Strategier for Tracking Anastasis en celle Survival fænomen, Vender Apoptose

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Anastasis (græsk for "stigende til liv") henviser til inddrivelse af døende celler. Før disse celler komme sig, har de passeret vigtige checkpoints af apoptose, herunder mitokondrie fragmentering, frigivelse af mitokondrie cytochrom c i cytosolen, aktivering af caspaser, chromatinkondensering, DNA-skader, nuklear fragmentering, plasma membranblæredannelse, celle krympning, celleoverfladeeksponering af phosphatidylserin og dannelse af apoptotiske legemer. Anastasis kan opstå, når apoptotiske stimuli fjernes før døden, hvorved døende celler at vende apoptose og potentielt andre død mekanismer. Derfor synes Anastasis at involvere fysiologiske helbredende processer, der også kan opretholde beskadigede celler uhensigtsmæssigt. De funktioner og mekanismer Anastasis er stadig uklart, hæmmes dels af de begrænsede værktøjer til påvisning af tidligere begivenheder efter inddrivelse af tilsyneladende raske celler. Strategier til at påvise Anastasis vil sætte undersøgelser af de fysiologiske mekanismer, faren ved udøde celler i sygdom patologi og potentielle lægemidler til at modulere Anastasis. Her beskriver vi effektive strategier via levende celler mikroskopi og en pattedyr caspase biosensor til identifikation og sporing Anastasis i pattedyrsceller.

Introduction

Apoptose (græsk for "at falde til døden") generelt antages at være en ensrettet proces ender i celle selvmord 1-7. Genetisk afbrydelse af pro-dødsgener resulterer i overlevelse ekstra celler, der ellers ville dø i hele dyr, herunder celler, der er allerede iværksat apoptose pathway 8,9. Tilsvarende genetiske manipulationer tillader sunde pattedyrceller, der kunstigt vise "Eat Me" signaler eller der mister klæbeevne til deres ekstracellulære matrix at undslippe døden ved hel celle fagocytose eller entosis henholdsvis 10,11. Men vi og andre har vist, at uden genmanipulation normale pattedyrceller sunde og cellelinier kan også komme fra de tidlige stadier af apoptose 12-15. Brug værktøjer til at spore individuelle celler, har vi yderligere demonstreret genrejsning sene stadier af apoptose 12,13, efter at cellerne er gået vigtige checkpoints at typiskely markere "point of no return" 2-6. Disse checkpoints for sent tidspunkt apoptose omfatte mitokondrie frigivelse af cytochrom c, aktivering af caspaser, nuklear fragmentering, og dannelse af apoptotiske legemer. Vi vedtog en græsk sammensatte ord "Anastasis", som betyder "stigende til liv", til at beskrive denne tilbageførsel af apoptose på randen af celledød 2-6.

Medmindre hele døende inddrivelse proces overholdes af levende celler, er det en udfordring at adskille celler, der har undergået Anastasis fra celler, der aldrig har oplevet apoptotiske begivenheder. Årtiers arbejde har vist, at de morfologiske træk celle selvmord ved apoptose er drevet af evolutionært konserverede biokemiske og molekylære begivenheder 16-19. Disse begivenheder fremmer selvdestruktion af celler til at regulere udviklingsmæssige og homoeostatic processer i encellede og flercellede organismer ved at fjerne beskadiget eller dFARLIGT celler 16-19. Mens apoptotiske celler kan let skelnes ved standardiserede morfologiske, biokemiske og molekylære manifestationer af apoptose 1,5,6,16,20, i øjeblikket er der ingen kendt markør specifikke for Anastasis 12,13. Vigtigt er det, celler, der har undergået Anastasis synes at være normale, sunde celler og celler, der bare begynde at vende apoptose vises som apoptotic døende celler 12,13. Således er nye værktøjer er nødvendige for at konkludere med sikkerhed, at en given overlevende celle tidligere havde oplevet aktive apoptotiske processer.

Apoptose antages generelt som en irreversibel kaskade, fordi det er en hurtig og massiv proces ødelæggelse. Mens det kan tage minutter til dage for nogle celler til at indlede apoptose, når mitochondrier har frigivet apoptogenic faktorer såsom cytochrom c i cytosolen 21,22 kan caspaser aktiveres inden for 5 minutter 23,24, efterfulgt af cytoplasmatiske ognuklear kondens inden for 10 min 25-27, og celledød kort derefter 25-27. Aktiverede caspaser iscenesætte apoptose ved at spalte og inaktivere vigtige strukturelle og funktionelle komponenter med henblik på cellulær nedrivning 2,28, såsom endonuklease inhibitor DFF45 / ICAD 29,30. Caspaser også aktivere pro-apoptotiske faktorer, såsom Bcl-2 familiemedlem BID, som translokerer for mitokondrier at fremme mitochondrial frigivelse af cytochrom c 31,32. Caspaseaktivitet resulterer også i celleoverfladen af phosphatidylserin som en "spise mig" signal til fremme engulfment af døende celler af makrofager eller nabo celler gennem fagocytose 33. Desuden apoptotiske begivenheder gør mitokondrier dysfunktionelle, forstyrre cellulære bioenergetik og stofskifte 34,35,36. Således synes intuitivt usandsynligt genrejsning destruktionen.

I modsætning til den oprindelige forventetioner kan celler vende apoptotisk celledød proces selv på et sent tidspunkt. Ved løbende at overvåge skæbne døende celler i kultur, observerede vi reversibiliteten af sent stadium apoptose i en række primære celler og cellelinier 12,13. Fjernelse af død stimulus tilladt indvinding fra de åbenlyse funktioner i apoptose, såsom mitokondrie fragmentering, chromatinkondensering, DNA-skader, plasma membranblæredannelse, celleoverfladen af phosphatidylserin, frigivelse af mitokondrie cytochrom c, caspaseaktivering, nuklear fragmentering, celle svind, og dannelse af apoptotiske legemer. Disse observationer rejser ubesvarede spørgsmål om de funktioner, konsekvenser, og mekanismerne i Anastasis. For at løse disse spørgsmål, en forudsætning er at pålideligt identificere celler, der har undergået Anastasis. Her beskriver vi live mikroskopi metoder og en caspase biosensor til påvisning af celler, der tidligere har vendt sent apoptose og then overlevede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af celler til live Cell Imaging

  1. For at lette påvisning af morfologiske ændringer ved at vælge adhærente celler, såsom HeLa (human cervical carcinoma) celler, der er fladt på underlaget bedre at visualisere ændring af plasmamembranen og intracellulære organeller.
    Bemærk: Tilbageførsel af apoptose er blevet observeret i forskellige pattedyrceller 12,13, herunder primær muselever, primærbatterier musemakrofager, primære rottecardiomyocytter samt cellelinier, såsom humane embryonale nyre HEK-293T celler, afrikansk grøn abe renale epiteliale COS -7 celler, mus hjertemuskel HL-1-celler, muse NIH 3T3 fibroblaster, ilder (Mustela putoris furo) hjerne CRL1656-celler, humane hudkræft A375 celler, humane testikelkræft CRL1973-celler, humane småcellet lungekræft H446 celler, human leverkræft HepG2-celler, humane brystcancer MCF7-celler, human prostatacancer PC3-celler og humane neuroblastom SH-SY5Y-celler.
  2. Forvask dækglas af glas nederste celle dyrkningsskåle med absolut ethanol til rengøring og sterilisering.
    Note 1: Anvendelse af glasbund retter anbefales til høj kvalitet differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi, og stor forstørrelse konfokal eller epi-fluorescens mikroskopi (se diskussionen).
    Note 2: For store forstørrelser (40X, 60 / 63x eller 100X mål og høje numeriske åbninger 1.3 eller 1.4), brug af cellekultur retter med tyndere glas bund (tykkelse 0,085-,16 mm) giver længere arbejdstid afstande for imaging (se protokol 3 ).
  3. Afhængig af celletypen kan glasbund dyrkningsskåle kræver belægning med poly-D-lysin (0,1 mg / ml), collagen (0,01% opløsning i 0,01 M eddikesyre) og / eller fibronectin (5 pg / ml) forud for såning celler.
    Bemærk: Optimering af type og koncentration af coatingmiddel er påkrævet for forskellige cellelinier. HeLa-celler kan klæbe direkte på glas uden belægning. Men nogle celler, SUCH mus hjertemuskel HL-1-celler, ikke kan klæbe direkte til glasoverflader, men kræver specifikke kultur og coating protokoller 37.
  4. Seed ~ 2-3 x 10 5 celler på 35 mm præ-coatede glas nederste celle dyrkningsskåle og inkuberes ved 37 grader Celsius (° C) med 5% CO 2 for en dag for at opnå 80% konfluens.
    Note 1: optimale celledensitet, inkubationstid og kultur tilstand kan variere afhængigt af celletypen. Cellekonfluens kan påvirke den apoptotiske respons af celler (se protokol 2). Ved høj konfluens, kan celler være mindre følsomme over for de samme koncentrationer af apoptotiske stimuli.
    Note 2: Undgå at sammenflydende celler, som høj celledensitet kan tilsløre morfologiske ændringer af de enkelte celler og deres organeller.

2. Anvendelse og Fjernelse af Apoptotisk Cell Stimuli

  1. Kort før brug, pre-mix apoptose-inducerende middel med 37 ° C cellekulturmedium. Ethanol (3,6 til 4,5% Vol / vol) tjente som apoptoseinducer i den foreliggende demonstration.
    Note 1: vores offentliggjorte og ikke-offentliggjorte data viser, at celler også kan vende apoptose, der er udløst af andre apoptotiske stimuli 12,13, såsom dimethylsulfoxid (DMSO, 8% vol / vol i 24 timer), staurosporin (STS, 0,5 uM for 1 time), og taxol (1 uM i 12 timer). Optimering af dosis for at udløse apoptose er påkrævet for forskellige typer af celler for at opnå den mindste dosis, der kan udløse de fleste celler i populationen at undergå apoptose.
    Note 2: Pre-blanding apoptose-inducerende midler med cellekulturmedium er vigtigt at undgå ujævn eksponering af cellerne på apoptotiske stimuli.
  2. Billede en gruppe af sundhedsmæssige celler i cellekultur skålen før påføring af apoptose-inducerende middel til at etablere baseline morfologier.
  3. Fjern det oprindelige medium fra cellekulturen skålen, og derefter anvende 2 ml forblandet apoptose-inducerende middel til skålenudløse celler til at undergå apoptose. Inkuberes cellerne ved 37 ° C med 5% CO 2 (eller andre dyrkningsbetingelser normale).
  4. Efter inkubering observere cellerne af lys, epi-fluorescens eller konfokal mikroskopi til at overvåge progression af apoptotiske funktioner.
    Note 1: Celler undergår apoptose vil vise morfologiske, biokemiske og molekylære kendetegnende for apoptose, der kan påvises ved mikroskopi og fluorescens-baserede biosensorer (se protokol 3 og 4).
    Note 2: inkubationstid på celler med forskellige apoptose induktorer vil variere afhængigt af celletypen, celle betingelser (såsom sammenflydning og status næringsstoffer), og dosis af død stimulus anvendt. Omhyggelig titrering kan være påkrævet.
  5. Når celler vise kendetegnende for apoptose, fjerne apoptose-inducerende middel ved vask af cellerne en gang med varmt (37 ° C, eller anden normal kultur temperatur) frisk celledyrkningsmedium.
    Note 1: Som apoptotiske celler er mere løst bundet pådyrkningspladen, er det vigtigt at anvende og fjerne medium forsigtigt, så cellerne ikke bliver skyllet væk.
    Note 2: Levende suspenderede celler kan udvindes fra supernatanten ved forsigtig centrifugering (160 x g i 1 min) og tilsat tilbage til kulturen skålen.
  6. Cellerne inkuberes ved 37 ° C med 2 ml / 35 mm skål af frisk celledyrkningsmedium i 5% CO 2. Alternativt til anvendelse konditioneret medium (cellefri kulturmedium opsamlet fra sunde celler) yderligere at forbedre overlevelsen af ​​apoptotiske celler.
    Bemærk: Vask og inkubere cellerne med frisk medium tillader størstedelen af celler til at vende ethanol-induceret apoptose efter ethanol eksponering 12,13. Men gentage denne vasketrin kan være nødvendigt, når cellerne udsættes for andre apoptotiske stimuli (se diskussionen).

3. Levende Cell Microscopy

  1. Vi anbefaler at bruge en omvendt konfokal eller epi-fluorescens mikroskop med miljøstyring (37 ° C,5% CO 2) levende celler mikroskopi.
    Bemærk: Det er også muligt at billedet cellerne under anvendelse af opretstående mikroskoper med en vand dypning mål. Dyp målet direkte i dyrkningsmediet til at afbilde celler. Imidlertid kan celler blive knust ved dypning mål under fokusering.
  2. Pre-varme mikroskop (f.eks miljøkontrol kammer, scene inkubator, og objektiv varmelegeme) mindst 2 timer før billeddannelse.
    Bemærk: Dette giver mikroskop komponenter for at nå termo-ligevægt, således at den kan undgå afdrift af fokus og forskydning af XY-plan på grund af termisk udvidelse og sammentrækning af komponenterne.
  3. Placer en glasbund skål af dyrkede celler 35 mm (se protokol 1) på scenen af ​​et omvendt mikroskop og fange celle billeder ved hjælp af en 40X eller 63X plan-Apochromat mål med en numerisk apertur (NA) 1.3 eller 1.4 til billeddannelse celler fra bunden af ​​fadet gennem dækglas.
    Bemærk: Undgå at anvende mere end 2 ml mediumtil 35 mm glas bunden skålen, som vægten af ​​mediet kan forårsage krumning af glas bunden, hvilket gør det vanskeligt at billedet et felt af celler i samme fokale plan.
  4. Oprethold celler ved 37 ° C eller tilsvarende normal temperatur under hele imaging processen.
    Bemærk: Processen med apoptose, og sandsynligvis tilbageførsel af apoptose afhænger temperaturfølsomme enzymatiske aktiviteter. Derfor er det vigtigt hele forsøget opretholde celler ved 37 ° C (fx med et mikroskop stadium top inkubator). Nedsat temperatur kunne bremse den apoptotiske respons og inddrivelse respons efter fjernelse af apoptotisk stimulus.
  5. Brug en anordningen eller lægge en transparent folie (se Materialer) på dyrkningsskålen at reducere vandtab ved fordampning fra mediet.
    Bemærk: folien kan forstyrre polariteten af ​​lys til DIC mikroskopi. Gendan polaritet ved at justere polarisator på lysbanen.
  6. Oprethold pH icelledyrkningsmedium (pH 6,8 -7,3) ved inkubation i 5% CO 2 med en miljømæssig styrekammeret på mikroskopet.
    Bemærk: Vedligeholdelse pH i dyrkningsmediet kan også opnås ved at tilsætte HEPES buffer, eller ved at bruge kommercielle CO2 -uafhængig medium (se Materialer). Optimale betingelser kan variere afhængigt af celletypen.
  7. Minimer fluorescens / laser (excitation lysintensitet) eksponering for celler under den billeddannende proces for at undgå fototoksicitet ved at reducere fluorescensintensiteten til det laveste kræves for at opnå billeder af celle / subcellulære strukturer eller udtrykt biosensorer (detaljer i protokol 4) Høj kvalitet.

4. Strategier til detektion og sporing Anastasis Under og efter Apoptotiske Events

  1. Plasma membranblæredannelse, cytoplasmatisk kondens, celle svind og apoptotisk krop dannelse (se figur 1A - C, E).
    1. Udfør time-lapse levende celle diffedifferens- kontrast interferens (DIC) eller fasekontrastmikroskopi at spore en gruppe af sundheds-celler og overholde deres celle morfologi (Se protokol 3 til levende celler mikroskopi, og se diskussionen).
      Note 1: Reducer intensitet lyskilde til DIC / fase kontrakt imaging at undgå fototoksicitet til cellerne.
      Note 2: Hvis DIC og fasekontrastmikroskopi ikke er tilgængelige, skal du bruge CellTracker at farve cytosolen at skitsere morfologien af ​​levende celler til konfokal eller epi-fluorescens mikroskopi og overvåge cellemorfologien.
    2. Påfør celledød stimulus til at udløse celler til at undergå apoptose (Se protokol 2 til påføring og fjernelse af apoptotiske stimuli).
    3. Observer behandlede celler for morfologiske kendetegn for apoptose såsom plasma membranblæredannelse, cytoplasmisk kondensering cellekrympning og apoptotisk organ formation (figur 1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Vask væk død stimuli, og nye forsyninger celler med frisk medium, når cellerne DISPLAy morfologiske kendetegn for apoptose.
      Note 1: Anvend celledød stimulus eller ændre celledyrkningsmediet på mikroskopbordet under tidsforskudt levende celler billeddannelse kan opnås ved hjælp af en perfusion cellekulturkammer, eller kan udføres direkte på celledyrkningsskål ved omhyggeligt at pipettere uden at røre fadet, i pauserne mellem billeddannelse.
      Note 2: Brug fokus afdrift erstatningsordninger for at undgå ud af fokus af cellerne på grund af tabet af termo-ligevægt af mikroskopet systemet efter at ændre cellekulturmediet (se diskussionen).
    5. Kontinuerlig time-lapse imaging at spore skæbne celler, der viser kendetegnende for apoptose. Celler, reverse apoptose kan reparere skader og genvinde normal flad morfologi (figur 1A, 1B, 1C, 1E).
  2. Mitokondrie fragmentering, DNA / chromatinkondensering, og nuklear fragmentering (Se figur 1D, 1F, 1G).
    1. For at visualisere mitochondria, bejdse celler med 50 nM MitoTracker rød / dyb rød / grøn-fluorescerende farvestof, og samtidig plette kernen med 10 ug / ml Hoechst 33342 blå nuklear farvestof i dyrkningsmedium i 20 minutter ved 37 ° C med 5% CO 2.
      Note 1: Reducere koncentrationen af ​​farvestoffer og inkubationstiden for at undgå cytotoksicitet og reducere baggrund fluorescens, når behov. Optimer farvning betingelser til opnåelse af et godt signal-støj-forhold med den minimale mængde farvestof og inkubationstid for farvning.
      Note 2: Brug fluorescerende pletter for mitokondrier som MitoTracker Red CMXRos, MitoTracker Deep Red FM eller MitoTracker Green FM, som ikke sive ud fra mitokondrier under apoptose. Dette gør det muligt at visualisere mitokondrie morfologi under apoptose og Anastasis. Se materialer og udstyr bord til oplysninger om disse pletter.
    2. Hold farvede celler i mørke for at undgå fotoblegning.
    3. Fjern overskydende plet ved vask af cellerne3 gange med 37 ° C phosphatbufret saltopløsning (PBS) opløsning eller frisk cellekulturmedium, med 1 min inkubering i frisk medium mellem hver vask, og derefter yderligere inkuberes i frisk medium i 20 minutter, før den sidste vask for at tillade overdreven pletter at forlade cellerne til at reducere ikke-specifikke signal baggrund til billeddannelse.
      Bemærk: Forkort inkuberingstider med cellemedium efter farvning kan resultere i høj baggrund for billeddannelse.
    4. Udfør realtid levende celle konfokal eller epi-fluorescensmikroskopi til billedet raske celler før apoptotisk induktion anvendes (se protokol 3 til levende celler mikroskopi).
      Bemærk: Sunde celler vise rørformede mitokondrier og runde kerner i de fleste celletyper (figur 1D, 1F, 1G).
    5. Trigger celler til at undergå apoptose (se protokol 2 til påføring og fjernelse af apoptotiske stimuli til cellerne).
    6. Fortsæt time-lapse levende celler mikroskopi til at observere ændringer i mitokondrie og nuklear morphologIES umiddelbart efter død stimulus påføres cellerne. Overhold celler til at vise kendetegnende for apoptose såsom mitokondrie fragmentering og hævelse, chromatinkondensering og nuklear fragmentering, i modsætning til sunde celler, som viser rørformede mitokondrier og runde kerner.
    7. Når celler viser kendetegnende for apoptose, vaske og levere celler med frisk medium, og fortsætte time-lapse imaging at spore skæbne celler. Celler, vende apoptose genvinde normal mitokondrie og nuklear morfologi (figur 1D, 1F, 1G).
      Bemærk: Udfør DIC mikroskopi parallelt når det er muligt at få yderligere oplysninger for at få adgang faser af apoptose ved at observere ændringer i cellemorfologi i den samme gruppe af celler (se protokol 4.1 for DIC mikroskopi).
  3. Påvisning af mitokondrie frigivelse af cytochrom C ved anvendelse af celler, der stabilt udtrykker en cytochrom c GFP fusion protein (se figur 2).
    1. Stain celler stabilt udtrykker cytochrom c -GFP 23,24 med MitoTracker Red at mærke polariserede celle mitokondrier (se trin 4.2.1 til 4.2.3 for levende celle mitokondrier farvning).
    2. Udfør realtid levende celle konfokal eller epi-fluorescensmikroskopi at spore sunde celler (Detaljer i protokol 3 for levende cell imaging).
      Bemærk: Den cytochrom c -GFP signal primært lokaliseres i mitokondrier af sunde celler (figur 2A i, 2B).
    3. Trigger celler til at undergå apoptose (se protokol 2 til påføring og fjernelse af apoptotiske stimuli til cellerne). Fortsæt time-lapse mikroskopi at observere translokation af cytochrom c -GFP fra mitokondrierne til cytosolen (figur 2Aii-III, 2B).
      Bemærk: mitokondrie frigivelse af cytochrom c i cytosolen er en markør for mitochondrial ydre membran permeabilisering (MOMP)4, et afgørende skridt i mitokondrier-afhængig apoptose 21,22
    4. Når celler vise cytochrom c GFP signal i cytoplasmaet, fjern celledød stimulus, og levering celler med frisk medium (se protokol 2). Fortsæt time-lapse imaging at spore skæbne celler med cytosolisk GFP.
      Bemærk: Celler, vende apoptose genvinde normal celle morfologi, og mindske deres cytosolisk cytochrom c -GFP signal formentlig gennem nedbrydning eller translokation tilbage til mitokondrier (figur 2Aiv-vii, 2B).
    5. Capture DIC billeder parallelt at indhente yderligere oplysninger for at få adgang faser af apoptose ved at observere ændringer i cellemorfologi i enkelte celler eller grupper af celler (se protokol 4.1 for DIC mikroskopi).
  4. Påvisning af caspaseaktivitet ved hjælp af en caspase biosensor (se figur 3)
    1. Transficerer celler med caspase biosensor NES-DEVD-YFP-NLS for16 til 24 timer, før udsætte dem for en apoptotisk stimulus 13.
    2. Farv de transficerede kulturer med Hoechst 33342 at mærke cellekerner (se trin 4.2.1 til 4.2.3 for levende cellekerner farvning).
    3. Udfør realtid levende celle konfokal eller epi-fluorescensmikroskopi at spore sunde celler (Detaljer i protokol 3 for levende cell imaging).
      Bemærk: NES-DEVD-YFP-NLS biosensor signal primært lokaliseres i cytosolen af sunde celler på grund af dets nukleare signal eksport (NES) (figur 3A, 3BI og 3C, se diskussion).
    4. Trigger celler til at undergå apoptose (se protokol 2 til påføring og fjernelse af apoptotiske stimuli til cellerne). Fortsæt time-lapse mikroskopi at observere nukleare translokation af YFP.
      Bemærk: Aktivering af caspaser spalter DEVD motiv i caspase biosensor NES-DEVD-YFP-NLS, hvilket resulterer i YFP-NLS translokation fra cytosolen til cellekernen (fig 3A, 3Bii-iv, se diskussion).
    5. Bemærk: Celler, reverse apoptose genvinde normal cellemorfologi, men bevarer den nukleare YFP signal (figur 3 BV-x celler 1 og 2, og 3D).
    6. Fortsæt time-lapse imaging at spore skæbne celler, der viser nukleart YFP.
      Bemærk: Det nukleare YFP signal bliver nedbrudte flere timer efter celler har vendt apoptose (figur 3B, vi-x, Cell 1, Se Resultater og Diskussion) formentlig gennem normale celle clearance mekanismer såsom proteasom nedbrydning.
    7. Capture DIC billeder parallelt at indhente yderligere oplysninger for at få adgang faser af apoptose ved at observere ændringer i cellemorfologi i enkelte celler eller en gruppe af celler. (Se protokol 4.1 for DIC mikroskopi).
  5. Celleoverfladeeksponering af phosphatidylserin (se figur 4)
    1. Seed celler på glrøv Dækglas at opnå 80% cellekonfluens (se protokol 1).
    2. Co-pletten cellerne med røde fluorescerende MitoTracker og blå Hoechst 33342 pletten for mitokondrier og kerner, henholdsvis (se trin 4.2.1 til 4.2.3 for levende celle mitokondrie og nuklear farvning).
    3. Trigger celler til at undergå apoptose ved hjælp af en apoptoseinducer (se protokol 2).
    4. Anvend fluorescensmærket annexin V (se Materialer) at farve apoptotiske celler 10 minutter ved 37 ° C før fjernelse af apoptoseinducer at detektere eksponering af phosphatidylserin på overfladen af ​​apoptotiske celler.
      Note 1: Sund celler ikke farvet med annexin V fordi phosphatidylserin normalt afsondres på den indvendige folder af cellens plasmamembran 38. Apoptotiske celler farves med annexin V, som binder til phosphatidylserin på celleoverfladen (figur 4A og 4B).
      Note 2: fluorescensmærket annexin V kan også anvendes til farvning af apoptotiske celler immediately efter fjernelse af apoptoseinducer, med 10 minutters inkubation.
    5. Fjern celledød stimulus, vaskes de farvede celler med varmt PBS eller frisk medium gang, og derefter forsyne cellerne med frisk medium i 2 timer ved 37 ° C med 5% CO 2 (se protokol 2).
      Note 1: Celler, omvendt apoptose genvinde normal morfologi og fastholde fluorescensmærket annexin V signal efter at genvinde normal morfologi (figur 4A og 4B).
      Note 2: annexin V signal falder med tiden på genvundne celler (se diskussionen).
    6. Fix celler ved valgte tidspunkter med 4% paraformaldehyd indeholdende 8% saccharose i 1x PBS i 20 minutter i mørke ved stuetemperatur, og vask de fikserede celler med PBS 3 gange for at fjerne paraformaldehyd før montering celler på objektglas dækglas med antifade mountant (Se Materialer) for konfokal eller epi-fluorescens mikroskopi og observere annexin V på celler efter fjernelse af apoptose inducer.
      Note 1: Saccharose i fiksativ bevarer cellemembranen struktur under fiksering.
      Note 2: Opbevar paraformaldehydopløsning i mørke ved 4 ° C for at forhindre nedbrydning.
      Note 3: Varm op paraformaldehydopløsning til stuetemperatur, før du anvender den til celler til fiksering at undgå kuldechok til cellerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at undersøge tilbageførsel af apoptose, er vævskulturceller først udsat for en død stimulus til at udløse apoptose. Når cellerne vise kendetegnende for apoptose, er frisk dyrkningsmedium derefter anvendt til at vaske væk stimulus og derefter inkuberes de døende celler til at tillade genvinding (figur 1A). Her er det centrale spørgsmål, der behandles, er, hvor langt de enkelte dør dyrkede celler kan fremskridt i retning af apoptose og stadig undergår Anastasis. Dette spørgsmål kan endeligt besvaret af løbende overvågning med biomarkører til at spore celle skæbner under anvendelse af de metoder, der er beskrevet nedenfor.

Vi først beskrive vores strategier til at detektere vending af apoptose i vævskulturceller ved hjælp af time-lapse levende celler mikroskopi, som er nødvendig til sporing og registrering af reaktion af de enkelte celler før, under og efter udsættelse for et apoptotisk stimulus 12,13. Sunde adhærente celler spredes på deres tilknyttede substrat (Figur 1Bi) 12,13, og viste trådformede mitokondrier og runde kerner før behandling (figur 1CI, Di, Ei, Fi, Gi) 12,13. Efter eksponering for 3,8-4,5% ethanol i celledyrkningsmedium (vol / vol), DIC eller fasekontrastmikroskopi viste, at cellerne udviste morfologiske kendetegn for apoptose, herunder cytoplasmatisk kondens, plasma membranblæredannelse og celleskrumpning (figurerne 1Bii, 1Cii- III, og 1Eii-vi) 12,13. Apoptotisk organ dannelse af de samme celler blev let observeret af DIC (fig 1Eii-VI). Opsplitning af MitoTracker-mærkede mitokondrier (fig 1Dii-III, 1Fii-vi) 12,13 samt kondensering af Hoechst-farvet kerne-DNA (figur 1Dii-III Fii-III Gii) 12,13, og fragmentering af kerner (Figninger 1Evi og FVI, hvide pile), blev påvist samtidigt ved konfokal eller epi-fluorescensmikroskopi. De celler, der med succes vendt apoptose blev efterfølgende observeret at genvinde normal morfologi, tilsyneladende reparere deres skader (figur 1Biii, C og Div-vi, E og FVII-XII, og gIII) 12,13. Celler under disse betingelser også var blevet vist at genvinde organel motilitet, celle migration og funktionel endocytose baseret på optagelse af fluorescens-emitterende Quantum Dots og celledeling 13. Interessant, nogle celler, der beundrede apoptose viste uregelmæssig nukleare morfologi (figur 1Fxii), og også unormal celledeling og dannelse af mikrokerner (fig 1Giv-vii) 13, som er en biomarkør for DNA-skader, kromosombrud og hele kromosom tab delende celler 39, 40. Fordrevne chromosomes eller kromosomfragmenter uden undlader at indgå i datter cellekerner er omsluttet af kernemembranen 39, 40. Således kunne en konsekvens af Anastasis være indkvartering af genomer, der blev beskadiget under afbrudt apoptose, hvilket fører til tumorigenese og kræft progression. Tilstedeværelsen af mikrokerner er også almindeligt i kræftceller 40,41.

Frigivelse af mitokondrie cytochrom c er et afgørende skridt til at mægle eller forstærke caspase-afhængig apoptose 20-22. Brug HeLa-celler, der stabilt udtrykker GFP-mærket cytochrom c, vi overvåget subcellulære flytning af cytochrom c under apoptose og Anastasis ved konfokal mikroskopi. Som rapporteret 23,24, cytochrom c -GFP lokaliseret til mitokondrierne før behandling (fig 2AI og B), men derefter blev frigivet i cytosolen efter en død stimulus var blevet anvendt (fig 2Aii,2Aiii og B). Andre karakteristiske morfologi såsom mitokondrie fragmentering og plasma membranblæredannelse, blev også observeret i celler, der var udgivet cytochrom c -GFP (figur 2Aiii). Disse celler blev rapporteret at undergå celledød kort efter udgivelsen af cytochrom c 23-27. Efter fjernelse af død stimulus, vi bemærkede imidlertid, at cytosolisk cytochrom C -GFP niveauer faldt, mitokondrier genvandt trådformede strukturer, og plasmamembranen genvundet et normalt udseende (figur 2Aiv-VII, og B). Derfor kan apoptotiske celler undergår Anastasis efter mitokondrie frigivelse af cytochrom c.

Forstærkning af downstream DEVD-spaltende caspaser antages generelt at være "point of no return" i apoptose 2,5. Derfor brugte vi en caspase biosensor NES-DEVD-YFP-NLS exprsmelteostpro- fra et plasmid 13, hvilket gør det muligt at detektere overlevende celler, der tidligere har oplevet caspaseaktivitet (figur 3A). Denne caspase biosensor er et polypeptid med en N-terminal nuklear udelukkelse signal (NES), en linker med caspase-3/7 lconsensusspaltningssted (DEVD) 26,42,43, efterfulgt af et gult fluorescerende protein (YFP) og en C-terminale kernelokaliseringssignalet (NLS). Hos raske celler, denne biosensor overvejende lokaliseret til cytosolen som en funktion af NES (fig 3BI, Ci-IV, og D) 13. Under apoptose, aktiverede caspaser spalter DEVD motiv, frigiver YFP-NLS, som effektivt translokerer fra cytosolen til kernen i celler, der samtidig eller efterfølgende vist andre funktioner i apoptose, såsom DNA / chromatinkondensering og celle krympning (figur 3B ii -IV, og D) 13. SåledesSE-celler bevarer funktion kerneimport efter caspaseaktivering. Efter fjernelse af apoptoseinducer celler, der undergår Anastasis display morfologiske genopretning selv efter caspaseaktivering er opstået (fig 3 BV-X, og D) 13, tilsyneladende vende sent apoptose. Under inddrivelse af normal morfologi, det nukleare YFP signal aftager i intensitet i nogle celler, når de begynder at vende apoptose efter fjernelse af død stimulus (figur 3 BV-x, Cell 1) 13, hvilket tyder på, at cellerne forringe caspase-spaltet biosensor, eventuelt ved den samme mekanisme, der anvendes til at fjerne andre caspase-spaltede produkter under og efter Anastasis.

Anastasis kan også påvises uden levende celler mikroskopi. Dette kan opnås ved anvendelse af fluorescensmærket annexin V 38,44, som binder og Marks externalized phosphatidylserin (PS) på et tidligt trin i apoptose ( (figur 4B) 13, som phosphatidylserin er begrænset til det indre blad af plasmamembranen af raske celler 38. I modsætning ethanol-inducerede apoptotiske døende celler udsættes phosphatidylserin på celleoverfladen (figur 4B) 13, og derfor kan mærkes med fluorescerende annexin V 38,44. Mærkbart, kan annexin V-mærkede celler genvinde normal morfologi efter fjernelse af død stimuli, hvilket tyder på, at primære cardiomyocytes har vendt apoptose (figur 4B) 13. Andre har tidligere anvendt en lignende strategi, der tyder på, at helbredelse fra apoptose kan forekomme in vivo. I en in vivo-model af transient iskæmisk skade, caspase-afhængig annexin V mærkning af cardiomyocytter hos kaniner og mus tilsyneladende reresulteret i internalisering af annexin V af overlevende celler efter forbigående iskæmi 45, tyder på, at Anastasis kunne forekomme i levende dyr. Desuden to andre undersøgelser anvendes cellesortering at identificere en del af annexin V-mærket muse BCL 1 .3B3 B lymfomceller (udsat for anti-immunoglobulin-antistoffer, der inducerer apoptose i BCL 1 .3B3) og musebrystcarcinom MOD celler, der udtrykker temperatur -følsom p53 (der forårsager apoptose efter inkuberet under permissive temperatur) fortsatte med at proliferere, når de blev returneret til normale dyrkningsbetingelser 14,15. Kollektivt antyder disse undersøgelser, at annexin V er nyttig til bestemmelse af skæbnen for celler, der har vendt apoptose uden live-cell mikroskopi billeddannelse. Der er dog forbehold med denne strategi, som annexin V fluorescens er ikke permanent (figur 4B) 13 resterende påviselig for kun et par timer efter fjernelse af død stimulus, således atdisse metoder kan ikke give sporing langsigtet af celler, der omvendt apoptose.

Figur 1
Figur 1: Sporing tilbageførsel af apoptose ved levende celler. (Gengivet med tilladelse fra Tang et al, MBoC 23, 2240-2252 13, for figur 1A -. D og G). (A) tilgang til at inducere apoptose og efterfølgende give dyrkede celler at komme sig efter vask væk apoptose inducer. (B) Time-lapse levende celler fasekontrastmikroskopi af sunde primære muse leverceller (ubehandlet), den samme gruppe af celler, der blev behandlet med 4,5% ethanol i dyrkningsmedium (vol / vol) i 5 timer (behandlet), og derefter vasket og inkuberet yderligere med frisk dyrkningsmedium i 24 timer (vasket). Scale bar, 100 pm. (C) Kontinuerlig time-lapse levende celler epi-fluorescensmikroskopi af den samme primære muselever celle, før EthAnol behandling (I), på de angivne tidspunkter efter behandling med 4,5% ethanol i celledyrkningsmedium i 2,5 timer (II og III), og efter vask og inkubation med frisk medium for at tillade genvinding i 1 time (IV - VI). Flettede billeder af MitoTracker-farvede mitokondrier (rød) og Hoechst-farvet kerne (blå) blev visualiseret ved epi-fluorescensmikroskopi, og cellemorfologi ved DIC-mikroskopi. Scale bar, 10 um. (D) sammenflettede fluorescens kun (uden DIC) billeder fra panel C viser organel morfologier. (E) Kontinuerlig time-lapse levende celler konfokal mikroskopi af de humane småcellet lungecarcinom H446 celler, før ethanol behandling (I) efter behandling med 3,8% ethanol i celledyrkningsmedium i 2 timer 28 min (II-VI), og efter vask og inkubation med frisk medium for at tillade genvinding (VII-XII). Flettede billeder af MitoTracker-farvede mitokondrier (rød) og de Hoechst-farvede kerner (blå) blev visualiseret ved konfokal mikroskopi og c ell morfologi af DIC-mikroskopi. Hvide pile angiver en fragmenteret kerne i apoptotiske legemer (VI). Scale bar, 10 um. (F) Flettede fluorescensbilleder kun (uden DIC) fra panelet E afsløre organel morfologier. (G) Kontinuerlig time-lapse levende celler epi-fluorescens mikroskopi for monokrome Hoechst-farvet nuklear billeddannelse af en enkelt HeLa celle, der undergår upræcis celledeling. Før ethanol behandling (i) behandling med 4,3% ethanol i celledyrkningsmedium i 5 timer (ii), og efter ethanol fjernelse (vasket, III-VI). Paneler iv afslører unormale celledelinger. Røde pile angiver de store kerner i de opdelte celler (IV- VI). Scale bar, 30 um. Times er angivet som hr:. Min Klik her for at se en større udgave af dette tal.

gur 2 "src =" / files / ftp_upload / 51964 / 51964fig2highres.jpg "/>
Figur 2: Påvisning tilbageførsel af apoptose efter mitochondrial frigivelse af cytochrom c (A) Kontinuerlig time-lapse levende celler konfokal mikroskopi af HeLa-celler, der stabilt udtrykker cytochrom c -GFP (Cyto C GFP) før (i), under (ii-iii) og efter (III-VII) eksponering til 3,9% ethanol i celledyrkningsmedium. Sammenflettede konfokale billeder af CytoC-GFP (grønt), MitoTracker-farvede mitokondrier (rød), og Hoechst-farvede kerner (blå) er kombineret med DIC billeder (venstre panel). Fusioneret versioner vises separat for CytoC-GFP, præsenteret som en varme kort over signalet intensitet (venstre midterste panel), monokrom billede af CytoC-GFP (midterste panel), og monokrome billede af mitokondrier (højre midterste panel). Flettede billeder af CytoC-GFP og mitokondrier (højre panel). (B) Ændringen af cytosoliske cytochrom c-GFP signal intensitet af cellerne, Cell 1 og celle 2, som angivet i monokrom CytoC-GFP billede på Panel Ai. Times er angivet som hr:. Min Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Afsløring tilbageførsel af apoptose efter caspaseaktivering (Genoptrykt med tilladelse fra Tang et al, MBoC 23, 2240-2252 13, for 3A - D.). (A) Diagram over caspase biosensor fusionsprotein sammensat af en nuklear eksport signal (NES), DEVD caspasespaltningssted, gult fluorescerende protein (YFP) og kernelokaliseringssignalet (NLS). (B) Kontinuerlig time-lapse levende celle konfokal mikroskopi af HeLa-celler, der udtrykker caspase biosensor NES-DEVD-YFP-NLS før (I), under (ii -iv), og efter vx eksponering () til 4,3% ethanol i celledyrkningsmedium. Sammenflettede konfokale billeder af caspase biosensor (grøn), Hoechst-farvede kerner (blå) og DIC billeder (venstre panel), en monokrombilleder af YFP signal (midterste panel), og en varme kort angiver YFP signal intensitet (højre panel) . (C) Ubehandlede kontroller analyseret som i panel B. (D) Kvantificeret fluorescensintensiteter for den aktiverede nukleare caspase biosensor i individuelle celler (nummereret 1 og 2 i panel Bi) før, under og efter eksponering af ethanol og i ubehandlede kontroller (nummereret 3 og 4 i panelet Ci) blev beregnet som procent af YFP stede i kernen (celle YFP signalintensiteten nukleare / total x 100%). Times er angivet som hr: min. Scale bar, 10 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

ays "> Figur 4
Figur 4: Afsløring tilbageførsel af apoptose ved fluorescensmærket annexin V (Genoptrykt med tilladelse fra Tang et al, MBoC 23, 2240-2252 13, for figur 4A - B.). (A) Diagram af annexin V-FITC Anastasis assay anvendt i panel B. (B) Neonatal rotte primære kardiale ventrikelmyocytter blev udsat for 4,5% ethanol i celledyrkningsmedium i 5 timer, og derefter inkuberet med annexin V-FITC i 10 min før fjernelse af ethanol medium. Cellerne blev enten fast straks (behandlet), eller fast efter refeeding med frisk medium i yderligere 2 timer recovery (vasket). Ubehandlede celler, der blev udsat annexin V-FITC tjene som kontrol (ubehandlet). MitoTracker-farvede mitokondrier (rød), Hoechst-farvede kerner (blå) og annexin V-FITC (grøn) blev visualiseret ved konfokal mikroskopi, og cellemorfologi blev visualiseret ved DIC mikroskopi. Scale bar, 10 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anastasis refererer til det fænomen, hvor celler, der har aktiveret celledød vej senere vende dødsprocessen og overleve. Her har vi vist, at levende celler kan bruges til at bekræfte, at de samme individuelle celler i virkeligheden kan vende apoptotisk celledød proces på et sent tidspunkt, og derefter fortsætte overlevende og reproducere. Vores protokoller beskriver flere optimeret celletype-specifik behandling betingelser for at inducere apoptose og tillader en stor del af cellerne til at gennemgå tilbageførsel af apoptose overvåges med flere biomarkører for verifikation. Med hensyn til tekniske problemer blev glasbund retter anvendes til dyrkning af celler til billeddannelse 12,13, på grund af den særdeles transparente tynde glas mellem celler og mikroskopet mål, som giver lang arbejdstid afstande for konfokal høj kvalitet eller epi-fluorescensmikroskopi i høj forstørrelse, letter observation af klassisk apoptose herunder mitokondrie fragmentering, Frigivelse af cytochrom c, og nuklear kondens og fragmentering. Glas også ikke fordrejer polaritet lys, for at tillade høj kvalitet DIC mikroskopi til overvågning af membranblæredannelse, celle krympning af celler og apoptotiske krop dannelse under apoptose. DIC-mikroskopi har fordele i forhold fasekontrastmikroskopi at overholde disse morfologiske kendetegn for apoptose, da DIC øger kontrasten i ufarvede og gennemsigtige celleprøver, forbedre påvisning af celle morfologier. Hvis DIC og fasekontrastmikroskopi ikke er tilgængelige, kan CellTracker bruges til at farve cytosolen at skitsere morfologien af ​​levende celler til konfokal eller epi-fluorescens mikroskopi og overvåge cellemorfologien.

Anvendelsen af ​​passende doser af død stimuli og strategier fjernelse af stimuli er kritiske trin til påvisning af Anastasis. Vi har valgt at bruge lave koncentrationer af ethanol som en død stimulus for eksperimenter descrIBED her, fordi en stor procent af de behandlede celler ensartet kan undergå apoptose og kan komme sig fra dette, potentielt mildere, død stimulus. Alligevel kan også anvendes disse fremgangsmåder med succes med andre død stimuli, som vi har rapporteret 12,13. Men nogle dødsfald stimuli i sagens natur er mere udfordrende end andre, såsom staurosporin (STS), et almindeligt anvendt apoptoseinducerende middel. Måske fordi det binder sine substrater med høj affinitet 46-48, gentagne vaske er vigtige, men stadig ikke effektivt fjerne STS fra cellerne. I dette tilfælde kan anvendelse af lavere medikamentkoncentrationer og kortere lægemiddel inkubationstid, der stadig kan aktivere apoptotisk døende proces være nyttigt at tillade flere celler at vende apoptose. Re-fodring celler med konditioneret celledyrkningsmedium kan også forbedre tilbageførsel af apoptose bedre end frisk celledyrkningsmedium. Apoptotiske celler er normalt løst fastgjort til dyrkningsskålen overflade især på glas suransigter, og derfor er det vigtigt at vaske væk apoptose inducere forsigtigt for at undgå afmontering celler. Coating glas retter med poly-D-lysin, collagen og / eller fibronectin kunne øge celleadhærence for at tillade visse typer celler, såsom cardiomyocytter 37, at fastgøre korrekt på glasoverflade cellekulturskåle, især efter udsættelse af celler for en død stimulus.

Processen af ​​apoptose, og sandsynligvis tilbageførsel af apoptose afhænger af enzymatiske aktiviteter, der kan påvirkes af temperaturen. Derfor opretholde celler ved 37 ° C eller ved deres normale dyrkningsbetingelser er vigtige i hele billeddannelse for at sikre reproducerbarhed af forsøgsresultater. Pre-varm mikroskop før start levende celler billeddannelse er også et kritisk trin, der tillader mikroskop komponenter at nå termo-ligevægt. Dette kan undgå afdrift af fokus og forskydning af XY-plan på grund af termisk udvidelse og sammentrækning afkomponenter under live-cell imaging. Anvendelse eller fjerner død stimulus ved at ændre mediet en kultur skål med enten en pipette eller ved perfusion i forvarmet mikroskopi systemet under time-lapse billeddannelse kan stadig forårsage afdrift af fokus på grund af ændringer i temperatur eller volumen af ​​mediet. Z-stack erhvervelse kan hjælpe til at afbilde celler ved den korrekte brændplan, men vil øge risikoen for fototoksicitet skyldes ekstra udsættelse af celler for fluorescerende lasere. Alternativt brug af kompensationsordninger fokus drift, såsom en infrarød laser-baserede korrektion automatisk fokus system, kan holde cellerne på samme fokalplan under tidsforskudt levende celler billeddannelse ved at opretholde afstanden mellem cellerne / glas og målet uden yderligere eksponering af cellerne til kort bølgelængde, fototoksisk fluorescens.

Mitokondrie frigivelse af apoptogenic proteiner, såsom cytochrom c, og aktivering af effektor-caspaser, såsom nedstrøms / virkningeller caspase-3 og caspase-7, har generelt været anset for at være "point of no return" i apoptotisk celledød proces 2,5,6. Western blots er blevet anvendt til at påvise spaltning (aktivering) af caspase-3 og dets substrater, såsom poly (ADP) -ribose polymerase-1 (PARP) og DFF45 / ICAD i hele cellepopulationen under apoptotisk induktion og efter fjernelse af apoptotisk stimuli, og viste, at spaltede caspase-3, ICAD og PARP viste i celler under udsættelse for død stimuli, men forsvandt efter cellerne blev re-foder med frisk dyrkningsmedium 13. Imidlertid afslører disse metoder almentilstanden i celle befolkning, men ikke skelne mellem de enkelte celler, der i sidste ende vil dø af dem, der vil vende apoptose og derefter overleve. Biokemisk fraktionering at analysere frigivelse af mitokondrie cytochrom c har lignende forbehold. Derfor, for at spore skæbne af individuelle celler efter cytochrom c-frigivelse og caspase-activationen, to af de mest anerkendte kendetegnende for apoptose 2,5,6, GFP-mærket cytochrom c (Cyto C GFP) og et caspase biosensor, som den anvendes her NES-DEVD-YFP-NLS, kombineret med levende celler mikroskopi omgå disse problemer ved direkte at observere morfologisk genopretning og translokationen af Cyto C -GFP biosensor i de samme celler. Disse resultater indikerer reversibilitet af apoptose efter mitokondrie cytochrom c frigivelse og caspaseaktivering.

Den aktuelle udfordring for at studere Anastasis er manglen på mærkning teknikker til at detektere celler, der har undergået Anastasis på ethvert punkt i hele deres levetid, in vivo eller in vitro. Stabil ekspression af caspase biosensor NES-DEVD-YFP-NLS tillader også påvisning af caspaseaktivitet hvis caspaser aktiveres igen i fremtiden, men ikke permanent registrerer caspase aktivitet som den aktiverede biosensor vil blive nedbrudt uden SustaINED caspaseaktivitet 13. Andre tidligere rapporterede caspase biosensorer, såsom FRET-baserede SCAT biosensorer (f.eks ECFP- [DEVD] -Venus) 26,49 samt fluorescerende reportere Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] GFP) 50 og CPV (f.eks CD8 - [DEVD] -Venus) 51,52, kan anvendes til at detektere caspaseaktivitet i hele dyr og i dyrkede celler, men har lignende begrænsninger. Tilsvarende kan Cyto C -GFP ikke bruges til at spore celler, der tilbageføres apoptose i lang sigt, da det er frigivet fra mitokondrier i cytosolen under apoptose og efterfølgende nedbrydes. Annexin V mærkning er blevet anvendt til at spore celler, der tilbageføres apoptose, men signalintensiteten også falder med tiden, så er ikke anvendelig til sporing af Anastasis 13,45 lang sigt. Kontinuerlig langsigtet in vivo billeddannelse kan bruges til at spore skæbnen for de samme celler efter eksponering af død stimuli. Dog er langsigtede in vivo imaging stadig udfordrende to udføre i de fleste levende dyr. Derfor er der behov for yderligere tiltag for at udvide Anastasis forskning til hele dyreforsøg og til screening af lægemidler, der kan fremme eller hæmme Anastasis hjælp vævskulturceller

I fremtiden er nyere protokoller og teknikker, der sporer langsigtet celle skæbne er nødvendig for at udvikle og afprøve de fysiologiske, patologiske og terapeutiske virkninger af Anastasis. Vi foreslog at Anastasis kunne være en generel mekanisme celleoverlevelse at redde skadede celler, der er vanskelige at erstatte, såsom modne neuroner og hjerteceller 13. Anastasis af apoptotiske kræftceller efter kemoterapeutiske behandlinger, kan imidlertid resultere i tilbagebetaling af farlige celler fører til gentagelse af resistente tumorer 12,13. Anastasis kunne også være en vigtig mekanisme af tumorigenese, da nogle celler vise onkogen transformation, efter at de vendte apoptose 13. Derfor øge Anastasis kunne være en ny theralingsmæssige strategi til inhibering neurodegeneration og hjertesvigt, mens undertrykke Anastasis som en ny måde til forebyggelse eller behandling af cancere. Udvikling biosensorer til at spore tilbageførsel af apoptose i sygdomsmodel systemer vil fremme forståelsen af ​​de celle overlevelse mekanismer Anastasis og potentielle lægemidler til vanskelige sygdomme ved at modulere Anastasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Rev. Dr. Ralph Bohlmann og Rev. Dr. James Voelz for at foreslå ordet "Anastasis" til at beskrive tilbageførsel af apoptose; Douglas R. Green for HeLa-celler, der stabilt udtrykker cytochrom c GFP; Charles M. Rudin og Eric E. Gardner til H446 celler; Heather Lamb om bistand i tegneserie tegning på videoen; Yee Hui Yeo for værdifuld diskussion af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af en Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (HLT), Fulbright tilskud 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation fællesskab (HLT), NIH giver NS037402 (JMH) og NS083373 (JMH) og University Grants udvalg af Hongkong AOE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang er en Shurl og Kay Curci Foundation Fellow af Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics