Candida albicans Biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti Foreign Bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da Bioluminescence Imaging

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Kucharíková, S., Vande Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52239, doi:10.3791/52239 (2015).

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Abstract

Candida albicans sviluppo di biofilm su superfici biotici e / o abiotici rappresenta una minaccia specifica per i pazienti ospedalizzati. Finora, C. biofilm albicans sono stati studiati prevalentemente in vitro, ma vi è la necessità fondamentale per una migliore comprensione di questo processo dinamico in condizioni in vivo. Abbiamo sviluppato un modello di ratto per via sottocutanea in vivo per studiare C. formazione di biofilm albicans. Nel nostro modello, multipla (fino a 9) Candida -infected dispositivi vengono impiantati alla parte posteriore dell'animale. Questo ci dà un grande vantaggio rispetto al sistema venoso centrale modello catetere in quanto ci permette di studiare diversi biofilm indipendenti in un animale. Recentemente, abbiamo adattato questo modello per studiare C. albicans biofilm sviluppo in topi BALB / c. In questo modello, maturo C. biofilm albicans si sviluppano entro 48 ore e dimostrano la tipica architettura biofilm tridimensionale. La quantificazione di biofilm fungineè tradizionalmente analizzato post mortem e richiede sacrificio host. Poiché questo richiede l'uso di molti animali di effettuare studi cinetici, abbiamo applicato non invasivo bioluminescenza (BLI) per longitudinalmente seguire in vivo maturare C. albicans biofilm sviluppare nel nostro modello sottocutaneo. C. cellule albicans erano stati ideati per esprimere il gene Gaussia princeps luciferasi (Gluc) attaccato alla parete cellulare. Il segnale di bioluminescenza è prodotta dalla luciferasi che converte il substrato coelenterazine aggiunto in luce che può essere misurato. Il segnale BLI assomigliava conta di cellule ottenute da cateteri espiantati. Di imaging non invasiva per quantificare in formazione vivo biofilm fornisce applicazioni immediate per lo screening e la validazione di farmaci antifungini in condizioni in vivo, così come per gli studi basati su interazioni ospite-patogeno, dichiara contribuendo ad una migliore comprensionezione della patogenesi delle infezioni da catetere-associate.

Introduction

Candida albicans è un organismo commensale, che può essere trovato in differenti siti di individui sani, per esempio sulla pelle o come parte della flora gastrointestinale e vaginale. Tuttavia, in ospedalizzati, e specialmente immunocompromessi pazienti, può causare una vasta gamma di infezioni 1. In questi individui, il sistema immunitario indebolito permette alle cellule di Candida per diffondere nel flusso sanguigno e di invadere i tessuti più profondi che causano infezioni pericolose per la vita. Inoltre, la presenza di substrati abiotici quali cateteri venosi centrali e delle vie urinarie, valvole cardiache artificiali e fughe può fornire una nicchia per Candida fissaggio 2. Adesione a tali supporti è un prerequisito per l'ulteriore sviluppo del biofilm, che rappresenta uno strato di cellule di lievito e ifali incorporati in materiale polimerico extracellulare, principalmente da polisaccaridi 2. C. catetere -associated infezioni albicanssono associati con alto tasso di mortalità. Una caratteristica generale del biofilm è la loro ridotta sensibilità al antimicotici noti, come azoli 3,4. Solo nuove classi di farmaci antifungini, come echinocandine e la formulazione liposomiale di amfotericina B ha dimostrato di essere attivo contro le infezioni da catetere-associate 5-7. A causa di biofilm resilienza di antimicotici, approcci terapeutici sono molto limitate, spesso conduce a rimozione del catetere e la successiva sostituzione come una soluzione unica.

La maggior parte della nostra attuale comprensione della C. sviluppo biofilm albicans proviene da studi in vitro su substrati abiotici come polistirolo, o plastiche utilizzate per la fabbricazione di dispositivi sopra menzionati, cioè, silicone, poliuretano 2. Questi modelli sono abbastanza avanzato e cercare di simulare la situazione in vivo il più possibile. Tuttavia, questi sistemi non comportano il continuo flusso di sangue e tl sistema immunitario dell'ospite. Questo ha portato allo sviluppo di sistemi modello in vivo, come il modello catetere venoso centrale (CVC) 8-10, il modello stomatite protesi di candidosi orale 11 e un modello murino per catetere associato candiduria 12. Inoltre, C. sviluppo biofilm albicans è stato studiato in vivo sulle superfici mucose, come quelli dalla vagina 13 e 14 della cavità orale. Il nostro laboratorio ha contribuito con la costituzione di un C. sottocutaneo Modello biofilm albicans, che si basa sull'impianto di pezzi catetere infetti sul retro Sprague Dawley 15. Questo modello è stato utilizzato con successo nel nostro laboratorio per testare la suscettibilità biofilm di fluconazolo e echinocandine farmaci 5,16, per studiare l'effetto della terapia combinatoria di diclofenac e caspofungin 17. Più di recente, abbiamo adattato il sistema per l'utilizzo in BALB / c topi 18,19. Inconfronto con altri modelli in vivo, il vantaggio principale di questo modello sottocutanea è la possibilità di studiare più biofilm per animale sviluppato all'interno del lume del catetere pezzi impiantati.

Per ridurre il numero di animali da laboratorio, abbiamo adattato questo modello per studiare lo sviluppo di C. albicans biofilm non invasivo mediante bioluminescenza (BLI) 18,19. Questo metodo ha dimostrato di essere una tecnica potente, che può essere usato per quantificare biofilm misurando il segnale specifico BLI alla regione di interesse (nel nostro caso la zona di cateteri impiantati), evitando il sacrificio di animali. Rispetto ai batteri, che può esprimere sia il gene e il substrato richiesta per la reazione bioluminescenza causa dell'introduzione di una specifica lux operone 20, la maggior parte degli organismi eucarioti, comprese C. albicans, dipendono l'espressione eterologa di un gene luciferasi accoppiato con ilgestione esterna di un substrato specifico, come D-luciferina o coelenterazine 21. Probabilmente a causa della presenza della parete cellulare fungina e C. albicans morfogenesi, la consegna intracellulare del substrato per l'enzima luciferasi era una sfida principale 21. Per risolvere questo problema, Enjalbert et al. 22 progettato un ceppo in cui un C. sintetica albicans versione codone ottimizzata del gene per la naturale secreto Gaussia princeps luciferasi (Gluc) è stata fusa al C. gene albicans PGA59, un GPI- ancorata proteine ​​della parete cellulare. A causa della presenza della luciferasi alla parete cellulare, i problemi relativi alla disponibilità intracellulare del substrato potrebbero essere evitati. Questo particolare sistema è stato utilizzato per studiare infezioni superficiali causate da C. albicans 22. Molto recentemente, BLI è stato utilizzato anche per seguire la progressione della candidosi orofaringea e la sua possible trattamento 23. Questi risultati supportano l'uso di BLI come una tecnica promettente per studiare le infezioni causate da cellule a vita libera, ma anche infezioni periferica associata.

In questo studio, descriviamo la C. albicans sviluppo biofilm su pezzi catetere in poliuretano in topi BALB / c e la sua quantificazione usando BLI. Forniamo un protocollo dettagliato di colonizzazione in vitro dei cateteri in poliuretano, durante il periodo di aderenza seguita da impianto in topi e successivo sviluppo biofilm di animali vivi. Oltre a misurare il segnale emesso dal BLI C. cellule albicans, si determinano anche l'unità formanti colonia per il confronto con la tecnica standard per biofilm fungina carico quantificazione.

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Protocol

NOTA: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico della KU Leuven (numero di progetto 090/2013). Mantenere gli animali in conformità con le linee guida KU Leuven cura degli animali.

1. C. albicans Crescita

  1. Ventiquattro ore prima dell'inizio della sperimentazione animale, preparare piastre YPD aggiungendo 10 g di estratto di lievito granulato, 20 g di peptone batteriologica, e 15 g di agar granulare. Portare il volume a 900 ml con acqua Milli-Q e autoclave.
  2. Aggiungere 50 ml di sterile al 40% di glucosio. Mescolare bene e versare in piastre di Petri. Lasciare piastre di agar per raffreddare e solidificare.
    NOTA: In questo studio, utilizzare due ceppi, cioè wild type C. albicans SC5314 - ceppo GLUC negativo (denominato WT) e C. albicans SKCA23 ceppo, che è un tipo C. selvaggia albicans SC5314 trasformato con Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide 22 .In questo ceppo (chiamato SKCA23- ACTgLuc) Gluc stato fuso al gene endogeno PGA59 sotto il controllo di ACT1 (actina) promotore (questo promotore è attiva nel lievito, nonché hyphal fase di crescita fungina). Questo ceppo può essere richiesto presso il laboratorio del Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belgio. Plasmidi Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide 22 è stata gentilmente donata dal Prof. C. d'Enfert, Istituto Pasteur, Parigi, Francia.
  3. Mantenere entrambi i ceppi in stock di glicerolo e conservare a -80 ° C.
  4. Prima di eventuali ceppi esperimento striscia su un piatto YPD. Incubare la piastra a 37 ° C durante la notte.

2. catetere Pezzi Preparazione

  1. Prima dell'esperimento, determinare quanti cateteri sono necessari. È possibile impiantare fino a 6 pezzi catetere per topo (3 cateteri a sinistra e 3 catetere sul lato destro dell'animale (Figura 2A).
  2. Ventiquattro ore prima dell'intervento degli animali, aprire il paccoetà contenente Catetere triplo lume sotto la cappa di sicurezza biologica. Rimuovere tutti i componenti non necessari con le pinzette sterili e tagliare la parte collegata al catetere con un bisturi sterile. Posizionare righello sotto il pacchetto di plastica e tagliare pezzi di cateteri in poliuretano di esattamente 1 centimetro secondo la scala sul righello (Figura 1).
    NOTA: È importante ricordare che questo tipo di pezzo catetere non è fosforescente e quindi adatto per BLI 18,19.
  3. Posizionare un massimo di 15 pezzi catetere taglio (passo. 2.2) in 2 ml microprovette. Sempre preparare 3 pezzi aggiuntivi, che vengono utilizzati per enumerare la quantità di cellule Candida allegati sul dispositivo dopo il periodo di aderenza.
  4. Supplemento cateteri con circa 1,8 ml di siero fetale bovino 100% (FBS).
  5. Vigorosamente vortice e aggiungere ulteriori 100-200 ml di 100% FBS. Coprire completamente tutti i pezzi catetere con siero.
  6. Incubare a 37 ° C durante la notte.

    3. Gli animali e la soppressione del sistema immunitario

    1. Tenere femmina BALB / c topi (circa 8 settimane di età) in ventilazione individuale top gabbie filtro con libero accesso al cibo normale e acqua ad libitum.
    2. Avviare la soppressione del sistema immunitario 24 ore prima dell'intervento chirurgico animale con l'aggiunta di desametasone (0,4 mg / L) per l'acqua potabile degli animali. Per evitare qualsiasi contaminazione batterica dell'ospite, integrare l'acqua potabile con antibiotici, per esempio, polvere di ampicillina sodio (0,5 g / L).
    3. Mantenere immunosoppressione degli animali durante l'intero esperimento (fino a 6 giorni).

    4. Substrati poliuretano ex vivo C. albicans Adesione su FBS rivestite

    1. Trasferire ogni catetere pezzo di siero rivestite in un nuovo 1,5 ml provetta.
    2. Raschiare alcuni C. cellule albicans coltivate su piastre YPD (Fase 1) e sospendere in 1 ml di PBS.
    3. Diluire Cancellule Dida (1: 100) in una provetta separata. Prendere 10 ml di campione diluito e applicarlo su una camera conteggio delle cellule. Contare almeno 16 piccole piazze.
    4. Preparare cellule Candida (ciascun ceppo separatamente) in terreno RPMI 1640 ad una concentrazione finale di 5 x 10 4 cellule / ml.
    5. Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare per ogni catetere pezzo di siero-rivestito.
    6. Vigorosamente VORTEX e assicurarsi che i cateteri sono immersi nel mezzo e non galleggia sulla parte superiore.
    7. Incubare cateteri a 37 ° C per 90 min (periodo di adesione).
    8. Rimuovere cateteri con pinzette sterili e lavare due volte con 1 ml di PBS. Durante questa fase assicurarsi che il liquido di lavaggio passa attraverso il lume mantenendo il catetere in posizione verticale mentre delicatamente lavaggio cateteri. Importante, non utilizzare un forte flusso che può portare alla rimozione di cellule attaccate.
    9. Trasferire ogni catetere lavato in una provetta pulita (un pezzo per tuessere).
    10. Mettere in ghiaccio e tenere lì fino chirurgia.

    5. Anestesia

    1. Preparare anestesia mescolando 75 ml di ketamina (100 mg / ml) con 100 ml di medetomidina (1 mg / ml) e 825 ml di soluzione fisiologica sterile. Somministrare per via intraperitoneale (ip) 60-80 ml di cocktail anestetico per 10 g di peso corporeo, con un conseguente dose di 45-60 mg / kg ketamina e 0,6-0,8 mg / kg medetomidina.
    2. Per l'inversione di anestesia, diluire 50 microlitri atipamezolo (5 mg / ml) in 4,95 ml di soluzione salina, somministrare ip 100 microlitri per 10 g di peso corporeo come antidoto, risultante in una dose di 0,5 mg / kg.
    3. Dopo l'iniezione di anestesia, mettere l'animale in una gabbia separata e attendere che sia completamente addormentato.
    4. Verificare il corretto anestesia dell'animale da pizzico pelle chiara e pizzico punta, che non causa alcun danno alla pelle. Qualsiasi movimento osservato che l'animale non è sufficientemente anestetizzati per eseguire un intervento chirurgico. In questo caso, attendere un coupio di minuti in più fino a quando l'animale non mostra alcun segno di movimento su pelle o del piede pizzico.

    6. Chirurgia Animal

    1. Trasferimento anestetizzato animale dalla gabbia su un tessuto pulito posto sul rilievo di riscaldamento, pre-riscaldato a 37 ° C (Figura 2A, (1)).
      NOTA: Un'alternativa più economica è quella di utilizzare le termocoperte. È anche possibile utilizzare tamponi isotermici, che devono essere riscaldati nel forno a microonde prima dell'intervento animale.
    2. Applicare pomata oftalmica sugli occhi.
    3. Radere la schiena dell'animale con un rasoio elettrico. Rimuovere tutti i peli di animali e trasferire animali su un panno pulito. Disinfettare la pelle (ad esempio, con 1% di iodio isopropanolo o clorexidina 0,5% nel 70% alcool) e lasciare la zona disinfettati per asciugare per circa 1 min (Figura 2A, (2)).
    4. Effettuare una piccola incisione nella pelle (quella a sinistra e uno sul lato destro dell'animale) (circa 0.5 &# 8211; 1 cm) (Figura 2A, (3)).
    5. Sezionare il sottocute con una forbice per creare due tunnel sottocutaneo. Ogni tunnel dovrebbe essere lunga circa 1,5 cm di lunghezza e 1 cm.
    6. Inserire tre pezzi catetere, in precedenza infettati con Candida, in ogni tunnel. Assicurarsi che i cateteri giacciono uno accanto all'altro in una disposizione orizzontale e che non coprono l'altro per consentire l'impianto di sei frammenti catetere in totale (Figura 2A, (4)).
    7. Chiudere le incisioni con punti di sutura. In alternativa, utilizzare Dermabond per chiudere la ferita.
    8. Disinfettare la ferita molto delicatamente con clorexidina 0,5% nel 70% alcool o con isopropanolo iodio (1%).
    9. Applicare anestetico locale (gel xylocaina, 2%) direttamente sulla ferita.
    10. Somministrare inversione di anestesia (protocollo 5, punto 2): per via intraperitoneale 100 microlitri per 10 g di peso corporeo.
    11. Trasferimento animale a gabbia pulita precedentemente immesso su una piastra riscaldante. Mantenere l'animaleseparata e caldo fino a quando l'animale è completamente sveglio. Nel frattempo, continuare con l'operazione e l'impianto del prossimo animale. Una volta che tutti gli animali operati sono completamente sveglio. Trasferimento a una gabbia. Monitorare gli animali regolarmente.

    7. bioluminescenza Imaging: Preparazione di coelenterazine (CTZ), il substrato per G. luciferasi princeps

    1. Preparare coelenterazine fresco (CTZ) stock soluzione sciogliendo 5 mg / ml CTZ in etanolo acidificato o secondo le istruzioni del produttore.
    2. Preparare la soluzione di lavoro 1.2 mM diluendo la soluzione madre 1:10 in PBS sterile.
      NOTA: Iniettare 100 ul CTZ soluzioni di lavoro per via sottocutanea nella zona circostante i cateteri. Utilizzare siringhe da insulina per iniezione sottocutanea di CTZ.
    3. Tenere sempre CTZ al buio (ad esempio, coprire microprovette contenenti CTZ con foglio di alluminio). Conservare la soluzione madre a -80 ° C per tutta la durata degli esperimenti.
    4. 8. Bioluminescence Imaging

      1. Inizializzare la fotocamera BLI.
      2. Anestetizzare gli animali utilizzando una scatola di induzione. Utilizzare una miscela di gas di isoflurano in ossigeno, N 2 O / O 2, o aria a 2-3%.
      3. Dopo l'induzione, mantenere l'anestesia nella casella induzione e nella camera di imaging a 1,5-2%.
      4. Prima di iniziare la sessione di imaging, posizionare la piastra di imaging in posizione A, che corrisponde ad un FOV di 10 cm. Assicurarsi che la giusta posizione delle prese anestesia e animali ponendo un animale addormentato nella casella.
      5. Prendere alcune fotografie fino animale è nella posizione desiderata di imaging, nel FOV destra sotto la telecamera.
      6. Preparare due siringhe da insulina contenenti ciascuna 100 ml di soluzione di lavoro CTZ.
      7. Inserire un animale in panchina e tenerlo addormentato mediante un cono forniscono anestesia gas.
      8. Portare gli aghi delle siringhe in luogo circostante cateteri sottocutanea e iniettareCTZ simultaneamente sopra i cateteri.
      9. Subito dopo l'iniezione, collocare l'animale sul piatto caldo nella casella fotocamera e avviare l'acquisizione dell'immagine bioluminescenza.
      10. Acquisire scansioni consecutive con tempi di acquisizione da 20 a 60 sec (a seconda dell'intensità del segnale) fino al raggiungimento della massima intensità del segnale. Durante l'acquisizione del frame successivo, misurare l'intensità del segnale BLI dei telai precedentemente acquisiti posizionando una ROI su ogni cateteri trio e misurando il flusso di fotoni attraverso questo ROI.
      11. Ripetere dal punto 7 per l'animale successivo (s).
      12. Dopo l'imaging, ritorno degli animali alla loro gabbia. Ripetere BLI durante il corso di un esperimento per longitudinale, non invasivo di follow-up di formazione di biofilm.
      13. Analizzare i dati BLI con Living software immagine. Posizionare un ROI rettangolare di dimensioni fisse su ogni trio catetere e misurare il flusso di fotoni (radianza) attraverso ogni ROI. Ripetere questa operazione per ogni animale.
      14. Relazionel'intensità del segnale BLI di ogni trio catetere fotoni flusso per secondo. Rappresentare i dati BLI su scala logaritmica tracciando la media e la deviazione standard del flusso di fotoni al secondo per ciascun gruppo. Effettuare analisi statistiche sui log 10 dati trasformati.

      9. Catetere Espianto

      1. Preparare provette da microcentrifuga contenente 1 ml di PBS, uno per ciascun dispositivo catetere e tenerli su ghiaccio.
      2. Euthanize gli animali per dislocazione cervicale (Figura 2B, (1)).
      3. Disinfettare la pelle del dorso con 0,5% clorexidina nel 70% alcool o con isopropanolo iodio (1%).
      4. Praticare un'incisione (circa 3 cm) al di sopra dei cateteri.
      5. Tagliare il tessuto sottocutaneo e rimuovere i frammenti catetere uno per uno da sotto il tessuto sottocutaneo usando pinzette sterili (Figura 2B, (2)).
      6. Maniglia catetere delicatamente in posizione verticale e lavarlo due volte con 1 ml di PBS sterile. Posizionare ogni cateterepezzo una provetta separata (preparata al punto 1).

      10. Le cellule Quantificazione dei biofilm associati di Colony Forming Count Units (CFU) e analisi statistica dei risultati

      1. Cateteri Sonicare precedentemente inseriti in 1 ml di PBS per 10 minuti a 40.000 Hz in un sonicatore bagnomaria e disporli sul ghiaccio.
      2. Dopo sonicazione, vigorosamente vortex per 30 sec e il luogo di nuovo sul ghiaccio.
      3. Preparare due microprovette supplementari contenenti 900 ml di PBS.
      4. Fare 1:10 e 1: 100 diluizioni dal vostro campione originale (quella che contiene il catetere) e mantenere tutte le microprovette su ghiaccio.
      5. Piatto 100 ml di campioni originali, 1:10 e 1: 100 diluizioni su piastre di agar YPD in duplicato.
      6. Incubare le piastre per 2 giorni a 37 ° C e contare CFU.
      7. Contare le colonie cresciute su piastre di agar YPD (quantità numerabile di colonie, massimo 300 colonie / piastra) e moltiplicare per il corretto Dilufattore di (1x-originale, 10x o di diluizione 100x). Ulteriori moltiplicare ogni pezzo catetere 10x, che corrisponde alla quantità finale di colonie in 1 ml provetta contenente il catetere. Portare l'importo finale delle colonie di accedere a 10 cellule / pezzo catetere con deviazione standard (SD). Esprimere i dati come media ± SD.
      8. Mettere tutti i valori per ogni catetere e gruppo specifico in un foglio di calcolo e / o statistico, effettuare i calcoli di cui sopra e le analisi statistiche. Indicare gruppi specifici di confrontare, cioè WT vs mutante o 2 giorni contro. 6 giorni di formazione di biofilm e di eseguire il test t spaiato e ANOVA con il post-test Tukey sui dati log10-trasformati.
        1. Esprimere il livello di significatività per un valore p. In questo studio indicano la significatività se il valore p <0,05, rappresentato come segue: * p <0.05, ** p <0.005, *** p <0,0005.

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Representative Results

In questo studio, dimostriamo la procedura chirurgica di catetere dell'impianto e durante espianto in vivo C. albicans biofilm sviluppo in un topo. Inoltre, mostriamo la quantificazione dei biofilm maturi non solo di CFU classica enumerazione, ma anche di BLI.

Come mostrato nella Figura 1A, non fosforescenti pezzi catetere poliuretano sono stati tagliati in 1 dispositivi cm e successivamente rivestite con siero. Questo passaggio è molto importante perché permette di allegare cellule Candida più rapidamente al substrato in confronto con impianti rivestiti non siero 15. È importante ricordare che prima di ogni C. esperimento albicans noi documentata sfondo luminescenza dei nostri dispositivi 18. Questo passo è cruciale prima di eseguire qualsiasi BLI causa alta fosforescenza del dispositivo interferisca con la valutazione delle specifiche di intensità del segnale e segnale cinetica bioluminescenti da gLuc-cellule esprimenti. Avanti, C. cellule albicans vengono incubate con i pezzi catetere siero rivestite. Catetere frammenti vengono impiantati nella parte posteriore dell'animale dopo l'incisione sottocutanea (Figura 2A). In questo in vivo istituito, due incisioni sono eseguite (uno a destra e l'altra sul lato sinistro della parte posteriore di un mouse) seguita da formazione di tunnel sottocutaneo all'interno di ogni incisione (Figura 2A (3)). Successivamente, tre dispositivi, precedentemente infettati con cellule Candida, vengono impiantati all'interno di ogni sito dell'operazione (Figura 2A (3 e 4)). Questa impostazione permette di studiare fino a sei biofilm per animale. È interessante notare che due siti di funzionamento prevedono la possibilità di studiare la formazione di biofilm da due diversi ceppi di interesse, per esempio wild type e mutante nello stesso animale. Figura 2B mostra la ferita contenente cateteri prima della espianto dispositivo e successive fasi di lavaggio.Biofilm sviluppati all'interno della parte posteriore dell'animale sono stati valutati per le misurazioni del segnale bioluminescenza. Uno degli animali rappresentativi che mostrano il segnale bioluminescenza con rettangoli caratterizzano le regioni di interesse (ROI) è mostrato nella figura 3. Dopo l'ultimo punto di tempo BLI, cateteri vengono espiantate, sonicato e successivamente vortexate e in seguito valutati per le cellule che formano biofilm quantificazione da CFU. Dati analisi che dimostrano i Log 10 CFU ottenuti da ogni parte del catetere dopo lo sviluppo di biofilm e espianto sono mostrati in figura 4A. Accanto a questo, CFU sono stati confrontati con l'intensità del segnale BLI e questi dati sono illustrati nella Figura 4B. Novanta minuti dopo l'impianto di un chiaro segnale BLI è prodotto dalla ACTgLuc esprimente il biofilm che esiste nel ceppo selvatico, pochissima luce viene prodotta; L'intensità della luce rilevata dal esprimente ACTgLucbiofilm è significativamente aumentando il biofilm si forma, qui seguendo la stessa mouse (Figura 4C). Questo aumento nella luce segue lo stesso andamento all'aumento CFU per biofilm (Figura 4A). Nei nostri esperimenti abbiamo anche osservato che un normale ceppo selvatico (non ingegnerizzata per esprimere luciferasi) comporta anche la produzione di luce dopo l'aggiunta del substrato. Tuttavia, il flusso di fotoni era significativamente inferiore a quello ottenuto per il ceppo ingegnerizzata.

Nel loro insieme, i nostri dati dimostrano che BLI è una potente tecnica per monitorare e quantificare in vivo maturare C. albicans formazione di biofilm in un modello di topo sottocutaneo.

Figura 1
Figura 1: Preparazione di dispositivi poliuretano Poliuretano parte del catetere taglio di 1 cm pezzi.. Poc plasticacato contenente catetere è aperta alle condizioni sterili e tutte le parti, tranne catetere viene rimosso dalla confezione. In secondo luogo, mettere righello sotto la tasca in plastica e tagliare esattamente 1 pezzi cm di poliuretano. Tali dispositivi vengono successivamente distribuiti ai tubi microcentrifuga (max 15 parti / tubo) e immersi nel siero fetale bovino al 100% seguita da incubazione overnight a 37 ° C.

Figura 2
Figura 2: Grandi passi durante la chirurgia degli animali. (A) Procedura di impianto del catetere. (1) Luogo anestetizzato animale su un rilievo caldo contenente carta tissue e applicare la pomata oftalmica sugli occhi. (2) Shave parte bassa della schiena e disinfettare. (3) Creare due piccole (circa 0,5 centimetri). Incisioni attraverso la pelle sulla sinistra e sulla destra della schiena. Creare tunnel sottocutaneo all'interno di ogni incisione e posizionare 3 cateteri all'interno. (4) Chiudere il wo und con suture e posto degli animali su un tappetino caldo per recuperare. (B) Procedura di rimozione del catetere. (1) Luogo sacrificato animale su un tappetino e disinfettare i cateteri laterali contenenti gestite. Tagliare la ferita proprio sopra i cateteri. (2) Togliere ogni catetere delicatamente e lavare due volte con 1 ml di PBS. Posizionare la provetta separata.

Figura 3
Figura 3:. Misura del segnale bioluminescenza in vivo BLI immagine da un topo rappresentante ripreso dopo 6 giorni di sviluppo biofilm. La quantificazione di intensità del segnale è eseguita posizionando una regione di interesse (ROI) (rettangolare) attorno ai cateteri seguiti mediante misurazione del flusso di fotoni per secondo attraverso ogni ROI.

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Figura 4: Quantificazione dei maturi Candida albicans biofilm di unità formanti colonie (CFU) e da BLI. (A) in vivo maturare C. albicans SKCA23- ACTgLuc e SC5314 (WT) biofilm quantificazione da Log10 CFU dopo 90 minuti, 2 giorni e 6 giorni di sviluppo biofilm. (B) Segnale bioluminescenza intensità quantificazione da biofilm in vivo formata da SKCA23- ACTgLuc e C. albicans WT. Signal è stato determinato dopo 90 min (periodo di adesione), 2 giorni e 6 giorni di sviluppo del biofilm. Come controllo, abbiamo utilizzato topi che sono stati impiantati con cateteri non colonizzati e che sono stati iniettati sottocute con CTZ. Il flusso di fotoni ottenuto in questi topi provoca nostro segnale sfondo (BG). I dati sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD). La significatività statistica è indicata come segue: * p <0.05, ** p <0,005, *** p <0,0005. in vivo immagini bioluminescenza da un topo rappresentativo che è stato impiantato con frammenti di catetere contenenti selvaggio tipo C. cellule albicans sul lato sinistro e le cellule esprimente ACTgLuc sul lato destro. Il topo è stato ripreso in tre diversi periodi di tempo, cioè 90 min, 2 giorni e 6 giorni dopo l'impianto dei frammenti catetere.

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Discussion

L'uso di modelli animali, e in particolare i modelli di roditori, per gli studi dedicati a biofilm microbici è molto importante in quanto il sistema immunitario dell'ospite è un fattore essenziale nella formazione di biofilm che i modelli in vitro non possono spiegare. In questo studio, descriviamo un relativamente semplice sottocutanea C. albicans modello murino biofilm, che può essere facilmente adottata in un laboratorio di ricerca e non richiede forti competenze tecniche. Questo modello è stato originariamente sviluppato per studiare Staphylococcus epidermidis formazione di biofilm in un topo 24.

Nel modello presentato, cateteri siero rivestite di poliuretano sono stati contestati con cellule di Candida ex vivo durante il periodo di aderenza (90 min, 37 ° C). Questo primo passo in vitro può essere considerata come un fattore limitante per la mancanza del sistema immunitario nelle prime fasi del processo di infezione biofilm. Dopo l'adesione e primaimpianto del catetere, cellule associate non-device vengono rimossi con il lavaggio. Evitando la fase di lavaggio dopo il periodo di aderenza può creare quantità incontrollabile di cellule associate con il dispositivo. Per questo motivo, si consiglia di lavare i cateteri prima l'impianto e quindi, di avviare il suo sviluppo dalle cellule aderito. Dopo questo periodo iniziale di adesione, cateteri contengono circa il 2,0-2,5 Log 10 CFU / dispositivo diffuso lungo il catetere lume 15. Durante questa fase Candida tubi in germinali, che sono attaccati sul substrato.

Per assomigliare la situazione nei pazienti ricoverati, di cui il sistema immunitario è spesso compromessa, abbiamo immunodepressi i ratti nel nostro sistema modello per via sottocutanea 15. Parziale compromissione del sistema immunitario di un ratto, prima dell'impianto dispositivo e per tutto il periodo di sviluppo biofilm, ha determinato una maggiore riproducibilità delle cellule biofilm formano recuperati dalcateteri impiantati nello stesso host e anche da dispositivi ottenuti da animali aggiuntivi. A causa di questi risultati si consiglia di immunosuppress topi prima dell'impianto del catetere e anche durante il periodo di formazione di biofilm. Tuttavia, i nostri risultati mostrano che la variabilità nei topi immunocompetenti è molto inferiore rispetto a quello osservato nei ratti, che rende tale sistema modello topi adatto per studiare il ruolo del sistema immunitario dell'ospite su biofilm anche. Nel nostro modello di ratto originale e anche nello stesso modello tradotto a topi, maturare C. biofilm albicans si sviluppano entro 48 ore dimostrato dalla quantità simile di CFU e architettura biofilm tra 2 e 6 giorni 15,18,19.

Il modello biofilm sottocutaneo è stato utilizzato con successo per seguire lo sviluppo del biofilm da diversi mutanti 15. È stato dimostrato in precedenza dal Nobile et al. 25 che C. albicans bcr1 Δ / bcr1 Δ non è riuscito aformano biofilm in un catetere venoso (CVC) modello centrale. Questo ceppo visualizzata caratteristiche biofilm rudimentali nel nostro modello sottocutanea puntamento per il fatto che le variazioni fenotipiche trovati nel modello CVC potrebbero essere riprodotti nel modello sottocutanea 15.

In confronto con altri modelli esistenti, vale a dire., CVC modello o protesi modello stomatite 8,9,11, il modello sottocutaneo permette di seguire lo sviluppo del biofilm in più pezzi catetere ottenuti da un animale, riducendo così il numero di animali necessari per gli studi biofilm. Nonostante questi vantaggi, una lacuna può essere la mancanza di flusso di sangue che può portare ad alcuni privazione dei nutrienti nel biofilm. Pertanto, in termini di forniture di nutrienti e delle condizioni ambientali, il modello sottocutanea è più legato alle infezioni da dispositivo associato sviluppati su protesi articolari, protesi vocali e pacemaker di quelle formate su cateteri endovenosi. Ancora più importante,traducendo il ratto sistema biofilm sottocutanea a topi reso questo modello animale compatibile con BLI, che riduce ulteriormente i costi e, soprattutto, il numero di animali necessari. Inoltre, traducendo il modello di ratto per topi consente l'utilizzo di modelli di topi transgenici per studiare i fattori ospitanti interessati agli studi infezioni catetere-associata.

Il principale vantaggio di utilizzare BLI quantificare biofilm di animali vivi non sta solo nel carattere non invasiva di questo metodo, ma anche nella sua capacità di fornire informazioni dinamiche sullo sviluppo di un'infezione. In questo studio, Gluc espresso alla parete cellulare di C. albicans permesso una migliore accessibilità e interazione diretta con il coelenterazine substrato, che sono fondamentali per la rilevazione di segnali bioluminescente in vivo. Nello studio di Vande Velde et al. 18, siamo stati in grado di seguire il segnale bioluminescente da C. albicans biofilm sviluppato su foreicorpi GN in vitro. L'intensità del segnale BLI fortemente in corrispondenza con i dati ottenuti da ulteriori tecniche di quantificazione biofilm, cioè, determinazione CFU e test XTT riduzione. Accanto a questi risultati, abbiamo dimostrato che il segnale bioluminescente dal vivo biofilm in era in accordo con la quantità di cellule biofilm associate recuperati da biofilm espiantati. Inoltre, Vande Velde et al. 18 dimostrato che BLI può essere utilizzata per seguire lo sviluppo biofilm da un tipo selvaggio e anche da C. albicans bcr1Δ / bcr1Δ (ceppo biofilm-deficient) nello stesso animale allo stesso tempo. Questi risultati sostengono fortemente l'uso di BLI corso degli studi dedicati alla valutazione del decorso temporale di sviluppo biofilm e infezioni nello stesso animale.

Con la presente, abbiamo descritto una procedura sperimentale per impianto in vivo per via sottocutanea di dispositivi Candida -infected con il monitoraggio successivo of in vivo sviluppo biofilm da BLI. Nel loro insieme, BLI ha dimostrato di essere una tecnica affidabile, che ci ha permesso di seguire una infezione nel tempo evitando sacrifici di animali in ogni fase di analisi dei dati.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract granulated Merck MERC1.03753.0500
Bacteriological peptone Oxoid LP037B
Agar granulated Difco 214530
D-(+)-glucose Fluka 49159-5KG
Phosphate buffered saline  Prepared in the laboratory for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4
RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate  Sigma R6504-1L Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing 
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Sigma M1254 MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0)
fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524
Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730)  BBraun CV-15703 Polyurethane part cut into 1 cm pieces
Dexamethasone Fagron SAS, France 611139 Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml)
Ampicillin  Duchefa Biochemie, The Netherlands A0104 Antibacterial prophylaxis
Ketamine 1000 Pfizer 804 119 Anesthetic
Domitor Pfizer 134737-1 Anesthetic
Antisedan Pfizer 134783-2 Reversal of anesthesia
Xylocaine gel (2%) - this is Linisol AstraZeneca 352 1206 Local anesthetic for the skin
Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment To prevent drying and infection of eyes
Coelenterazine  Prolume (Nanolight) NF-CTZ-FB Light sensitive agent (must be kept in the dark)
Iodine isopropanol (1%) 3M™ DuraPrep™  Disinfectant for the skin
0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol.   Cedium Disinfectant for the skin
Equipment
Cell counting chamber
Insulin syringes (0.3 ml) Terumo Myjector 29G 324826 For injection of coelenterazine
Electric razor For small animals
Sterile surgical tools Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel
Heating pad Leica 14042321474
Skin suture Johnson&Johnson K890H Surgical thread, needle
Water bath sonicator Branson 2210
BLI camera (IVIS Spectrum)  Perkin Elmer, Alameda IVISSPE
Living Image software  Perkin Elmer, Alameda (version 4.2) 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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