 ml (Endkonzentration 0,5 mM)
B27 oder NS21 {Chen 2008 # 2399}, 10 ml
Cytosin β-D-arabinofuranosid (AraC), 0,56 mg (Endkonzentration, 4 uM)
Das Gesamtvolumen beträgt 500 ml.
Allgemeines
Unsere Kulturmedien wirken Antibiotika nicht enthalten, weil sie zytotoxische Effekte auf kultivierte Gliazellen und Neuronen (Referenz 70, 71) ausüben könnte. Dadurch ist es besonders wichtig, sich an Verfahren in kulturbezogene Arbeit steril.
Siehe Tabelle der Reagenzien für die ausführlichen Quellen von Chemikalien.

Tabelle 1. Lösungen

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Discussion

Die hier vorgestellte Protokoll enthält Verfahren für die Tätowierung zur Kennzeichnung / Identifizierung Mäusen, zur Genotypisierung Mäuse aus Schwanzspitzen und zur Kultivierung von Maus Gehirnneuronen bei geringer Dichte. In einer Runde von Experimenten mit 6-8 Welpen, diese Verfahren benötigen in der Regel ~ 0,5 Stunden, ca. 4 h und ca. 2 h zugeführt, an insgesamt 6-7 Stunden. Dies macht es praktisch für eine einzige Versuchsleiter, alle aus der Zeit der Jungtiere "die Geburtsstunde der Beschichtung von neuronalen Kulturen erforderlichen Verfahren abzuschließen - in weniger als einem einzigen Arbeitstag (mit Ausnahme der vor Erstellung von Gliazellen Feeder-Schichten).

Tätowierung

Langzeit-Identifizierung der Tiere ist für die Zwecke der Züchtung und wissenschaftlichen Studien wie erforderlich über Analysen der Histologie, Zellfunktion und das Verhalten der Tiere. Tätowieren neugeborenen Tieren ist vorteilhaft, da sie schnell durchgeführt werden und wird für viele Lebens 7,22-25 des Tieres. Tattooing auf den Fußballen kann besser sein als Zehen Clipping-23 im Hinblick auf die Erhaltung testbare Verhaltensweisen, beispielsweise in Suspension oder Greif 22,26, obwohl einige Studien haben darauf hingewiesen, nicht solche Mängel (zB 25). Es gab keine Fälle von Müttern Ablehnung oder kannibalisieren Welpen nach dem Tätowieren. Bei anderen Methoden der Langzeit Kennzeichnung von Tieren finden Weaver 7,23,24.

Genotypisierung

Ein kritisches Merkmal in unserem Protokoll ist die Verwendung eines schnellen Genotypisierungsverfahrens. Obwohl ähnliche Genotypisierungsverfahren wurden in früheren Berichten (zB 27,28) beschrieben, das hier beschriebene System weist mindestens zwei Verbesserungen. Erstens kann es gewisse Schwankungen in der Menge des Ausgangsgewebes, das Alter der Tiere und Amplikonlänge tolerieren. Somit kann erfolgreich Genotypisierung unter Verwendung von Mäusen im Alter von 1 Tag und so alt wie 6 Monate alt erreicht werden und kann mit einem durchgeführt werdenbreite Palette von Primerpaare. Zweitens funktioniert diese Methode nicht erforderlich, eine Stopplösung für die DNA-Extraktionsschritt. Dies beseitigt übermäßige Rohr Handhabung und Pipettierung, und ermöglicht die parallele Mehrrohr Automatisierung des Prozesses mit einer PCR-Maschine. Die Anzahl der Proben kann skaliert werden (zB 96 Proben) dennoch leicht und gleichzeitig verarbeitet werden. Auch die Art der Probe wird nicht bis zum Schwanz Clips begrenzt; andere Probentypen, die verwendet werden könnten, umfassen Ohr Schläge, Zehenausschnitte, ganz frühen Embryonen und Plazenta Gewebe 2-4,29,30. Verschiedenen Tierarten können ebenfalls verwendet werden. So sind die Genotypisierung Verfahren sind zuverlässig (wiederholbare mit niedrigen Intra-Assay-Varianz) und reproduzierbare (geringe Inter-Assay-Varianz zwischen den Läufen oder zwischen Laboratorien) und haben den Vorteil, hohe Skalierbarkeit.

Beachten Sie, dass eine gewisse Vorsicht ist für die Erreichung der erwarteten Qualität der Ergebnisse erforderlich. Zuerst wird während der DNA-Extraktion, eine große Variation in dem Protokoll der Ergebnisse verschlechtern.Zum Beispiel kann eine signifikante Verringerung des Volumens der DNA Extraktionslösung (zum Beispiel von 200 auf 100 & mgr; l in Schritt 2.2) noch erlaubt Genotypisierung, aber es kann die Zuverlässigkeit verringert, was zu einer Variation in PCR-Ergebnisse. Unter solchen Bedingungen ist es empfehlenswert, das Volumen der DNA-Extrakt von 4 auf 2 & mgr; l zu reduzieren, und das Volumen von H 2 O von 2 bis 4 & mgr; l, um die Volumenänderung während der PCR-Reaktionen (Schritt 2,5) zu kompensieren. Zweite, am Ende des DNA-Extraktion, kann die Lösung für die PCR sofort ohne Zentrifugation in den meisten Fällen verwendet werden, obwohl der Schwanz wird seine Gesamtstruktur beibehalten und nicht völlig zerlegt werden. Allerdings ist die beschriebene Inversion der Rohre wesentlich für die Zwecke der dissoziierenden genomischer DNA aus dem Gewebe (Schritt 2.4). Es ist auch wichtig, um die obere, klare Teil der Lösung, ohne die Ablagerungen am Boden des Röhrchens zu verwenden, da die Aufnahme des letzteren um schlüssig PCR Ergebnissen führen. DieseSchritte wird wirksam mit minimalem Zeit- und Arbeitsaufwand. Gleich gute Ergebnisse können durch aktive Vortexen der Probe (an Stelle der Inversionen) erhalten werden, gefolgt von einer Zentrifugation und Verwendung des Überstandes. Drittens, nach der DNA-Extraktion, kann die DNA für eine langfristige (zB> zwei Wochen) gespeichert werden. Es wird empfohlen, die Lösung unter Verwendung einer Mikrozentrifuge (zB 3,000-13,000 g bei 4 ° C für 2 min), die Überstände wurden in neue Röhrchen, und im Kühlschrank bei -80 ° C zentrifugieren. Wenn die gespeicherte Extrakt die Genotypisierung verwendet werden, werden kurz die Probe zentrifugiert werden nach dem Auftauen und Verwendung des Überstandes.

Neuronenkulturen

Ein weiteres kritisches Merkmal unseres Protokolls ist die Verwendung von einer glialen Nährschicht auf neuronale Kulturen bei niedriger Dichte der Schicht zu etablieren. Typischerweise wird in Primärkulturen von Säugerhirn-Neuronen, die Zellen werden mit einer relativ hohen Dichte an beschichteten Deckgläsern ohne Glia plattiertl Feeder-Schicht (zB 31-39). Wenn die Dichte der Schicht von Neuronen mit dieser Methode reduziert die anfängliche Fehlen glial Blech führt zu einer schlechten neuronalen Wachstums und dendritischen Verlängerung (Panels B, C in den Figuren 8-10), wie früher berichtet 40-42, wahrscheinlich aufgrund der schlechten glial Wachstums 43,44.

Erfolgreiche niedriger Dichte neuronalen Kulturen können durch mindestens drei Typen von Verfahren erzeugt werden. In einem Ansatz wird Neurobasal Medium als Kulturmedium verwendet. Dies ermöglicht es, die Kultur Neuronen in Abwesenheit einer Feeder-Schicht Gliazellen und können für eine geringe Dichte neuronalen Kulturen 45,46 verwendet werden. In einem zweiten Ansatz ("Banker-type" und seine Modifikationen), sind Gliazellen cokultiviert mit Neuronen in der gleichen gut, aber physisch von ihnen getrennt. In diesem Zusammenhang bieten die Gliazellen 'trophischen Unterstützung' zu Neuronen ohne sie direkt zu kontaktieren1,41,42,47-49. Im dritten Ansatz werden Neuronen auf einem vorher festgelegten glial Nährschicht, die das neuronale Wachstum (zB 50-53) (Abbildungen 8-10) unterstützt plattiert. Insbesondere werden der Maus Gehirnneuronen auf einem Gliazellen Feeder-Schicht aus Mäusen oder Ratten 8,34,54 41,55,56 vorbereitet überzogen.

Wir bevorzugen die letzte der drei Ansätze niedriger Dichte Kultur, da das Neurobasal Medium kann das neuronale Überleben 57 beeinflussen, werden die Astrozyten Gliazellen wesentlich an der Regulation neuronaler Funktionen 8,58 sein, und der physikalische Kontakt zwischen den Neuronen und Gliazellen kann wichtig. Die Verfahren für die Kultivierung der Maus und Ratte Gliazellen sind ähnlich 59,60, aber wir haben sie leicht modifiziert, um für die schnellere In-vitro-Wachstum von Ratten gegen Maus Gliazellen unterzubringen. Die Verfahren für die Rattenzellkulturen wurden 61-63 modifiziert. Die Verwendung einer glialen Zuführung layer für Low-Density-neuronalen Kulturen macht es notwendig, schnelle Genotypisierung durchzuführen, um den Genotyp des Feeder-Schicht an, dass der Neuronen in der Zeit zwischen den Welpen "Geburten und der Todesfälle bei Neugeborenen oder das Ende des Kulturfensters entsprechen (1 -2 postnatale Tage).

Low-Density-Kultur auf einer glialen Feeder-Schicht ist auch eine wichtige Methode, wenn man versucht, Kultur Neuronen kleine Kerne im Gehirn (zB dem Norepinephrin-Releasing-Locus coeruleus und des Dopamin-Releasing Substantia nigra). Diese Kerne enthalten nur eine geringe Anzahl von Neuronen und würde unvermeidlich niedriger Dichte Kulturen 64-67 ergeben.

Primärkulturen werden routinemäßig in unserem Labor der CA3-CA1-Region des Hippocampus, dem Antriebsbereich des zerebralen Cortex und Striatum von Mäusen hergestellt. Die gleichen Verfahren können verwendet werden, um neuronale Kulturen herzustellen, welche anderen Hirnregionen, beispielsweise die gesamte Hippocampus (including den Gyrus dentatus) und die gesamte Hirnrinde. Rattenneuronen von Gehirnregionen wie dem Hippocampus und dem Locus coeruleus sind in ähnlicher Weise gezüchtet, mit der Ratten Glia Nährschicht. Diese kultivierten Neuronen werden üblicherweise bei 1-4 Wochen in vitro verwendet wird, mit der genauen Alter der Kultur, abhängig vom Zweck des Experiments. Es ist bemerkenswert, dass einige Neuronen auf einer glialen Feeder-Schicht kultiviert für mehr als 10 Wochen 34,68 überleben.

Ein mögliches Problem von geringer Dichte neuronalen Kulturen ist, dass die neuronale Eigenschaften können sich von denen in hochdichten Kulturen oder in Nervenzellen in situ ist. Vergleich dieser Systeme stellt eine interessante Möglichkeit zu untersuchen, wie der neuronalen Entwicklung und Reifung von mehreren Faktoren, wie der neuronalen Dichte der löslichen Faktoren, die von Neuronen sezerniert werden, Neuron zu Neuron Kontakt und glial-neuronalen Wechselwirkungen beeinflußt.

Zusammenfassend ist der tattooing basierten Maus Kennzeichnung langlebig ist, ist die Genotypisierung Verfahren schnell und die Kulturverfahren können zum Plattieren Mausneuronen bei niedriger Dichte. Das hier beschriebene Protokoll kann in seiner Gesamtheit auf andere Tierarten beherbergen, andere genetische Mutationen angewendet werden. Außerdem können einzelne Schritte des Protokolls für andere Zwecke verwendet werden. Damit kann das Protokoll in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, basierend auf Experimentatoren Bedürfnisse.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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