التصوير في الوقت الحقيقي من محور عصبي نقل الكم دوت المسمى عامل التغذية العصبية في الخلايا العصبية الابتدائية

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نقل محور عصبي من عامل التغذية العصبية الدماغي، وهو عامل التغذية العصبية، هو أمر حاسم لبقاء وظيفة العديد من السكان العصبية. وتتميز بعض الاضطرابات التنكسية من اختلال هيكل محور عصبي وظيفة. أثبتنا التقنيات المستخدمة لدراسة الاتجار المباشر لQD-عامل التغذية العصبية في غرف ميكروفلويديك باستخدام الخلايا العصبية الأولية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A. M., Pearn, M. L., Mobley, W. C., Wu, C. Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (91), e51899, doi:10.3791/51899 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

عامل التغذية العصبية تلعب دورا هاما في العديد من جوانب بقاء الخلايا العصبية، والتمايز، والوظيفة. وينظر بشكل متزايد العجز الهيكلية والوظيفية في محاور كميزة المبكرة من أمراض الاعصاب، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) ومرض هنتنغتون (HD). حتى الآن غير واضح هو آلية (ق) التي يتم الناجم عن إصابة محور عصبي. أبلغنا تطوير تقنية جديدة لإنتاج نشطة بيولوجيا، monobiotinylated عامل التغذية العصبية الدماغي (mBtBDNF) التي يمكن استخدامها لتتبع نقل محور عصبي من عامل التغذية العصبية. تم إنتاج عامل التغذية العصبية الكم نقطة المسمى (QD-عامل التغذية العصبية) عن طريق التصريف النقطة الكمومية 655 إلى mBtBDNF. تم استخدام جهاز ميكروفلويديك لعزل المحاور من أجسام الخلايا العصبية. إضافة QD-عامل التغذية العصبية إلى المقصورة محور عصبي سمحت التصوير الحي للنقل عامل التغذية العصبية في محاور عصبية. أثبتنا أن QD-عامل التغذية العصبية انتقلت أساسا retrogradely حصرا، مع عدد قليل جدا من توقف، في سرعة التحرك نحو 1.06 ميكرون / ثانية. هذا النظام يمكن أن تستخدم لتحقيق ليchanisms من تعطل وظيفة محور عصبي في AD أو HD، فضلا عن الاضطرابات التنكسية الأخرى.

Introduction

الخلايا العصبية مستقطبة للغاية الخلايا التي عمليات طويلة وغالبا ما وضعت للغاية تعتبر أساسية لإنشاء والحفاظ على بنية ووظيفة الدوائر العصبية. محور عصبي يلعب دورا حيويا في تحمل البضائع من وإلى نقاط الاشتباك العصبي. البروتينات والعضيات توليفها في سوما الخلية تحتاج ليتم نقلها من خلال محاور للوصول إلى المحطة قبل المشبكي لدعم وظيفة الخلايا العصبية. في المقابل، تلقت إشارات تحتاج في محاور البعيدة ليتم transduced ونقلت إلى سوما. هذه العمليات ضرورية لبقاء الخلايا العصبية، والتمايز، والصيانة. يجب أن تجرى في أن النقل محور عصبي في بعض الخلايا العصبية من خلال مسافات أكثر من 1،000 مرة من قطر جسم الخلية، وتصور إمكانية بسهولة أنه حتى العجز صغيرة يمكن أن تؤثر بشكل ملحوظ وظيفة الخلايا العصبية والدائرة.

الدماغ المستمدة عامل التغذية العصبية (عامل التغذية العصبية)، وهو عضو من عائلة neurotrophin من عوامل النمو، موجود في أماهمناطق الدماغ نيويورك، بما في ذلك الحصين والقشرة المخية، والدماغ الأمامي القاعدية. عامل التغذية العصبية تلعب دورا حاسما في تشكيل الإدراك والذاكرة من خلال دعم بقاء، والتمايز، ووظيفة الخلايا العصبية التي تشارك في الدوائر المعرفية. عامل التغذية العصبية يربط مستقبله، والتيروزين كيناز TrkB، في محطة محوار حيث ينشط مسارات الإشارات بوساطة TrkB بما في ذلك mitogen تنشيط بروتين كيناز / خارج الخلية التنظيم إشارة بروتين كيناز (MAPK / إرك)، فوسفتيدلينوستول-3-كيناز (PI3K) وفسفوليباز C-جاما (PLCγ). يتم تعبئتها البروتينات التي تشارك في هذه الممرات مما يشير إلى هياكل حويصلي التقامي لتشكيل عامل التغذية العصبية / TrkB يشير دخلول؛ جسيم داخلي 1-6 التي يتم نقلها بعد ذلك إلى retrogradely سوما العصبية.

غرفة ثقافة ميكروفلويديك هي عبارة عن منصة مفيدة جدا لدراسة البيولوجيا محور عصبي في ظل ظروف طبيعية، وكذلك في تحديد الإصابة والمرض 7،8. بواسطة محاور عزلمن أجسام الخلايا، سمح جهاز واحد لدراسة النقل وتحديدا في محاور 8-10. منصات ميكروفلويديك PDMS مقرها مع 450 ميكرون الحواجز مرسمة مجهارية المستخدمة في هذه الدراسة تم شراؤها تجاريا (انظر الجدول المواد). لدراسة نقل عامل التغذية العصبية الدماغي، قمنا بتطوير تكنولوجيا جديدة لإنتاج عامل التغذية العصبية monobiotinylated (mBtBDNF). ونحن قد استفادت من الببتيد البيوتين متقبل، AP (المعروف أيضا باسم AviTag). وهو تسلسل الأحماض الأمينية 15 الذي يحتوي على بقايا يسين التي يمكن و ligated تحديدا إلى البيوتين من قبل كولاي يغاز انزيم البيوتين، البيرة. نحن تنصهر في AviTag إلى C-محطة من الفأرة قبل proBDNF [كدنا] بواسطة PCR (الشكل 1A). تم استنساخ بناء إلى متجه التعبير الثدييات، pcDNA3.1 MYC-له النواقل. نحن أيضا استنساخ الحمض النووي البكتيري البيرة في pcDNA3.1 MYC-له النواقل. البلازميدات كانا عابر شارك transfected-إلى خلايا HEK293FT للتعبير عن كل من البروتينات. البيرة المحفز للربط من بيوفي خصيصا ليسين يقيمون داخل AviTag في C-محطة من عامل التغذية العصبية في نسبة 1: 1 لإنتاج عامل التغذية العصبية monobiotinylated مونومر. البيروكسيديز، تنضج عامل التغذية العصبية مع الكتلة الجزيئية ل~ 18 كيلو دالتون تم استردادها وتنقيته من وسائل الإعلام باستخدام ني الراتنج (الشكل 1C). كان biotinylation من عامل التغذية العصبية كاملة، كما دلل على ذلك عدم القدرة على كشف معدلة عامل التغذية العصبية التي immunoblotting (الشكل 1D). Streptavidin مترافق نقاط الكم، QD 655، واستخدمت لتسمية mBtBDNF لجعل QD-عامل التغذية العصبية. لم بحضور AviTag لا تتداخل مع نشاط عامل التغذية العصبية كما كان mBtBDNF قادرة على تفعيل TrkB فسفرته (الشكل 1E) وتحفيز ثمرة neurite (الشكل 1F) إلى الحد من عامل التغذية العصبية الدماغي البشري المؤتلف (rhBDNF). المناعية أظهرت أن عامل التغذية العصبية QD-colocalized مع TrkB محاور في قرن آمون، مشيرا إلى أن QD-عامل التغذية العصبية غير النشطة بيولوجيا (الشكل 1G). لدراسة نقل عامل التغذية العصبية، وأضيف إلى عامل التغذية العصبية QD-البعيدة مقصورة محوارالثقافات ميكروفلويديك تحتوي على الفئران E18 الخلايا العصبية قرن آمون (الشكل 2A). تم القبض QD-عامل التغذية العصبية النقل إلى الوراء في الوقت الحقيقي من محاور التصوير الحي من العلامة الحمراء الفلورسنت (دعم الفيديو S1، S2). من خلال تحليل مخطاط التموج ولدت، لوحظ QD-عامل التغذية العصبية ليتم نقلها retrogradely في سرعة التحرك نحو 1.06 ميكرون / ثانية (الشكل 3A). وقد استخدمت أو GFP mCherry الموسومة عامل التغذية العصبية لتتبع حركة محور عصبي من عامل التغذية العصبية. العوائق الرئيسية هي أنها ليست مشرقة بما فيه الكفاية للدراسات جزيء واحد. أيضا، فإن وجود كل من تقدمي والحركات عامل التغذية العصبية الوراء يجعل من الصعب تقييم ما إذا كان أو لم نقل retrogradely عامل التغذية العصبية في مجمع neurotrophin / مستقبلات.

في هذا الفيديو، ونحن لشرح التقنيات المستخدمة لدراسة الاتجار المباشر لQD-عامل التغذية العصبية في غرف ميكروفلويديك باستخدام الخلايا العصبية الأولية. وultrabrightness وصمود ممتازة من نقاط الكم ماكوفاق من الممكن تتبع أداء طويل الأجل لنقل عامل التغذية العصبية. هذه التقنيات يمكن استغلالها لتعزيز الدراسات وظيفة محور عصبي في AD، HD، والاضطرابات العصبية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتجرى العمليات الجراحية والحيوانية من بدقة وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تمت الموافقة على جميع التجارب التي تنطوي على استخدام الحيوانات جامعة كاليفورنيا سان دييغو المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. البلازميد الاستنساخ والتعبير وتنقية مونو المعقدة البيروكسيديز-عامل التغذية العصبية الدماغي (mBtBDNF)

ملاحظة: بناء قبل proBDNFavi والبيرة [كدنا] في ناقلات pcDNA3.1 وcoexpress في الخلايا HEK293FT 10. تنقية mBtBDNF باستخدام الخرز ني NTA فقا للطريقة التي تم نشرها مسبقا على إنتاج عامل نمو الأعصاب monobiotinylated ناضجة ونشطة بيولوجيا (mBtNGF) 10.

2. إعداد ميكروفلويديك الغرف

يجعل جهاز ميكروفلويديك عصبون زراعة من الممكن عزل fluidically محاور عصبية من أجسام الخلايا العصبية. تجميع غرف مع coverslips المغلفة الطازجة الحق قبل كل تشريح. غرف ميكروفلويديك تستخدمفي هذا البروتوكول يتم شراؤها تجاريا (انظر الجدول المواد والمعدات و). غسيل يدوي وإعادة استخدامها غرف شراؤها تجاريا يصل إلى 5-6x.

  1. غسل اليد في غرف ميكروفلويديك 1٪ Alconox. شطف ثلاث مرات بالماء ملي-Q لمدة 30 دقيقة لكل منهما. غرف غسل اليد مرة أخرى في 70٪ من الإيثانول.
  2. وضع خارج غرف لتجف على Parafilm في غطاء تدفق الصفحي. تشع وتعقيم جانبي غرف لمدة 20 دقيقة تحت أشعة فوق البنفسجية. متجر غرف تعقيم عقيمة في 15 سم طبق مختومة مع parafilm في درجة حرارة الغرفة.
  3. وضع 24 × 40 مم رقم 1 coverslips الزجاج في وعاء زجاجي. نقع لل coverslips في 35٪ حمض هيدروكلوريد بين عشية وضحاها على محور دوار. في اليوم التالي، وشطف لل coverslips ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منهما مع الماء.
  4. تعقيم لل coverslips واحدا تلو الآخر عن طريق غمس كل ساترة في الإيثانول بنسبة 100٪ وملتهبة أكثر من الموقد بنسن. تخزين coverslips الجافة في طبق بتري معقمة والحفاظ عليه في درجة حرارة الغرفة حتى الطلاء.
  5. وضع أوور لل coverslips في صحن الثقافة 15 سم. معطف كل ساترة مع 0.7 مل من 0.01٪ بولي-L-يسين (PLL) واحتضان في غطاء محرك السيارة في درجة حرارة الغرفة.
  6. بعد 1 ساعة، وشطف لل coverslips ثلاث مرات مع الماء المعقم. coverslips الجافة مع فراغ ومكان كل ساترة في طبق ثقافة 6 سم.
  7. لتجميع غرفة ميكروفلويديك، ضع الغرفة مع الجانب مرسمة مجهارية في أسفل على ساترة المغلفة PLL بحذر على عدم لمس microgrooves. ضغطت بلطف إلى أسفل الغرفة مع طرف ماصة لضمان ومختومة الغرفة بإحكام.

3. تشريح العصبية الثقافة وعلى لوحة الدوائر

  1. وضع اثنين E17-E18 الحصين الفئران (الدماغ واحد) في تشريح 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على 2 مل عازلة تشريح (HBSS، لا الكالسيوم والمغنيسيوم لا، مع 1٪ القلم / بكتيريا و 10 ملي HEPES. شطف الأنسجة 3X مع 5 مل تشريح العازلة في كل مرة. إزالة المنطقة العازلة تشريح قدر الإمكان وإضافة 900 ميكرولتر من دي الطازجةssection العازلة.
  2. لهضم الأنسجة، وإضافة 100 ميكرولتر من 10X التربسين (2.5٪) في المخزن المؤقت تشريح لجعل تركيز العمل 1X. وضع أنبوب مخروطي في 37 ° C حمام الماء. بعد 10 دقيقة من الهضم، وإضافة 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل الدناز الأول إلى تركيز النهائي حوالي 1 ملغ / مل.
  3. باستخدام الزجاج باستور ماصة مصقول النار، يسحن بلطف الأنسجة التي pipetting صعودا وهبوطا 5-10x. مباشرة بعد سحن، إخماد التربسين 2 مل مع الطلاء المتوسطة (Neurobasal مع 10٪ FBS، 2 مم GlutaMax، 2٪ B27).
  4. ترك العينة في غطاء محرك السيارة لمدة 5 دقائق للسماح أي حطام من الأنسجة ليستقر في القاع. إزالة بعناية 2 مل من طاف في العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي نظيف والطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه. Resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر سائل الاعلام الطلاء
  5. عد الخلايا مع عدادة الكريات. الحمل 15-20 ميكرولتر تعليق الخلية (~ 40،000 خلايا) في حجرة واحدة من غرفة ميكروفلويديك. وضع الغرفةفي الحاضنة لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا لنعلق على ساترة. بعد 10 دقيقة، إضافة وسائط أكثر الطلاء لملء كل من المقصورات من الغرفة.
  6. في اليوم الثاني من التشريح، وتحل تماما محل وسائل الإعلام الطلاء مع وسائل الاعلام الصيانة (Neurobasal مع 2 مم GlutaMax، 2٪ B27) في كل خلايا الجسم والمقصورة محور عصبي. محاور عصبية من الخلايا العصبية قرن آمون تبدأ لعبور microgrooves في يوم 3 والوصول إلى مقصورة محوار بين يوم 5-7. خلال هذه الفترة من الزمن، استبدال نصف وسائل الإعلام مع وسائل الاعلام زراعة صيانة جديدة كل 24 ~ 48 ساعة.

4. محور عصبي نقل QD-عامل التغذية العصبية

  1. قبل أن يعيش التصوير من QD-عامل التغذية العصبية النقل محور عصبي، تستنزف عامل التغذية العصبية من كل من جسم الخلية ومحور عصبي مقصورات للغرفة ميكروفلويديك بدقة من قبل شطف كل من مقصورات مع عامل التغذية العصبية حرة، حرة المصل وسائل الإعلام Neurobasal كل 30 دقيقة لمدة 2 ساعة.
  2. خلال استنزاف عامل التغذية العصبية، وإعداد تقارن QD-عامل التغذية العصبية. مزيج 50 نانومتر من أحادية المعقدة البيروكسيديز BDNF ديمر مع 50 نانومتر تقارن QD655-streptavidin في وسائل الإعلام neurobasal واحتضان على الجليد لمدة 60 دقيقة.
  3. إزالة وسائل الإعلام في المقصورة محور عصبي وإضافة 300 ميكرولتر QD-عامل التغذية العصبية مع تركيز النهائي من 0.25 نانومتر لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية. لتقليل نشرها من QD-عامل التغذية العصبية في حجرة خلايا الجسم، من المهم جدا أن تحافظ دائما على مستوى أعلى من وسائل الإعلام في المقصورة خلايا الجسم مما كانت عليه في المقصورة محور عصبي. يغسل غير منضم QD-عامل التغذية العصبية بعد الحضانة قبل التصوير الحي.
  4. تنفيذ التصوير الحي النقل QD-عامل التغذية العصبية باستخدام مجهر مقلوب مجهزة النفط 100X عدسة الهدف. الاحماء نطاق والغرفة البيئية المرتبطة به لدرجة حرارة ثابتة (37 درجة مئوية) وCO 2 (5٪). استخدام مجموعة من تكساس مكعبات الأحمر الإثارة / الانبعاثات لتصور إشارة QD655.
  5. اكتساب والتقاط الصور الوقت الفاصل ضمن محاور الوسطى بسرعة 1 إطار / ثانية أي ما مجموعه 2 دقيقة باستخدام كاميرا CCD. استخدام microgrooves مع عدم وجود محاور ثار لها أي QD، وبالتالي عدم وجود إشارة كجهاز تحكم عن التسلل.
  6. تحليل النقل عامل التغذية العصبية باستخدام أي برنامج تحليل الصور أو المعاهد الوطنية للصحة يماغيج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إنتاج وتنقية النشطة بيولوجيا عامل التغذية العصبية أحادي المعقدة البيروكسيديز

تم إنشاء ناقلات التعبير من عامل التغذية العصبية تنصهر مع تسلسل AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) وفقا لبروتوكول نشرت سابقا 10. وكان من المتوقع الكتلة الجزيئية للبروتين الكامل طول الانصهار لتكون ~ 32 كيلو دالتون ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) تم إنتاج عامل التغذية العصبية Monobiotinylated ناضجة مع الكتلة الجزيئية توقع من 18 كيلو دالتون (الشكل 1A) في الخلايا HEK293FT وتنقيته من وسائل الإعلام مكيفة كما هو موضح 10.

تم جمع الكسور المختلفة ويفصل على 15٪ SDS-PAGE. باستخدام أرنب مكافحة آفي علامة الأجسام المضادة، وهي الفرقة مع الوزن الجزيئي لل~ تم الكشف عن 18 كيلو دالتون في جزء الأول (الشكل 1B). لاختبار نقاء إعداد، تم فصل العينات على SDS-PAGE وكانت ملطخة كتبها silver تلطيخ. كما هو مبين في الشكل 1C، كانت 18 كيلو دالتون الفرقة الأنواع السائدة في شطف الأول. أجريت الخرز Streptavidin-الاغاروز المقايسات المنسدلة لتقييم مدى biotinylation إعداد mBtBDNF. بعد المنسدلة مع حبات streptavidin-الاغاروز، وعجلت البروتينات التي بقيت في طاف مع حمض الخليك ثلاثي الكلور 7٪ (TCA). وقد تم تحليل هذه العينات بواسطة SDS-PAGE وجرى التحقيق مع أي من البقع مكافحة آفي الأجسام المضادة (أعلى) للكشف عن البروتين الكلي أو HRP-streptavidin للكشف عن البروتينات المعقدة البيروكسيديز. أظهرت نتائجنا أن جميع الإشارات ارتبطت مع الخرز في حين تم الكشف عن أي فرقة في طاف (الشكل 1D). وبالتالي نستنتج أن mBtBDNF والمعقدة البيروكسيديز في كفاءة> 99.9٪.

لاختبار النشاط البيولوجي للmBtBDNF في ملزمة وتفعيل مستقبلات TrkB، كنا نعامل خط 3T3 الخلية التي تعرب TrkB مع أي rhBDNF (20 نانوغرام / مل) أو البولي يوريثانified mBtBDNF (20 نانوغرام / مل) لمدة 10 دقيقة. كما تم جمع الخلايا التي لم تتلق العلاج والسيطرة. تم فصل لست] على 4-12٪ SDS-PAGE، وكان يستخدم أرنب المضادة للpTrkB الأجسام المضادة للتحقيق في TrkB فسفرته. كما هو مبين في الشكل 1E، على غرار rhBDNF، كان قادرا على حمل الفسفرة من TrkB على مستوى مماثل mBtBDNF. كنا نعامل وأيضا الخلايا العصبية قرن آمون الفئران إما مع rhBDNF (20 نانوغرام / مل) أو تنقيته mBtBDNF (20 نانوغرام / مل) لمدة 48 ساعة. كان قادرا على تحفيز الحصين ثمرة neurite إلى حد rhBDNF (الشكل 1F) تنقيته mBtBDNF. لدراسة شارك في توطين QD-عامل التغذية العصبية مع مستقبلات TrkB، وأضيف QD-عامل التغذية العصبية الفئران لمحوار الحصين لمدة 4 ساعة عند 37 ° C. والخلايا العصبية ثم الثابتة وimmunostained لTrkB. كما هو مبين في الشكل 1G، QD-عامل التغذية العصبية شارك محلية مع TrkB. وبالتالي نستنتج أن mBtBDNF نشط بشكل كامل في وظيفة البيولوجية.

التصوير الحي من محور عصبي نقل QD-عامل التغذية العصبية طن الحصين الخلايا العصبية

تم تشريح الفئران الجنينية الخلايا العصبية قرن آمون الابتدائية (E17-18) ومطلي في حجرة خلايا الجسم من غرفة ميكروفلويديك. في يوم 4 أو 5، مددت محاور عبر microgrooves في حجرة محور عصبي. في يوم 7، نمت معظم محاور في حجرة محور عصبي. وجاء QD-عامل التغذية العصبية التي يحتضنها QD655 streptavidin مع mBtBDNF في نسبة 1: 1 (QD: عامل التغذية العصبية ديمر) على الجليد لمدة 1 ساعة. QD-عامل التغذية العصبية الدماغي (0.25 نانومتر) ثم تضاف إلى مقصورة محوار وحضنت لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية قبل التصوير (الشكل 2A).

بعد الحضانة، وعثر QD-عامل التغذية العصبية لربط خصيصا لمحاور عصبية في المقصورة محور عصبي. في المقصورة خلايا الجسم، وتراكمت الإشارات QD في معظم محاور الداني وأجسام الخلايا مما يدل على والمنضوية QD-عامل التغذية العصبية في محاور ونقلها retrogradely إلى الهيئات الخلية. نفذت الوقت الفاصل بين صورة سلسلة من الإشارات QD-عامل التغذية العصبية ضمن محاور للخروج في microgrooves. QD قوقد لوحظت ignals في معظم microgrooves مع محاور عصبية في حين يمكن رؤية أي إشارة QD في microgrooves في الغائب من المحاور، مشيرا إلى نشر ضئيلة أو معدومة للإشارة QD من المقصورة محور عصبي إلى المقصورة جسم الخلية (الشكل 2B).

في الشكل 2C، شريحة 80 ميكرون طويل من محاور عصبية من الخلايا العصبية قرن آمون سجلت fluorescently لمدة 100 ثانية. مجموعه 6 إشارات QD-عامل التغذية العصبية شوهدت بوضوح خلال تسجيل الفيديو. تحركت ثلاث QD إشارات سجلت باتجاه واحد نحو جسم الخلية (الجانب الأيسر). انتقل بسلاسة إلى خلايا الجسم عبور الحقل بأكمله في ~ 70 ثانية الحدث المسمى QD بواسطة السهم الأبيض (101 ثانية ت: 31 ثانية لر). انتقل retrogradely آخر الأولى الحدث المسمى QD بواسطة السهم الأخضر (61 ر ثانية: 1 ثانية لر). في ر: 21 ثانية، نقل QD-anterogradely عامل التغذية العصبية لمدة 10 إلى 20 ثانية، ثم تغير الاتجاه مرة أخرى نحو جسم الخلية. الحدث المسمى QD بواسطة السهم الأصفر (ر: 1 ثانية لر: 71 ثانية) أيضا تحركت retrograd اعل، ولكن توقف ل~ 20 ثانية أثناء الحركة. واعتبرت QD-BDNFs التي لم تتحرك خلال هذه ثانية 100 ثابتة. فقط وقد تم تحليل الأجسام المتحركة في وقت لاحق لحساب سرعة التحرك، ومتوسط ​​السرعة، والوقت توقف.

تحليل البيانات في QD-عامل التغذية العصبية النقل مخطاط التموج

تم إنشاؤها Kymographs من كل فيلم المسجلة باستخدام برنامج Metamorph. كما هو مبين في kymographs تمثيلي من QD-عامل التغذية العصبية النقل (الشكل 3A)، وسجلت تحركات QD-عامل التغذية العصبية خلال 120 ثانية في جزء طويل من محاور 80 ميكرون. في مخطاط التموج التمثيلي 1، انتقل QD-عامل التغذية العصبية بسرعة وسلاسة باتجاه اليمين (خلايا الجسم)، وعبرت الميدان (80 ميكرون) في ~ 60 ثانية، مع توقف قصيرة للغاية (دعم الفيديو S1). بينما في مخطاط التموج تمثيلي 2، QD-عامل التغذية العصبية سافر ~ 50 ميكرون في 120 ثانية retrogradely، مع ثلاثة على الأقل شرائح توقف أطول (المشار إليها السهام) (دعم الفيديو S2).

محتوى "> الشكل 3B هو مؤامرة مبعثر الانتقال السرعة، متوسط ​​السرعة، وتوقف الوقت من كل واحد QD-عامل التغذية العصبية. كانت سرعة الحركة من QD-عامل التغذية العصبية سريعة نسبيا، تتراوح 0،47-1،97 ميكرومتر / ثانية مع متوسط تم حساب 1.06 ± 0.05 ميكرون / ثانية، ومتوسط ​​سرعة QD-عامل التغذية العصبية ومسافة السفر / وقت استخدامها. ولأن عامل التغذية العصبية توقف أثناء النقل لها، كان متوسط ​​سرعة أقل بكثير من سرعة التحرك مع متوسط ​​0.48 ± 0.03 ميكرون / ثانية (تتراوح 0،17-1،59 ميكرومتر / ثانية). تم تحليل الوقت متوقفة مؤقتا أيضا بمثابة توصيف الحركة عامل التغذية العصبية الدماغي، وكانت متوسط ​​مدة توقف 15.88 ± 1.30 ثانية (تتراوح 6-33 ثانية) (الجدول 1).

الشكل 1
الرقم 1. تنقية بيولوجية نشطة، عامل التغذية العصبية monobiotinylated (mBtBDNF). (A) يظهر الرسم التخطيطي إنتاج mBtBDNF. تم استنساخ كل من قبل proBDNFavi والبيرة في pcDNA3.1myc-متجه له كما هو موضح 10. تم جمع (B) كسور مختلفة من elutes من ني الراتنج ويفصل على 15٪ هلام SDS-PAGE. تم استخدام أرنب مكافحة آفي علامة الأجسام المضادة في وصمة عار. وقد أدخلت الفرقة مع الوزن الجزيئي واضح من ~ 18 كيلو دالتون في أزل، بما يتفق مع الكتلة الجزيئية لتوقع البروتين ناضجة mBtBDNF. (C) والفضة تلطيخ هلام يظهر كان 18 كيلو دالتون mBtBDNF الأنواع السائدة في جزء شطف. وقد حضنت (D) تنقية mBtBDNF مع حبات streptavidin-الاغاروز. وكانت تغسل حبات والمغلي SDS العازلة تحميل بينما عجلت طاف مع TCA قبل تحليل SDS-PAGE. تم بحثها وصمة عار مع أي مكافحة آفي الأجسام المضادة أو مع HRP-streptavidin. وأضاف (E) 20 نانوغرام / مل من تنقية mBtBDNF أو rhBDNF إلى خط الخلية التي 3T3 البريدxpresses TrkB لمدة 10 دقيقة. كانت تحصد لست] وفصل على 4-12٪ SDS-PAGE. تم تحليل الخلايا أيضا السيطرة المحللة. تم بحثها وصمة عار مع أرنب المضادة للpTrkB الأجسام المضادة. تم الكشف الكلي TrkB باستخدام الماوس مكافحة TrkB الأجسام المضادة. وأضاف (F) 20 نانوغرام / مل من تنقية mBtBDNF أو rhBDNF الفئران إلى الخلايا العصبية قرن آمون لمدة 48 ساعة. وقد أخذت صور DIC لتحليل ثمرة neurite. وقد حضنت (G) QD-عامل التغذية العصبية قرن آمون الفئران مع محاور الخلايا العصبية لمدة 4 ساعة (شريط النطاق 5 ميكرون). والخلايا العصبية ثم الثابتة وimmunostained لTrkB.

الشكل 2
. الشكل 2. جزيء واحد من التصوير نقل إلى الوراء من QD-عامل التغذية العصبية في محاور عصبية (A) أعلى عرض: الرسم التخطيطي لمن غرفة ميكروفلويديك مع الخلايا العصبية الأولية مطلي في المقصورة خلايا الجسم. نمت محاور عبر ميكروغرامrooves في حجرة محور عصبي. وأضيف QD655 المسمى عامل التغذية العصبية إلى المقصورة محور عصبي. أبقى الصعيد الإعلامي في المقصورة محور عصبي أقل من مقصورة خلايا الجسم للحد من انتشار إشارة QD: عرض الجانب. (B) وصور مضان أحمر والصور DIC من مقصورة جسم الخلية، microgrooves ومحوار المقصورة. QD-عامل التغذية العصبية ملزمة خصيصا لمحاور عصبية، المنضوية، ونقلها retrogradely إلى أجسام الخلايا على طول محاور عصبية. وقد لوحظ عدم وجود إشارة QD في غياب microgrooves من المحاور. (C) الوقت الفاصل الفيديو صورة سلسلة النقل QD-عامل التغذية العصبية على طول محور عصبي. وكان كل من الحركة والثابتة إشارات QD-عامل التغذية العصبية موجودة في معظم الأفلام. في الوقت t: 1 ثانية، يمكن أن ينظر على الأقل 4 QDS. بعد 10 ثانية، وهما QDS (المشار إليها بواسطة الأسهم الخضراء والصفراء) تتحرك نحو جسم الخلية (يسار الصورة). هذه QDS اثنين تتحرك وقفة في الصور القليلة الأولى والانتقال في نهاية المطاف من الصور إلى اليسار (في ~ 70 ثانية). انتقل QD أخرى إلى الميدانفي ر: 31 ثانية (المشار إليها بواسطة السهم الأبيض) وانتقل بسرعة كبيرة دون توقف إلى اليسار.

الرقم 3
الرقم 3. QD-عامل التغذية العصبية الدماغي مخطاط التموج النقل وتحليل البيانات. (A) kymographs الممثل النقل QD-عامل التغذية العصبية في الخلايا العصبية قرن آمون الأولية. في kymo 1، تحركت QD مشرق عبر الميدان بسرعة فائقة نسبيا مع عدد قليل من توقف قصيرة. في kymo 2، وسرعة التحرك من QDS أبطأ، وتوقفت الحركة مع توقف أكثر تكرارا وأطول. (B) مؤامرة مبعثر من QD-عامل التغذية العصبية تتحرك السرعة، متوسط ​​السرعة (محسوبة والسفر الوقت / المسافة المستخدمة) وتوقفت مرة. وكان متوسط ​​سرعة التحرك من عامل التغذية العصبية QD-1.06 ± 0.05 ميكرون / ثانية (تتراوح 0،47-1،97 ميكرون / ثانية. وكان متوسط ​​سرعة QD-عامل التغذية العصبية 0.48 ± 0.03 ميكرون / ثانية (تتراوح بين 0. 17 حتي 1،59 ميكرون / ثانية). وكان متوسط ​​مدة توقف 15.88 ± 1.30 ثانية (تتراوح 6-33 ثانية).

دعم الفيديو S1 . ممثل QD-عامل التغذية العصبية الفيديو النقل 1. عدة QD-عامل التغذية العصبية التحرك بسرعة نحو الجانب الأيسر (خلايا الجسم) مع عدد قليل جدا من توقف قصيرة.

دعم الفيديو S2 . ممثل QD-عامل التغذية العصبية الفيديو النقل 2. عدة QD-عامل التغذية العصبية التحرك البطيء نسبيا نحو الجانب الأيسر (خلايا الجسم) مع توقف متكررة وطويلة.

88px؛ "> الأمراض المنقولة جنسيا الخطأ.
الحد الأدنى أقصى يعني
نقل السرعة (ميكرون / ثانية) 0.47 1.97 1.06 0.05
متوسط ​​سرعة (ميكرون / ثانية) 0.17 1.59 0.48 0.03
الوقت توقف (ثانية) 6 33 15.88 1.30

الجدول 1. تحليل بيانات النقل QD-عامل التغذية العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة، ونحن التقرير تطور تقنية جديدة لإنتاج نشطة بيولوجيا، monobiotinylated عامل التغذية العصبية الدماغي (mBtBDNF) التي يمكن استخدامها لتتبع نقل محور عصبي من عامل التغذية العصبية. بواسطة التصريف البروتين إلى نقطة الكم streptavidin، واستخدام غرفة ميكروفلويديك، الأسلوب يسمح احد للكشف عن نقل محور عصبي من عامل التغذية العصبية في الخلايا العصبية الأولية مع حساسية جزيء واحد، في الوقت الحقيقي ومع القرارات المكانية والزمانية. الأدوات المستخدمة هنا توفر الوسائل التي لدراسة الآلات الجزيئية التي تتوسط النقل محور عصبي من عامل التغذية العصبية / TrkB يشير الإندوسومات في الخلايا العصبية في الصحة والمرض.

عامل التغذية العصبية الدماغي-GFP، أو -mCherry استخدمت لتتبع حركة محور عصبي من عامل التغذية العصبية في مختلف الثقافات العصبية في المختبر. هذه الكواشف توفر خيار واحد لدراسة النقل تقدمي، وربما لدراسة تفعيل autocrine من TrkB. ومع ذلك، هناك عيوب كبيرة لدراسة النقل إلى الوراء، وأبرز من مبادرة الخوذ البيضاءالفصل هو أن GFP أو mCherry ليست مشرقة بما فيه الكفاية للدراسات جزيء واحد. وأظهرت دراسات سابقة أن تحت تركيزات الفسيولوجية للNGF، وقد استوعبت في NGF ديمر واحد 11 ونقل retrogradely 8. الأهم من ذلك، استخدام QD عامل التغذية العصبية كما يسمح احد لتحديد مكان التحت خلوية في عامل التغذية العصبية التي تربط مستقبلات TrkB لها. في استخدام GFP أو البروتينات mCherry الموسومة، والصومال التعبير يؤدي إلى وجود ضمن محور عصبي من البروتينات تمر تقدمي وكذلك النقل إلى الوراء. على هذا النحو، فإنه قد يكون من الصعب تقييم ما إذا أو عندما تنقل retrogradely عامل التغذية العصبية اجه مستقبله قبل النقل الوراء. في الواقع، وتكهنات والنقل الوراء ضمن محاور عصبية من عامل التغذية العصبية الدماغي، أو عامل التغذية العصبية GFP-mCherry أنتجت في نفس الخلايا العصبية قد تختلف من أنه في أعقاب ملزمة من عامل التغذية العصبية في الهدف من تعصيب.

على الرغم من أن يشابك الكيميائية قد استخدمت لإنتاج عامل نمو الأعصاب النشطة بيولوجيا(NGF)، وطريقة عرضه هنا هو الافضل. أولا، من الصعب التحكم بدقة مدى biotinylation. على سبيل المثال، وصفت كل NGF 5-9 مع البيوتين الأنصاف 8،9،12. ثانيا، يمكن يشابك إبطال نشاط البروتين. في حالة NGF، استلزم يشابك المرفق إلى مجموعات الكربوكسيل 13. في حالة عامل التغذية العصبية الدماغي، وغالبا ما يتم فقدان النشاط الكيميائي ليشابك التالية البيوتين. أخيرا، ومدى يشابك قد تكون غير مكتملة. وأظهر تقرير حديث أن ~ 0.8 البيوتين / تم إنتاج جزيء عامل التغذية العصبية التي يشابك الكيميائية؛ على هذا النحو كان ~ 20٪ من عامل التغذية العصبية لا المسمى 9. وجود عامل التغذية العصبية الخالي من الملصقات يمكن ان يعقد تفسير النتائج.

أسلوبنا تقدم المزايا الفريدة التي جزيئات عامل التغذية العصبية وصفت جميع مع البيوتين واحدة في نفس الموقع، مما يشكل إعداد متجانس من عامل التغذية العصبية المعقدة البيروكسيديز. قبل التصريف إلى جزيئات nanofluorescent مثل نقاط الكم، يمكن أن يكون mBtBDNFتستخدم لتتبع مسارات والعمليات التي يتم المنضوية عامل التغذية العصبية، يتم الاتجار بهم داخل الخلايا العصبية: في التشعبات، في محاور وكذلك في أجسام الخلايا. هذا الأسلوب يجعل من الممكن استخدام علامات بديلة للعامل التغذية العصبية. تطوير أنواع أخرى من الجسيمات النانوية وعود فوائد إضافية.

قد تورطت في الاتجار العيوب محور عصبي وإشارات من عامل التغذية العصبية في أمراض الاعصاب. أدلة قوية ربطت النقل عيب من عامل التغذية العصبية إلى ضمور القشرية-مخططي في مرض هنتنغتون 14،15. البروتين Huntingtin متحولة يتداخل مع التفاعل بين Huntingtin المرتبطة بالبروتين-1 (HAP1) والحركية داينين ​​في الخلايا العصبية متعاطفة، يمنع نقل عامل التغذية العصبية، ويؤدي إلى فقدان الدعم التغذية العصبية والسمية العصبية 16-18. يمكن لتقنيات تتبع حركة محواري من عامل التغذية العصبية بمثابة أداة قيمة لدراسة وظيفة محور عصبي في الاضطرابات العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أعلنت أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نشكر يو (بولين) هو جين تاو، راشيل Sinit للحصول على المساعدة الفنية. وتدعم الدراسة التي منحة المعاهد الوطنية للصحة (PN2 EY016525) وبتمويل من متلازمة داون مؤسسة البحوث والعلاج ومؤسسة لاري L. Hillblom.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Platinum pfx DNA polymerase  Invitrogen 11708021
EcoRI  Fermentas FD0274
BamHI  Fermentas FD0054
HEK293FT cells Invitrogen R70007
DMEM-high glucose media Mediatech 10-013-CV
D-biotin  Sigma B4639
TurboFect  Fermentas R0531
PMSF   Sigma P7626
Aprotinin Sigma A6279
Ni-NTA resins Qiagen 30250
Protease inhibitors cocktail Sigma  S8820
Silver staining kit  G-Biosciences 786-30
Human recombinant BDNF Genentech
Microfluidic chambers Xona SND450
24 x 40 mm No. 1 glass coverslips  VWR 48393-060
Poly-L-Lysine  Cultrex 3438-100-01
HBSS Gibco 14185-052
DNase I Roche 10104159001
Trypsin Gibco 15090-046
Neurobasal  Gibco 21103-049
FBS  Invitrogen 16000-044
GlutaMax  Invitrogen 35050-061
B27   Gibco 17504-044
QD655-streptavidin conjugates Invitrogen  Q10121MP
anti-Avi tag antibody GenScript A00674
streptavidin-agarose beads  Life Technology  SA100-04
Trichloroacetic acid Sigma T6399
HRP-streptavidin  Thermo Scientific N100
anti-pTrkB antibody a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody BD Science 610101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
  2. Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
  3. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
  4. Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
  5. Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
  6. Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
  7. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
  8. Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
  9. Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
  10. Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
  11. Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
  12. Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
  13. Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
  14. Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
  15. Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
  16. Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
  17. Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
  18. Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics