ट्रैकिंग Anastasis, apoptosis उलट है कि एक सेल अस्तित्व घटना के लिए रणनीतियाँ

Biology

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Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).

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Abstract

Anastasis ("जीवन के लिए बढ़ती" के लिए यूनानी) मर कोशिकाओं की वसूली करने के लिए संदर्भित करता है। इन कोशिकाओं को ठीक करने से पहले, वे mitochondrial विखंडन, साइटोसॉल में माइटोकॉन्ड्रियल साइटोक्रोम की रिहाई, caspases की सक्रियता, क्रोमेटिन संक्षेपण, डीएनए की क्षति, परमाणु विखंडन, प्लाज्मा झिल्ली blebbing, सेल संकोचन, कोशिका की सतह जोखिम सहित apoptosis की महत्वपूर्ण चौकियों के माध्यम से पारित कर दिया है phosphatidylserine, और apoptotic निकायों के गठन की। Apoptotic उत्तेजनाओं जिससे मर कोशिकाओं apoptosis और संभवतः अन्य मृत्यु तंत्र रिवर्स करने के लिए अनुमति देता है, मौत के लिए पहले हटा रहे हैं जब Anastasis हो सकता है। इसलिए, Anastasis भी अनुपयुक्त क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को उठाना पड़ सकता है कि शारीरिक चिकित्सा प्रक्रियाओं को शामिल करने के लिए प्रकट होता है। कार्यों और Anastasis के तंत्र को जाहिरा तौर पर स्वस्थ कोशिकाओं की वसूली के बाद अतीत की घटनाओं का पता लगाने के लिए सीमित साधनों के हिस्से में बाधा, अभी स्पष्ट नहीं कर रहे हैं। रणनीतियाँ Anasta पता लगाने के लिएबहन Anastasis मिलाना शारीरिक तंत्र का अध्ययन, रोग विकृति में मरे कोशिकाओं के खतरों, और संभावित चिकित्सा विज्ञान में सक्षम होगा। यहाँ, हम जीवित कोशिका माइक्रोस्कोपी और स्तनधारी कोशिकाओं में Anastasis की पहचान करने और ट्रैकिंग के लिए एक स्तनधारी कस्पासे biosensor का उपयोग करते हुए प्रभावी रणनीति का वर्णन है।

Introduction

Apoptosis ("मौत के लिए गिरने" के लिए यूनानी) आम तौर पर सेल आत्महत्या 1-7 में समाप्त होने वाले एक तरह से इस प्रक्रिया को माना जाता है। पहले से ही apoptosis के मार्ग 8,9 शुरू की है कि कोशिकाओं सहित अन्यथा पूरे पशुओं में मर जाएगा कि अतिरिक्त कोशिकाओं, के अस्तित्व में समर्थक मौत जीन परिणामों की जेनेटिक विघटन। इसी तरह, आनुवंशिक जोड़तोड़ कृत्रिम रूप से प्रदर्शित संकेतों "मुझे खाना" या कि उनके बाह्य मैट्रिक्स के लिए चिपचिपाहट खोना कि स्वस्थ स्तनधारी कोशिकाओं पूरे सेल phagocytosis या entosis क्रमश: 10,11 से मौत से बचने के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, हम और दूसरों को भी apoptosis को 12-15 के प्रारंभिक दौर से ठीक हो सकता है आनुवंशिक हेरफेर सामान्य स्वस्थ स्तनधारी कोशिकाओं और सेल लाइनों के बिना दिखाया है। कोशिकाओं ठेठ कि महत्वपूर्ण चौकियों पारित कर दिया है के बाद व्यक्ति की कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए उपकरण का उपयोग करना, हम आगे, apoptosis के 12,13 की देर चरणों से वसूली का प्रदर्शन किया हैly के 2-6 "नहीं लौटने की बात" मार्क। देर चरण apoptosis के इन चौकियों माइटोकॉन्ड्रियल साइटोक्रोम की रिहाई, caspases की सक्रियता, परमाणु विखंडन, और apoptotic निकायों के गठन शामिल है। हम कोशिका मृत्यु 2-6 की कगार पर apoptosis के इस उत्क्रमण का वर्णन करने के लिए, "जीवन के लिए बढ़ती" जिसका अर्थ है एक ग्रीक यौगिक शब्द "Anastasis," अपनाया।

पूरे मर-वसूली की प्रक्रिया लाइव सेल इमेजिंग द्वारा मनाया जाता है, जब तक कि यह apoptotic घटनाओं का अनुभव नहीं है कि कोशिकाओं से Anastasis आया है कि कोशिकाओं को अलग करने के लिए चुनौती दे रहा है। काम के दशकों apoptosis के द्वारा सेल आत्महत्या की रूपात्मक सुविधाओं evolutionarily संरक्षित जैव रासायनिक और आणविक घटनाओं 16-19 से संचालित कर रहे हैं कि पता चला है। इन घटनाओं के क्षतिग्रस्त या डी को नष्ट करने से कोशिकीय और बहुकोशिकीय जीवों में विकास और homoeostatic प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए कोशिकाओं की आत्म-विनाश को बढ़ावा देने केangerous कोशिकाओं 16-19। Apoptotic कोशिकाओं आसानी से apoptosis के 1,5,6,16,20 के मानकीकृत, रूपात्मक जैव रासायनिक और आणविक अभिव्यक्तियों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जबकि वर्तमान में Anastasis 12,13 के लिए विशिष्ट कोई ज्ञात मार्कर है। महत्वपूर्ण बात है, Anastasis आया है कि कोशिकाओं के सामान्य स्वस्थ कोशिकाओं, और सिर्फ apoptosis के पीछे शुरू कि कोशिकाओं के रूप में प्रकट apoptotic मर कोशिकाओं 12,13 होना दिखाई देते हैं। इस प्रकार, नए उपकरणों के लिए एक दिया जीवित सेल पहले से सक्रिय apoptotic प्रक्रियाओं का अनुभव था कि निश्चितता के साथ समाप्त करने के लिए आवश्यक हैं।

यह एक तेजी से और बड़े पैमाने पर विनाश की प्रक्रिया है क्योंकि apoptosis आम तौर पर एक अपरिवर्तनीय झरना के रूप में माना जाता है। माइटोकॉन्ड्रिया ऐसे साइटोसॉल 21,22 में साइटोक्रोम के रूप में apoptogenic कारकों जारी किया है एक बार कुछ कोशिकाओं, apoptosis को आरंभ करने के लिए के लिए यह दिन मिनट लग सकता है, caspases, 5 मिनट 23,24 के भीतर सक्रिय साइटोप्लास्मिक द्वारा पीछा किया जा सकता है औरपरमाणु 10 मिनट 25-27 भीतर संक्षेपण, और कोशिका मृत्यु उसके बाद शीघ्र ही 25-27। सक्रिय caspases cleaving और ऐसे endonuclease अवरोध करनेवाला DFF45 / ICAD 29,30 के रूप में सेलुलर विध्वंस 2,28, के प्रयोजन के लिए महत्वपूर्ण संरचनात्मक और कार्यात्मक घटकों को निष्क्रिय द्वारा apoptosis के आर्केस्ट्रा। Caspases भी ऐसी 31,32 सी साइटोक्रोम की माइटोकॉन्ड्रियल रिहाई को बढ़ावा देने के माइटोकॉन्ड्रिया के लिए translocates जो बीसीएल -2 परिवार के सदस्य बोली, के रूप में समर्थक apoptotic कारकों को सक्रिय करें। कस्पासे गतिविधि भी phagocytosis 33 के माध्यम से मैक्रोफेज या पड़ोसी कोशिकाओं द्वारा कोशिकाओं को मरने का घिराव को बढ़ावा देने के लिए एक "मुझे खाना" संकेत के रूप में phosphatidylserine की कोशिका की सतह जोखिम में यह परिणाम है। इसके अलावा, apoptotic घटनाओं सेलुलर बायोइनरजेटिक्स और चयापचय 34,35,36 में खलल न डालें बेकार माइटोकॉन्ड्रिया, प्रस्तुत करना। इस प्रकार, इस तरह के विनाश से वसूली में intuitively संभावना नहीं लगती।

मूल के विपरीत उम्मीदations, कोशिकाओं को भी एक अंतिम चरण में apoptotic कोशिका मृत्यु की प्रक्रिया को उल्टा कर सकते हैं। लगातार संस्कृति में कोशिकाओं के मरने का भाग्य निगरानी करके, हम प्राथमिक कोशिकाओं और सेल लाइनों 12,13 की एक श्रेणी में देर चरण apoptosis के उलटने मनाया। मौत प्रोत्साहन का हटाया जाना, ऐसे mitochondrial विखंडन, क्रोमेटिन संक्षेपण, डीएनए की क्षति, प्लाज्मा झिल्ली blebbing, phosphatidylserine की कोशिका की सतह जोखिम, माइटोकॉन्ड्रियल साइटोक्रोम की रिहाई, कस्पासे सक्रियण, परमाणु विखंडन, सेल संकोचन के रूप में apoptosis के प्रकट सुविधाओं से वसूली की अनुमति दी apoptotic निकायों का और गठन। इन टिप्पणियों Anastasis के कार्यों, परिणाम, और तंत्र के बारे में अनुत्तरित सवाल उठा। इन सवालों को संबोधित करने के लिए, एक शर्त मज़बूती Anastasis आया है कि कोशिकाओं की पहचान है। यहाँ, हम रहते माइक्रोस्कोपी तरीकों और पहले से देर चरण apoptosis और वें उलट है कि कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक कस्पासे biosensor का वर्णनएन बच गई।

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Protocol

लाइव सेल इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की 1. तैयारी

  1. Morphological परिवर्तन का पता लगाने की सुविधा है, ऐसे हेला (मानव ग्रीवा कार्सिनोमा) बेहतर प्लाज्मा झिल्ली और intracellular organelles के परिवर्तन कल्पना करने के लिए सब्सट्रेट पर फ्लैट हैं कि कोशिकाओं के रूप में पक्षपाती कोशिकाओं का चयन करें।
    नोट: apoptosis के उत्क्रमण प्राथमिक माउस जिगर की कोशिकाओं, प्राथमिक माउस मैक्रोफेज, प्राथमिक चूहे cardiomyocytes सहित विभिन्न स्तनधारी कोशिकाओं 12,13, में मनाया, और भी इस तरह के मानव भ्रूण गुर्दे HEK-293T कोशिकाओं, अफ्रीकी ग्रीन बंदर गुर्दे उपकला भंडार नियंत्रक के रूप में लाइनों सेल कर दिया गया है -7 कोशिकाओं, माउस हृदय की मांसपेशी एच एल -1 कोशिकाओं, माउस एनआईएच 3T3 fibroblasts, भाल मस्तिष्क CRL1656 कोशिकाओं, मानव त्वचा कैंसर A375 कोशिकाओं, मानव वृषण कैंसर CRL1973 कोशिकाओं, मानव छोटे सेल फेफड़ों कार्सिनोमा H446 कोशिकाओं, मानव यकृत कैंसर (Mustela furo putoris) HepG2 कोशिकाओं, मानव स्तन कैंसर MCF7 कोशिकाओं, मानव प्रोस्टेट कैंसर PC3 कोशिकाओं, और मानव neuroblastoma एसएच SY5Y कोशिकाओं।
  2. सफाई और नसबंदी के लिए पूर्ण इथेनॉल के साथ गिलास नीचे सेल संस्कृति व्यंजन के पूर्व धोने कांच coverslips।
    एक नोट: गिलास नीचे बर्तन का प्रयोग उच्च गुणवत्ता अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी, और उच्च बढ़ाई confocal या महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चर्चा देखें) के लिए सिफारिश की है।
    नोट 2: उच्च आवर्धन (40x, 60 / 63X या 100X उद्देश्यों और उच्च संख्यात्मक apertures के 1.3 या 1.4) के लिए, पतली गिलास नीचे (मोटाई 0.085-.16 मिमी) के साथ सेल संस्कृति व्यंजन का उपयोग इमेजिंग के लिए दूरी काम कर रह गया है प्रदान करता है (प्रोटोकॉल 3 देखें )।
  3. सेल के प्रकार पर निर्भर करता है, गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन पाली डी lysine (0.1 मिलीग्राम / एमएल), मज्जा (0.01 एम एसिटिक एसिड में 0.01% समाधान) और / या फ़ाइब्रोनेक्टिन (5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) के पूर्व बोने के लिए साथ कोटिंग आवश्यकता हो सकती है कोशिकाओं।
    नोट: प्रकार और कोटिंग एजेंट की एकाग्रता का अनुकूलन विभिन्न सेल लाइनों के लिए आवश्यक है। HELA कोशिकाओं कोटिंग के बिना कांच पर सीधे पालन कर सकते हैं। हालांकि, कुछ कोशिकाओं, सुचर्चा माउस हृदय की मांसपेशी एच एल -1 कोशिकाओं के रूप में, कांच की सतहों के लिए सीधे पालन करना है, लेकिन विशिष्ट संस्कृति और कोटिंग प्रोटोकॉल 37 की आवश्यकता नहीं कर सकते हैं।
  4. बीज ~ 35 मिमी पूर्व लेपित गिलास नीचे सेल संस्कृति व्यंजन पर 2-3 x 10 5 कोशिकाओं और 80% confluency प्राप्त करने के लिए एक दिन के लिए 5% सीओ 2 के साथ (° C) 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    नोट 1: सेल घनत्व, ऊष्मायन समय है, और संस्कृति हालत का इष्टतम स्थितियों सेल प्रकार पर निर्भर करता है, भिन्न हो सकते हैं। सेल confluency कोशिकाओं (प्रोटोकॉल 2 देखें) की apoptotic प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं। उच्च confluency में, कोशिकाओं apoptotic उत्तेजनाओं की एक ही सांद्रता कम करने के लिए संवेदनशील हो सकता है।
    उच्च सेल घनत्व व्यक्ति की कोशिकाओं और उनके organelles के morphological परिवर्तन अस्पष्ट कर सकते हैं, के रूप में मिला हुआ कोशिकाओं से बचें: 2 ध्यान दें।

2. आवेदन और apoptotic सेल उत्तेजनाओं के निकालना

  1. फौरन उपयोग करने से पहले, 37 डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति के माध्यम से apoptosis के उत्प्रेरण एजेंट पूर्व मिश्रण। इथेनॉल (3.6-4.5% वॉल / खंड) वर्तमान प्रदर्शन में apoptosis inducer के रूप में कार्य किया।
    एक नोट: हमारी प्रकाशित और अप्रकाशित डेटा कोशिकाओं को भी इस तरह के डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO, 24 घंटा के लिए 8% वॉल / खंड), staurosporine (अजजा, 0.5 माइक्रोन के लिए के रूप में, अन्य apoptotic उत्तेजनाओं 12,13 से शुरू हो रहा है कि apoptosis को उल्टा कर सकते हैं दिखाना है कि एक मानव संसाधन), और taxol (12 घंटा के लिए एक माइक्रोन)। ट्रिगर apoptosis के लिए खुराक का अनुकूलन apoptosis से गुजरना करने के लिए जनसंख्या में कोशिकाओं के बहुमत को गति प्रदान कर सकते हैं कि कम से कम खुराक प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के लिए आवश्यक है।
    नोट 2: सेल संस्कृति के माध्यम से apoptosis के उत्प्रेरण एजेंटों पूर्व मिश्रण उत्तेजनाओं apoptotic कोशिकाओं की असमान जोखिम से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. छवि आधारभूत morphologies की स्थापना के लिए apoptosis के उत्प्रेरण एजेंट लागू करने से पहले सेल संस्कृति डिश में स्वास्थ्य कोशिकाओं का एक समूह।
  3. सेल संस्कृति पकवान से मूल मध्यम निकालें, और उसके बाद के लिए पकवान premixed apoptosis के उत्प्रेरण एजेंट के 2 मिलीलीटर लागूapoptosis से गुजरना करने के लिए कोशिकाओं को ट्रिगर। 5% सीओ 2 (या अन्य सामान्य संस्कृति की स्थिति) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. ऊष्मायन के बाद, apoptotic सुविधाओं की प्रगति की निगरानी करने के लिए प्रकाश, महामारी प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं का पालन।
    एक नोट: apoptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति आधारित biosensors के द्वारा पता लगाया जा सकता है कि apoptosis की, रूपात्मक जैव रासायनिक और आणविक पहचान प्रदर्शित करेगा (देखें प्रोटोकॉल 3 और 4)।
    नोट 2: अलग apoptosis के inducers के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन समय सेल प्रकार, (जैसे confluency और पोषक तत्वों की स्थिति के रूप में) सेल की स्थिति, और लागू मौत उत्तेजना की खुराक पर निर्भर करता है, अलग अलग होंगे। सावधान अनुमापन आवश्यक हो सकता है।
  5. कोशिकाओं apoptosis की पहचान प्रदर्शित करते हैं, गर्म (37 डिग्री सेल्सियस, या अन्य सामान्य संस्कृति तापमान) ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से एक बार कोशिकाओं को धोने से apoptosis के उत्प्रेरण एजेंट को हटा दें।
    एक नोट: apoptotic कोशिकाओं अधिक शिथिल पर जुड़े होते हैं के रूप मेंसंस्कृति की थाली, इसे लागू करते हैं और कोशिकाओं धुल नहीं किया जाएगा तो यह है कि धीरे मध्यम दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    नोट 2: लाइव निलंबित कोशिकाओं कोमल centrifugation (160 XG के लिए एक मिनट) से सतह पर तैरनेवाला से बरामद किया और वापस संस्कृति डिश के लिए जोड़ा जा सकता है।
  6. 2 मिलीग्राम / 5% सीओ 2 में ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से 35 मिमी पकवान के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, उपयोग वातानुकूलित मध्यम (स्वस्थ कोशिकाओं से एकत्र सेल मुक्त संस्कृति के माध्यम से) आगे apoptotic कोशिकाओं के अस्तित्व को बढ़ाने के लिए।
    नोट: धुलाई और ताजा माध्यम के साथ incubating कोशिकाओं कोशिकाओं के बहुमत इथेनॉल जोखिम 12,13 के बाद इथेनॉल प्रेरित apoptosis रिवर्स करने के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, कोशिकाओं अन्य apoptotic उत्तेजनाओं को उजागर कर रहे हैं जब इस धोने कदम आवश्यक हो सकता है दोहरा (चर्चा देखें)।

3. जीवित सेल माइक्रोस्कोपी

  1. हम पर्यावरण नियंत्रण के साथ एक औंधा confocal या महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (37 डिग्री सेल्सियस उपयोग करने की अनुशंसाजीवित कोशिकाओं माइक्रोस्कोपी के लिए 5% सीओ 2)।
    नोट: यह भी एक पानी की सूई उद्देश्य के साथ ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिकाओं की छवि के लिए संभव है। छवि कोशिकाओं को संस्कृति के माध्यम में सीधे उद्देश्य डुबकी। हालांकि, कोशिकाओं ध्यान केंद्रित दौरान सूई उद्देश्य से कुचल दिया जा सकता है।
  2. पूर्व गर्म (जैसे पर्यावरण नियंत्रण कक्ष, चरण इनक्यूबेटर, और उद्देश्य हीटर के रूप में) माइक्रोस्कोप इमेजिंग से पहले कम से कम दो घंटा।
    नोट: यह बात ध्यान और XY विमान की पारी के बहाव से बचने कर सकते हैं ताकि माइक्रोस्कोप घटकों के कारण घटकों के थर्मल विस्तार और संकुचन के लिए, थर्मो-संतुलन तक पहुँचने के लिए अनुमति देता है।
  3. संवर्धित कोशिकाओं की एक 35 मिमी गिलास नीचे पकवान प्लेस एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर (प्रोटोकॉल एक देखें) और से कोशिकाओं इमेजिंग के लिए एक संख्यात्मक एपर्चर (एनए) 1.3 या 1.4 के साथ एक 40x या 63X योजना Apochromat उद्देश्य का उपयोग सेल छवियों पर कब्जा कांच coverslips के माध्यम से डिश के नीचे।
    नोट: मध्यम के 2 मिलीलीटर लागू करने से बचनेमध्यम का वजन ही फोकल हवाई जहाज़ पर छवि के लिए यह मुश्किल कोशिकाओं का एक क्षेत्र बना रही है, गिलास नीचे की वक्रता का कारण बन सकता है के रूप में 35 मिमी गिलास नीचे पकवान, करने के लिए।
  4. पूरे इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस या इसी सामान्य तापमान पर कोशिकाओं को बनाए रखने।
    नोट: apoptosis की प्रक्रिया है, और apoptosis की संभावना उलट, तापमान संवेदनशील enzymatic गतिविधियों पर निर्भर करता है। इसलिए, (एक खुर्दबीन मंच शीर्ष इनक्यूबेटर के साथ उदाहरण के लिए) 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखने के प्रयोग के दौरान महत्वपूर्ण है। में कमी तापमान apoptotic प्रतिक्रिया और apoptotic प्रोत्साहन के हटाने के बाद वसूली की प्रतिक्रिया को धीमा कर सकता है।
  5. मध्यम से वाष्पीकरण द्वारा पानी के नुकसान को कम करने के लिए संस्कृति डिश पर एक पारदर्शी पन्नी (देखें सामग्री) एक आर्द्रता डिवाइस का प्रयोग करें या निहित है।
    नोट: पन्नी डीआईसी माइक्रोस्कोपी के लिए प्रकाश के polarity को बाधित कर सकता है। प्रकाश पथ पर polarizer के समायोजन करके ध्रुवता पुनर्स्थापित करें।
  6. में पीएच बनाए रखनेमाइक्रोस्कोप पर एक पर्यावरण नियंत्रण कक्ष के साथ 5% सीओ 2 में incubating द्वारा सेल संस्कृति माध्यम (पीएच 6.8 -7.3)।
    नोट: मध्यम संस्कृति में पीएच भी HEPES बफर जोड़कर प्राप्त किया जा सकता रखरखाव, या वाणिज्यिक सीओ 2 स्वतंत्र माध्यम का उपयोग द्वारा (सामग्री देखें)। इष्टतम स्थितियों सेल प्रकार पर निर्भर करता है, भिन्न हो सकते हैं।
  7. सेल / subcellular संरचनाओं या व्यक्त biosensors (प्रोटोकॉल 4 में विवरण) की उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए आवश्यक कम करने के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता को कम करने से phototoxicity से बचने के लिए इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं को प्रतिदीप्ति / लेजर (उत्तेजना प्रकाश तीव्रता) जोखिम को कम।

के दौरान और apoptotic घटनाओं के बाद पता लगाने और ट्रैकिंग Anastasis के लिए 4. रणनीतियाँ

  1. प्लाज्मा झिल्ली blebbing, साइटोप्लास्मिक संक्षेपण, सेल संकोचन और apoptotic शरीर गठन (आंकड़े 1A देखें - सी, ई)।
    1. समय चूक लाइव सेल diffe के प्रदर्शन करनाrential हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) या चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी स्वास्थ्य कोशिकाओं का एक समूह को ट्रैक करने के लिए और अपने सेल आकृति विज्ञान (लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के लिए प्रोटोकॉल 3 देखें, और चर्चा देखें) निरीक्षण करने के लिए।
      एक नोट: कोशिकाओं को phototoxicity से बचने के लिए डीआईसी / चरण अनुबंध इमेजिंग के लिए प्रकाश स्रोत की तीव्रता को कम।
      नोट 2: डीआईसी और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी उपलब्ध नहीं हैं, तो confocal या महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए जीवित कोशिकाओं की आकृति विज्ञान रूपरेखा और सेल आकृति विज्ञान की निगरानी के लिए साइटोसॉल दाग CellTracker का उपयोग करें।
    2. (आवेदन और apoptotic उत्तेजनाओं को हटाने के लिए प्रोटोकॉल 2 देखें) apoptosis से गुजरना करने के लिए कोशिकाओं को गति प्रदान करने के लिए कोशिका मृत्यु उत्तेजना लागू करें।
    3. ऐसे प्लाज्मा झिल्ली blebbing, साइटोप्लास्मिक संक्षेपण, सेल संकोचन और apoptotic शरीर गठन (आंकड़े 1 ए, 1 बी, 1C, 1E) के रूप में apoptosis के रूपात्मक पहचान के लिए इलाज किया कोशिकाओं का पालन।
    4. ताजा मध्यम जब कोशिकाओं के साथ मौत उत्तेजनाओं, और फिर से आपूर्ति की कोशिकाओं को धो दूर displaapoptosis के Y रूपात्मक पहचान।
      एक नोट: कोशिका मृत्यु उत्तेजना लागू करें या एक छिड़काव सेल संस्कृति कक्ष का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है समय चूक लाइव सेल इमेजिंग के दौरान खुर्दबीन मंच पर सेल संस्कृति के माध्यम से बदल रहा है, या ध्यान से छू बिना pipetting द्वारा सेल संस्कृति डिश पर सीधे किया जा सकता है इमेजिंग के बीच के अंतराल के दौरान पकवान,।
      नोट 2: का प्रयोग करें फोकस बहाव मुआवजा सिस्टम सेल संस्कृति माध्यम (चर्चा देखें) बदलने के बाद माइक्रोस्कोप प्रणाली के थर्मो-संतुलन के नुकसान की वजह से कोशिकाओं के ध्यान से बाहर से बचने के लिए।
    5. सतत समय चूक इमेजिंग apoptosis की पहचान को प्रदर्शित कि कोशिकाओं के भाग्य को ट्रैक करने के लिए। Apoptosis को रिवर्स कि कोशिकाओं को नुकसान की मरम्मत और सामान्य फ्लैट आकृति विज्ञान (आंकड़े 1 ए, 1 बी, 1C, 1E) हासिल कर सकते हैं।
  2. Mitochondrial विखंडन, डीएनए / क्रोमेटिन संक्षेपण, और परमाणु विखंडन (आंकड़े -1 डी, 1F, 1G देखें)।
    1. Mitochond कल्पना करने के लिएरिया, 50 एनएम Mitotracker लाल / गहरे लाल / ग्रीन फ्लोरोसेंट डाई के साथ दाग कोशिकाओं, और एक साथ 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मध्यम संस्कृति में Hoechst 33342 नीले परमाणु डाई के 10 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर के साथ नाभिक दाग।
      एक नोट: cytotoxicity से बचने और जब जरूरत है पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम करने के लिए रंगों और ऊष्मायन की अवधि की एकाग्रता में कमी। धुंधला के लिए डाई और ऊष्मायन समय के कम से कम राशि के साथ शोर अनुपात करने के लिए एक अच्छा संकेत प्राप्त करने के लिए धुंधला स्थिति अनुकूलन।
      दो नोट: इस तरह के apoptosis के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया से बाहर लीक नहीं करता कि Mitotracker लाल CMXRos, Mitotracker डीप रेड एफएम, या Mitotracker ग्रीन एफएम, के रूप में माइटोकॉन्ड्रिया के लिए फ्लोरोसेंट दाग का प्रयोग करें। इस apoptosis और Anastasis दौरान माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान visualizing अनुमति देता है। इन दाग के बारे में जानकारी के लिए सामग्री और उपकरणों की तालिका देखें।
    2. Photobleaching से बचने के लिए अंधेरे में दाग कोशिकाओं रखें।
    3. कोशिकाओं धोने से अतिरिक्त दाग को दूरफिर एक मिनट प्रत्येक धोने के बीच ताजा माध्यम में ऊष्मायन, और साथ 37 डिग्री सेल्सियस फॉस्फेट बफर (पीबीएस) खारा समाधान या ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से, के साथ 3 बार आगे अत्यधिक अनुमति देने के लिए अंतिम धोने से पहले 20 मिनट के लिए ताजा माध्यम में सेते दाग इमेजिंग के लिए गैर विशिष्ट संकेत पृष्ठभूमि को कम करने के लिए कोशिकाओं बाहर निकलने के लिए।
      नोट: धुंधला इमेजिंग के लिए उच्च पृष्ठभूमि में हो सकता है के बाद सेल के माध्यम से ऊष्मायन बार छोटा।
    4. Apoptotic प्रेरण लागू होने के पहले छवि स्वस्थ कोशिकाओं को वास्तविक समय रहते सेल confocal या महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन (लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के लिए प्रोटोकॉल 3 देखें)।
      नोट: स्वस्थ कोशिकाओं को सबसे अधिक प्रकार की कोशिकाओं में (आंकड़े -1 डी, 1F, 1G) ट्यूबलर माइटोकॉन्ड्रिया और गोल नाभिक प्रदर्शित करते हैं।
    5. (कोशिकाओं के लिए आवेदन और apoptotic उत्तेजनाओं को हटाने के लिए प्रोटोकॉल 2 देखें) apoptosis से गुजरना करने के लिए कोशिकाओं को ट्रिगर।
    6. माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु morpholog में परिवर्तन निरीक्षण करने के लिए जीवित सेल माइक्रोस्कोपी समय चूक जारी रखेंमौत प्रोत्साहन कोशिकाओं को लागू किया जाता है के तुरंत बाद एँ। ट्यूबलर माइटोकॉन्ड्रिया और गोल नाभिक को प्रदर्शित करने के लिए स्वस्थ कोशिकाओं के विपरीत, इस तरह के mitochondrial विखंडन और सूजन, क्रोमेटिन संक्षेपण और परमाणु विखंडन के रूप में apoptosis की पहचान प्रदर्शित करने के लिए कोशिकाओं का पालन।
    7. कोशिकाओं apoptosis की पहचान प्रदर्शित करते हैं, धोने और ताजा माध्यम के साथ कोशिकाओं की आपूर्ति, और कोशिकाओं के भाग्य को ट्रैक करने के लिए समय चूक इमेजिंग जारी है। Apoptosis को रिवर्स कि कोशिकाएं सामान्य माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु आकारिकी (आंकड़े -1 डी, 1F, 1G) हासिल।
      नोट: कोशिकाओं (डीआईसी माइक्रोस्कोपी के लिए प्रोटोकॉल 4.1 देखें) के एक ही समूह में सेल आकृति विज्ञान के परिवर्तन को देख कर apoptosis के चरणों तक पहुँचने के लिए अतिरिक्त जानकारी प्राप्त करने के लिए संभव है जब समानांतर में डीआईसी माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन।
  3. Stably एक साइटोक्रोम -GFP संलयन जनसंपर्क व्यक्त कोशिकाओं का उपयोग कर साइटोक्रोम की माइटोकॉन्ड्रियल रिहाई की जांचotein (चित्र 2 देखें)।
    1. Stably Mitotracker लाल के साथ -GFP 23,24 सी साइटोक्रोम व्यक्त दाग कोशिकाओं ध्रुवीकृत सेल माइटोकांड्रिया (लाइव सेल माइटोकॉन्ड्रिया धुंधला के लिए 4.2.3 करने के लिए कदम 4.2.1 देखें) लेबल करने के लिए।
    2. स्वस्थ कोशिकाओं (सेल रहते इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल 3 में विवरण) को ट्रैक करने के लिए वास्तविक समय रहते सेल confocal या महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन।
      नोट: साइटोक्रोम -GFP संकेत मुख्य रूप से स्वस्थ कोशिकाओं (आंकड़े 2A मैं, 2 बी) के माइटोकॉन्ड्रिया में localizes।
    3. (कोशिकाओं के लिए आवेदन और apoptotic उत्तेजनाओं को हटाने के लिए प्रोटोकॉल 2 देखें) apoptosis से गुजरना करने के लिए कोशिकाओं को ट्रिगर। साइटोसॉल को माइटोकॉन्ड्रिया से साइटोक्रोम -GFP के स्थानान्तरण निरीक्षण करने के लिए समय चूक माइक्रोस्कोपी जारी रखें (आंकड़े 2Aii-III, 2 बी)।
      नोट: साइटोसॉल में साइटोक्रोम की Mitochondrial रिहाई माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली permeabilization के एक मार्कर है (MOMP)4, माइटोकॉन्ड्रिया पर निर्भर apoptosis को 21,22 में एक महत्वपूर्ण कदम
    4. कोशिकाओं कोशिका द्रव्य में साइटोक्रोम -GFP संकेत प्रदर्शित करते हैं, कोशिका मृत्यु प्रोत्साहन हटाने, और आपूर्ति कोशिकाओं ताजा माध्यम के साथ (प्रोटोकॉल 2 देखें)। साइटोसोलिक GFP के साथ कोशिकाओं के भाग्य को ट्रैक करने के लिए समय चूक इमेजिंग जारी रखें।
      नोट: सामान्य कोशिका आकृति विज्ञान हासिल apoptosis को रिवर्स कि कोशिकाओं, और माइटोकॉन्ड्रिया वापस करने के लिए संभवतः गिरावट या स्थानान्तरण के माध्यम से अपने साइटोसोलिक साइटोक्रोम -GFP संकेत को कम (आंकड़े 2Aiv-सातवीं, 2 बी)।
    5. एकल कक्षों या कोशिकाओं के समूह (डीआईसी माइक्रोस्कोपी के लिए प्रोटोकॉल 4.1 देखें) में सेल आकारिकी में परिवर्तन देख द्वारा apoptosis के चरणों तक पहुँचने के लिए अतिरिक्त जानकारी प्राप्त करने के लिए समानांतर में डीआईसी छवियों पर कब्जा।
  4. एक कस्पासे biosensor का उपयोग कर कस्पासे गतिविधि की जांच (चित्रा 3 देखें)
    1. के लिए कस्पासे biosensor एनईएस-DEVD-YFP-एनएलएस साथ transfect कोशिकाओं16 एक apoptotic प्रोत्साहन 13 करने के लिए उन्हें subjecting से पहले घंटा 24 को।
    2. (लाइव सेल परमाणु धुंधला के लिए कदम 4.2.3 के लिए 4.2.1 देखें) सेल नाभिक लेबल करने के लिए Hoechst 33342 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट संस्कृतियों दाग।
    3. स्वस्थ कोशिकाओं (सेल रहते इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल 3 में विवरण) को ट्रैक करने के लिए वास्तविक समय रहते सेल confocal या महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन।
      नोट: एनईएस-DEVD-YFP-एनएलएस biosensor संकेत मुख्य रूप से अपने परमाणु निर्यात संकेत (एनईएस) (आंकड़े 3 ए, 3Bi और -3 सी, चर्चा देखें) की वजह से स्वस्थ कोशिकाओं की cytosol में localizes।
    4. (कोशिकाओं के लिए आवेदन और apoptotic उत्तेजनाओं को हटाने के लिए प्रोटोकॉल 2 देखें) apoptosis से गुजरना करने के लिए कोशिकाओं को ट्रिगर। YFP के परमाणु स्थानान्तरण निरीक्षण करने के लिए समय चूक माइक्रोस्कोपी जारी रखें।
      नोट: caspases cleaves के सक्रियण नाभिक को cytosol से YFP-एनएलएस स्थानान्तरण में जिसके परिणामस्वरूप कस्पासे biosensor एनईएस-DEVD-YFP-एनएलएस में DEVD आकृति, (आंकड़े 3 ए, 3Bii-चतुर्थ, चर्चा देखें)।
    5. Apoptosis के सामान्य कोशिका आकृति विज्ञान हासिल रिवर्स कि सेल, लेकिन परमाणु YFP संकेत (आंकड़े 3Bv-एक्स, प्रकोष्ठों 1 और 2, और 3 डी) बनाए रखने के लिए: ध्यान दें।
    6. परमाणु YFP प्रदर्शित कि कोशिकाओं के भाग्य को ट्रैक करने के लिए समय चूक इमेजिंग जारी रखें।
      नोट: परमाणु YFP संकेत कोशिकाओं apoptosis के उलट जाने के बाद (आंकड़े -3 बी, VI-एक्स, सेल 1, परिणाम और चर्चा देखें) अपमानित कई घंटे बन संभवतः ऐसे Proteasome गिरावट के रूप में सामान्य सेल निकासी तंत्र के माध्यम से होगा।
    7. सेल एकल कक्षों में आकृति विज्ञान या कोशिकाओं के एक समूह में परिवर्तन देख द्वारा apoptosis के चरणों तक पहुँचने के लिए अतिरिक्त जानकारी प्राप्त करने के लिए समानांतर में डीआईसी छवियों पर कब्जा। (डीआईसी माइक्रोस्कोपी के लिए प्रोटोकॉल 4.1 देखें)।
  5. Phosphatidylserine की कोशिका की सतह जोखिम (चित्रा 4 देखें)
    1. जीएल पर बीज कोशिकाओंगधा 80% सेल confluency (प्रोटोकॉल 1 देखें) प्राप्त करने के लिए coverslips।
    2. (लाइव सेल माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु धुंधला के लिए कदम 4.2.3 के लिए 4.2.1 देखें) क्रमशः माइटोकॉन्ड्रिया और नाभिक, के लिए लाल फ्लोरोसेंट Mitotracker और नीले Hoechst 33342 दाग के साथ कोशिकाओं सह दाग।
    3. एक apoptosis के inducer के उपयोग करके apoptosis से गुजरना करने के लिए कोशिकाओं को ट्रिगर (प्रोटोकॉल 2 देखें)।
    4. Apoptotic कोशिकाओं की सतह पर phosphatidylserine के जोखिम का पता लगाने में apoptosis के inducer के हटाने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर apoptotic कोशिकाओं 10 मिनट दाग फ्लोरोसेंट लेबल Annexin वी (सामग्री देखें) लागू करें।
      नोट 1: phosphatidylserine सामान्य रूप से सेल प्लाज्मा झिल्ली 38 के भीतरी-पत्रक पर तनहा है क्योंकि स्वस्थ कोशिकाओं Annexin वी के साथ दाग नहीं कर रहे हैं। Apoptotic कोशिकाओं कोशिका की सतह (आंकड़े -4 ए और 4 बी) पर phosphatidylserine को बांधता है जो Annexin वी, साथ दाग रहे हैं।
      नोट 2: फ्लोरोसेंट लेबल Annexin वी भी apoptotic कोशिकाओं आई एम एम दाग के लिए लागू किया जा सकता हैediately 10 मिनट ऊष्मायन के साथ apoptosis के inducer के हटाने के बाद।
    5. , कोशिका मृत्यु प्रोत्साहन निकालें एक बार गर्म पीबीएस या ताजा माध्यम के साथ दाग धोने कोशिकाओं, और फिर 5% सीओ 2 (प्रोटोकॉल 2 देखें) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए ताजा माध्यम के साथ कोशिकाओं की आपूर्ति।
      नोट 1: apoptosis के सामान्य आकृति विज्ञान पाने और सामान्य आकृति विज्ञान वापस आ जाने के बाद fluorescently लेबल Annexin वी संकेत बनाए रखने के उलट है कि कोशिकाओं (आंकड़े -4 ए, और 4 बी)।
      नोट 2: Annexin वी संकेत बरामद कोशिकाओं (चर्चा देखें) पर समय के साथ कम हो जाती है।
    6. कमरे के तापमान पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए 1x पीबीएस में 8% सूक्रोज युक्त 4% paraformaldehyde के साथ चुना समय बिंदुओं पर कोशिकाओं को ठीक करें, और गिलास स्लाइड पर कोशिकाओं बढ़ते से पहले paraformaldehyde के दूर करने के लिए 3 बार के लिए पीबीएस के साथ तय की कोशिकाओं को धोने antifade mountant साथ coverslips confocal या महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए (सामग्री देखें) और apoptosis inducer के हटाने के बाद कोशिकाओं पर Annexin वी निरीक्षण करते हैं।
      नोट 1: लगानेवाला में सुक्रोज निर्धारण के दौरान कोशिका झिल्ली संरचना को बरकरार रखता है।
      नोट 2: गिरावट को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में paraformaldehyde समाधान स्टोर।
      3 नोट: कोशिकाओं को ठंड के झटके से बचने के लिए निर्धारण के लिए कोशिकाओं को लागू करने से पहले कमरे के तापमान को paraformaldehyde समाधान गर्म।

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Representative Results

Apoptosis के उत्क्रमण का अध्ययन करने के लिए, टिशू कल्चर कोशिकाओं पहले apoptosis को ट्रिगर करने के लिए एक मौत की उत्तेजना को उजागर कर रहे हैं। कोशिकाओं apoptosis की पहचान प्रदर्शित करते हैं, ताजा संस्कृति के माध्यम से फिर प्रोत्साहन दूर धोने और फिर वसूली (चित्रा 1 ए) की अनुमति देने के लिए मर कोशिकाओं सेते लिए आवेदन किया है। इधर, संबोधित किया जा रहा महत्वपूर्ण सवाल व्यक्ति मर संवर्धित कोशिकाओं में apoptosis की दिशा में प्रगति और अभी भी Anastasis गुजरना कर सकते हैं कितनी दूर है। इस सवाल निश्चित नीचे वर्णित तरीकों का उपयोग सेल भाग्य को ट्रैक करने के लिए बायोमार्कर के साथ सतत निगरानी से उत्तर दिया जा सकता है।

हम पहली दौरान, ट्रैकिंग के लिए आवश्यक है, जो समय-चूक लाइव सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर, और इससे पहले कि व्यक्ति की कोशिकाओं की प्रतिक्रिया रिकॉर्डिंग से टिशू कल्चर कोशिकाओं में apoptosis के उलट पता लगाने के लिए हमारी रणनीति का वर्णन है, और एक apoptotic प्रोत्साहन 12,13 के लिए जोखिम के बाद। उनके जुड़ी सब्सट्रेट पर फैल स्वस्थ पक्षपाती कोशिकाओं (चित्रा 1Bi) 12,13, और filamentous माइटोकॉन्ड्रिया और इलाज के लिए पहले दौर नाभिक प्रदर्शित (आंकड़े 1Ci, डि, EI, फाई, सैनिक) 12,13। सेल संस्कृति माध्यम (खंड / खंड) में 3.8-4.5% इथेनॉल के लिए प्रदर्शन के बाद, डीआईसी या चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं साइटोप्लास्मिक संक्षेपण, प्लाज्मा झिल्ली blebbing, और सेल संकोचन (आंकड़े 1Bii, 1Cii- सहित apoptosis के रूपात्मक पहचान, प्रदर्शन किया है कि पता चला III, और 1Eii-VI) 12,13। एक ही कोशिकाओं द्वारा apoptotic शरीर गठन आसानी से डीआईसी द्वारा मनाया गया (1Eii छठी आंकड़े)। Mitotracker लेबल माइटोकॉन्ड्रिया के विखंडन 12,13 के साथ ही हेक्स्ट से सना हुआ परमाणु डीएनए के संघनन (आंकड़े 1Dii-III, एफआईआई-III, जी आई आई) 12,13, और नाभिक के विखंडन (1Dii-III, 1Fii छठी आंकड़े) (अंजीरures 1Evi और Fvi, सफेद तीर), confocal या महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा एक साथ पाया गया। सफलतापूर्वक apoptosis के उलट कोशिकाओं है कि बाद में जाहिरा तौर पर उनके नुकसान की मरम्मत, सामान्य आकृति विज्ञान हासिल करने के लिए मनाया गया (आंकड़े 1Biii, सी और डिव-VI, ई और Fvii-बारहवीं, और Giii) 12,13। इन शर्तों के तहत कोशिकाओं को भी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन क्वांटम डॉट्स और कोशिका विभाजन 13 के तेज के आधार पर organelle गतिशीलता, सेल प्रवास, और कार्यात्मक endocytosis हासिल करने के लिए दिखाया गया था। दिलचस्प है, श्रद्धेय apoptosis के अनियमित परमाणु आकारिकी (चित्रा 1Fxii), और भी असामान्य कोशिकाओं के विभाजन और micronuclei के गठन प्रदर्शित कि कुछ कोशिकाओं को 13, विभाजित कोशिकाओं में डीएनए की क्षति, गुणसूत्र टूटना और पूरे गुणसूत्र नुकसान का एक बायोमार्कर है जो (1Giv-सातवीं आंकड़े) 39, 40। विस्थापित गhromosomes या गुणसूत्र टुकड़े बाहर परमाणु झिल्ली 39, 40 से संलग्न हैं बेटी सेल नाभिक में शामिल किया जाना असफल। इस प्रकार, Anastasis का एक परिणाम tumorigenesis और कैंसर की प्रगति के लिए अग्रणी, गर्भपात apoptosis के दौरान क्षतिग्रस्त हो गए थे कि जीनोम की शरण हो सकता है। micronuclei की उपस्थिति भी कैंसर की कोशिकाओं 40,41 में आम है।

माइटोकॉन्ड्रियल साइटोक्रोम की रिहाई के लिए मध्यस्थता या कस्पासे निर्भर apoptosis को 20-22 बढ़ाना करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। Stably GFP टैग साइटोक्रोम व्यक्त कि HELA कोशिकाओं का उपयोग करना, हम confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा apoptosis और Anastasis दौरान साइटोक्रोम के subcellular स्थानांतरण पर नजर रखी। एक की मौत प्रोत्साहन 2Aii (आंकड़े लागू किया गया था के बाद सूचना दी 23,24, जैसा कि तब (आंकड़े 2Ai और बी) से पहले इलाज के लिए माइटोकॉन्ड्रिया के लिए स्थानीय, लेकिन साइटोक्रोम -GFP, साइटोसॉल में जारी किया गया था2Aiii और बी)। ऐसे mitochondrial विखंडन और प्लाज्मा झिल्ली blebbing के रूप में अन्य विशेषता morphologies, भी साइटोक्रोम -GFP (चित्रा 2Aiii) जारी किया था कि कोशिकाओं में मनाया गया। इन कोशिकाओं को साइटोक्रोम 23-27 की रिहाई के बाद शीघ्र ही कोशिका मृत्यु गुजरना करने के लिए सूचित किया गया है। हालांकि, मौत के प्रोत्साहन के हटाने के बाद, हम साइटोसोलिक साइटोक्रोम -GFP स्तरों माइटोकॉन्ड्रिया filamentous संरचनाओं आ गया है, और प्लाज्मा झिल्ली एक सामान्य उपस्थिति बरामद, मना कर दिया कि मनाया (आंकड़े 2Aiv-सातवीं, और बी)। इसलिए, apoptotic कोशिकाओं साइटोक्रोम की माइटोकॉन्ड्रियल रिहाई के बाद Anastasis गुजरना कर सकते हैं।

नीचे की ओर DEVD-cleaving caspases का प्रवर्धन आम तौर पर apoptosis के 2,5 में "नहीं लौटने की बात" माना जाता है। इसलिए, हम एक कस्पासे biosensor एनईएस-DEVD-YFP-एनएलएस expr इस्तेमाल कियाक्या यह संभव है कि पहले कस्पासे गतिविधि (चित्रा 3 ए) का अनुभव किया है कि जीवित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए कर रही है, एक प्लाज्मिड 13 से essed। इस कस्पासे biosensor एक एन टर्मिनल परमाणु बहिष्कार संकेत (एनईएस), के साथ एक linker कस्पासे -3 एक पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) द्वारा पीछा / 7 आम सहमति दरार साइट (DEVD) 26,42,43, और एक साथ एक पॉलीपेप्टाइड है सी टर्मिनल परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस)। स्वस्थ कोशिकाओं में, इस biosensor मुख्य रूप से एनईएस के एक समारोह के रूप में साइटोसॉल को localizes 13 (3Bi, सीआई-चतुर्थ, और डी आंकड़े)। Apoptosis के दौरान सक्रिय caspases कुशलता से एक साथ, या बाद में, इस तरह के डीएनए / क्रोमेटिन संक्षेपण और सेल संकोचन (आंकड़े -3 बी द्वितीय के रूप में apoptosis की अन्य सुविधाओं को प्रदर्शित कि कोशिकाओं में नाभिक को cytosol से translocates जो YFP-एनएलएस, रिहा DEVD आकृति फोड़ना -IV, और डी) 13। इस प्रकार,एसई कोशिकाओं कस्पासे सक्रियण के बाद परमाणु आयात समारोह बरकरार रहती है। Apoptosis के inducer के हटाने के बाद, कस्पासे सक्रियण (आ गई है, के बाद भी Anastasis प्रदर्शन रूपात्मक वसूली से गुजरना है कि कोशिकाओं, 3Bv-X आंकड़े और डी) 13, जाहिरा तौर पर देर से मंच apoptosis के पीछे। वे मौत प्रोत्साहन (आंकड़े 3Bv-एक्स, सेल 1) 13 के हटाने के बाद apoptosis को उल्टा करने के लिए शुरू करने के समय सामान्य आकृति विज्ञान की वसूली के दौरान, परमाणु YFP संकेत कोशिकाओं संभवतः द्वारा, कस्पासे cleaved biosensor नीचा, सुझाव है कि कुछ कोशिकाओं में तीव्रता में कम हो जाती है इस्तेमाल किया उसी तंत्र के दौरान और Anastasis के बाद अन्य कस्पासे cleaved उत्पादों को दूर करने के लिए।

Anastasis भी जीवित सेल माइक्रोस्कोपी के बिना पता लगाया जा सकता है। इस बांध और निशान apoptosis में एक प्रारंभिक कदम (कम से phosphatidylserine (पीएस) externalized, जो fluorescently लेबल Annexin वी 38,44 का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है 38 के प्लाज्मा झिल्ली के भीतरी पत्रक के लिए प्रतिबंधित है के रूप में उदाहरण के लिए, स्वस्थ और इलाज नवजात चूहे प्राथमिक हृदय निलय myocytes, Annexin वी (चित्रा 4 बी) 13 के साथ लेबल नहीं किया जा सकता। इसके विपरीत, इथेनॉल प्रेरित apoptotic मर कोशिकाओं कोशिका की सतह (चित्रा 4 बी) 13 पर phosphatidylserine का पर्दाफाश, और इसलिए, फ्लोरोसेंट Annexin वी 38,44 के साथ लेबल किया जा सकता है। ज़ाहिर, Annexin वी-लेबल की कोशिकाओं प्राथमिक cardiomyocytes (चित्रा 4 बी) 13 apoptosis के उलट है, सुझाव है कि मौत उत्तेजनाओं को हटाने के बाद सामान्य आकृति विज्ञान हासिल कर सकते हैं। दूसरों को पहले से विवो में हो सकता है apoptosis के से कि वसूली का सुझाव के लिए एक समान रणनीति आवेदन किया है। क्षणिक इस्कीमिक चोट का इन विवो मॉडल में, खरगोशों में cardiomyocytes और चूहों के कस्पासे निर्भर Annexin वी लेबलिंग जाहिरा तौर पर फिर सेजीवित पशुओं में हो सकता है कि Anastasis, सुझाव क्षणिक ischemia के 45 के बाद कोशिकाओं को जीवित द्वारा Annexin वी के internalization में sulted। इसके अलावा, दो अन्य अध्ययनों से एक (बीसीएल एक .3B3 में apoptosis प्रेरित कि विरोधी इम्युनोग्लोबुलिन एंटीबॉडी उजागर करने के लिए) एक .3B3 बी लिंफोमा कोशिकाओं Annexin वी लेबल माउस बीसीएल के अंश और माउस स्तन कार्सिनोमा तापमान व्यक्त रक्षा मंत्रालय कोशिकाओं की पहचान करने के लिए छँटाई सेल का इस्तेमाल किया -sensitive p53 (उस के बाद अनुमोदक तापमान नीचे incubated apoptosis के कारण बनता है) वे सामान्य संस्कृति शर्तों 14,15 को लौट रहे थे के बाद पैदा करना जारी रखा। सामूहिक रूप से, इन अध्ययनों Annexin वी रहते सेल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग बिना apoptosis के उलट है कि कोशिकाओं के भाग्य का निर्धारण करने के लिए उपयोगी सुझाव है कि। Annexin वी प्रतिदीप्ति है, ताकि मृत्यु के प्रोत्साहन के हटाने के बाद केवल कुछ ही घंटे के लिए पहचाने जाने शेष (चित्रा 4 बी) 13, स्थायी नहीं है लेकिन, जैसा कि इस रणनीति के साथ निरंतर कर रहे हैं,इन तरीकों apoptosis के उलट है कि कोशिकाओं के दीर्घकालिक ट्रैकिंग प्रदान नहीं कर सकते।

चित्र 1
चित्रा 1: लाइव सेल इमेजिंग द्वारा apoptosis के उलट ट्रैकिंग। (- डी, और जी। आंकड़े 1A के लिए, तांग एट अल, MBoC 23, 2240-2252 में 13 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित)। Apoptosis को उत्पन्न करने और बाद में संवर्धित कोशिकाओं को apoptosis inducer के दूर धोने के बाद ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए (ए) दृष्टिकोण। (इलाज) स्वस्थ प्राथमिक माउस जिगर की कोशिकाओं (बी) समय चूक जीवित कोशिका चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी, इलाज किया गया है कि कोशिकाओं के एक ही समूह 5 घंटा (इलाज), और फिर धोया और आगे (धोया) 24 घंटा के लिए ताजा संस्कृति के माध्यम से incubated के लिए मध्यम संस्कृति (खंड / खंड) में 4.5% इथेनॉल के साथ। स्केल बार, 100 माइक्रोन। (सी) etha से पहले ही प्राथमिक माउस जिगर सेल की सतत समय व्यतीत लाइव सेल महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपीNol 2.5 घंटा (द्वितीय और तृतीय), और धोने के बाद के लिए सेल संस्कृति माध्यम में 4.5% इथेनॉल के साथ इलाज के बाद संकेत समय पर उपचार (मैं), और 1 घंटे के लिए वसूली की अनुमति के लिए ताजा माध्यम के साथ incubating (चतुर्थ - VI)। Mitotracker से सना हुआ माइटोकांड्रिया (लाल) और Hoechst से सना हुआ नाभिक (नीला) के विलय छवियों डीआईसी माइक्रोस्कोपी द्वारा महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, और सेल आकृति विज्ञान द्वारा कल्पना थे। स्केल बार, पैनल सी से 10 माइक्रोन। (डी) विलय प्रतिदीप्ति छवियों केवल (डीआईसी) के बिना organelle morphologies प्रकट करते हैं। (ई) इथेनॉल इलाज से पहले मानव छोटे सेल फेफड़ों कार्सिनोमा H446 कोशिकाओं की सतत समय व्यतीत रहते सेल confocal माइक्रोस्कोपी (मैं) 2 घंटा 28 मिनट (द्वितीय छठी) के लिए सेल संस्कृति माध्यम में 3.8% इथेनॉल के साथ इलाज के बाद, और धोने के बाद और वसूली (सात-बारहवीं) की अनुमति देने के लिए नए सिरे से मध्यम के साथ incubating। Mitotracker से सना हुआ माइटोकांड्रिया (लाल) और Hoechst से सना हुआ नाभिक (नीला) के विलय छवियों confocal माइक्रोस्कोपी, और ग द्वारा कल्पना थे डीआईसी माइक्रोस्कोपी द्वारा पक्ष आकृति विज्ञान। व्हाइट तीरों apoptotic निकायों (vi) में एक खंडित नाभिक से संकेत मिलता है। स्केल बार, 10 माइक्रोन। (एफ) विलय केवल (डीआईसी) के बिना प्रतिदीप्ति छवियों पैनल से organelle morphologies प्रकट करते हैं। (जी) सतत imprecise कोशिका विभाजन से होकर गुजरती है कि एक एकल HeLa सेल की मोनोक्रोम हेक्स्ट से सना हुआ परमाणु इमेजिंग के लिए समय चूक लाइव सेल महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी। 5 घंटे के लिए सेल संस्कृति माध्यम में 4.3% इथेनॉल के साथ इथेनॉल उपचार (मैं), इलाज से पहले (ii) और इथेनॉल हटाने के बाद (धोया, तृतीय-VI)। पैनलों चतुर्थ असामान्य कोशिका विभाजन का पता चलता है। लाल तीर विभाजित कोशिकाओं (iv- vi) में प्रमुख नाभिक से संकेत मिलता है। स्केल बार, 30 माइक्रोन। टाइम्स घंटा के रूप में संकेत कर रहे हैं:। मिनट में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2: के दौरान साइटोक्रोम की माइटोकॉन्ड्रियल रिहाई (ए) stably (मैं) से पहले साइटोक्रोम -GFP (Cyto सी -GFP) व्यक्त हेला कोशिकाओं की सतत समय व्यतीत रहते सेल confocal माइक्रोस्कोपी के बाद apoptosis के उत्क्रमण का पता लगाने (II-III) और सेल संस्कृति माध्यम में 3.9% इथेनॉल (iii-सात) प्रदर्शन के बाद। CytoC-GFP (हरा), Mitotracker से सना हुआ माइटोकांड्रिया (लाल), और Hoechst से सना हुआ नाभिक (नीला) का विलय कर दिया confocal छवियों डीआईसी छवियों (बाएं पैनल) के साथ संयुक्त कर रहे हैं। अनमर्ज संस्करणों एक संकेत तीव्रता की गर्मी नक्शा (बाएं मध्यम पैनल), CytoC-GFP (मध्यम पैनल) की मोनोक्रोम छवि, और माइटोकॉन्ड्रिया के मोनोक्रोम छवि (दाएं मध्यम पैनल) के रूप में प्रस्तुत किया है, CytoC-GFP के लिए अलग से दिखाए जाते हैं। CytoC-GFP और माइटोकांड्रिया (सही पैनल) के विलय छवियों। (बी) कोशिकाओं, cel की साइटोसोलिक साइटोक्रोम सी-GFP संकेत तीव्रता के परिवर्तनपैनल पर मोनोक्रोम CytoC-GFP छवि में संकेत के रूप में एल 1 और सेल 2,। टाइम्स घंटा के रूप में संकेत कर रहे हैं:। मिनट में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: (आंकड़े 3A के लिए तांग एट अल, MBoC 23, 2240-2252 में 13 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित, - डी।) कस्पासे सक्रियण के बाद apoptosis के उत्क्रमण का पता लगाने। लाइव एक परमाणु निर्यात संकेत (एनईएस), DEVD कस्पासे दरार साइट, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP), और परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) से बना कस्पासे biosensor संलयन प्रोटीन (ए) आरेख। (बी) सतत समय चूक दौरान कस्पासे biosensor एनईएस-DEVD-YFP-एनएलएस (मैं) से पहले, व्यक्त हेला कोशिकाओं के सेल confocal माइक्रोस्कोपी (द्वितीय -IV) और सेल संस्कृति माध्यम में 4.3% इथेनॉल के लिए (VX) प्रदर्शन के बाद। कस्पासे biosensor (हरा) का विलय कर दिया confocal छवियों, हेक्स्ट से सना हुआ नाभिक (नीला) और डीआईसी छवियों (बाएं पैनल), YFP संकेत (मध्यम पैनल) के एक मोनोक्रोम छवियों, और YFP संकेत तीव्रता का संकेत गर्मी नक्शा (सही पैनल) । (सी) इलाज के दौरान पहले पैनल बी (डी) (पैनल द्विपक्षीय में 1 और 2 गिने) व्यक्ति की कोशिकाओं में सक्रिय परमाणु कस्पासे biosensor के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता मात्रा निर्धारित है, के रूप में विश्लेषण नियंत्रण, और इथेनॉल के प्रदर्शन के बाद, और अनुपचारित नियंत्रण में (पैनल Ci में 3 और 4 गिने) नाभिक (परमाणु / कुल सेल YFP संकेत तीव्रता एक्स 100%) में YFP वर्तमान के प्रतिशत के रूप में गणना की गई। टाइम्स घंटा के रूप में संकेत कर रहे हैं: मि। स्केल बार, 10 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ays "> चित्रा 4
चित्रा 4: फ्लोरोसेंट लेबल Annexin वी द्वारा apoptosis के उत्क्रमण का पता लगाने (। - बी आंकड़े -4 ए के लिए, तांग एट अल, MBoC 23, 2240-2252 में 13 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित)। पैनल बी (बी) प्राथमिक हृदय निलय myocytes 5 घंटे के लिए सेल संस्कृति माध्यम में 4.5% इथेनॉल के संपर्क में है, और फिर 10 के लिए Annexin वि FITC के साथ incubated रहे थे नवजात चूहे में इस्तेमाल Annexin वि FITC Anastasis परख की (ए) आरेख न्यूनतम इथेनॉल मध्यम के हटाने से पहले। कोशिकाओं या तो तुरंत तय (इलाज), या एक अतिरिक्त 2 घंटा वसूली के लिए ताजा माध्यम के साथ refeeding के बाद तय किया गया (धोया)। Annexin वि FITC अवगत कराया गया कि अनुपचारित कोशिकाओं नियंत्रण (इलाज) के रूप में सेवा करते हैं। Mitotracker से सना हुआ माइटोकांड्रिया (लाल), हेक्स्ट से सना हुआ नाभिक (नीला) और Annexin वि FITC (हरा) confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना कर रहे थे, और सेल आकृति विज्ञान डीआईसी माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की गई थी। सुप्रीम कोर्टशराब बार, 10 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Anastasis कोशिका मृत्यु मार्ग सक्रिय कर लिया है कि कोशिकाओं बाद मरने की प्रक्रिया रिवर्स और जीवित रहते हैं जहां घटना को दर्शाता है। यहाँ, हम जीना सेल इमेजिंग वास्तव में एक ही व्यक्ति की कोशिकाओं एक देर चरण में apoptotic कोशिका मृत्यु की प्रक्रिया रिवर्स, और फिर जीवित और reproducing जारी रख सकते हैं, इसकी पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया है। हमारी प्रोटोकॉल apoptosis को उत्पन्न करने और सत्यापन के लिए कई बायोमार्कर के साथ नजर रखी apoptosis के पलटने से गुजरना करने के लिए कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा अनुमति देने के लिए कई अनुकूलित सेल प्रकार विशिष्ट उपचार स्थितियों का वर्णन है। तकनीकी मुद्दों के बारे में, गिलास नीचे व्यंजन क्योंकि उच्च वृद्धि में उच्च गुणवत्ता confocal या महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए लंबे समय तक काम दूरी की अनुमति देता है जो कोशिकाओं और खुर्दबीन उद्देश्य के बीच अत्यधिक पारदर्शी पतली गिलास, के, इमेजिंग 12,13 के लिए संस्कृति कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया, mitochondrial विखंडन सहित क्लासिक apoptosis के अवलोकन की सुविधा, साइटोक्रोम सी, और परमाणु संक्षेपण और विखंडन की रिहाई। ग्लास भी apoptosis के दौरान झिल्ली blebbing, कोशिकाओं के सेल संकोचन, और apoptotic शरीर गठन की निगरानी के लिए उच्च गुणवत्ता डीआईसी माइक्रोस्कोपी अनुमति देने के लिए, प्रकाश के polarity बिगाड़ना नहीं करता है। डीआईसी सेल morphologies का पता लगाने में सुधार, बेदाग और पारदर्शी सेल के नमूने के विपरीत बढ़ाता रूप में डीआईसी माइक्रोस्कोपी, apoptosis के इन रूपात्मक पहचान निरीक्षण करने के लिए चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी से अधिक लाभ है। डीआईसी और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी उपलब्ध नहीं हैं, तो CellTracker confocal या महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए जीवित कोशिकाओं की आकृति विज्ञान रूपरेखा और सेल आकृति विज्ञान की निगरानी के लिए साइटोसॉल दाग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

मौत उत्तेजनाओं की उचित खुराक के आवेदन और उत्तेजनाओं को हटाने की रणनीतियों Anastasis का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। हम प्रयोगों Descr के लिए एक मौत प्रोत्साहन के रूप में इथेनॉल की कम मात्रा का उपयोग करने के लिए चुना हैibed यहां इलाज कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत समान रूप से apoptosis से गुजरना कर सकते हैं और संभवतः, इस से मामूली ठीक हो सकता है, क्योंकि मृत्यु प्रोत्साहन। हम 12,13 सूचना दी है फिर भी, जैसा इन तरीकों इसके अलावा, अन्य मृत्यु उत्तेजनाओं के साथ सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है। हालांकि, कुछ मौत उत्तेजनाओं ऐसी staurosporine (अजजा), आमतौर पर इस्तेमाल किया apoptosis के उत्प्रेरण एजेंट के रूप में दूसरों की तुलना में स्वाभाविक रूप से अधिक चुनौती दे रहे हैं। यह उच्च आत्मीयता 46-48 के साथ अपने substrates के बांधता है, शायद क्योंकि दोहराया washes के लिए आवश्यक हैं, लेकिन अभी भी कुशलता से कोशिकाओं से अनुसूचित जनजातियों को दूर नहीं कर सकते हैं। इस मामले में, अभी भी apoptotic मरने की प्रक्रिया को सक्रिय कर सकते हैं कि कम दवा सांद्रता और छोटी दवा ऊष्मायन समय का उपयोग कर अधिक कोशिकाओं apoptosis को उल्टा करने के लिए अनुमति देने के लिए उपयोगी हो सकता है। री-खिला भी ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से बेहतर apoptosis के उलट वृद्धि कर सकते हैं वातानुकूलित सेल संस्कृति के माध्यम से कोशिकाओं। Apoptotic कोशिकाओं आमतौर पर शिथिल विशेष रूप से कांच सुर पर संस्कृति डिश सतह से जुड़े होते हैंचेहरे, इसलिए यह कोशिकाओं detaching से बचने के लिए धीरे apoptosis के inducers दूर धोने के लिए महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से एक करने के लिए कोशिकाओं के प्रदर्शन के बाद, सेल संस्कृति व्यंजन की कांच की सतह पर ठीक से संलग्न करने के लिए, इस तरह के cardiomyocytes 37 के रूप में कोशिकाओं के कुछ प्रकार की अनुमति के लिए सेल के पालन में वृद्धि कर सकता पाली डी lysine, मज्जा और / या फ़ाइब्रोनेक्टिन के साथ कांच के बर्तन कोटिंग मौत प्रोत्साहन।

apoptosis की प्रक्रिया है, और apoptosis की संभावना उलट, तापमान से प्रभावित किया जा सकता है कि enzymatic गतिविधियों पर निर्भर करता है। इसलिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर या अपने सामान्य संस्कृति हालत में कोशिकाओं को बनाए रखने के प्रयोगात्मक परिणामों के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए लाइव इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण है। लाइव सेल इमेजिंग शुरू करने से पहले प्री-गर्म माइक्रोस्कोप भी माइक्रोस्कोप घटकों थर्मो-संतुलन तक पहुँचने के लिए अनुमति देता है एक महत्वपूर्ण कदम है। इस वजह से थर्मल विस्तार और संकुचन के लिए ध्यान केंद्रित करने और XY विमान की पारी के बहाव से बच सकते हैंलाइव सेल इमेजिंग के दौरान घटकों। आवेदन या तापमान के कारण या मध्यम की मात्रा में परिवर्तन करने के लिए अभी भी ध्यान देने का बहाव पैदा कर सकता है समय चूक इमेजिंग के दौरान या तो एक pipet के साथ या पूर्व गर्म माइक्रोस्कोपी प्रणाली में छिड़काव द्वारा मध्यम एक संस्कृति डिश बदलकर मौत प्रोत्साहन हटा। Z ढेर अधिग्रहण सही फोकल हवाई जहाज़ पर छवि कोशिकाओं को मदद कर सकता है, लेकिन कारण फ्लोरोसेंट लेज़रों के लिए कोशिकाओं के अतिरिक्त निवेश के लिए phototoxicity का खतरा बढ़ जाएगा। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के एक अवरक्त लेजर आधारित स्वत: ध्यान सुधार प्रणाली के रूप में ध्यान केंद्रित करने के बहाव मुआवजा प्रणाली, का उपयोग, अतिरिक्त बिना कोशिकाओं / ग्लास और उद्देश्य के बीच दूरी बनाए रखने के द्वारा समय व्यतीत लाइव सेल इमेजिंग के दौरान ही फोकल हवाई जहाज़ में कोशिकाओं को रख सकते हैं छोटी तरंग दैर्ध्य, phototoxic प्रतिदीप्ति कोशिकाओं के संपर्क में।

Mitochondrial ऐसे साइटोक्रोम के रूप में apoptogenic प्रोटीन की रिहाई, और इस तरह नीचे की ओर / प्रभाव के रूप में प्रेरक caspases, की सक्रियताया कस्पासे 3 और कस्पासे 7, आम तौर पर apoptotic कोशिका मृत्यु प्रक्रिया 2,5,6 में "नहीं लौटने की बात" माना गया है। पश्चिमी blots कस्पासे 3 की दरार (सक्रियण) और ऐसे apoptotic प्रेरण दौरान पूरे सेल की आबादी में पाली (ADP) -ribose पोलीमर्स -1 (PARP) और DFF45 / ICAD के रूप में और apoptotic को हटाने के बाद अपने substrates के पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है उत्तेजनाओं, और cleaved कस्पासे -3, ICAD, और PARP मौत उत्तेजनाओं को प्रदर्शन के दौरान कोशिकाओं में पता चला है कि पता चला है, लेकिन ताजा संस्कृति के माध्यम से 13 के साथ कोशिकाओं गया के बाद फिर से फीड गायब हो गया। हालांकि, इन तरीकों सेल की आबादी में सामान्य स्थिति का पता चलता है, लेकिन अंत में जीवित रहने के लिए तो apoptosis को रिवर्स और है कि उन लोगों से मर जाएगा कि व्यक्ति की कोशिकाओं भेद नहीं है। माइटोकॉन्ड्रियल साइटोक्रोम की रिहाई का विश्लेषण करने के लिए बायोकेमिकल विभाजन इसी तरह निरंतर है। इसलिए, साइटोक्रोम जारी है और कस्पासे एसी के बाद व्यक्ति की कोशिकाओं के भाग्य को ट्रैक करने के लिएtivation, apoptosis के 2,5,6 की सबसे मान्यता प्राप्त पहचान के दो, इस तरह जीना सेल के साथ संयुक्त एनईएस-DEVD-YFP-एनएलएस यहां इस्तेमाल एक, के रूप में GFP टैग साइटोक्रोम सी (Cyto सी -GFP) और एक कस्पासे biosensor, माइक्रोस्कोपी सीधे रूपात्मक वसूली और एक ही कोशिकाओं में Cyto सी -GFP biosensor के स्थानान्तरण को देख कर इन समस्याओं को दरकिनार। इन परिणामों के माइटोकॉन्ड्रियल साइटोक्रोम जारी है और कस्पासे सक्रियण के बाद apoptosis के उलटने का संकेत मिलता है।

Anastasis के अध्ययन के लिए वर्तमान चुनौती विवो में या इन विट्रो में, उनके जीवन काल के दौरान किसी भी बिंदु पर Anastasis आया है कि कोशिकाओं का पता लगाने के लिए लेबलिंग तकनीक की कमी है। कस्पासे biosensor एनईएस-DEVD-YFP-एनएलएस के स्थिर अभिव्यक्ति caspases भविष्य में फिर से सक्रिय हो रहे हैं, तो भी कस्पासे गतिविधि का पता लगाने के लिए परमिट, लेकिन सक्रिय biosensor susta बिना अपमानित किया जाएगा के रूप में स्थायी रूप से कस्पासे गतिविधि रिकॉर्ड नहीं हैined कस्पासे गतिविधि 13। ऐसे झल्लाहट आधारित गोबर biosensors के रूप में अन्य जैसा कि पहले बताया कस्पासे biosensors, (जैसे ECFP- [DEVD] -Venus) 26,49 के साथ-साथ फ्लोरोसेंट संवाददाताओं Apoliner (सीडी 8-RFP- [DQVD] -GFP) 50 और सीपीवी (जैसे सीडी 8 - [DEVD] -Venus) 51,52, पूरे पशुओं में और संवर्धित कोशिकाओं में कस्पासे गतिविधि का पता लगाने के लिए किया जाता है, लेकिन इसी तरह की सीमाएं हैं किया जा सकता है। इसी तरह, Cyto सी -GFP यह apoptosis के दौरान cytosol में माइटोकॉन्ड्रिया से जारी है और बाद में अपमानित किया जाता है, के रूप में लंबे समय में apoptosis के उलट है कि कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। Annexin वी लेबलिंग apoptosis के उलट है कि कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया, लेकिन संकेत तीव्रता भी समय के साथ गिरावट आती है, तो Anastasis 13,45 के दीर्घकालिक नज़र रखने के लिए उपयोगी नहीं है किया गया है। Vivo इमेजिंग में निरंतर लंबी अवधि मौत उत्तेजनाओं के प्रदर्शन के बाद एक ही कोशिकाओं के भाग्य पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, vivo इमेजिंग में लंबी अवधि अभी भी टी चुनौती दे रहा हैओ सबसे जीवित पशुओं में प्रदर्शन करते हैं। इसलिए अतिरिक्त दृष्टिकोण पूरे जानवरों के अध्ययन के लिए, और बढ़ावा देने या टिशू कल्चर कोशिकाओं का उपयोग Anastasis को बाधित कर सकता है कि दवाओं के स्क्रीनिंग के लिए Anastasis अनुसंधान का विस्तार करने की जरूरत है

भविष्य में, लंबी अवधि के सेल भाग्य है कि ट्रैक नए प्रोटोकॉल और तकनीकों को विकसित करने और Anastasis की, शारीरिक रोग और चिकित्सीय निहितार्थ का परीक्षण करने की जरूरत है। हम Anastasis ऐसे परिपक्व न्यूरॉन्स और हृदय कोशिकाओं के रूप में 13, को बदलने के लिए मुश्किल हो जाता है कि घायल कोशिकाओं को बचाने के लिए एक सामान्य सेल अस्तित्व तंत्र हो सकता है कि प्रस्तावित। हालांकि, chemotherapeutic उपचार के बाद apoptotic कैंसर कोशिकाओं के Anastasis प्रतिरोधी ट्यूमर 12,13 की पुनरावृत्ति के लिए अग्रणी खतरनाक कोशिकाओं की वसूली में परिणाम सकता है। वे apoptosis के 13 उलट बाद कुछ कोशिकाओं oncogenic परिवर्तन प्रदर्शित रूप Anastasis भी, tumorigenesis का एक महत्वपूर्ण तंत्र हो सकता है। इसलिए, Anastasis बढ़ाने के लिए एक नया Thera हो सकता हैरोकने या के कैंसर के इलाज के लिए एक नए तरीके के रूप में Anastasis दबा है, जबकि neurodegeneration और दिल की विफलता बाधा के लिए peutic रणनीति। Biosensors का विकास Anastasis modulating द्वारा असभ्य रोगों के लिए सेल अस्तित्व Anastasis के तंत्र, और संभावित चिकित्सा विज्ञान की समझ अग्रिम जाएगा रोग मॉडल प्रणाली में apoptosis के उलट ट्रैक करने के लिए।

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Acknowledgments

हम शब्द "Anastasis" apoptosis के उत्क्रमण का वर्णन करने के सुझाव के लिए रेव डॉ राल्फ Bohlmann और रेव डॉ जेम्स Voelz धन्यवाद; Stably साइटोक्रोम -GFP व्यक्त हेला कोशिकाओं के लिए डगलस आर ग्रीन; H446 कोशिकाओं के लिए चार्ल्स एम रूडिन और एरिक ई गार्डनर; वीडियो पर कार्टून ड्राइंग में सहायता के लिए हीथ मेमने; इस पांडुलिपि की बहुमूल्य चर्चा के लिए यी हुई यीओ। यह काम एक सर एडवर्ड Youde मेमोरियल फैलोशिप (HLT), डॉ वाल्टर Szeto मेमोरियल छात्रवृत्ति (HLT), फुलब्राइट अनुदान 007-2009 (HLT), लाइफ साइंस रिसर्च फाउंडेशन फैलोशिप (HLT) द्वारा समर्थित किया गया था, एनआईएच NS037402 (JMH) अनुदान और NS083373 (JMH), और हांगकांग विश्वविद्यालय अनुदान समिति AoE / बी-07/99 (एमसीएफ)। हो लाम तांग लाइफ साइंसेज रिसर्च फाउंडेशन की एक Shurl और Kay CURCI फाउंडेशन फैलो हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201

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