استراتيجيات لتتبع القيامة، خلية بقاء ظاهرة التي عكس موت الخلايا المبرمج

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

القيامة (اليونانية ل "ارتفاع في الحياة") يشير إلى انتعاش الخلايا الميتة. قبل هذه الخلايا على التعافي، وأنها مرت عبر نقاط التفتيش مهمة من موت الخلايا المبرمج، بما في ذلك تجزئة الميتوكوندريا، وإطلاق سراح من الميتوكوندريا السيتوكروم ج في العصارة الخلوية، وتفعيل caspases، والتكثيف لونين، الحمض النووي من التلف، والتجزؤ النووي، blebbing غشاء البلازما، وانكماش الخلايا، والتعرض سطح الخلية من فسفاتيديل، وتشكيل هيئات أفكارك. يمكن أن يحدث القيامة عندما تتم إزالة المثيرات أفكارك قبل الموت، مما يسمح الخلايا الميتة لعكس موت الخلايا المبرمج وآليات الموت يحتمل الأخرى. لذلك، يظهر القيامة لإشراك عمليات الشفاء الفسيولوجية التي يمكن أيضا أن الحفاظ على الخلايا التالفة بشكل غير لائق. وظائف وآليات القيامة لا تزال غير واضحة، عرقل في جزء من أدوات محدودة للكشف عن الأحداث الماضية بعد التعافي من خلايا سليمة ظاهريا. استراتيجيات للكشف عن anastaوجهاز الأمن والمخابرات تمكين دراسات الآليات الفسيولوجية، والمخاطر الخلايا أوندد في علم الأمراض المرض، والعلاجات المحتملة لتعديل القيامة. هنا، نحن تصف استراتيجيات فعالة باستخدام المجهر الخلايا الحية وجهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس الثدييات لتحديد وتتبع القيامة في خلايا الثدييات.

Introduction

موت الخلايا المبرمج (اليونانية ل "يسقط إلى الموت") يفترض عموما أن يكون عملية ذات اتجاه واحد تنتهي في خلية انتحارية 1-7. اضطراب وراثي للجينات النتائج المؤيدة للوفاة في بقاء الخلايا الإضافية التي من شأنها أن يموت على خلاف ذلك في الحيوانات كلها، بما في ذلك الخلايا التي بدأت بالفعل 8،9 مسار موت الخلايا المبرمج. وبالمثل، التلاعب الجيني تسمح خلايا الثدييات الصحية التي تعرض بشكل مصطنع "أكل لي" إشارات أو التي تفقد الإلتصاق إلى مصفوفة من خارج الخلية إلى الهروب الموت البلعمة خلية كاملة أو entosis، على التوالي 10،11. ومع ذلك، نحن وغيرنا قد أظهرت أنه من دون التلاعب الجيني خلايا الثدييات صحية طبيعية وخطوط الخلايا يمكن أيضا استرداد من المراحل المبكرة من موت الخلايا المبرمج 12-15. استخدام أدوات لتتبع الخلايا الفردية، ولقد أثبتت مزيد من التعافي من المراحل المتأخرة من موت الخلايا المبرمج 12،13، بعد مرور خلايا نقاط التفتيش الهامة التي نموذجيةلاي بمناسبة "نقطة اللاعودة" 2-6. وتشمل هذه الحواجز من أواخر مرحلة موت الخلايا المبرمج الإفراج الميتوكوندريا من السيتوكروم ج، وتفعيل caspases، والتجزؤ النووي، وتشكيل هيئات أفكارك. اعتمدنا كلمة مركبة اليونانية "القيامة"، وهو ما يعني "ارتفاع في الحياة"، لوصف هذا عكس موت الخلايا المبرمج على شفا موت الخلية 2-6.

إلا إذا لوحظ عملية استرداد الموت بأكملها من خلال تصوير الخلايا الحية، فإنه يمثل تحديا للتمييز الخلايا التي خضعت القيامة من الخلايا التي لم يشهد الأحداث أفكارك. وقد كشفت عقود من العمل أن السمات المورفولوجية للانتحار الخلية عن طريق الخلايا هي التي تحرك الأحداث البيوكيميائية والجزيئية الحفظ تطويريا 16-19. هذه الأحداث تعزز التدمير الذاتي للخلايا لتنظيم العمليات التنموية وhomoeostatic في الكائنات وحيدة الخلية ومتعددة الخلايا من خلال القضاء على تلف أو دخلايا angerous 16-19. في حين أن الخلايا أفكارك يمكن تمييزها بسهولة من المظاهر الشكلية، والكيمياء الحيوية والجزيئية موحدة للموت الخلايا المبرمج 1،5،6،16،20، حاليا لا يوجد أي علامة معروفة محددة لالقيامة 12،13. الأهم من ذلك، تظهر الخلايا التي خضعت القيامة لتكون الخلايا السليمة العادية، والخلايا التي تبدأ فقط عكس موت الخلايا المبرمج تظهر الخلايا أفكارك كما الموت 12،13. وبالتالي، هناك حاجة إلى أدوات جديدة لإبرام مع اليقين أن خلية على قيد الحياة نظرا قد شهدت في السابق عمليات أفكارك النشطة.

ويفترض موت الخلايا المبرمج عموما باعتباره سلسلة لا رجعة فيها لأنها عملية التدمير السريعة والواسعة النطاق. في حين ان الامر قد يستغرق دقائق إلى أيام لبعض الخلايا لبدء موت الخلايا المبرمج، بمجرد الإفراج الميتوكوندريا عوامل apoptogenic مثل السيتوكروم ج في العصارة الخلوية 21،22، يمكن تنشيط caspases خلال 5 دقائق 23،24، تليها حشوية والتكثيف النووي في غضون 10 دقيقة 25-27، وموت الخلايا بعد ذلك بوقت قصير 25-27. caspases تنشيط الانسجام موت الخلايا المبرمج من قبل الشق وتعطيل المكونات الهيكلية والوظيفية الرئيسية لغرض هدم الخلوي 2،28، مثل مثبطات نوكلياز داخلية DFF45 / ICAD 29،30. أيضا تفعيل Caspases العوامل المؤيدة لأفكارك، مثل BID عضو BCL-2 الأسرة، التي translocates إلى الميتوكوندريا لتعزيز الإفراج الميتوكوندريا من السيتوكروم ج 31،32. النتائج النشاط كاسباس أيضا في التعرض سطح الخلية من فسفاتيديل بأنه "أكل لي" إشارة لتعزيز ابتلاع الموت الخلايا الضامة أو الخلايا المجاورة من خلال 33 البلعمة. وعلاوة على ذلك، والأحداث أفكارك تجعل الميتوكوندريا المختلة وظيفيا، وتعطيل الطاقة الحيوية الخلوية والتمثيل الغذائي 34،35،36. وهكذا، يبدو من غير المحتمل بشكل حدسي الشفاء من هذا التدمير.

وعلى عكس الأصلي نتوقعations، يمكن للخلايا عكس عملية موت الخلايا أفكارك حتى في مرحلة متأخرة. من خلال المراقبة المستمرة مصير الموت الخلايا في الثقافة، لاحظنا عكس من أواخر مرحلة موت الخلايا المبرمج في مجموعة من الخلايا الأولية وخطوط الخلايا 12،13. إزالة الحوافز الموت سمحت التعافي من الميزات العلنية من موت الخلايا المبرمج، مثل تجزئة الميتوكوندريا، والتكثيف لونين، الحمض النووي من التلف، والبلازما blebbing الغشاء، والتعرض سطح الخلية من فسفاتيديل، وإطلاق سراح من الميتوكوندريا السيتوكروم ج، وتفعيل كاسباس، والتجزؤ النووي، انكماش الخلية، وتشكيل هيئات أفكارك. هذه الملاحظات تثير علامات الاستفهام بشأن الوظائف، والعواقب، وآليات القيامة. لمعالجة هذه المسائل، وهو شرط أساسي هو تحديد موثوق الخلايا التي خضعت القيامة. هنا، نحن تصف أساليب الفحص المجهري المباشر وجهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس للكشف عن الخلايا التي قد عكس في السابق أواخر مرحلة موت الخلايا المبرمج والعشريننجا أون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الخلايا ليعيش التصوير خلية

  1. لتسهيل الكشف عن التغيرات المورفولوجية، واختيار الخلايا الملتصقة مثل هيلا (سرطان عنق الرحم البشري) الخلايا التي هي شقة على الركيزة لتصور أفضل تغيير في غشاء البلازما وعضيات داخل الخلايا.
    ملاحظة: وقد لوحظ عكس موت الخلايا المبرمج في مختلف خلايا الثدييات 12،13، بما في ذلك خلايا الكبد الماوس الأساسي، الضامة الماوس الأولية، والعضلية الفئران الأولية، وأيضا بخلية خطوط مثل الخلايا HEK-293T الإنسان الكلى الجنينية، القرد الأخضر COS الظهارية الكلوية الأفريقية -7 الخلايا، الماوس عضلة القلب HL-1 الخلايا، الخلايا الليفية الماوس NIH 3T3، النمس (موستيلا putoris فرو) خلايا الدماغ CRL1656، وخلايا سرطان الجلد a375 الأزياء الإنسان، خلايا CRL1973 سرطان الخصية الإنسان، خلايا سرطان الرئة H446 زنزانة صغيرة الإنسان، وسرطان الكبد البشري خلايا HepG2، وخلايا MCF7 سرطان الثدي البشرية، وخلايا PC3 سرطان البروستاتا البشرية، والعصبية خلايا SH-SY5Y الإنسان.
  2. coverslips الزجاج قبل غسل الزجاج أطباق زراعة الخلايا السفلى مع الايثانول المطلق لتنظيف وتعقيم.
    ملاحظة 1: استخدام أطباق الزجاج السفلي من المستحسن للحصول على جودة عالية تدخل الفرق النقيض (DIC) المجهري، وارتفاع التكبير أو متحد البؤر المجهري برنامج التحصين الموسع ومضان (انظر مناقشة).
    ملاحظة 2: لتكبير عالية (40X، 60 / 63X أو 100X الأهداف وفتحات العددية عالية 1.3 أو 1.4)، واستخدام أطباق زراعة الخلايا مع أرق أسفل الزجاج (سمك 0،085-،16 ملم) يوفر مسافات أطول للتصوير العمل (انظر بروتوكول 3 ).
  3. اعتمادا على نوع من الخلايا، قد تتطلب الزجاج أطباق الثقافة أسفل الطلاء مع بولي د يسين (0.1 ملغ / مل)، والكولاجين (الحل 0.01٪ في 0.01 M حمض الخليك) و / أو فبرونيكتين (5 ميكروغرام / مل) قبل البذر الخلايا.
    ملاحظة: مطلوب التحسين من نوع وتركيز عامل طلاء لخطوط مختلفة من الخلايا. خلايا هيلا يمكن أن تنضم مباشرة على الزجاج دون تغطية. ومع ذلك، بعض الخلايا، سوالفصل كما الماوس عضلة القلب HL-1 الخلايا، لا يمكن الانضمام مباشرة إلى الواجهات الزجاجية، ولكنها تتطلب بروتوكولات الثقافة وطلاء محددة 37.
  4. البذور ~ 2-3 × 10 5 الخلايا على 35 ملم الزجاج قبل المغلفة أطباق زراعة الخلايا السفلية واحتضان عند 37 درجة مئوية (° C) مع CO 2 5٪ لمدة يوم لتحقيق 80٪ confluency.
    ملاحظة 1: يمكن أن تختلف الظروف المثلى من كثافة الخلايا، والوقت الحضانة، وحالة الثقافة، وهذا يتوقف على نوع من الخلايا. الخلية confluency يمكن أن تؤثر على استجابة أفكارك من الخلايا (انظر بروتوكول 2). في confluency عالية، ويمكن أن يكون أقل حساسية الخلايا لنفس تركيزات من المحفزات أفكارك.
    ملاحظة 2: تجنب الإفراط في خلايا متكدسة، وكثافة الخلايا عالية يمكن أن تحجب التغيرات المورفولوجية من الخلايا الفردية والعضيات بهم.

2. تطبيق وإزالة أفكارك خلية المحفزات

  1. قبل وقت قصير من استخدامها، قبل المزيج الوكيل الذي يحفز الخلايا مع 37 ° C مستنبت الخلية. الإيثانول (3،6-4،5٪ المجلد / المجلد) بمثابة محفز موت الخلايا المبرمج في التظاهرة الحالية.
    ملاحظة 1: تظهر البيانات المتوفرة لدينا المنشورة وغير المنشورة أن الخلايا يمكن أيضا عكس الخلايا التي يتم تشغيلها من قبل الآخرين أفكارك محفزات 12،13، مثل سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO، 8٪ المجلد / المجلد لمدة 24 ساعة)، staurosporine (STS، و 0.5 ميكرومتر ل 1 ساعة)، والتاكسول (1 ميكرومتر لمدة 12 ساعة). مطلوب تعظيم الاستفادة من جرعة لتحريك الخلايا لأنواع مختلفة من الخلايا لتحقيق الحد الأدنى من الجرعة التي يمكن أن تؤدي غالبية الخلايا في السكان على الخضوع لموت الخلايا المبرمج.
    ملاحظة 2: ما قبل الخلط وكلاء الذي يحفز الخلايا مع مستنبت الخلية المهم تجنب التعرض غير المتكافئ للخلايا لأفكارك المحفزات.
  2. صورة مجموعة من الخلايا الصحية في طبق ثقافة الخلية قبل تطبيق عامل يحفز موت الخلايا المبرمج لإنشاء الأشكال التضاريسية خط الأساس.
  3. إزالة المتوسطة الأصلي من الطبق زراعة الخلايا، ومن ثم تطبيق 2 مل من خلط الوكيل الذي يحفز الخلايا على طبق لتحريك خلايا للخضوع لموت الخلايا المبرمج. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 (أو غيرها من الظروف الثقافة العادية).
  4. وبعد الحضانة، ومراقبة الخلايا عن طريق الضوء، برنامج التحصين الموسع ومضان أو المجهري متحد البؤر لمراقبة تطور من الميزات أفكارك.
    ملاحظة 1: سوف الخلايا التي تمر موت الخلايا المبرمج عرض بصمات المورفولوجية، والكيمياء الحيوية والجزيئية للموت الخلايا المبرمج والتي يمكن الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري وأجهزة الاستشعار القائم على مضان (انظر بروتوكولات 3 و 4).
    ملاحظة 2: سوف تمتد فترة الحضانة من الخلايا مع محرضات موت الخلايا المبرمج مختلفة تختلف، اعتمادا على نوع من الخلايا، وظروف الخلية (مثل confluency ووضع المواد الغذائية)، وجرعة من التحفيز الموت تطبيقها. قد تكون هناك حاجة المعايرة متأنية.
  5. عندما تعرض الخلايا بصمات موت الخلايا المبرمج، وإزالة عامل يحفز الخلايا عن طريق غسل خلايا مرة واحدة مع دافئ (37 درجة مئوية، أو غيرها من درجة حرارة الثقافة العادية) الطازجة مستنبت الخلية.
    ملاحظة 1: كما يتم إرفاق الخلايا أفكارك أكثر فضفاضة علىلوحة الثقافة، فمن المهم لتطبيق وإزالتها بلطف المتوسطة بحيث لن يتم غسلها خلايا بعيدا.
    ملاحظة 2: علقت لايف خلايا يمكن استردادها من طاف بواسطة الطرد المركزي لطيف (160 x ج لمدة 1 دقيقة)، وأضاف إلى الطبق الثقافة.
  6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 2 مل / 35 ملم طبق من الطازجة المتوسطة ثقافة خلية في 5٪ CO 2. بدلا من ذلك، استخدام المتوسطة مكيفة (خالية من الخلايا مستنبت تم جمعها من الخلايا السليمة) لزيادة تعزيز بقاء الخلايا أفكارك.
    ملاحظة: الغسل واحتضان الخلايا مع متوسطة جديدة تسمح للغالبية الخلايا لعكس الإيثانول الناجم عن موت الخلايا المبرمج بعد التعرض الإيثانول 12،13. ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة تكرار هذه الخطوة الغسيل عندما تتعرض الخلايا لمنبهات أفكارك الأخرى (انظر مناقشة).

3. لايف المجهر خلية

  1. نوصي باستخدام مقلوب مبائر أو برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر مع الرقابة البيئية (37 ° C،5٪ CO 2) للخلايا الحية المجهري.
    ملاحظة: من الممكن أن الصورة أيضا الخلايا باستخدام المجاهر تستقيم مع الهدف غمس المياه. تراجع الهدف مباشرة في مستنبت للخلايا الصورة. ومع ذلك، والخلايا يمكن سحقت من قبل الهدف غمس خلال التركيز.
  2. قبل تدفئة المجهر (مثل غرفة تحكم البيئية، ومرحلة الحاضنة، وسخان موضوعي) على الأقل 2 ساعة قبل التصوير.
    ملاحظة: هذا يسمح مكونات المجهر للوصول الحرارية التوازن، بحيث يمكن تجنب الانجراف التركيز والتحول من الطائرة س ص بسبب التمدد الحراري والانكماش من المكونات.
  3. وضع زجاج 35 مم طبق السفلي من الخلايا المستزرعة (انظر بروتوكول 1) على مرحلة مجهر مقلوب والتقاط الصور باستخدام خلية هدف خطة امزيغ 40X 63X أو مع الفتحة العددية (NA) 1.3 أو 1.4 لتصوير الخلايا من قاع الطبق من خلال coverslips الزجاج.
    ملاحظة: تجنب تطبيق أكثر من 2 مل من المتوسطإلى 35 ملم الزجاج طبق أسفل، ووزن المتوسط ​​يمكن أن يسبب انحناء أسفل الزجاج، مما يجعل من الصعب صورة حقل من الخلايا في نفس المستوى البؤري.
  4. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية أو درجة الحرارة العادية المقابلة أثناء عملية التصوير بأكملها.
    ملاحظة: عملية موت الخلايا المبرمج، وعلى الأرجح عكس موت الخلايا المبرمج، ويعتمد على درجة حرارة الأنشطة الإنزيمية الحساسة. لذلك، والحفاظ على خلايا عند 37 درجة مئوية (على سبيل المثال مع مرحلة المجهر أعلى حاضنة) المهم في كافة مراحل التجربة. درجة الحرارة انخفضت يمكن أن تبطئ الاستجابة أفكارك واستجابة الانتعاش بعد إزالة التحفيز أفكارك.
  5. استخدام جهاز الرطوبة أو وضع احباط شفافة (انظر المواد) على طبق ثقافة للحد من فقدان الماء عن طريق التبخر من المتوسط.
    ملاحظة: احباط يمكن أن يعطل قطبية الضوء لDIC المجهري. استعادة قطبية عن طريق ضبط المستقطب في مسار الضوء.
  6. الحفاظ على درجة الحموضة فيزراعة الخلايا المتوسطة (درجة الحموضة 6.8 -7.3) التي تفرخ في CO 2 5٪ مع غرفة التحكم البيئية على المجهر.
    ملاحظة: صيانة درجة الحموضة في مستنبت يمكن أن يتحقق أيضا من خلال إضافة العازلة HEPES، أو باستخدام التجاري CO 2 متوسطة مستقلة من (انظر المواد). يمكن أن تختلف الظروف المثلى، اعتمادا على نوع من الخلايا.
  7. تقليل مضان / ليزر (الإثارة شدة الضوء) التعرض إلى الخلايا أثناء عملية التصوير لتجنب الضيائية عن طريق الحد من كثافة مضان إلى أدنى المطلوبة للحصول على صور ذات جودة عالية من خلية / الهياكل التحت خلوية أو أجهزة الاستشعار أعرب (التفاصيل في بروتوكول 4).

4. استراتيجيات لكشف وتتبع القيامة أثناء وبعد أفكارك الأحداث

  1. البلازما blebbing الغشاء، والتكثيف حشوية، انكماش الخلايا وتشكيل هيئة أفكارك (انظر الشكلين 1A - C، E).
    1. أداء الوقت الفاصل بين زراعية مختلفة الخلية الحيةعلى النقيض rential تدخل (DIC) أو النقيض من المرحلة المجهري لتعقب مجموعة من الخلايا الصحية ومراقبة مورفولوجيا الخلايا الخاصة بهم (انظر بروتوكول 3 للفحص المجهري الخلايا الحية، وانظر مناقشة).
      ملاحظة 1: تخفيض كثافة مصدر للضوء لDIC / مرحلة التصوير عقدا لتجنب الضيائية إلى الخلايا.
      ملاحظة 2: إذا DIC والنقيض من المرحلة المجهري غير متوفرة، استخدم CellTracker وصمة عار على العصارة الخلوية لتحديد مورفولوجية الخلايا الحية للمتحد البؤر أو برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر ورصد مورفولوجيا الخلايا.
    2. تطبيق التحفيز موت الخلايا لتحريك خلايا الخضوع لموت الخلايا المبرمج (انظر بروتوكول 2 لتطبيق وإزالة المثيرات أفكارك).
    3. مراقبة الخلايا المعالجة لبصمات المورفولوجية من الخلايا مثل البلازما blebbing الغشاء، والتكثيف حشوية، انكماش الخلايا وتشكيل هيئة أفكارك (أرقام 1A، 1B، 1C، 1E).
    4. يغسل المحفزات الموت، والخلايا إعادة التموين مع متوسطة جديدة عندما الخلايا displaبصمات المورفولوجية Y من موت الخلايا المبرمج.
      ملاحظة 1: تطبيق التحفيز موت الخلية أو تغيير مستنبت الخلية على المسرح المجهر خلال الوقت الفاصل بين التصوير الخلية الحية يمكن أن يتحقق عن طريق استخدام غرفة زراعة الخلايا نضح، أو لا يمكن أن يؤديها مباشرة على طبق ثقافة الخلية بواسطة pipetting بعناية دون لمس الطبق، خلال الفترات الفاصلة بين التصوير.
      ملاحظة 2: أنظمة استخدام التركيز تعويض الانجراف لتجنب من التركيز من الخلايا نتيجة لفقدان التوازن الحراري للنظام المجهر بعد تغيير مستنبت الخلية (انظر مناقشة).
    5. مستمر الوقت الفاصل بين التصوير لتتبع مصير الخلايا التي عرض السمات المميزة لموت الخلايا المبرمج. الخلايا التي عكس موت الخلايا المبرمج يمكن إصلاح الأضرار واستعادة طبيعي التشكل شقة (أرقام 1A، 1B، 1C، 1E).
  2. تجزئة الميتوكوندريا، DNA / التكثيف لونين، والتفكك النووي (انظر الشكلين 1D، 1F، 1G).
    1. لتصور mitochondريا، وخلايا وصمة عار مع 50 نانومتر MitoTracker أحمر / أحمر عميق / صبغ الأخضر الفلورسنت، وصمة عار في وقت واحد النواة مع 10 ميكروغرام / مل من هويشت 33342 صبغ النووي الأزرق في مستنبت لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
      ملاحظة 1: تقليل تركيز الأصباغ ومدة الحضانة لتجنب سمية الخلايا وتقليل مضان الخلفية عند الحاجة. تحسين الظروف تلطيخ للحصول على إشارة جيدة إلى نسبة الضوضاء مع الحد الأدنى من صبغ وحضانة الوقت لتلطيخ.
      ملاحظة 2: استخدام البقع الفلورسنت لالميتوكوندريا مثل MitoTracker الأحمر CMXRos، MitoTracker أحمر عميق FM، أو MitoTracker الخضراء FM، وهذا لا يتسرب من خلال الميتوكوندريا موت الخلايا المبرمج. وهذا يسمح تصور مورفولوجيا الميتوكوندريا أثناء موت الخلايا المبرمج والقيامة. رؤية المواد والجدول معدات لمن التفاصيل حول هذه البقع.
    2. حفاظ على الخلايا الملون في الظلام لتجنب photobleaching من.
    3. إزالة وصمة عار الزائدة عن طريق غسل الخلايا3 مرات مع 37 ° C الفوسفات عازلة المالحة (PBS) حل أو الطازجة المتوسطة ثقافة الخلية، مع 1 دقيقة حضانة في متوسطة جديدة بين كل غسل، ومن ثم مزيد من احتضان في متوسطة جديدة لمدة 20 دقيقة قبل غسل النهائي للسماح مفرطة البقع للخروج من الخلايا للحد من خلفية إشارة غير محددة للتصوير.
      ملاحظة: تقصير مرات الحضانة مع المتوسطة الخلية بعد تلطيخ قد يؤدي إلى خلفية عالية للتصوير.
    4. أداء الوقت الحقيقي مبائر خلية حية أو برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري لصورة الخلايا السليمة قبل تطبيق الاستقراء أفكارك (انظر بروتوكول 3 للفحص المجهري الخلايا الحية).
      ملاحظة: يتم عرض الخلايا السليمة الميتوكوندريا أنبوبي ونوى مستديرة في معظم أنواع الخلايا (أرقام 1D، 1F، 1G).
    5. تحريك خلايا للخضوع لموت الخلايا المبرمج (انظر بروتوكول 2 لتطبيق وإزالة المثيرات أفكارك إلى الخلايا).
    6. مواصلة الوقت الفاصل بين المجهري الخلايا الحية لمراقبة التغيرات في morpholog الميتوكوندريا والنوويالمنشأ فورا بعد تطبيق التحفيز الموت للخلايا. مراقبة الخلايا لعرض السمات المميزة لموت الخلايا المبرمج مثل تجزئة الميتوكوندريا وتورم، والتكثيف لونين والتفتت النووي، على النقيض من الخلايا السليمة التي تظهر الميتوكوندريا أنبوبي ونوى مستديرة.
    7. عندما تعرض الخلايا بصمات موت الخلايا المبرمج، وغسل وتوريد الخلايا مع المتوسطة الطازجة، ويستمر التصوير الوقت الفاصل بين لتتبع مصير الخلايا. الخلايا التي عكس الخلايا تستعيد الميتوكوندريا العادي والتشكل النووي (أرقام 1D، 1F، 1G).
      ملاحظة: إجراء DIC المجهري بالتوازي عندما يكون ذلك ممكنا للحصول على معلومات إضافية للوصول إلى مراحل موت الخلايا المبرمج من خلال مراقبة التغيرات مورفولوجيا الخلايا في نفس المجموعة من الخلايا (انظر بروتوكول 4.1 لDIC المجهري).
  3. الكشف عن الإفراج الميتوكوندريا من السيتوكروم ج باستخدام الخلايا معربا عن ستابلي على -GFP الانصهار السيتوكروم ج العلاقات العامةotein (انظر الشكل 2).
    1. خلايا وصمة عار معربا عن ستابلي السيتوكروم ج -GFP 23،24 مع MitoTracker الأحمر لتسمية الميتوكوندريا خلية الاستقطاب (انظر خطوات 4.2.1 إلى 4.2.3 للخلية الحية الميتوكوندريا تلطيخ).
    2. أداء الوقت الحقيقي مبائر الخلية الحية أو برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري لتعقب الخلايا السليمة (التفاصيل في بروتوكول 3 لتصوير الخلايا الحية).
      ملاحظة: -GFP إشارة السيتوكروم ج يموضع في المقام الأول في الميتوكوندريا الخلايا السليمة (أرقام 2A ط، 2B).
    3. تحريك خلايا للخضوع لموت الخلايا المبرمج (انظر بروتوكول 2 لتطبيق وإزالة المثيرات أفكارك إلى الخلايا). مواصلة الوقت الفاصل بين المجهري لمراقبة النبات من السيتوكروم ج -GFP من الميتوكوندريا إلى العصارة الخلوية (أرقام 2Aii والثاني والثالث، 2B).
      ملاحظة: الإفراج الميتوكوندريا من السيتوكروم ج في العصارة الخلوية هو علامة من الميتوكوندريا permeabilization الغشاء الخارجي (MOMP)4، خطوة حاسمة في تعتمد على الميتوكوندريا موت الخلايا المبرمج 21،22
    4. عندما تعرض الخلايا إشارة -GFP السيتوكروم ج في السيتوبلازم، وإزالة الحوافز موت الخلايا، والخلايا العرض ومتوسطة جديدة (انظر بروتوكول 2). مواصلة التصوير الوقت الفاصل بين لتتبع مصير الخلايا مع GFP عصاري خلوي.
      ملاحظة: الخلايا التي عكس موت الخلايا المبرمج استعادة مورفولوجيا الخلايا العادية، والحد من عصاري خلوي السيتوكروم ج -GFP إشارة يفترض من خلال تدهور أو النبات إلى الميتوكوندريا (أرقام 2Aiv-السابع، 2B).
    5. التقاط الصور DIC بالتوازي للحصول على معلومات إضافية للوصول إلى مراحل موت الخلايا المبرمج من خلال مراقبة التغيرات في مورفولوجيا الخلايا في الخلايا واحد أو مجموعة من الخلايا (انظر بروتوكول 4.1 لDIC المجهري).
  4. الكشف عن النشاط كاسباس باستخدام جهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس (انظر الشكل 3)
    1. خلايا بالنقل مع كاسباس جهاز الاستشعار البيولوجي NES-DEVD-YFP-NLS ل16 و 24 ساعة قبل إخضاعهم إلى التحفيز أفكارك 13.
    2. وصمة عار على ثقافات transfected مع هويشت 33342 لتسمية نواة الخلية (راجع خطوات 4.2.1 إلى 4.2.3 ليعيش خلية تلطيخ النووي).
    3. أداء الوقت الحقيقي مبائر الخلية الحية أو برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري لتعقب الخلايا السليمة (التفاصيل في بروتوكول 3 لتصوير الخلايا الحية).
      ملاحظة: إشارة جهاز الاستشعار البيولوجي NES-DEVD-YFP-NLS يموضع في المقام الأول في العصارة الخلوية الخلايا السليمة بسبب إشارة النووية التصدير (NES) (أرقام 3A، 3Bi و3C، انظر مناقشة).
    4. تحريك خلايا للخضوع لموت الخلايا المبرمج (انظر بروتوكول 2 لتطبيق وإزالة المثيرات أفكارك إلى الخلايا). مواصلة الوقت الفاصل بين المجهري لمراقبة النبات النووي من YFP.
      ملاحظة: تفعيل caspases يشق عزر DEVD كاسباس في جهاز الاستشعار البيولوجي NES-DEVD-YFP-NLS، مما أدى إلى YFP-NLS النبات من العصارة الخلوية إلى النواة (أرقام 3A، 3Bii-IV، انظر مناقشة).
    5. ملاحظة: الخلايا التي عكس موت الخلايا المبرمج استعادة مورفولوجيا الخلايا العادية، ولكن الإبقاء على إشارة YFP النووية (أرقام 3Bv-X، خلايا 1 و 2، و3D).
    6. مواصلة التصوير الوقت الفاصل بين لتتبع مصير الخلايا التي عرض YFP النووي.
      ملاحظة: سوف إشارة YFP النووية أصبحت عدة ساعات المتدهورة بعد أن عكس خلايا موت الخلايا المبرمج (أرقام 3B، من السادس إلى العاشر، خلية 1، انظر النتائج والمناقشة) يفترض من خلال آليات إزالة الخلية الطبيعية مثل تدهور proteasome و.
    7. التقاط الصور DIC بالتوازي للحصول على معلومات إضافية للوصول إلى مراحل موت الخلايا المبرمج من خلال مراقبة التغيرات في مورفولوجيا الخلايا في الخلايا واحد أو مجموعة من الخلايا. (انظر بروتوكول 4.1 لDIC المجهري).
  5. التعرض سطح الخلية من فسفاتيديل (انظر الشكل 4)
    1. خلايا البذور على GLالحمار coverslips لتحقيق 80٪ الخلية confluency (انظر بروتوكول 1).
    2. شارك في وصمة عار الخلايا مع MitoTracker الأحمر والأزرق الفلورسنت هويشت 33342 وصمة عار للالميتوكوندريا ونوى، على التوالي (راجع خطوات 4.2.1 إلى 4.2.3 لالميتوكوندريا خلية حية وتلطيخ النووي).
    3. تحريك خلايا للخضوع لموت الخلايا المبرمج باستخدام محفز الخلايا (انظر بروتوكول 2).
    4. تطبيق الفلورسنت المسمى annexin V (راجع المواد) إلى وصمة عار الخلايا أفكارك 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل إزالة محفز الخلايا للكشف عن تعرض فسفاتيديل على سطح الخلايا أفكارك.
      لا ملطخة صحية الخلايا مع annexin V لأن المحتبسة فسفاتيديل عادة على النشرة الداخلية لغشاء البلازما الخلية 38: ملاحظة 1. هي ملطخة الخلايا أفكارك مع annexin V، التي تربط لفسفاتيديل على سطح الخلية (أرقام 4A و 4B).
      ملاحظة 2: الفلورسنت المسمى annexin V يمكن أن تطبق أيضا على وصمة عار الخلايا أفكارك IMMediately بعد إزالة محفز موت الخلايا المبرمج، مع 10 دقيقة الحضانة.
    5. إزالة الحوافز موت الخلايا، وغسل الخلايا ملطخة PBS الدافئ أو متوسطة جديدة مرة واحدة، ومن ثم تزويد الخلايا مع المتوسط ​​الطازجة لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 (انظر بروتوكول 2).
      ملاحظة 1: الخلايا التي عكست موت الخلايا المبرمج استعادة التشكل الطبيعي وتحتفظ fluorescently المسمى annexin إشارة V بعد استعادة التشكل الطبيعي (أرقام 4A، و4B).
      ملاحظة 2: انخفاض إشارة annexin V مع الوقت على خلايا المستردة (انظر مناقشة).
    6. إصلاح الخلايا في نقاط زمنية المختار مع 4٪ بارافورمالدهيد تحتوي على 8٪ سكروز في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 20 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة، وغسل الخلايا الثابتة مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 مرات لإزالة بارافورمالدهيد قبل التركيب الخلايا على الشرائح الزجاجية coverslips مع antifade مرس (راجع المواد) للمتحد البؤر أو برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر ومراقبة annexin V على الخلايا بعد إزالة الخلايا محفز.
      ملاحظة 1: السكروز في تثبيتي يحافظ على هيكل غشاء الخلية أثناء التثبيت.
      ملاحظة 2: تخزين حل بارافورمالدهيد في الظلام في 4 درجات مئوية لمنع تدهور.
      ملاحظة 3: الاحماء حل بارافورمالدهيد إلى درجة حرارة الغرفة قبل تطبيقه على الخلايا لتثبيت لتجنب الصدمة الباردة إلى الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لدراسة عكس موت الخلايا المبرمج، وأول تتعرض الخلايا زراعة الأنسجة لحافز الموت لتحريك موت الخلايا المبرمج. عندما تعرض الخلايا بصمات موت الخلايا المبرمج، ثم يتم تطبيق ثقافة جديدة المتوسطة ليغسل التحفيز ثم احتضان الخلايا الميتة للسماح الاسترداد (الشكل 1A). هنا، فإن السؤال الرئيسي يجري تناولها هو مدى الخلايا المستزرعة الموت الفردية يمكن إحراز تقدم نحو موت الخلايا المبرمج والتي لا تزال تخضع القيامة. هذا السؤال يمكن الإجابة بشكل قاطع عن طريق الرصد المستمر مع المؤشرات الحيوية لتتبع مصائر الخلية باستخدام الأساليب المذكورة أدناه.

وصفنا أولا استراتيجياتنا لكشف عكس موت الخلايا المبرمج في الخلايا زراعة الأنسجة باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري الخلية الحية، وهو مطلوب لتتبع وتسجيل استجابة الخلايا الفردية قبل وأثناء وبعد التعرض ل12،13 التحفيز أفكارك. الخلايا الملتصقة صحية تنتشر على الركيزة على المرفق (الرقم 1Bi) 12،13، وعرض الميتوكوندريا الخيطية ونوى الجولة السابقة للعلاج (أرقام 1Ci، دي، المنظمة الدولية للتعليم، فاي، جي) 12،13. بعد التعرض ل3،8-4،5٪ من الإيثانول في زراعة الخلايا المتوسطة (المجلد / المجلد)، كشفت مدينة دبي للإنترنت أو النقيض من المرحلة المجهري أن الخلايا أظهرت بصمات المورفولوجية للموت الخلايا المبرمج، بما في ذلك التكثيف حشوية، والبلازما blebbing الغشاء، وانكماش الخلية (أرقام 1Bii، 1Cii- الثالث، و1Eii الى السادس) 12،13. تشكيل هيئة أفكارك من قبل نفس الخلايا ولوحظ بسهولة من قبل DIC (أرقام 1Eii الى السادس). تجزئة الميتوكوندريا MitoTracker المسمى (أرقام 1Dii والثاني والثالث، 1Fii الى السادس) 12،13 فضلا عن تكثيف DNA النووي هويشت الملون (أرقام 1Dii والثاني والثالث، قسم الصناعات السمكية والثاني والثالث، GII) 12،13، وتفتيت نوى (تينتم الكشف عن ures 1Evi وFVI، والسهام البيضاء)، في وقت واحد من قبل متحد البؤر أو برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري. وقد لوحظت الخلايا التي عكست موت الخلايا المبرمج بنجاح في وقت لاحق لاستعادة التشكل الطبيعي، على ما يبدو إصلاح الضرر بهم (أرقام 1Biii، C و div الى السادس، E والعامل VII الى الثاني عشر، وGIII) 12،13. أيضا قد أظهرت الخلايا تحت هذه الظروف لاستعادة القدرة على الحركة العضيم، الهجرة الخلية، والإلتقام وظيفية بناء على امتصاص الباعثة للمضان نقاط الكم وخلية تقسيم 13. ومن المثير للاهتمام، وبعض الخلايا التي موت الخلايا المبرمج التبجيل عرض التشكل عدم انتظام النووي (الشكل 1Fxii)، وكذلك انقسام الخلايا غير الطبيعي وتشكيل النويات (أرقام 1Giv-VII) 13، والتي هي العلامات البيولوجية من الحمض النووي من التلف، كروموسوم الكسر وفقدان كروموسوم كامل في تقسيم الخلايا 39، 40. ج النازحينhromosomes أو شظايا كروموسوم خارج تفشل ليتم تضمينها في نوى الخلايا ابنة ومحاطة غشاء النووي 39 و 40. وهكذا، يمكن لذلك من القيامة يكون إيواء الجينومات التي تضررت خلال موت الخلايا المبرمج المجهضة، مما يؤدي إلى تكون الأورام وتطور السرطان. وجود النويات شائع أيضا في الخلايا السرطانية 40،41.

الإفراج عن الميتوكوندريا السيتوكروم ج هو خطوة حاسمة للتوسط أو تضخيم التي تعتمد على كاسباس موت الخلايا المبرمج 20-22. باستخدام خلايا هيلا التي تعبر عن مستقر الموسومة GFP السيتوكروم ج، فإننا مراقبة نقل التحت خلوية من السيتوكروم ج خلال موت الخلايا المبرمج والقيامة بواسطة المجهر متحد البؤر. كما ذكرت 23،24، وأطلق سراح السيتوكروم ج -GFP المترجمة إلى الميتوكوندريا قبل العلاج (أرقام 2Ai وباء)، ولكن بعد ذلك في العصارة الخلوية بعد التحفيز الموت قد طبقت (أرقام 2Aii،2Aiii وباء). الأشكال التضاريسية المميزة الأخرى مثل تجزئة الميتوكوندريا وblebbing غشاء البلازما، لوحظت أيضا في الخلايا التي أطلقت سراح السيتوكروم ج -GFP (الشكل 2Aiii). تم الإبلاغ عن هذه الخلايا على الخضوع لموت الخلايا بعد وقت قصير من الإفراج عن السيتوكروم ج 23-27. ومع ذلك، بعد إزالة الحوافز الموت، لاحظنا أن السيتوكروم عصاري خلوي مستويات ج -GFP انخفضت، الميتوكوندريا استعادت الهياكل الخيطية، واسترداد غشاء البلازما مظهر طبيعي (أرقام 2Aiv-السابع، وباء). لذلك، يمكن خلايا أفكارك الخضوع القيامة بعد الإفراج الميتوكوندريا من السيتوكروم ج.

يفترض التضخيم من caspases-الشق DEVD المصب عموما أن يكون "نقطة اللاعودة" في موت الخلايا المبرمج 2،5. لذلك، استخدمنا كاسباس جهاز الاستشعار البيولوجي NES-DEVD-YFP-NLS EXPRإسيد من البلازميد 13، مما يجعل من الممكن للكشف على قيد الحياة الخلايا التي شهدت سابقا النشاط كاسباس (الشكل 3A). هذا جهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس هو ببتيد مع N-الطرفية إشارة استبعاد النووي (NES)، والربط مع كاسباس 7/3 الموقع انشقاق الآراء (DEVD) 26،42،43، تليها بروتين فلوري أصفر (YFP) و -C محطة إشارة توطين النووية (NLS). في الخلايا السليمة، وهذا جهاز الاستشعار البيولوجي يموضع في الغالب إلى العصارة الخلوية بوصفها وظيفة من NES (أرقام 3Bi، CI-الرابع، وD) 13. خلال موت الخلايا المبرمج، caspases تنشيط كليف عزر DEVD، والإفراج عن YFP-NLS التي translocates بكفاءة من العصارة الخلوية إلى النواة في الخلايا التي في وقت واحد، أو في وقت لاحق، وعرض الميزات الأخرى من الخلايا مثل الحمض النووي / الكروماتين التكثيف وانكماش الخلية (أرقام 3B الثاني -iv، وD) 13. وهكذا، فإنخلايا حد ذاته تحتفظ ظيفة استيراد النووية بعد تفعيل كاسباس. بعد إزالة محفز الخلايا، والخلايا التي تخضع الانتعاش الصرفي عرض القيامة حتى بعد أن وقعت تفعيل كاسباس (أرقام 3Bv-X، وD) 13، على ما يبدو عكس أواخر مرحلة موت الخلايا المبرمج. خلال استرداد مورفولوجيا العادي، يقلل من إشارة YFP النووية في شدة في بعض الخلايا عندما تبدأ في عكس موت الخلايا المبرمج بعد إزالة الحوافز الموت (أرقام 3Bv-X، خلية 1) 13، مما يشير إلى أن الخلايا تتحلل وجهاز الاستشعار البيولوجي-المشقوق كاسباس، ربما عن طريق نفس الآلية المستخدمة لإزالة غيرها من المنتجات المشقوق كاسباس أثناء وبعد القيامة.

ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن القيامة دون المجهر الخلايا الحية. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام fluorescently المسمى annexin V 38،44، الذي يربط وعلامات تخريجها فسفاتيديل (PS) في خطوة مبكرة في موت الخلايا المبرمج ( (الشكل 4B) 13، وفسفاتيديل يقتصر على النشرة الداخلية للغشاء البلازما الخلايا السليمة 38. في المقابل، الخلايا الميتة أفكارك الإيثانول الناجم عن تعرض فسفاتيديل على سطح الخلية (الشكل 4B) 13، وبالتالي، يمكن أن توصف مع الفلورسنت annexin V 38،44. بشكل ملحوظ، يمكن خلايا-V المسمى annexin استعادة التشكل الطبيعي بعد إزالة المثيرات وفاة، مما يوحي بأن العضلية الأولية قد عكس موت الخلايا المبرمج (الشكل 4B) 13. الآخرين طبقت سابقا استراتيجية مماثلة تشير إلى أن التعافي من موت الخلايا المبرمج يمكن أن تحدث في الجسم الحي. في نموذج في الجسم الحي من الإصابة الدماغية عابرة، annexin وضع العلامات V التي تعتمد على كاسباس الخلايا العضلية في الأرانب والفئران على ما يبدو إعادةsulted في استيعاب annexin V من الباقين على قيد الحياة الخلايا بعد نقص تروية عابرة 45، مما يشير إلى أن تحدث في الحيوانات الحية التي القيامة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت اثنين من دراسات أخرى الخلية فرز لتحديد جزء من annexin-V المسمى BCL الماوس 1 .3B3 خلايا سرطان الغدد الليمفاوية B (يتعرض لأضداد الغلوبولين المناعي التي تحفز على موت الخلايا المبرمج في BCL 1 .3B3) والفأر سرطان الثدي خلايا MOD التعبير عن درجات الحرارة استمر البروتين p53 -sensitive (الذي يسبب موت الخلايا المبرمج بعد المحتضنة أقل من درجة حرارة متساهلة) لتتكاثر بعد أن عاد إلى ظروف التربية العادية 14،15. بشكل جماعي، وتشير هذه الدراسات إلى أن annexin V هو مفيد لتحديد مصير الخلايا التي عكست موت الخلايا المبرمج دون الخلية الحية التصوير المجهري. ومع ذلك، هناك محاذير مع هذه الاستراتيجية، كما annexin V مضان ليست دائمة (الشكل 4B) 13، المتبقية للكشف عن عدد قليل فقط من ساعة بعد إزالة الحوافز موت، حتى أنلا يمكن لهذه الأساليب أن توفر تتبع المدى الطويل من الخلايا التي عكست موت الخلايا المبرمج.

الشكل (1)
الشكل 1: تتبع عكس موت الخلايا المبرمج من قبل تصوير الخلايا الحية. (أعيد طبعها بإذن من تانغ وآخرون، MBoC 23، 2240-2252 13، للأرقام 1A - D، وG). (A) نهج للحث على موت الخلايا المبرمج وبالتالي السماح الخلايا المستزرعة لاسترداد بعد غسل بعيدا محفز موت الخلايا المبرمج. (B) الوقت الفاصل بين مرحلة الخلية الحية النقيض المجهري للخلايا الكبد الماوس الابتدائية صحية (غير المعالجة)، وهي نفس المجموعة من الخلايا التي تم علاجها مع 4.5٪ من الإيثانول في مستنبت (المجلد / المجلد) لمدة 5 ساعة (المعالجة)، ثم غسلها وزيادة حضنت مع مستنبت الطازجة لمدة 24 ساعة (غسلها). شريط الحجم، 100 ميكرون. (C) مستمر وقت الفاصل بين الخلية الحية برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر من نفس خلايا الكبد الماوس الأولية قبل الإيثانولالعلاج نول (ط)، في الأوقات المشار إليها بعد العلاج مع 4.5٪ من الإيثانول في الثقافة خلية متوسطة لمدة 2.5 ساعة (الثاني والثالث)، وبعد الغسيل واحتضان مع متوسطة جديدة للسماح الانتعاش لمدة 1 ساعة (الرابع - السادس). تم تصور الصور المدمجة من الميتوكوندريا MitoTracker الملون (أحمر) وهويشت الملون والنواة (الأزرق) بواسطة المجهر برنامج التحصين الموسع ومضان، ومورفولوجيا الخلايا التي DIC المجهري. شريط المقياس، 10 ميكرون. (D) وصور مضان اندمجت فقط (بدون DIC) من لوحة C تكشف الأشكال التضاريسية عضية. (E) مستمر وقت الفاصل بين الخلية الحية المجهري متحد البؤر من خلايا سرطان الرئة ذي الخلية الصغيرة H446 الإنسان قبل العلاج الايثانول (ط) بعد العلاج مع 3.8٪ من الإيثانول في زراعة الخلايا المتوسطة لمدة 2 ساعة 28 دقيقة (الثاني إلى السادس)، وبعد الغسيل واحتضان مع متوسطة جديدة للسماح الاسترداد (السابع الى الثاني عشر). تم تصور الصور المدمجة من الميتوكوندريا MitoTracker الملون (أحمر) ونوى هويشت الملون (الأزرق) من خلال الفحص المجهري متحد البؤر، وج الذراع التشكل من قبل DIC المجهري. السهام البيضاء تشير إلى وجود نواة مجزأة في الهيئات أفكارك (السادس). شريط المقياس، 10 ميكرون. (F) مدموجة الصور مضان فقط (بدون DIC) من لوحة E تكشف الأشكال التضاريسية العضيم. (G) مستمر الوقت الفاصل بين الخلية الحية المجهري برنامج التحصين الموسع ومضان لأحادية اللون هويشت الملون والتصوير النووي للخلية واحدة هيلا أن يخضع لانقسام الخلايا غير دقيق. قبل العلاج الايثانول (ط)، والمعاملة مع 4.3٪ من الإيثانول في الثقافة خلية متوسطة لمدة 5 ساعة (الثاني) وبعد إزالة الإيثانول (غسلها، من الثالث إلى السادس). وحات الرابع يكشف عن انقسامات الخلية غير طبيعية. السهام الحمراء تشير إلى نواة رئيسية في الخلايا تنقسم (رابعا السادس). شريط المقياس، 30 ميكرون. يشار إلى أضعاف ساعة: دقيقة من فضلك انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

جوري 2 "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 51964 / 51964fig2highres.jpg "/>
الشكل 2: الكشف عن عكس موت الخلايا المبرمج بعد الإفراج الميتوكوندريا من السيتوكروم ج (A) مستمر وقت الفاصل بين الحي خلية المجهري متحد البؤر من خلايا هيلا معربا عن ستابلي السيتوكروم ج -GFP (خلوي C -GFP) قبل (ط)، خلال (II-III) وبعد (من الثالث الى السابع) التعرض إلى 3.9٪ من الإيثانول في مستنبت الخلية. يتم الجمع بين الصور مبائر اندمجت من CytoC-GFP (الأخضر)، الميتوكوندريا MitoTracker الملون (أحمر)، ونوى هويشت الملون (الأزرق) مع الصور DIC (اللوحة اليسرى). وتظهر الإصدارات تم إلغاء دمج بشكل منفصل لCytoC-GFP، كما عرضت خريطة الحرارة من شدة إشارة (يسار وسط لوحة)، صورة أحادية اللون من CytoC-GFP (لوحة المتوسطة)، وصورة أحادية اللون من الميتوكوندريا (لوحة المتوسطة اليمنى). الصور المدمجة من CytoC-GFP والميتوكوندريا (اللوحة اليمنى). (ب) تغير من السيتوكروم عصاري خلوي ج-GFP كثافة إشارة من الخلايا، سلل 1 و 2 خلية، كما هو مبين في الصورة أحادية اللون CytoC-GFP في لوحة عاي. يشار إلى أضعاف ساعة: دقيقة من فضلك انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: الكشف عن عكس موت الخلايا المبرمج بعد تفعيل كاسباس (أعيد طبعها بإذن من تانغ وآخرون، MBoC 23، 2240-2252 13، للأرقام 3A - D). (A) رسم تخطيطي لكاسباس جهاز الاستشعار البيولوجي انصهار بروتين تتكون من إشارة التصدير النووي (NES)، وموقع DEVD كاسباس الانقسام والأصفر البروتين الفلوري (YFP)، وإشارة توطين النووية (NLS). (ب) المستمر الحية الوقت الفاصل خلية المجهري متحد البؤر من خلايا هيلا معربا عن كاسباس NES-DEVD-YFP-NLS جهاز الاستشعار البيولوجي قبل (ط)، خلال (II -iv) وبعد (VX) التعرض إلى 4.3٪ من الإيثانول في مستنبت الخلية. صور مبائر اندمجت من جهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس (الأخضر)، ونوى هويشت الملون (الأزرق) والصور DIC (اللوحة اليسرى)، والصور أحادية اللون إشارة YFP (لوحة المتوسطة)، وخريطة الحرارة مما يدل على شدة إشارة YFP (اللوحة اليمنى) . (C) الضوابط غير المعالجة تحليلها كما في لوحة B. (D) كميا شدة مضان لتفعيل جهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس النووي في الخلايا الفردية (مرقمة من 1 و 2 في لوحة بي) قبل وأثناء وبعد التعرض للإيثانول، والضوابط غير المعالجة (مرقمة 3 و 4 في لوحة تسى) حسبت كما في المئة من YFP موجودة في نواة (النووية / مجموع كثافة الخلايا YFP إشارة × 100٪). يشار إلى أضعاف ساعة: دقيقة. شريط المقياس، 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

آيس "> الشكل (4)
الشكل 4: الكشف عكس موت الخلايا المبرمج من قبل الفلورسنت المسمى annexin V (أعيد طبعها بإذن من تانغ وآخرون، MBoC 23، 2240-2252 13، للأرقام 4A - B). (A) رسم تخطيطي لannexin V-FITC القيامة الفحص المستخدمة في لوحة B. (B) الفئران حديثي الولادة تعرضت myocytes البطين في القلب الأولية إلى 4.5٪ من الإيثانول في الثقافة خلية متوسطة لمدة 5 ساعة، ثم حضنت مع annexin V-FITC لمدة 10 دقيقة قبل إزالة المتوسطة الايثانول. تم خلايا إما ثابتة على الفور (معاملة)، أو ثابتة بعد إعادة التغذية مع متوسطة جديدة لعدد إضافي من الانتعاش 2 ساعة (غسلها). الخلايا غير المعالجة التي تعرضت annexin V-FITC بمثابة التحكم (غير المعالجة). تم تصور الميتوكوندريا MitoTracker الملون (أحمر)، نوى هويشت الملون (الأزرق) وannexin V-FITC (الخضراء) من خلال الفحص المجهري متحد البؤر، وكان تصور مورفولوجيا الخلايا التي DIC المجهري. الشوريشريط مزر، 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

القيامة يشير إلى ظاهرة حيث الخلايا التي تم تنشيطها مسار موت الخلايا بعد ذلك عكس عملية الموت والبقاء على قيد الحياة. هنا، لقد أثبتنا أن تصوير الخلايا الحية يمكن أن تستخدم للتأكد من أن الخلايا الفردية نفسها في الواقع يمكن عكس أفكارك عملية موت الخلايا في مرحلة متأخرة، وبعد ذلك يستمر على قيد الحياة والتكاثر. بروتوكولات لدينا تصف عدة نوع معين الظروف العلاج بالخلايا الأمثل للحث على موت الخلايا المبرمج والسماح لنسبة كبيرة من الخلايا للخضوع لعكس موت الخلايا المبرمج رصدها مع العديد من المؤشرات الحيوية للتحقق منها. وفيما يتعلق بالقضايا الفنية، استخدمت أطباق الزجاج السفلي للخلايا الثقافة للتصوير 12،13، لأن من الزجاج رقيقة شفافة للغاية بين الخلايا والهدف المجهر، والذي يسمح لمسافات طويلة للعمل متحد البؤر ذات جودة عالية أو برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري في تضخم عالية، يسهل مراقبة موت الخلايا المبرمج الكلاسيكية بما في ذلك تجزئة الميتوكوندريا، وإطلاق سراح من السيتوكروم ج، والتكثيف النووي وتجزئة. الزجاج أيضا لا تشوه قطبية الضوء، للسماح جودة عالية DIC المجهري لرصد blebbing الغشاء، انكماش الخلايا من الخلايا، وتشكيل هيئة أفكارك أثناء موت الخلايا المبرمج. مدينة دبي للإنترنت المجهري له مزايا أكثر النقيض من المرحلة المجهر لمراقبة هذه السمات المميزة المورفولوجية للموت الخلايا المبرمج، ومدينة دبي للإنترنت يعزز على النقيض من عينات الخلايا غير ملوثين وشفافة، وتحسين الكشف عن الأشكال التضاريسية الخلية. إذا DIC والنقيض من المرحلة المجهري غير متوفرة، CellTracker يمكن استخدامها لوصمة عار على العصارة الخلوية لتحديد مورفولوجية الخلايا الحية للمتحد البؤر أو برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر ورصد مورفولوجيا الخلايا.

تطبيق الجرعات المناسبة من المحفزات الموت واستراتيجيات إزالة المثيرات خطوات حاسمة للكشف عن القيامة. لقد اخترنا لاستخدام تركيزات منخفضة من الإيثانول كحافز الموت لأن descr التجاربibed هنا لأن نسبة كبيرة من الخلايا المعالجة يمكن أن يخضع موحد موت الخلايا المبرمج ويمكن الشفاء من هذا، يحتمل أن تكون أكثر اعتدالا، وحافز الموت. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تطبق هذه النهج بنجاح مع المثيرات الموت أخرى، ونحن قد ذكرت 12،13. ومع ذلك، فإن بعض المحفزات الموت هي بطبيعتها أكثر صعوبة من غيرها، مثل staurosporine (STS)، وكيل الذي يحفز الخلايا التي يشيع استخدامها. ربما لأنه يربط ركائز مع تقارب عالية 46-48، ويغسل المتكررة ضرورية ولكن لا يزال قد لا تزيل STS بكفاءة من الخلايا. في هذه الحالة، وذلك باستخدام أقل تركيزات المخدرات وأقصر فترة حضانة المخدرات التي ما زالت قادرة على تفعيل عملية الموت أفكارك يمكن أن يكون مفيدا للسماح للمزيد من الخلايا لعكس موت الخلايا المبرمج. إعادة تغذية الخلايا مع مشروط خلية ثقافة المتوسط ​​يمكن أن يعزز أيضا انعكاس للموت الخلايا المبرمج أفضل من مستنبت خلايا جديدة. وعادة ما تكون مرفقة الخلايا أفكارك فضفاضة على سطح الطبق الثقافة بشكل خاص على الزجاج سوروجوه، وبالتالي من المهم أن يغسل محرضات موت الخلايا المبرمج بلطف لتجنب فصل الخلايا. طلاء أطباق الزجاج مع بولي-D-ليسين، والكولاجين و / أو فبرونيكتين يمكن زيادة الالتزام خلية للسماح أنواع معينة من الخلايا، مثل العضلية 37، لنعلق بشكل صحيح على سطح الزجاج من الأطباق زراعة الخلايا، وخاصة بعد تعرض الخلايا إلى التحفيز الموت.

تعتمد عملية موت الخلايا المبرمج، وعلى الأرجح عكس موت الخلايا المبرمج، على الأنشطة الأنزيمية التي يمكن أن تتأثر درجة الحرارة. لذلك، والحفاظ على خلايا عند 37 درجة مئوية أو في حالة الثقافة وضعها الطبيعي المهم في جميع مراحل عملية التصوير الحي لضمان استنساخ النتائج التجريبية. المجهر قبل الدافئ قبل بدء التصوير الخلية الحية هو أيضا خطوة حاسمة تسمح مكونات المجهر للوصول الحرارية التوازن. وهذا يمكن تجنب الانجراف التركيز والتحول من الطائرة س ص بسبب التمدد الحراري والانكماش منالمكونات أثناء التصوير الخلية الحية. وضع أو إزالة الحوافز الموت عن طريق تغيير المتوسطة طبق ثقافة إما مع الماصة أو عن طريق نضح في النظام المجهري قبل تحسنت خلال الوقت الفاصل بين التصوير لا تزال تسبب الانجراف التركيز نتيجة للتغيرات في درجة الحرارة أو حجم المتوسط. اكتساب Z كومة يمكن أن تساعد على خلايا الصورة في المستوى البؤري الصحيحة، ولكن سوف تزيد من خطر الضيائية بسبب التعرض الإضافي من الخلايا لأشعة الليزر الفلورسنت. بدلا من ذلك، استخدام نظم التعويض الانجراف التركيز، مثل نظام التصحيح التلقائي القائم على التركيز ليزر الأشعة تحت الحمراء، يمكن أن تبقي خلايا في نفس المستوى البؤري خلال الوقت الفاصل بين التصوير الخلية الحية من خلال الحفاظ على المسافة بين الخلايا / الزجاج والهدف اضافية دون تعرض الخلايا إلى الطول الموجي القصير، مضان الضوئي السمي.

الإفراج الميتوكوندريا من البروتينات apoptogenic مثل السيتوكروم ج، وتفعيل caspases المستجيب، مثل المصب / الأثرأو كاسباس 3 و كاسباس 7، وقد يعتبر عموما أن تكون "نقطة اللاعودة" في أفكارك 2،5،6 عملية موت الخلايا. وقد استخدمت البقع الغربية للكشف عن الانقسام (تفعيل) من كاسباس 3 وركائز لها مثل بولي (ADP) -ribose البلمرة-1 (PARP) وDFF45 / ICAD في السكان الخلية كله خلال الحث أفكارك وبعد إزالة أفكارك المحفزات، وكشف عن أن المشقوق كاسباس 3، أظهرت ICAD، وPARP تصل في الخلايا أثناء التعرض للمؤثرات الموت، ولكن اختفى بعد أن الخلايا إعادة تغذية مع ثقافة جديدة المتوسطة 13. ومع ذلك، هذه الأساليب تكشف عن الحالة العامة في السكان الخلية، ولكن لا تميز الخلايا الفردية التي سوف يموت في نهاية المطاف من تلك التي من شأنها عكس الخلايا ومن ثم البقاء على قيد الحياة. تجزئة البيوكيميائية لتحليل الإفراج عن الميتوكوندريا السيتوكروم ج ديها المحاذير مماثلة. لذلك، لتتبع مصير الخلايا الفردية بعد السيتوكروم ج الافراج عن وكاسباس ميلانيحصر تفعيل، وهما من السمات المميزة معظم المعترف بها من موت الخلايا المبرمج 2،5،6، الموسومة GFP السيتوكروم ج (C خلوي -GFP) وجهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس، مثل تلك المستخدمة هنا NES-DEVD-YFP-NLS، جنبا إلى جنب مع الخلية الحية المجهر الالتفاف على هذه المشاكل من خلال مراقبة مباشرة الانتعاش الصرفي والنبات من جهاز الاستشعار البيولوجي خلوي C -GFP في نفس الخلايا. هذه النتائج تشير إلى عكس موت الخلايا المبرمج بعد السيتوكروم الميتوكوندريا ج إطلاق وتفعيل كاسباس.

التحدي الحالي لدراسة القيامة هو عدم وجود تقنيات وضع العلامات للكشف عن الخلايا التي خضعت القيامة في أي لحظة طيلة حياتها، في الجسم الحي أو في المختبر. التعبير المستقر للكاسباس جهاز الاستشعار البيولوجي NES-DEVD-YFP-NLS أيضا يسمح الكشف عن النشاط كاسباس في حالة تنشيط caspases مرة أخرى في المستقبل، ولكن لا يسجل بشكل دائم النشاط كاسباس كما سيتم المتدهورة في جهاز الاستشعار البيولوجي تفعيلها دون sustaالنشاط كاسباس INED 13. غيرها من أجهزة الاستشعار كاسباس ذكر سابقا، مثل أجهزة الاستشعار SCAT القائم على الحنق (على سبيل المثال ECFP- [DEVD] -Venus) 26،49 وكذلك صحفيين الفلورسنت Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] -GFP) 50 وCPV (على سبيل المثال CD8 - [DEVD] -Venus) 51،52، ويمكن استخدامها للكشف عن النشاط كاسباس في الحيوانات كلها والخلايا المستزرعة، ولكن لديها قيود مشابهة. وبالمثل، خلوي C -GFP لا يمكن استخدامها لتعقب الخلايا التي عكست موت الخلايا المبرمج في المدى الطويل، كما يتم تحريرها من الميتوكوندريا في العصارة الخلوية خلال موت الخلايا المبرمج وتدهورت في وقت لاحق. وقد استخدم وضع العلامات Annexin V لتعقب الخلايا التي عكست موت الخلايا المبرمج، ولكن تنخفض كثافة إشارة أيضا مع الوقت، لذلك ليس من المفيد لتتبع المدى الطويل القيامة 13،45. يمكن استخدامها على المدى الطويل المستمر في مجال التصوير فيفو لتتبع مصير من نفس الخلايا بعد التعرض للمثيرات الموت. ومع ذلك، على المدى الطويل في مجال التصوير فيفو لا يزال تحديا رس أداء في معظم الحيوانات الحية. لذلك هناك حاجة إلى نهج إضافية لتوسيع البحوث القيامة للدراسات الحيوانية كلها، وفحص الأدوية التي يمكن أن تعزز أو تمنع القيامة باستخدام الخلايا زراعة الأنسجة

في المستقبل، وهناك حاجة أحدث البروتوكولات والتقنيات التي تتبع مصير خلية طويلة الأجل لتطوير واختبار الآثار الفسيولوجية، المرضية والعلاجية للالقيامة. اقترحنا أن القيامة قد تكون آلية بقاء الخلية العامة لانقاذ الخلايا المصابة التي يصعب استبدال، مثل الخلايا العصبية الناضجة وخلايا القلب 13. ومع ذلك، يمكن أن القيامة الخلايا السرطانية أفكارك بعد العلاج العلاج الكيميائي يؤدي إلى استعادة خلايا خطيرة مما يؤدي إلى تكرار حدوث الأورام مقاومة 12،13. القيامة يمكن أن يكون أيضا آلية مهمة لتكون الأورام، كما عرض بعض خلايا التحول أنكجنيك بعد أن عكس موت الخلايا المبرمج 13. وبالتالي، تعزيز القيامة يمكن أن يكون ثيرا جديداستراتيجية peutic لتثبيط التنكس العصبي والقلب والفشل، في حين قمع القيامة باعتبارها وسيلة جديدة لمنع أو علاج السرطان. تطوير أجهزة الاستشعار لتعقب عكس موت الخلايا المبرمج في نظم نموذج المرض وتعزيز فهم آليات بقاء الخلية من القيامة، والعلاجات المحتملة للأمراض المستعصية عن طريق تحوير القيامة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشكر القس الدكتور رالف Bohlmann والقس الدكتور جيمس Voelz لاقتراح كلمة "القيامة" لوصف عكس موت الخلايا المبرمج. دوغلاس R. الأخضر للخلايا هيلا معربا عن ستابلي السيتوكروم ج -GFP. تشارلز M. رودين واريك E. غاردنر لH446 خلايا. هيذر لامب للمساعدة في الرسوم المتحركة الرسم في الفيديو؛ يي هوى يو لمناقشة قيمة هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل زمالة السير إدوارد Youde التذكارية (HLT)، ومنح الدراسية الدكتور والتر Szeto التذكارية (HLT)، منحة فولبرايت 007-2009 (HLT)، زمالة مؤسسة أبحاث علوم الحياة (HLT)، NIH منح NS037402 (JMH) وNS083373 (JMH)، ولجنة المنح الجامعية من هونغ كونغ اوي / B-07/99 (قدم مكعبة). هو لام تانغ هو مؤسسة زميل Shurl وكاي كورتشي لمؤسسة بحوث علوم الحياة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics