מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dilworth, D., Nelson, C. J. Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (98), e52345, doi:10.3791/52345 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

קביעת מצב פעולה של כימיקלים ביו-אקטיביים היא עניין למגוון רחב של אקדמיות, תרופות, ומדענים תעשייתיים. Saccharomyces cerevisiae, או שמרי ניצנים, הוא מודל לeukaryote שאוסף של ~ 6000 מוטציות מחיקת גן וגן חיוני hypomorphic מלא מוטציות זמינות מסחרי. אוספים אלה של מוטציות יכולים לשמש כדי לזהות באופן שיטתי אינטראקציות כימיות-גן, גנים כלומר צורך לסבול כימי. מידע זה, בתורו, דיווחים על המצב הסביר של פעולה של המתחם. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי המהיר של אינטראקציות כימיות-גנטית בשמרי ניצנים. אנו מדגימים את השיטה באמצעות הסוכן כימותרפיות 5-fluorouracil (5-FU), שבה יש מנגנון מוגדר היטב של פעולה. התוצאות שלנו מראות כי הנווד הגרעיני RNA אנזימי exosome ותיקון DNA נחוצים לשגשוג בנוכחות 5-FU, שעולה בקנה אחד עם מ 'קודםicroarray גישות המבוססות על קידוד בר כימיות גנטיות והידע ש5-FU משפיע לרעה על חילוף חומרים הן RNA ו- DNA. פרוטוקולי האימות המבוקשות למסכי תפוקה גבוהה אלה גם מתוארים.

Introduction

הכלים ומשאבים זמינים באורגניזם המודל Saccharomyces cerevisiae הגנטיים אפשרו מחקרי גנומיקה התפקודית בקנה מידה גדולה שביחד מספקים תובנה חדשה איך גנים לתפקד כרשתות כדי למלא את הדרישות של מערכות ביולוגיות. אבן הפינה של כלים אלה הייתה היצירה המשותפת של סט שלם של מחיקות גן שאינו חיוניות של כל מסגרות הקריאה הפתוחה בשמרי 1,2. תצפית מדהימה הייתה שרק ~ 20% מגנים של שמרים נדרשים לכדאיות כאשר גדלו כhaploids בתנאי מעבדה סטנדרטיים. זה מדגיש את יכולתו של תא לחיץ נגד הפרעות הגנומי באמצעות הניצול של מסלולים ביולוגיים חלופיים. מוטציות גנטיות כי הן מבחינה אישית, אך קטלניות בשילוב, לאותת מסלולים ביולוגיים מקבילים מחוברים או מתכנסים ויוצרות רשתות אינטראקציה גנטיות המתארות פונקציה ביולוגית. עם התפתחותה של te המותנהאללים mperature רגישים וhypomorphic של גנים חיוניים הטכנולוגיה לא מוגבל למחקר של גנים שאינם חיוניים 3,4. מושג זה יושם בקנה מידה הגנומי לייצר מפת אינטראקציה גנטית משוחדת הממחישה את הגנים מעורבים בתהליכים תאיים דומים להתקבץ יחדיו 5.

הפרעות כימיות של רשתות גנטיות מחיקות גן לחקות (איור 1) 6. שאילתות תרכובות צמיחה מעכבת כנגד מערך צפיפות גבוהה של זני מחיקה לרגישות יתר מזהה פרופיל אינטראקציה כימית-גנטי, כלומר רשימה של גנים שנדרשו לסבול מתח כימי. כמו אינטראקציות גנטיות, מסכי בקנה מידה גדולה של ספריות כימיות הראו כי תרכובות עם מצב דומה של אשכול פעולה יחד 7. לכן, על ידי הקמת פרופיל האינטראקציה הכימית-גנטית של מתחם המצב של פעולה ניתן ללמוד על ידי השוואתו עם larאינטראקציה גנטית וכימית סינתטית ge בקנה המידה גנטית מערכי נתונים 8,9.

מסכי כימיים-גנטית בקנה מידה גדול, שבו עשרות רבות של תרכובות נחקרו, בוצעו על ידי מבחני תחרות ברקוד. בגישה זו, האוסף המשולב של זני מחיקה הוא גדל בהמוניהם לכמה דורות בנפח קטן של מדיה המכילה חומר כימי. מאז כל מוטציה מחיקת נמלים ברקוד גנטי ייחודי, את הכדאיות / הצמיחה של מוטציות בודדות בתוך הבריכה של זני מחיקה היא מעקב על ידי microarray או תפוקה גבוהה רצף 10.

הסיק כושר על ידי ניטור גודל מושבה של מוטציות ערוכות מבחינה פיזית גדלו על אגר מוצק המכיל תרכובת ביו-אקטיבית הוא גם שיטה יעילה לזיהוי אינטראקציות כימיות-גנטי 11,12. גישה זו מספקת חלופה חסכונית להקרנה מבוססת תחרות והוא גם מתאים למנסה לאמוד ספריות קטנות של כימיקלים.מתואר כאן היא מתודולוגיה פשוטה להפקת רשימה של אינטראקציות כימיות-גנטי בS. cerevisiae שאינו מסתמך על מניפולציות מולקולריות ביולוגיה או תשתיות. זה דורש רק אוסף שמרי מחיקה, מנגנון נעיצה רובוטית או ידני, ותוכנת ניתוח תמונה זמינה באופן חופשי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: העבודה הכללית של הליך זה מתואר באיור 2.

1. קביעת מינון צמיחה-מעכבת

  1. הכנה של תרבות לילה שמרים
    הערה: תקשורת שמרים-תמצית-peptone דקסטרוז הצמיחה (YEPD) שימוש בפרוטוקול זה היא מתכון סטנדרטי 13.
    1. Streak את BY4741 (his3 מאטה Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) תאים על צלחת אגר YEPD דגירה במשך 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס או עד מושבות גלויות טופס.
    2. הכן תרבויות לילה בלחסן 5 מיליליטר של נוזל תקשורת YEPD בכלי תרבות סטרילי עם מושבה אחת. דגירה הלילה בשעה 30 ° C עם סיבוב רציף או רועד. התרבות בדרך כלל תגיע לרוויה בבוקר (~ 2 × 10 8 תאים / מיליליטר).
  2. הכנת מדיה אגר מוצקה המכילים מינונים שונים כימיים
    1. הכן כמה מניות שלהכימי להיבדק ב100x ריכוז סופי רצוי בממס מתאים.
      הערה: ריכוזים אפקטיביים יהיו תלויים בחומר הכימי, ויש לקבוע באופן אמפירי. אי לכך, מומלץ תחילה לבחון מגוון רחב ריכוז סופי, כלומר, ממיקרומטר הנמוך לגבוה מ"מ.
    2. עבור כל ריכוז של חומר כימי להיבדק, aliquot 3 מיליליטר של אגר YEPD המותך לכמה צינור תרבות סטרילי. מקום באמבט המים C ° 55 כדי לשמור לחיזוק.
    3. עבור כל ריכוז של חומר כימי להיבדק להוסיף 30 μl של מתחם 100x לתקשורת מותכת, מערבולת 2-3 שניות כדי לערבב, ופיפטה 1 מיליליטר לכל זוג של בארות כפולות בצלחת 12 גם. הקפד לכלול רכב רק שליטה. לאפשר צלחות להגדיר לילה בטמפרטורת חדר. לבטל את כל אמצעי תקשורת נוספת.
  3. תאי התפשטות ציפוי
    1. לחסן 10 מיליליטר של נוזל תקשורת YEPD עם 2 μl של תרבית שמרים רוויה, גדל הלילה כמו בשלב 1.1.2.
    2. צלחת 25 μl של תרבית שמרים מדוללת היטב, להתפשט באופן שווה באמצעות חרוזים זכוכית סטרילית או מוט, ולאפשר את הצלחת לייבוש תחת אש. דגירה צלחת ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
    3. להעריך את הצמיחה של שמרים (גם מספר והגודל כולל של מושבות) על הצלחות. בחר ריכוז תת-קטלני של מתחם שלא לעכב את הצמיחה על ידי יותר מ 10% -15% כדי לבצע את המסך.

2. מסך כימי גנטי שיטתי

  1. תחזוקה של מחיקת מוטנטי-מערך (DMA) והכנה של צלחת המקור
    1. לתיאור מפורט על בניית מערכי מוטציה מחיקה ממניות גליצרול עיין et al Baryshnikova. 14. ברגע שמוטציות מחיקה כבר ערוכות בצפיפות של 384 מושבות בכל צלחת, DMA יכול להיות מאוחסן במשך כמה חודשים על 4 מעלות צלזיוס. לשכפל על אגר YEPD המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418 כנדרש כדי למנוע ממושבות גדלו לתוך כלאחר.
      יש להימנע משוכפלים סידוריים מרובה על מנת למנוע אובדן של זנים גדלו איטיים ולצמצם את המראה של מוטציות מדכאת: הערה. זה רלוונטי במיוחד אם שמירת האוספים כhaploids.
    2. לבצע את כל שלבי העתק-הציפוי באמצעות חיידקים עֲרִיכָה מערכת רובוטית. לחלופין, לתפעל ערוך מושבות באמצעות כלים pinning ידניים.
      הערה: אוסף שמרי המחיקה זמין כhaploids וdiploids ממספר מקורות מסחריים ונשלח בדרך כלל כמניות גליצרול ב96-גם צלחות.
  2. עיבוי מערך המוטציה המחיקה
    1. הכן 250 מיליליטר של תקשורת אגר YEPD המכילה 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418. הריכוז היעיל של G418 עשוי להשתנות וכל מגרש יש לבדוק באופן אמפירי.
    2. הכן חמש צלחות אגר YEPD על ידי שפיכת 50 מיליליטר של אגר YEPD המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418 לכל צלחת. האם יום אחד זה לפני עיבוי המערך ולאפשר הצלחות להתקרר בטמפ 'החדרerature לילה על אף משטח שטוח.
      הערה: ארבע צלחות תידרש לאיסוף בצפיפות 1,536 מתח, הצלחת החמישית היא שפך כתוספת.
    3. הסר את 16 צלחות פטרי המכילות את אוסף מחיקת המוטציה בצפיפות של 384 מושבות בכל צלחת ולאפשר להגיע לטמפרטורת חדר (~ 1 שעה).
    4. נגב כל עיבוי שנוצר על המכסה של כל צלחת באמצעות משימה עדינה לנגב. אם לא יעשה זאת עלולה לגרום לטיפי מים שהופקדו על המערך וזיהום צולב של מוטנטים ערוכים.
    5. באמצעות רובוט מערך תולה חיידקים, להתעבות DMA מצפיפות של 384 מושבות בכל צלחת (16 צלחות פטרי) ל1,536 מושבות בכל צלחת (4 צלחות פטרי). לבצע את זה כדי שמושבת -1 מפינים 1 הצלחת לחתור עמודה 1 1 של מערך תמצית, המושבה -1 בצלחת 2 לחתור 1 טור 2, המושבה -1 בצלחת 3 לחתור 2 ועמודה 1, ו המושבה -1 בצלחת 4 לחתור 2עמודה 2.
    6. דגירה המערך המאוחד על 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    7. לבחון את המערך כדי להבטיח העברה אחידה של מושבות מצלחות מקור. תהיה כמה עמדות ריקות, שהתאגדו בכוונה תחילה את המערך, המשמשים כמדריך כדי להבטיח את DMA כבר מרוכז בצורה נכונה (איור 4 א).
      הערה: אלה יהיו צלחות המקור לציפוי העתק על גבי מדיה המכילה את תרכובת המבחן. צלחת מקור יחידה יכולה לשמש לpinnings מרובה. גם רובוטים רבים יהיו תכונת קיזוז, אשר תבטיח מספרים דומים של שמרים מועברים בכל פעם.
  3. מערך מוטציה מחיקת צלחת Replica
    1. הכן 700 מיליליטר של שליטה (רכב בלבד) ו -700 מיליליטר של תקשורת הניסיונית (המכיל כימית). זה מספיק לביצוע assay בשלושה עותקים (12 צלחות לכל מצב, בתוספת שתי תוספות).
    2. יוצקים 50 מיליליטר של אגר YEPD מכיל כימי מבחן או שליטה לכל צלחת. לאפשר t הצלחותo להתקרר בטמפרטורת חדר למשך לילה על אף משטח שטוח.
    3. שימוש ברובוט לצלחת העתק, לחסן DMA על שלושה סטים של צלחות המכילות כימיקלים בריכוז בניסוי הנחוש, כמו גם שלושה סטים של צלחות המכילות שליטה ברכב. דגירה צלחות בטמפרטורת חדר למשך 24-48 שעות.

3. צלחות הדמיה וניתוח נתונים

  1. הסר צלחות מהחממה ולאפשר להם להגיע לטמפרטורת חדר (~ שעה 1) לפני ההדמיה. זה ימנע עיבוי מ טביעה בזמן ההדמיה הצלחות.
  2. צלחות תמונה ב 24 ו 48 שעות על ידי הסרת המכסה והצבה עם פנים כלפי מטה על סורק למיטה שטוח. צלם תמונות ברזולוציה של לפחות 300 dpi. לחלופין, להשתמש במצלמה דיגיטלית כדי ללכוד תמונות. אם כך צלחות מקום, עם הפנים כלפי מעלה על רקע כהה ולהסיר את המכסים לתמונה.
    הערה: תבנית הקובץ והמיקום של צלחות תהיה תלויה בתכנית הכימות בשימוש. בצע כימות והשוואה של גדלי מושבה מערך באמצעות אחד מכמה תוכנות קוד פתוחות, כוללים 15 "שטויות, SGAtools 16, וScreenMill 17.

4. אישור של מסך

הערה: בשלב זה מוטציות כמה מחיקות שמרים את הציון רגישה כמו לכימי של עניין. אינטראקציות כימיות-גנטי אלה חייבים להיות מאומתים הבאות בשתי דרכים. ראשית את זהותו של זנים רגישים צריכה להיות מאושרת על ידי PCR. שנית, רגישות כימית חייבת להיות הבקיע באופן עצמאי. המפורטים להלן הוא פרוטוקול קצר לביצוע מבחני איתור כדי לאמת את רגישות יתר לחץ, טכניקה נפוצה בשמרי ביולוגיה.

  1. Streak את מוטציות רצויה (רגישות יתר) מאוסף מחיקת השמרים על אגר YEPD המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418. לדגור על 30 מעלות צלזיוס עד טופס מושבות. ודא גנוטיפ של המתח על ידי PCR עם פריימרים אבחון על פיהפרוטוקול של היצרן.
  2. לחסן 5 מיליליטר של נוזל YEPD עבור כל זן ודגירת הלילה בשעה 30 ° C עם רוטציה או רועד.
  3. למדוד OD 600 ולדלל כל זן לOD 600 = 1 בסטרילי DH 2 O. אלה נמצאים כעת תרביות שמרים מנורמלות.
  4. לוותר על שמרים מנורמלים wild-type (BY4741) תרבות 100 μl ולA1 של צלחת 96-היטב. לוותר של עד שבעה זנים נוספים 100 μl לבארות B1-H1.
  5. השתמש pipettor רב-ערוצי לוותר 90 μl של סטרילי DH 2 O לבארות A2-H2 דרך A6-H6. לבסוף, להכין סדרה של דילולים 1:10 תרבויות שמרים מנורמלות. התחל על ידי סדרתי pipetting 10 μl של עמודת 1 לעמודה 2 עם pipettor רבי ערוצים, ותמשיך על פני הצלחת 96-היטב עד שישה דילולים נעשים (כלומר, 10 0-10 -5).
  6. העבר 2-5 μl של תרבויות שמרים מדוללים ברשת באמצעות רב-ערוציpipettor על גבי מדיה מוצקה YEPD מכילה שליטה כימית ורכב. דגירה צלחות בטמפרטורה המתאימה ל24-48 שעות.
  7. בדוק צלחות ולהשוות את הרגישות של מוטציות בחרו לכימי (יחסית לBY4741 שליטה). צלחות תמונה ב 24 ו -48 שעות כמו בשלב 3.2.
    הערה: בעוד שזיהוי של מספר זנים רגישים עם אונטולוגיות גן קשור או פונקציות מעניק ביטחון לתוקף של המסך, הפיכתו של זן מחיקה רגיש עם פלסמיד המכיל עותק wild-type של הגן נדרש לקבוע רשמית כי גן מחיקה של עניין (ומוטציות אתר השניה לא מוסתרות) גורם לרגישות לסמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאימות של גישה זו הופענו מסך נציג כימי גנטי אינטראקציה של 5-fluorouracil הסוכן כימותרפיות (5-FU) בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל. 5-FU ידוע לשבש synthase thymidylate כמו גם DNA ו- RNA חילוף חומרים 18. האינטראקציות הגנטיות הכימית של 5-FU היטב למדו ונחקרו על ידי טכניקות microarray השמרים ברקוד באמצעות שני אוספי מחיקה הטרוזיגוטיים והומוזיגוטים 8,19. כאן אנו מראים כי ניתן להשיג תוצאות דומות על ידי quantitation ההשוואתי של גודל מושבה מוטציה.

יש לציין כי המסך ביצע מנצל את אוסף מחיקת גן הפלואידים שאינו חיוני. סוג זה של מסך יכול גם להתבצע באמצעות זני דיפלואידי, מוטציות רגישות לטמפרטורה, ואללים hypomorphic, המאפשר ההכללה של מוטציות גנטיות חיוניות. אחד יתרונות לשימוש באוסף מחיקת הפלואידים הוא גדל sensitiv סמיםity של מסלולי יעד, בהתחשב בהעדר מוצר הגן השלם. עם זאת, שני חסרונות משמעותיים הם שרגישות יתר גן חיוני לא יכול להיות שאל, ואוסף הפלואידים נוטה למוטציות ספונטניות מדכאת שנבחרו למעל propagations מרובה. זה יכול להוביל להידרדרות של האוסף. לפיכך, יש סחר טבוע מבין שלמותה ולרוחבה של המערך ורגישות להשפעת סמים. זה חייב להילקח בחשבון וגביית המוטציה המתאימה ביותר נבחרה על בסיס היישום הרצוי.

ראשית, הריכוז תת-קטלניים המתאים של 5-FU לשימוש במסך היה נחוש להיות 10 מיקרומטר על ידי גידול BY4741 תאים (מאטה his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) על הגדלת ריכוז של 5-FU וחזותי הערכת צמיחת שמרי מושבה ( איור 3 א). לחלופין, ניתן להשיג תוצאות דומות על ידי ye גדלAST צלחות microtiter בתרבות נוזלית וניטור תכוף של הצפיפות האופטית התרבויות באמצעות microplate קורא (איור 3), כפי שתואר על ידי קבוצות קודמות 10,20.

באמצעות הרוטור זינגר, שמרי DMA היה משוכפל ב1,536 מושבות בכל צלחת צפיפות על גבי מדיה המכילה 10 מיקרומטר 5-FU או שליטת sulfoxide דימתיל (DMSO) (איור 4 א). צלחות אלה טופחו במשך 24 שעות בטמפרטורת חדר וצלמו על סורק למיטה שטוח. מדידת גודל מושבה לכל מוטציה בשני צלחות ניסיוניות ושליטה בוצעה באמצעות מנוע ניתוח תמונת "שטויות 15. תוכנת "שטויות מחשבת את יחס הגודל של מושבות ביחסיות מערך הניסיוני לשלוט. המשתמש יכול להגדיר סף יחס ואם המסך מתבצע בלפחות עוֹתֶק מְשׁוּלָשׁ p-ערך שיוקצה לכל מוטציה. במוטציות מסך הנציג שלנו שהראו יחס של ≤0.8 היו לשקולed להיות להיטים. התוצאות של כימות המושבה יכולות להיות מוצגות באופן גרפי על ידי התוויית יחס הגודל לכל מושבה בציר y ואת מחיקת הגן המסודרת על עמדת מערך (איור 4) או יחס (איור 4C) על ציר x.

חולים סינטטי / ניתן לקבץ מוטציות קטלניות שזוהו במסך המבוסס על תיאורים פונקציונליים על ידי ביצוע ניתוח אונטולוגיה גן (GO). ישנם מספר כלים זמינים בפומבי לניתוח GO של רשימותיו של ס ' גני cerevisiae; כולל 21 Funspec, מסד נתונים DAVID ביואינפורמטיקה 22,23, ומסד נתוני Saccharomyces הגנום (SGD) עבור הטווח 24 Finder. מחיקות גן שהיה יחס של פחות מ או שווה ל 0.8 במסך 5-FU שמשו כרשימת קלט עבור Funspec. Funspec מקבל רשימה של שמות גן שמרים שיטתיים או נפוצים ופלטי סיכומים של אונטולוגיה גן, סיווגים פונקציונליים, לוקליזציה, קומפלקסי חלבונים כמו גם otסיווגים השימושיים שמועשרים ברשימה ש. מסך הנציג ביצע הראה העשרה של אונטולוגיה לחילוף חומרי RNA, כולל tRNA מתנדנד, שינוי uridine ומכונות מעקב RNA, ותגובה לנזק לדנ"א (טבלה 1). תוצאות אלו מסכימה עם מחקרים קודמים שהראו 5-FU תוצאות טיפול בהצטברות של polyadenylated RNAs noncoding, אשר מעובדים על ידי exosome הגרעיני TRF / Rrp6 / מיזוג / Mtr4 polyadenylation (נווד) 25. כך שממצאים אלה בהסכם עם מסכי גנטיים כימיים קודמים והמנגנון הידוע של 8,19 את הפעילות הביולוגית של 5-FU.

כמו בכל הגישות הגנומי התפקודיות התפוקה גבוהה יש צורך לאמת את התוצאות. כדי לאמת את שמרי מוטציות גנטיות אינטראקציות כימיות יש-תוקף PCR עם פריימרים ראשון שלחשל בתוך האמרגן של גן המטרה וקלטת שיבוש KANMX. בחירה של זנים לתוקףation הוא מוטציות שרירותיות במידה מסוימת, אולם עדיפות שמראות פנוטיפ חזק וקבוצה פונקציונלית מספקת נקודת התחלה טובה. בשלב הבא, רגישות יתר לחומר כימי הוא אישר שימוש במבחני איתור, גישה מקובלת למדידת כושר של שמרי מוטציות. לשם כך, דילולים סדרתי של שמרי זנים הם הבחינו ברשת בתקשורת המכילה את המינון הכימי המתאים, כמו גם שליטה. כדוגמא, אנו מאשרים את האינטראקציה הגנטית הכימית של 5-FU עם מוטציות air1 וtrf5 של מתחם הנווד (איור 5). גנים אלו מקודדים מרכיבי exosome הגרעיני הנווד. נציין כי מתח rrp6, חסר הליבה 3'-5 פעילות exonuclease של נווד, הלך לאיבוד באוסף DMA בצפיפות הגבוהה של המעבדה שלנו. בקבלת מוטציה rrp6 טרי אנו מאשרים rrp6 וש5-FU גם להציג אינטראקציה גנטית כימית, שקבע כי פעילות הנווד נדרשה לסבול 5-FU. זה ממחישכי שלמות אוספי מחיקה גדולות עשויה להיות נפגעת לאורך זמן, מה שהופך את תחזוקת DMA נכונה ואימות מתח קריטית.

המסך שלנו גם זיהה מוטציות בכמה אנזימי תיקון DNA (כולל rad50, rad52 וmre11) כ5-FU רגיש. ניקוד של גודל מושבה הצביע על הכושר היחסי של מוטציות אלה ב -10 מיקרומטר 5-FU כ0.7, 0.65, 0.42 ולעומת סוג בר. בהתבסס על מבחני האיתור מאשרים (איור 5), ערכים אלה הם הערכת חסר הנראה בשל הטווח הדינמי המוגבל של מדידת כושר על ידי ניקוד גודל מושבה. זה מדגיש סיבה שנייה כדי לאשר באופן עצמאי על ידי אינטראקציות תצפית סידורי: סדר הגודל של כמה אינטראקציות גנטיות כימיות יכול לזלזל בניתוח הנתונים ראשוני. התוצאות שלנו להמחיש כי מסך המבוסס על צמיחה כימית גנטי הופיע עם ~ אוסף מחיקת הפלואידים 4,800 מתח, בשלושה עותקים, מספק Resol ההולם ution לבודד את ביטחון אינטראקציות גנטיות כימיות ספציפיות.

איור 1
איור 1:. ייצוג סכמטי של אינטראקציות גנטיות כימיות מחיקות ג'ין שתגרומנה לרגישות יתר להפרעות כימיות מאפשרות זיהוי של תהליכים ביולוגיים הממוקדים על ידי חומר כימי. יכולים להיות מופרים מסלולים מתכנס () או על ידי מחיקת הגן (geneA) או כימי (geneB). בנפרד, יכולים להיות נסבלים עלבונות הסלולריים אלה בשל היתירות הגלומה במסלולים ביולוגיים. עם זאת, בכדאיויות תא שילוב נפגעת כתוצאה מכך גם הפנוטיפ סינטטי חולה או קטלני. מחיקה של גנים (geneC) קריטיים עבור מקלים מתח מושרה כימי גם לגרום לרגישות יתר ומצביע על מסלולים ביולוגיים מופרים על ידי טיפול כימי (B). "Target =" jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: זרימת עבודה עבור מסך גנטי כימי קביעה (א) למינון תת-מעכב:. זני שמרי הורים גדלים לשלב נייח, בדילול 1: 5,000, והתפשטות מצופות על תקשורת YEPD מוצקה המכילה מינון כימי הגדלת. הריכוז הגבוה ביותר שאין לו עיכוב צמיחה גדול יותר מ 10-15% נבחר להקרנה נגד DMA. מסך גנטי כימי שיטתי (B): שימוש במערך תפוקה גבוהה מצמיד רובוט S. cerevisiae DMA הוא העתק מצופה על מדיה המכילה הריכוז המתאים של בדיקה כימית. צלחות מודגרת בטמפרטורת חדר למשך 24-48 שעות, צילמו, וגודל מושבה יחסי נקבע.נ"צ = יעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3 :. קביעת הריכוז תת-מעכב. צמיחה (א) לBY4741 תאים על תקשורת מוצקה המכילה 5-fluouracil. התרבות רוויה BY4741 בדילול 1: 5,000 ומצופית על ריכוזים הולכים וגדל של 5-fluorouracil. עקומת צמיחה (B) של BY4741 תאים בתקשורת נוזלית המכילה 5-flurouracil. ~ 4 × 10 4 תאים הופקדו בשלושה עותקים בריכוזים גוברים של 5-FU ומכנסי הש"כ נמדדו כל 10 דקות במשך 22 שעות.

איור 4
איור 4: מסך גנטי כימי של 5Fluorouracil. (א) ס מערך המוטציה מחיקת cerevisiae משוכפל על אגר YEPD המכיל 10 מיקרומטר 5-FU (מימין) ושליטה DMSO (משמאל). (ב) תוצאות של מסך גנטי כימי: צמיחה יחסית של מוטציות על 10 מיקרומטר 5-FU בהשוואה לשליטת DMSO שהוזמנה על ידי עמדת מערך. (ג) גידול יחסית של מוטציות על 10 מיקרומטר 5-FU בהשוואה לשליטת DMSO שהוזמנה על ידי יחס גודל מושבה. סף יחס של ≤0.8 מצויינים בשני הגרפים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: אימות של אינטראקציות גנטיות כימיות. דילולים סדרתי של כמה זנים מוטנטים מבודדים גדלו על DMSO בקרה (), 10 מיקרומטר 5-FU ( C).

קטגוריה GO P-ערך הגנים שזוהו (להיטים) # להיטים # כולל של גנים בקטגורית GO
שינוי uridine לנענע tRNA [GO: 0002098] 2.24 × 10 -6 SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 7 24
שעתוק, [GO: 0006351] DNA תלוי 1.69 × 10 -5 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 32 540
תרגום [GO: 0006412] 4.28 × 10 -5 RPS7A RPS19A RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A RPS19B MRP7 22 318
thiolation uridine העמדה לנענע tRNA [GO: 0002143] 1.88 × 10 -4 NCS6 URM1 TUM1 3 5
רגולציה של שעתוק, [GO: 0006355] DNA תלוי 4.98 × 10 -4 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 27 507
urmylation חלבון [GO: 0032447] 6.33 × 10 -4 NCS6 URM1 URE2 3 7
יצוא mRNA מגרעין בתגובה לחום מתח [GO: 0031990] 2.04 × 10 -3 RPB4 NUP120 NUP133 3 10
polyadenylation תלוי הגרעיני תהליך קטבולי CUT [GO: 0071039] 2.04 × 10 -3 AIR1 TRF5 MPP6 3 10
תהליך חילוף חומרים טריפטופן [GO: 0006568] 2.15 × 10 -3 TRP5 TRP3 2 3
מוקדם אנדוזום לתחבורה Golgi [GO: 0034498] 2.75 × 10 -3 ENT5 TCA17 RCY1 3 11
biogenesis המקטע הקטן ריבוזומלי [GO: 0042274] 3.63 × 10 -3 RPS19A SAC3 LTV1 RPS19B 4 24
שינוי הכרומטין [GO: 0016568] 3.64 × 10 -3 SGF11 LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ASH1ELP3 9 114
תהליך חילוף חומרים ATP [GO: 0046034] 4.23 × 10 -3 VMA2 VMA1 2 4
V-סוג ההובלה-פרוטון vacuolar ATPase הרכבה מורכבת [GO: 0070072] 4.23 × 10 -3 VMA21 VPH2 2 4
לוקליזציה כרומוזום [GO: 0050000] 4.23 × 10 -3 NUP120 NUP133 2 4
תחבורת mRNA [GO: 0051028] 4.59 × 10 -3 DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 6 58
החמצת vacuolar [GO: 0007035] 4.89 × 10 -3 VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 4 26
יצוא rRNA מהגרעין [GO: 0006407] 5.63 × 10 <sup> -3 RPS19A NUP120 NUP133 RPS19B 4 27
אנדוציטוזה [GO: 0006897] 6.57 × 10 -3 SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 END3 7 82
מעקב mRNA הגרעיני של עיבוד mRNA 3'-הסוף [GO: 0,071,031] 6.92 × 10 -3 AIR1 MPP6 2 5
polyadenylation ncRNA [GO: 0043629] 6.92 × 10 -3 AIR1 TRF5 2 5
polyadenylation תלוי הגרעיני תהליך קטבולי snoRNA [GO: 0071036] 6.92 × 10 -3 AIR1 TRF5 2 5
polyadenylation תלוי הגרעיני תהליך קטבולי snRNA [GO: 0071037] 6.92 × 10 -3 AIR1 TRF5 2 5
תהליך biosynthetic טריפטופן [GO: 0000162] 6.92 × 10 -3 TRP5 TRP3 2 5
החדרת חלבון לתוך קרום ER [GO: 0045048] 6.92 × 10 -3 GET1 GET4 2 5
ייצוב mRNA [GO: 0048255] 6.92 × 10 -3 ATP25 IGO1 2 5
תגובה לגירוי נזק ל- DNA [GO: 0006974] 7.05 × 10 -3 MUS81 RAD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 DEF1 MMS22 RAD52 MRE11 RAD50 RMI1 12 197
ב"> # להיטים
קטגוריה GO P-ערך הגנים שזוהו (להיטים) # כולל של גנים בקטגורית GO
polyadenylation תלוי הגרעיני תהליך קטבולי rRNA [GO: 0071035] 8.46 × 10 -3 AIR1 TRF5 MPP6 3 16

טבלת 1: אונטולוגיה ג'ין (GO) אפיון מוטציות רגישות 5-Fluorouracil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מתואר כאן הוא גישה ליצירת פרופילי אינטראקציה כימית-גנטית. השיטה היא פשוטה: על ידי השוואת גדלי מושבה של כל זן באוספי מחיקת גן מקיפים בנוכחות והיעדרות של חומר כימי, כל הגנים הדרושים כדי לסבול עלבון כימי מזוהים. ניתוח העשרת ביאור של הרשימה של זנים רגישים וכתוצאה מכך לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לספק תובנה למצב של פעולת כימיקלים. בעוד פרוטוקול זה כבר מותאם לשמרי ניצנים, זה גם יכול להיות מותאם לשימוש עם אוספים אחרים ערוכים חיידקי מחיקה, כגון E. אוסף coli Keio, אשר שמש בהצלחה לחקור מאות 26,27 הפרעות סלולריות.

פרופיל כימי-גנטית בשמרים ואורגניזמים אחרים הוא מבוסס היטב. רוב המחקרים הללו הסתמכו על מבחני תחרות שלכמת נקוו מוטציות מחיקה באמצעות ניתוח microarray או sequ תפוקה גבוההencing של ברקודים הגנטיים הייחודיים. גישה זו הוכיחה מוצלחת בייצור פרופילים כימיים-גנטי חזקים של ספריות כימיות גדולות. המתודולוגיה שתוארה כאן מספקת אלטרנטיבה שימושית לניתוח כימי-גנטית של מספרים קטנים יותר של תרכובות בדיקה. Assay מספק קריאה פשוטה שהיא פחות עלותו יותר מאשר רצף תפוקה גבוהה או ניתוח microarray ואינו סובל מהטית רצף. בעוד הפרוטוקול כפי שתואר דורש מכשיר רובוטי למניפולצית מושבה, מערכות מסוג זה הופכים להיות יותר נוחות ו, לסירוגין הפרוטוקול יכול להיות מותאם לשימוש עם כלים pinning ידניים, דוגמאות שנכללו ברשימת חומרים.

חשוב להיות מודעים למגבלותיה של גישה זו ופרופיל גנטי כימי באופן כללי. ראשית, המתחם חייב להיות השפעה על כדאיות בשמרי ניצנים, או מנוצל האורגניזם הספציפי. בעוד רבים תהליכים ביולוגיים בסיסייםופונקציות גם נשמרים בין אאוקריוטים, אינטראקציות גנטיות כימיות ספציפיות האורגניזם עשויים להשתנות במידה רבה, כמו גם את הספיגה של חומרים כימיים לתאים. כמו כן יש לציין כי מספר זני מחיקה נמצאו להיות רגיש לטיפולים תרופתיים רבים 8. אלה כוללים גני המעורבים בזרימת סמים, פונקצית vacuolar, ושלמות קרום. חשוב לקחת בהתנגדות רב בסמים בחשבון בעת ​​ביצוע מסקנות ביחס לכוון ומצבים עקיפים של פעולה.

המסך המתואר כאן בוצע באמצעות אוסף מחיקת הפלואידים, גישה מקובלת לניתוח כימי-גנטית בשמרים. כיום יש מספר רב של אוספים של מוטציות שמרים זמינות לסיוע נוסף בקביעת המצב של תרכובת כימית של פעולה. זה כולל לא רק הומוזיגוטים מלא ואוספי מחיקת דיפלואידי הטרוזיגוטיים, אלא גם מוטציות גנטיות מותנות רגישה לטמפרטורה חיוניות, Decreased שפע על ידי mRNA הפרעות ספריית מוטציה שמרים (לחים), וH3 היסטון סינטטי ואוסף המוטציה H4, אשר יכול לשמש כדי לחקור טיפולים מולקולריים המבוססים אפיגנטיים 3,4,28, בהתחשב בעומק המדהים של הכלים זמין, קל המתודולוגיה, והתשתית המוגבלת הנדרשת, גישה זו מספקת פורמט נגיש לגישה למידע פונקציונלי עשיר ביחס למנגנון של תרכובת כימית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

מחקר במעבדה CJN נתמך על ידי מענקים הפועלים מNSERC, הקנדי למלחמה בסרטן אגודת מכון המחקר (CCSRI), והשד הקנדי קרן למלחמה בסרטן (BC-יוקון סניף).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast Extract BioBasic G0961 For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)
Tyrptone Powder BD Biosciences 211820 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)
Dextrose Anachemia 31096-380 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.
Agar A Bio Basic FB0010 For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)
G418 A.G. Scientific Inc. G-1033 Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. 
12-well plate Greiner Bio One 655180
5 ml culture tubes Evergreen Scientific 222-2376-080
10 cm Petri Dish VWR 25384-302
ROTOR HDA Singer Instruments  ROT-001 high-throughput microbial array pinning robot
PLUSPLATE© Petri Dish Singer Instruments  PLU-001 Box of 200 dishes
384 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-384 Box of 1,000 pads
1536 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-1536 Box of 1,000 pads
Alternative Pinning Tools:
Fully Automated Robtic Systems S&P robotics http://www.sprobotics.com Several automated colony handling robitic and imagining systems available.
Manual Pinning Tools V&P Scientific http://www.vp-scientific.com Handheld replication tools and accessories. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
  2. Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
  3. Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
  4. Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
  6. Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
  7. Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
  8. Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
  9. Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
  10. Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
  11. Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
  12. Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10, (6), (2010).
  13. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
  14. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
  15. Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
  16. Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
  17. Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
  18. Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
  19. Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
  20. Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
  21. Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
  22. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
  24. Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
  25. Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
  27. Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
  28. Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics