क्वांटम के Axonal परिवहन की वास्तविक समय इमेजिंग प्राथमिक न्यूरॉन्स में BDNF डॉट लेबल

Neuroscience

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Summary

BDNF, एक neurotrophic कारक, की axonal परिवहन कई neuronal आबादी के अस्तित्व और समारोह के लिए महत्वपूर्ण है. कुछ अपक्षयी विकार axonal संरचना और समारोह के विघटन से चिह्नित कर रहे हैं. हम प्राथमिक न्यूरॉन्स का उपयोग microfluidic कक्षों में QD-BDNF का जीना तस्करी की जांच करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक का प्रदर्शन किया.

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Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A. M., Pearn, M. L., Mobley, W. C., Wu, C. Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (91), e51899, doi:10.3791/51899 (2014).

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Abstract

BDNF neuronal अस्तित्व, भेदभाव, और समारोह के कई पहलुओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. Axons में संरचनात्मक और कार्यात्मक घाटा तेजी से अल्जाइमर रोग (ई) और हंटिंग्टन रोग (एचडी) सहित neurodegenerative रोगों, का एक प्रारंभिक सुविधा के रूप में देखा जाता है. अभी तक यह स्पष्ट नहीं axonal चोट प्रेरित है जिसके द्वारा तंत्र (एस) है. हम जैविक रूप से सक्रिय निर्माण करने के लिए एक उपन्यास तकनीक के विकास की सूचना दी, BDNF की axonal परिवहन पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि BDNF (mBtBDNF) monobiotinylated. क्वांटम डॉट लेबल BDNF (G-BDNF) mBtBDNF क्वांटम डॉट 655 conjugating द्वारा तैयार की गई थी. एक microfluidic डिवाइस न्यूरॉन सेल शरीर से axons अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. Axonal डिब्बे में QD-BDNF के अलावा axons में BDNF परिवहन के लाइव इमेजिंग की अनुमति दी. हम QD-BDNF के आसपास 1.06 माइक्रोन / सेकंड की एक चलती वेग में, बहुत कुछ pauses के साथ, प्रतिगमनपूर्वक अनिवार्य रूप से विशेष रूप से ले जाया गया है कि प्रदर्शन किया. इस प्रणाली मुझे जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैई या HD में बाधित axonal समारोह है, साथ ही अन्य अपक्षयी विकारों के chanisms.

Introduction

न्यूरॉन्स अत्यधिक जिसका लंबी और अक्सर अत्यधिक सविस्तार प्रक्रियाओं की स्थापना और तंत्रिका सर्किट की संरचना और समारोह को बनाए रखने के लिए मौलिक हैं कोशिकाओं ध्रुवीकरण कर रहे हैं. अक्षतंतु को और synapses से कार्गो को ले जाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. सेल सोमा में संश्लेषित प्रोटीन और organelles न्यूरोनल समारोह का समर्थन करने के प्रीसानेप्टिक टर्मिनल तक पहुंचने के लिए एक्सोन के माध्यम से ले जाया जाना चाहिए. तदनुसार, संकेत बाहर का axons transduced करने की आवश्यकता पर प्राप्त किया और सोमा को अवगत करा दिया. इन प्रक्रियाओं neuronal अस्तित्व, भेदभाव, और रखरखाव के लिए आवश्यक हैं. कुछ न्यूरॉन्स में कि axonal परिवहन दूरी के माध्यम से 1,000 से अधिक बार सेल शरीर के व्यास का आयोजन किया जाना चाहिए, संभावना आसानी से भी छोटे घाटा स्पष्ट रूप से neuronal और सर्किट समारोह को प्रभावित कर सकता है कि कल्पना की है.

मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (BDNF), वृद्धि कारकों के neurotrophin परिवार के एक सदस्य, एमए में मौजूद हैहिप्पोकैम्पस, प्रमस्तिष्क प्रांतस्था, और बेसल अग्रमस्तिष्क सहित NY मस्तिष्क क्षेत्रों,. BDNF संज्ञानात्मक सर्किट में भाग लेने कि न्यूरॉन्स के अस्तित्व, भेदभाव, और समारोह का समर्थन करके अनुभूति और स्मृति गठन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. BDNF यह माइटोजन सक्रिय प्रोटीन काइनेज / बाह्य संकेत विनियमित प्रोटीन kinase (MAPK / ERK), phosphatidylinositol-3-kinase सहित TrkB की मध्यस्थता संकेत दे रास्ते सक्रिय है जहां अक्षतंतु टर्मिनल पर, अपने रिसेप्टर, tyrosine kinase TrkB को बांध (PI3K) और phospholipase सी गामा (PLCγ). इन संकेत दे रास्ते में भाग लेने कि प्रोटीन तो प्रतिगमनपूर्वक न्यूरोनल सोमा लिए ले जाया जाता है कि endosome 1-6 संकेत BDNF / TrkB के लिए फार्म endocytic vesicular संरचनाओं पर पैक कर रहे हैं.

microfluidic संस्कृति कक्ष सामान्य परिस्थितियों के साथ ही चोट और बीमारी 7,8 की सेटिंग में axonal जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक बहुत ही उपयोगी मंच है. अलग axons द्वारासेल शरीर से, युक्ति axons 8-10 में विशेष रूप से परिवहन अध्ययन करने के लिए एक की अनुमति दी है. इस अध्ययन में इस्तेमाल 450 माइक्रोन microgroove बाधाओं के साथ PDMS आधारित microfluidic प्लेटफार्मों व्यावसायिक रूप से (सामग्री तालिका देखें) खरीदे थे. BDNF परिवहन की जांच करने के लिए, हम monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) का उत्पादन करने के लिए एक उपन्यास प्रौद्योगिकी विकसित की है. हम (भी AviTag के रूप में जाना जाता है) बायोटिन स्वीकर्ता पेप्टाइड, एपी का फायदा उठाया. यह विशेष रूप से Escherichia कोलाई एंजाइम बायोटिन ligase, बीरा द्वारा एक बायोटिन को ligated जा सकता है कि एक लाइसिन अवशेषों जिसमें एक 15 अमीनो एसिड अनुक्रम है. हम पीसीआर (चित्रा 1 ए) द्वारा माउस पूर्व proBDNF सीडीएनए की सी टर्मिनस तक AviTag जुड़े. निर्माण स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर, pcDNA3.1 MYC-उसकी वेक्टर में क्लोन किया गया था. हम भी pcDNA3.1 MYC-उसकी वेक्टर में बैक्टीरियल बीरा डीएनए क्लोन. दो plasmids क्षणिक दोनों प्रोटीन व्यक्त करने HEK293FT कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट सह रहे थे. बीरा Biot के बंधाव उत्प्रेरितविशेष रूप से लाइसिन करने के लिए एक 1 पर BDNF की सी टर्मिनस पर AviTag भीतर रहते में: 1 अनुपात BDNF मोनोमर monobiotinylated निर्माण करने के लिए. Biotinylated, ~ 18 केडीए के एक आणविक जन के साथ BDNF परिपक्व बरामद और नी राल (चित्रा 1C) का उपयोग करते हुए मीडिया से शुद्ध किया गया था. (चित्रा -1) Immunoblotting द्वारा असंशोधित BDNF का पता लगाने में असमर्थता द्वारा न्याय के रूप में BDNF की biotinylation, पूरा हो गया था. Streptavidin संयुग्मित क्वांटम डॉट्स, QD 655, QD-BDNF बनाने के लिए mBtBDNF लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया. mBtBDNF phosphorylated TrkB (चित्रा 1E) को सक्रिय करने और पुनः संयोजक मानव BDNF (rhBDNF) की सीमा तक neurite परिणाम (चित्रा 1F) को प्रोत्साहित करने में सक्षम था के रूप में AviTag की उपस्थिति BDNF की गतिविधि के साथ हस्तक्षेप नहीं किया. QD-BDNF QD-BDNF bioactive (चित्रा 1G) का संकेत है कि, हिप्पोकैम्पस axons में TrkB साथ colocalized पता चला है कि immunostaining. BDNF परिवहन अध्ययन करने के लिए, QD-BDNF के बाहर का अक्षतंतु डिब्बे में जोड़ा गयाचूहे E18 hippocampal न्यूरॉन्स (2A चित्रा) युक्त microfluidic संस्कृतियों. Axons भीतर QD-BDNF प्रतिगामी परिवहन लाल फ्लोरोसेंट टैग (सहायक वीडियो S1, S2) के वास्तविक समय रहते इमेजिंग द्वारा कब्जा कर लिया था. उत्पन्न kymograph विश्लेषण करके, QD-BDNF के आसपास 1.06 माइक्रोन / सेक (चित्रा 3) की एक चलती वेग में प्रतिगमनपूर्वक जाया जाएगा मनाया गया. GFP या mCherry टैग BDNF BDNF की axonal आंदोलन को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. प्रमुख कमियां वे एक अणु के अध्ययन के लिए काफी उज्ज्वल नहीं हो रहे हैं. इसके अलावा, दोनों अग्रगामी और प्रतिगामी BDNF आंदोलनों की उपस्थिति यह मुश्किल प्रतिगमनपूर्वक जाया BDNF एक neurotrophin / रिसेप्टर परिसर में किया गया था या नहीं, का मूल्यांकन करने के लिए बनाता है.

इस वीडियो में, हम प्राथमिक न्यूरॉन्स का उपयोग microfluidic कक्षों में QD-BDNF का जीना तस्करी की जांच करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक का प्रदर्शन. ultrabrightness और क्वांटम डॉट्स पहुंच के उत्कृष्ट photostabilityतों यह संभव BDNF परिवहन के लंबी अवधि के प्रदर्शन पर नज़र रखने के लिए. इन तकनीकों में ई, HD, और अन्य neurodegenerative विकारों में axonal समारोह के अध्ययन को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता.

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Protocol

शल्य चिकित्सा और पशु प्रक्रियाओं की देखभाल के लिए एनआईएच गाइड करने के लिए और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग अनुसार कड़ाई से बाहर किया जाता है. जानवरों के उपयोग से जुड़े सभी प्रयोगों UCSD संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं.

1 प्लास्मिड क्लोनिंग, मोनो biotinylated BDNF की अभिव्यक्ति और शोधन (mBtBDNF)

नोट: HEK293FT कोशिकाओं 10 में pcDNA3.1 वेक्टर और coexpress में पूर्व proBDNFavi और बीरा सीडीएनए का निर्माण. MBtBDNF परिपक्व और जैविक रूप से सक्रिय monobiotinylated तंत्रिका वृद्धि कारक (mBtNGF) 10 उत्पादन के पहले प्रकाशित विधि के अनुसार नी NTA मोती का उपयोग कर शुद्ध.

Microfluidic मंडलों के 2 तैयारी

Microfluidic न्यूरॉन संवर्धन डिवाइस fluidically न्यूरॉन सेल शरीर से axons अलग करने के लिए यह संभव बनाता है. सही प्रत्येक विच्छेदन से पहले हौसले लेपित coverslips साथ कक्षों को इकट्ठा करो. इस्तेमाल किया Microfluidic कक्षोंइस प्रोटोकॉल में व्यावसायिक रूप से (सामग्री और उपकरणों की तालिका देखें) खरीदी कर रहे हैं. हाथ से धोएं और 5-6x अप करने के लिए पुन: उपयोग वाणिज्यिक खरीदा कक्षों.

  1. हाथ धोने 1% Alconox में microfluidic कक्षों. 30 मिनट प्रत्येक के लिए मिल्ली क्यू पानी के साथ तीन बार कुल्ला. 70% इथेनॉल में फिर से हाथ धो कक्षों.
  2. लामिना का प्रवाह हुड में Parafilm पर सुखाने के लिए कक्षों बाहर करना. विकीर्ण और यूवी के तहत 20 मिनट के लिए कक्षों की दोनों पक्षों बाँझ. स्टोर कमरे के तापमान पर Parafilm के साथ बंद एक बाँझ 15 सेमी डिश में कक्षों निष्फल.
  3. एक ग्लास कंटेनर में 24 x 40 मिमी नंबर 1 कांच coverslips रखें. रातोंरात एक रोटेटर पर 35% हाइड्रोक्लोराइड एसिड में coverslips भिगोएँ. अगले दिन, 30 मिनट पानी से प्रत्येक के लिए coverslips तीन बार कुल्ला.
  4. 100% इथेनॉल में प्रत्येक coverslip सूई और एक लेम्प बर्नर से अधिक ज्वलंत द्वारा coverslips एक के बाद एक जीवाणुरहित. एक बाँझ पेट्री डिश में शुष्क coverslips स्टोर और कोटिंग जब तक कमरे के तापमान पर रखें.
  5. कहां लेटाओएक 15 सेमी संस्कृति डिश में coverslips टी. कोट 0.01% पाली एल Lysine (पीएलएल) के 0.7 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक coverslip और कमरे के तापमान पर हुड में सेते हैं.
  6. 1 घंटे बाद, coverslips बाँझ पानी के साथ तीन बार कुल्ला. एक 6 सेमी संस्कृति डिश में वैक्यूम और जगह प्रत्येक coverslip के साथ सूखी coverslips.
  7. Microfluidic कक्ष इकट्ठा करने के लिए, microgrooves को छूने के लिए नहीं सावधानी के साथ पीएलएल लेपित coverslip पर तल पर microgroove पक्ष के साथ चैम्बर जगह. धीरे चैम्बर कसकर सील किया गया सुनिश्चित करने के लिए एक विंदुक टिप के साथ चैम्बर नीचे दबाया.

मंडलों पर 3 Neuronal संस्कृति के विच्छेदन और प्लेट

  1. 1% कलम / strep और 10 मिमी HEPES के साथ 2 मिलीलीटर विच्छेदन बफर (HbSS, कोई कैल्शियम, कोई मैग्नीशियम युक्त एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में विच्छेदित दो E17-E18 चूहे हिप्पोकाम्पी (एक मस्तिष्क), रखें. ऊतकों 5 एमएल के साथ 3x कुल्ला विच्छेदन जितना संभव विच्छेदन बफर निकालें. हर बार बफर और ताजा डि के 900 μl जोड़नेssection बफर.
  2. , ऊतक को पचाने 1x काम एकाग्रता बनाने के लिए विच्छेदन बफर में 10x trypsin (2.5%) की 100 μl जोड़ें. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शंक्वाकार ट्यूब रखें. पाचन के 10 मिनट के बाद, 1 मिलीग्राम / एमएल के चारों ओर एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल DNase मैं के 100 μl जोड़ें.
  3. एक आग पॉलिश पाश्चर कांच विंदुक का प्रयोग, धीरे नीचे 5-10x ऊपर pipetting और से ऊतकों triturate. राइट विचूर्णन के बाद, (10% FBS, 2 मिमी Glutamax, 2% B27 साथ Neurobasal) मध्यम चढ़ाना 2 मिलीलीटर के साथ trypsin बुझाना.
  4. नीचे करने के लिए बसने के ऊतकों के किसी भी मलबे अनुमति देने के लिए 5 मिनट के लिए हुड में नमूना छोड़ दें. ध्यान से गोली कोशिकाओं के 5 मिनट के लिए 200 XG पर एक साफ बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सतह पर तैरनेवाला के 2 मिलीलीटर हटा दें. 50 μl चढ़ाना मीडिया में गोली Resuspend
  5. Hemocytometer साथ कोशिकाओं की गणना. लोड microfluidic चैम्बर के एक डिब्बे में 15-20 μl सेल निलंबन (~ 40,000 कोशिकाओं). चैम्बर रखेंइनक्यूबेटर में 10 मिनट कोशिकाओं coverslip को संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए के लिए. 10 मिनट के बाद, चैंबर के दोनों डिब्बों को भरने के लिए अधिक चढ़ाना मीडिया जोड़ें.
  6. विच्छेदन के दूसरे दिन, पूरी तरह से सेल शरीर और अक्षतंतु डिब्बे दोनों में (2 मिमी Glutamax, 2% B27 साथ Neurobasal) रखरखाव मीडिया के साथ चढ़ाना मीडिया की जगह. Hippocampal न्यूरॉन्स से axons दिन 3 में microgrooves पार और सुबह 5-7 के बीच अक्षतंतु डिब्बे तक पहुँचने के लिए शुरू करते हैं. समय की इस अवधि के दौरान, ताजा रखरखाव मीडिया हर 24 ~ 48 घंटा के साथ संवर्धन मीडिया के आधे की जगह.

QD-BDNF का 4 Axonal परिवहन

  1. , QD-BDNF axonal परिवहन की इमेजिंग रहते microfluidic चैंबर के सेल शरीर और अक्षतंतु दोनों डिब्बों से BDNF खलाना करने से पहले अच्छी तरह से 2 घंटे के लिए BDNF मुक्त, सीरम मुक्त Neurobasal मीडिया हर 30 मिनट के साथ दोनों डिब्बों कुल्ला.
  2. BDNF कमी के दौरान, QD-BDNF conjugates तैयार करते हैं. मोनो biotinylated बी के 50 एनएम मिक्सएनएफ Neurobasal मीडिया में 50 एनएम QD655-streptavidin conjugates साथ डिमर और 60 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  3. अक्षतंतु डिब्बे में मीडिया निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए 0.25 एनएम के अंतिम एकाग्रता के साथ 300 μl QD-BDNF जोड़ें. सेल शरीर डिब्बे में QD-BDNF का diffusing को कम करने के लिए, यह हमेशा अक्षतंतु डिब्बे में से सेल शरीर के डिब्बे में मीडिया के एक उच्च स्तर को बनाए रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. लाइव इमेजिंग से पहले ऊष्मायन के बाद अपार QD-BDNF बंद धो लें.
  4. एक 100X तेल उद्देश्य लेंस से लैस एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग QD-BDNF परिवहन के लाइव इमेजिंग बाहर ले. गुंजाइश है और एक लगातार तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) और सीओ 2 (5%) करने के लिए इसे से जुड़े पर्यावरण कक्ष गरम. QD655 संकेत कल्पना करने के लिए टेक्सास लाल / उत्तेजना उत्सर्जन cubes के एक सेट का उपयोग करें.
  5. मोल और एक सीसीडी कैमरे का उपयोग कर 2 मिनट के लिए कुल 1 फ्रेम / सेकंड की गति से मध्यम axons भीतर समय चूक छवियों पर कब्जा. कोई axons साथ उपयोग microgrooves थाटी कोई QD और इसलिए घुसपैठ के लिए एक नियंत्रण के रूप में कोई संकेत नहीं है.
  6. किसी भी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर या एनआईएच ImageJ का उपयोग BDNF परिवहन का विश्लेषण करें.

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Representative Results

उत्पादन और जैविक रूप से सक्रिय मोनो biotinylated BDNF का शोधन

एक AviTag अनुक्रम (GGGLNDIFEAQKIEWHE) के साथ जुड़े हुए BDNF की अभिव्यक्ति वेक्टर एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 10 के अनुसार बनाया गया था. पूरी लंबाई संलयन प्रोटीन की आणविक जन ~ 32 केडीए (होने की भविष्यवाणी की थी http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) 18 केडीए (चित्रा 1 ए) की एक भविष्यवाणी की आणविक जन के साथ Monobiotinylated परिपक्व BDNF उत्पादन किया गया था वातानुकूलित मीडिया से HEK293FT कोशिकाओं में और शुद्ध 10 वर्णित है.

विभिन्न भागों एकत्र और एक 15% एसडीएस पृष्ठ पर अलग हो गए थे. एक खरगोश विरोधी एवी टैग एंटीबॉडी, 18 केडीए पहला अंश (चित्रा 1 बी) में पाया गया था ~ के एक आणविक वजन के साथ एक बैंड का उपयोग करना. तैयारी की शुद्धता का परीक्षण करने के लिए, नमूने एसडीएस पृष्ठ पर अलग हो गए थे और एस द्वारा दाग थेilver धुंधला हो जाना. चित्रा 1C में दिखाया गया है, 18 केडीए बैंड पहली क्षालन में प्रमुख प्रजातियों था. Streptavidin-agarose मोती पुलडाउन assays mBtBDNF तैयारी की biotinylation की सीमा का आकलन करने के लिए प्रदर्शन किया गया. Streptavidin-agarose मोती के साथ pulldown के बाद सतह पर तैरनेवाला में बने प्रोटीन है कि 7% trichloroacetic एसिड (टीसीए) के साथ उपजी गया. इन नमूनों एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया और दाग biotinylated प्रोटीन का पता लगाने के लिए कुल प्रोटीन या एचआरपी streptavidin पता लगाने के लिए या तो विरोधी एवी एंटीबॉडी (शीर्ष) के साथ जांच कर रहे थे. हमारे परिणाम नहीं बैंड सतह पर तैरनेवाला (चित्रा -1) में पाया गया था, जबकि सभी संकेतों मोतियों के साथ जुड़े थे कि दिखाया गया है. हम इस प्रकार mBtBDNF दक्षता> 99.9% पर biotinylated था कि समाप्त.

बंधन और TrkB रिसेप्टर को सक्रिय करने में mBtBDNF की जैविक गतिविधि का परीक्षण करने के लिए, हम एक 3T3 सेल rhBDNF (20 एनजी / एमएल) के साथ या तो TrkB व्यक्त कि लाइन या पुर इलाजified mBtBDNF 10 मिनट के लिए (20 एनजी / एमएल). कोई उपचार प्राप्त है कि कोशिकाओं को भी नियंत्रण के रूप में एकत्र किए गए थे. Lysates एक 4-12% एसडीएस पृष्ठ पर अलग हो गए थे और एक खरगोश विरोधी pTrkB एंटीबॉडी phosphorylated TrkB की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया था. RhBDNF के समान चित्रा 1E, में दिखाया गया है, mBtBDNF एक समान स्तर पर TrkB के फास्फारिलीकरण प्रेरित करने में सक्षम था. हम भी rhBDNF (20 एनजी / एमएल) या 48 घंटे के लिए शुद्ध mBtBDNF (20 एनजी / एमएल) के साथ या तो चूहे hippocampal न्यूरॉन्स का इलाज किया. शुद्ध mBtBDNF rhBDNF (चित्रा 1F) की सीमा तक हिप्पोकैम्पस neurite परिणाम को प्रोत्साहित करने में सक्षम था. TrkB रिसेप्टर के साथ QD-BDNF के सह स्थानीयकरण की जांच करने के लिए, QD-BDNF 37 में 4 घंटे के लिए हिप्पोकैम्पस अक्षतंतु चूहे को जोड़ा गया डिग्री सेल्सियस. न्यूरॉन्स तो तय है और TrkB के लिए immunostained गया. चित्रा 1G में दिखाया गया है, QD-BDNF TrkB साथ सह स्थानीयकृत. हम इस प्रकार mBtBDNF अपने जैविक समारोह में पूरी तरह से सक्रिय है कि समाप्त.

QD-BDNF मैं की Axonal परिवहन के लाइव इमेजिंगn hippocampal न्यूरॉन्स

प्राथमिक भ्रूण चूहे hippocampal न्यूरॉन्स (E17-18) विच्छेदित और microfluidic चैंबर के सेल शरीर डिब्बे में चढ़ाया गया. दिन 4 या 5 में, axons अक्षतंतु डिब्बे में microgrooves भर बढ़ाया. सुबह 7 बजे, सबसे axons अक्षतंतु डिब्बे में वृद्धि हुई. 1 घंटे के लिए बर्फ में: 1 अनुपात (BDNF डिमर QD:) QD-BDNF एक 1 पर mBtBDNF साथ streptavidin QD655 incubating द्वारा किया गया था. QD-BDNF (0.25 एनएम) तो अक्षतंतु डिब्बे में जोड़ा और 37 डिग्री सेल्सियस इमेजिंग के लिए पहले (2A चित्रा) में 4 घंटे के लिए incubated था.

ऊष्मायन के बाद, QD-BDNF अक्षतंतु डिब्बे में axons करने के लिए विशेष रूप से बाध्य करने के लिए मिला था. सेल शरीर कम्पार्टमेंट में, QD संकेतों समीपस्थ axons और QD-BDNF axons पर भली भाँति और प्रतिगमनपूर्वक सेल शरीर के लिए ले जाया गया था का संकेत सेल शरीर के अधिकांश में संचित थे. Axons भीतर QD-BDNF संकेतों के समय चूक छवि श्रृंखला microgrooves में किए गए. QD हैकोई QD संकेत सेल शरीर कम्पार्टमेंट (चित्रा 2 बी) को अक्षतंतु डिब्बे से QD संकेत के कम या कोई प्रसार का संकेत axons की अनुपस्थित में microgrooves में देखा जा सकता है, जबकि ignals axons साथ microgrooves से ज्यादातर में मनाया गया.

चित्रा -2 में, hippocampal न्यूरॉन्स के axons की एक 80 माइक्रोन लंबे खंड fluorescently 100 सेकंड के लिए दर्ज किए गए. 6 QD-BDNF संकेतों की कुल स्पष्ट रूप से वीडियो रिकॉर्डिंग के दौरान देखा गया था. दर्ज तीन QD संकेतों सेल शरीर (बाईं ओर) की ओर unidirectionally चले गए. सफेद तीर द्वारा लेबल QD घटना (टी: 31 सेकंड टी करने के लिए: 101 सेकंड) ~ 70 सेकंड में पूरे क्षेत्र को पार सेल शरीर को सुचारू रूप से चले गए. (: टी 1 सेकंड: टी 61 सेकंड) हरी तीर द्वारा लेबल एक और QD घटना पहली प्रतिगमनपूर्वक चले गए. टी में: 21 सेकंड, QD-BDNF 20 सेकंड के लिए 10 के लिए anterogradely ले जाया गया, और फिर सेल शरीर के प्रति फिर से दिशा बदल दी. पीले तीर द्वारा लेबल QD घटना (टी: 1 सेकंड टन तक: 71 सेकंड) भी retrograd ले जाया गया इली, लेकिन आंदोलन के दौरान 20 सेकंड ~ के लिए रोक दिया है. इस 100 सेकंड के दौरान हिल नहीं रहे थे कि QD-BDNFs स्थिर माना जाता था. केवल चलती वस्तुओं बाद में आगे बढ़ वेग, औसत वेग की गणना करने के लिए विश्लेषण किया, और समय रोका गया.

QD-BDNF परिवहन kymograph में डेटा विश्लेषण

Kymographs Metamorph सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दर्ज प्रत्येक फिल्म से बनाए गए थे. QD-BDNF परिवहन (छवि 3 ए) के प्रतिनिधि kymographs में दिखाया गया है, QD-BDNF आंदोलनों axons की एक 80 माइक्रोन लंबे खंड में 120 सेकंड के दौरान दर्ज किए गए. प्रतिनिधि kymograph 1 में, QD-BDNF, बहुत ही संक्षिप्त विराम देता है (वीडियो S1 सहायक) के साथ, ~ 60 सेकंड में क्षेत्र (80 माइक्रोन) को पार कर छोड़ दिया (सेल शरीर) की ओर तेजी से और आसानी से ले जाया गया. प्रतिनिधि kymograph 2 में, एक QD-BDNF कूच जबकि ~ 50 माइक्रोन प्रतिगमनपूर्वक सेकंड, अब रुक जाता है की कम से कम तीन क्षेत्रों के साथ (तीर द्वारा संकेत) 120 में (वीडियो S2 सहायक).

सामग्री "> चित्रा 3B वेग, औसत वेग बढ़ने की तितर बितर साजिश है, और प्रत्येक एकल QD-BDNF का समय रुका हुआ है. QD-BDNF की रफ़्तार का मतलब के साथ 0.47-1.97 माइक्रोन / सेकंड से लेकर अपेक्षाकृत तेजी से गया था 1.06 ± 0.05 माइक्रोन / सेक. QD-BDNF का औसत वेग दूरी / समय का इस्तेमाल यात्रा के रूप में गणना की गई. और BDNF इसके परिवहन के दौरान रुका हुआ है, क्योंकि औसत वेग 0.48 ± 0.03 माइक्रोन / सेकंड का मतलब के साथ वेग से आगे बढ़ तुलना में काफी कम थी (लेकर 0.17-1.59 माइक्रोन / सेकंड) से. रोका गया समय भी BDNF आंदोलन का एक लक्षण के रूप में विश्लेषण किया गया था. pauses का मतलब अवधि 6-33 सेकंड से लेकर 15.88 ± 1.30 सेकंड () (1 टेबल) था.

चित्रा 1
सक्रिय जैविक 1. शोधन, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) चित्रा. (ए) एक योजनाबद्ध ड्राइंग mBtBDNF के उत्पादन से पता चलता है. पूर्व proBDNFavi और बीरा दोनों वर्णित के रूप में 10 pcDNA3.1myc-उसकी वेक्टर में क्लोन किया गया. नी राल से elutes (बी) विभिन्न भागों एकत्र और एक 15% एसडीएस पृष्ठ जेल पर अलग हो गए थे. एक खरगोश विरोधी एवी टैग एंटीबॉडी दाग ​​में इस्तेमाल किया गया था. ~ 18 केडीए के एक स्पष्ट आणविक वजन के साथ एक बैंड परिपक्व mBtBDNF प्रोटीन के लिए भविष्यवाणी की आणविक जन के साथ संगत Elute में मान्यता दी गई थी. (ग) एक चांदी धुंधला जेल 18 केडीए mBtBDNF क्षालन अंश में प्रमुख प्रजातियों था दिखाता है. (डी) शुद्ध mBtBDNF streptavidin-agarose मोती के साथ incubated था. मोती धोया और सतह पर तैरनेवाला एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण करने से पहले टीसीए साथ उपजी थी, जबकि एसडीएस लोड हो रहा है बफर में उबला हुआ थे. दाग या तो विरोधी एवी एंटीबॉडी के साथ या एचआरपी streptavidin के साथ जांच की गई थी. शुद्ध mBtBDNF या rhBDNF (ई) 20 एनजी / एमएल एक 3T3 सेल लाइन है कि ई करने के लिए जोड़ा गया था10 मिनट के लिए TrkB xpresses. Lysates काटा और एक 4-12% एसडीएस पृष्ठ पर अलग हो गए थे. नियंत्रण सेल lysate भी विश्लेषण किया गया था. दाग एक खरगोश विरोधी pTrkB एंटीबॉडी के साथ जांच की गई थी. कुल TrkB एक माउस विरोधी TrkB एंटीबॉडी का उपयोग कर पता चला था. शुद्ध mBtBDNF या rhBDNF की (एफ) 20 एनजी / एमएल 48 घंटे के लिए hippocampal न्यूरॉन्स चूहे को जोड़ा गया है. डीआईसी छवियों neurite परिणाम का विश्लेषण करने के लिए ले जाया गया. (जी) QD-BDNF 4 घंटा (पैमाने बार 5 माइक्रोन) के लिए चूहे के हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन axons साथ incubated था. न्यूरॉन्स तो तय है और TrkB के लिए immunostained गया.

चित्रा 2
. चित्रा 2 axons में QD-BDNF का प्रतिगामी परिवहन के एकल अणु इमेजिंग (ए) शीर्ष दृश्य: सेल शरीर डिब्बे में चढ़ाया प्राथमिक न्यूरॉन्स के साथ microfluidic चैंबर के एक योजनाबद्ध ड्राइंग. Axons microg भर में बढ़ीअक्षतंतु डिब्बे में rooves. QD655 लेबल BDNF अक्षतंतु डिब्बे में जोड़ा गया था. साइड देखें: अक्षतंतु डिब्बे में मीडिया स्तर QD संकेत के प्रसार को कम करने के लिए सेल शरीर डिब्बे की तुलना में कम रखा गया था. (बी) लाल प्रतिदीप्ति छवियों और सेल शरीर डिब्बे, microgrooves और अक्षतंतु डिब्बे की डीआईसी छवियों. QD-BDNF, axons करने के लिए विशेष रूप से बाध्य भाँति, और प्रतिगमनपूर्वक axons साथ सेल शरीर में पहुंचा दिया. कोई QD संकेत axons के अनुपस्थित microgrooves में मनाया गया. (सी) अक्षतंतु साथ QD-BDNF परिवहन के समय चूक वीडियो छवि श्रृंखला. दोनों चल रहा है और स्थिर QD-BDNF संकेतों फिल्मों के अधिकांश में मौजूद थे. समय टी: 1 सेकंड, कम से कम 4 QDs देखा जा सकता है. 10 सेकंड के बाद, दो QDs (हरे और पीले तीर द्वारा संकेत) (छवि के बाएं) सेल शरीर की ओर बढ़ रहे हैं. इन दो QDs कदम है और पहले दो छवियों में थामने के लिए और अंततः (70 सेकंड ~ पर) बाईं ओर छवियों से बाहर कदम. एक अन्य QD क्षेत्र में ले जाया गयाटी में: 31 सेकंड (सफेद तीर द्वारा संकेत) और बाईं ओर ज्यादा pauses बिना जल्दी चले गए.

चित्रा 3
चित्रा 3 QD-BDNF परिवहन kymograph और डेटा विश्लेषण. (ए) प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स में QD-BDNF परिवहन के प्रतिनिधि kymographs. Kymo 1 में, एक उज्ज्वल QD केवल कुछ ही रुक जाता है के साथ अपेक्षाकृत तेज गति से क्षेत्र भर में ले जाया गया. Kymo 2 में, QDs की रफ़्तार धीमी थी, और आंदोलन और अधिक लगातार और लंबे समय तक रुक जाता है साथ बाधित किया गया था. वेग से आगे बढ़ QD-BDNF (बी) तितर बितर साजिश, और (प्रयुक्त दूरी / समय यात्रा के रूप में गणना) औसत वेग समय रुका हुआ है. QD-BDNF का मतलब रफ़्तार 0.47-1.97 माइक्रोन / सेकंड से लेकर 1.06 ± 0.05 माइक्रोन / सेक (था. QD-BDNF का औसत वेग 0 से लेकर ± 0.03 माइक्रोन / सेक (0.48 था. 17-1.59 माइक्रोन / सेक). pauses का मतलब अवधि (6-33 सेकंड से लेकर) 15.88 ± 1.30 सेकंड था.

वीडियो S1 सहायक . प्रतिनिधि QD-BDNF परिवहन वीडियो 1 कई QD-BDNF बहुत कुछ ही रुक जाता है के साथ बाईं ओर (सेल शरीर) की ओर तेजी से कदम.

वीडियो S2 सहायक . प्रतिनिधि QD-BDNF परिवहन वीडियो 2. कई QD-BDNF लगातार और लंबी pauses के साथ बाईं ओर (सेल शरीर) की ओर अपेक्षाकृत धीमी गति से चलते हैं.

88px;. "> सामान्य त्रुटि
न्यूनतम अधिकतम मीन
वेग स्थानांतरण (माइक्रोन / सेक) 0.47 1.97 1.06 0.05
औसत वेग (माइक्रोन / सेक) 0.17 1.59 0.48 0.03
रुका हुआ समय (सेकंड) 6 33 15.88 1.30

QD-BDNF परिवहन की तालिका 1 डाटा विश्लेषण.

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Discussion

इस अध्ययन में, हम जैविक रूप से सक्रिय निर्माण करने के लिए एक उपन्यास तकनीक के विकास रिपोर्ट, BDNF की axonal परिवहन पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि BDNF (mBtBDNF) monobiotinylated. क्वांटम डॉट streptavidin के लिए प्रोटीन conjugating, और एक microfluidic कक्ष का उपयोग करके, विधि एक वास्तविक समय में और स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ एक अणु संवेदनशीलता के साथ प्राथमिक न्यूरॉन्स में BDNF की axonal परिवहन पता लगाने के लिए अनुमति देता है. इस के साथ साथ प्रयुक्त उपकरण स्वास्थ्य और रोग में न्यूरॉन्स में BDNF / TrkB संकेत endosomes की axonal परिवहन मध्यस्थता कि आणविक मशीनों का अध्ययन करने के लिए है जिसके द्वारा एक साधन प्रदान करते हैं.

BDNF GFP, या -mCherry विट्रो में विभिन्न neuronal संस्कृतियों में BDNF की axonal आंदोलन को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन अभिकर्मकों TrkB की autocrine सक्रियण की जांच के लिए, संभवतः, अग्रगामी परिवहन की जांच के लिए एक विकल्प प्रदान करते हैं. हालांकि, whi की प्रतिगामी परिवहन के अध्ययन के लिए, सबसे प्रमुख प्रमुख कमियां हैंचर्चा GFP या mCherry एक अणु के अध्ययन के लिए काफी उज्ज्वल नहीं हो रहा है. पूर्व के अध्ययन NGF के शारीरिक सांद्रता के तहत, एक एकल NGF डिमर 11 भाँति और प्रतिगमनपूर्वक 8 जाया गया था कि पता चला है. महत्वपूर्ण बात है, QD BDNF का उपयोग भी एक BDNF अपने TrkB रिसेप्टर्स बांध जिस पर subcellular स्थान को परिभाषित करने की अनुमति देता है. GFP या mCherry टैग प्रोटीन का उपयोग करते हुए, somal अभिव्यक्ति अग्रगामी दौर से गुजर प्रोटीन की अक्षतंतु के भीतर उपस्थिति में और अच्छी तरह से प्रतिगामी परिवहन के रूप में परिणाम होगा. प्रतिगमनपूर्वक जाया BDNF परिवहन प्रतिगामी को अपने रिसेप्टर पूर्व का सामना करना पड़ा है या नहीं, या जहां जैसे, यह आकलन करना मुश्किल हो सकता है. दरअसल, एक अटकलें के रूप में, BDNF-GFP या BDNF-mCherry के axons भीतर प्रतिगामी परिवहन तंत्रिका वितरण के लक्ष्य में BDNF की कि निम्न बंधन से अलग हो सकता है एक ही न्यूरॉन में उत्पादन किया.

रासायनिक crosslinking जैविक रूप से सक्रिय तंत्रिका वृद्धि कारक के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया है(NGF), के साथ साथ शुरू की विधि से बेहतर है. सबसे पहले, यह ठीक biotinylation की हद तक नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है; उदाहरण के लिए, प्रत्येक NGF 5-9 बायोटिन moieties 8,9,12 के साथ चिह्नित किया गया. दूसरे, crosslinking प्रोटीन निष्क्रिय कर सकते हैं. NGF के मामले में, crosslinking carboxyl समूहों से 13 लगाव जरूरी हो गया. BDNF के मामले में, गतिविधि अक्सर बायोटिन को रासायनिक crosslinking निम्नलिखित खो दिया है. अंत में, crosslinking की हद तक अधूरा हो सकता है. एक ताजा रिपोर्ट से पता चला है कि ~ 0.8 बायोटिन / BDNF अणु रासायनिक crosslinking द्वारा तैयार की गई थी; जैसे ~ BDNF का 20% 9 लेबल नहीं था. लेबल हटाया गया BDNF की उपस्थिति परिणामों की व्याख्या उलझा सकता है.

हमारी तकनीक BDNF अणुओं सभी इस प्रकार biotinylated BDNF का एक सजातीय तैयारी का गठन, एक ही स्थल पर एक भी बायोटिन के साथ चिह्नित कर रहे हैं कि अद्वितीय लाभ प्रदान करता है. जैसे क्वांटम डॉट्स के रूप में nanofluorescent कणों को conjugating करके, mBtBDNF हो सकता हैaxons में और साथ ही सेल शरीर में, डेन्ड्राइट में: BDNF भाँति है कि रास्ते और प्रक्रियाओं, न्यूरॉन्स के भीतर अवैध व्यापार पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया. इस विधि BDNF के लिए वैकल्पिक टैग का उपयोग संभव बनाता है. नैनोकणों के अन्य प्रकार के विकास के अतिरिक्त लाभ का वादा किया.

Axonal तस्करी और BDNF का संकेत में दोष neurodegenerative रोगों में फंसाया गया है. पुख्ता सबूत हंटिंग्टन रोग 14,15 में cortical-striatal शोष को BDNF की दोषपूर्ण परिवहन से जोड़ दिया है. उत्परिवर्ती हनटिंग्टन प्रोटीन हनटिंग्टन जुड़े प्रोटीन -1 (HAP1) और सहानुभूति न्यूरॉन्स में dynein मोटर के बीच बातचीत के साथ हस्तक्षेप, BDNF परिवहन रोकता है, और neurotrophic समर्थन और neuronal विषाक्तता 16-18 के नुकसान में परिणाम है. BDNF की ट्रैकिंग axonal आंदोलन की हमारी तकनीक neurodegenerative विकारों में axonal समारोह के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हम उनके तकनीकी सहायता के लिए यू (पॉलीन) हू, राहेल Sinit धन्यवाद देना चाहूंगा. अध्ययन एनआईएच अनुदान (PN2 EY016525) द्वारा और डाउन सिंड्रोम अनुसंधान और उपचार फाउंडेशन और लैरी एल Hillblom फाउंडेशन से धन के द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Platinum pfx DNA polymerase  Invitrogen 11708021
EcoRI  Fermentas FD0274
BamHI  Fermentas FD0054
HEK293FT cells Invitrogen R70007
DMEM-high glucose media Mediatech 10-013-CV
D-biotin  Sigma B4639
TurboFect  Fermentas R0531
PMSF   Sigma P7626
Aprotinin Sigma A6279
Ni-NTA resins Qiagen 30250
Protease inhibitors cocktail Sigma  S8820
Silver staining kit  G-Biosciences 786-30
Human recombinant BDNF Genentech
Microfluidic chambers Xona SND450
24 x 40 mm No. 1 glass coverslips  VWR 48393-060
Poly-L-Lysine  Cultrex 3438-100-01
HBSS Gibco 14185-052
DNase I Roche 10104159001
Trypsin Gibco 15090-046
Neurobasal  Gibco 21103-049
FBS  Invitrogen 16000-044
GlutaMax  Invitrogen 35050-061
B27   Gibco 17504-044
QD655-streptavidin conjugates Invitrogen  Q10121MP
anti-Avi tag antibody GenScript A00674
streptavidin-agarose beads  Life Technology  SA100-04
Trichloroacetic acid Sigma T6399
HRP-streptavidin  Thermo Scientific N100
anti-pTrkB antibody a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody BD Science 610101

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References

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