Percutaneous सुई बायोप्सी से प्राप्त कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों से अलग mitochondria की तैयारी और Respirometric आकलन

Medicine
 

Summary

Vastus lateralis की बायोप्सी, शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी, और respirometric प्रोफाइलिंग के लिए तरीके वर्णित हैं। छोटे मांसपेशियों की मात्रा का उपयोग नैदानिक ​​अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए इस तकनीक का उपयुक्त बनाता है।

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Bharadwaj, M. S., Tyrrell, D. J., Lyles, M. F., Demons, J. L., Rogers, G. W., Molina, A. J. A. Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy. J. Vis. Exp. (96), e52350, doi:10.3791/52350 (2015).

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Abstract

पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के Respirometric रूपरेखा सामान्यतः इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला समारोह जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हम एक बाह्य प्रवाह (एक्सएफ) विश्लेषक का उपयोग एक, मानव vastus lateralis के नमूने प्राप्त करने के कंकाल मांसपेशियों के ऊतकों की न्यूनतम मात्रा से माइटोकॉन्ड्रिया के लिए अलग तरीका है, और प्लेट आधारित respirometric रूपरेखा का वर्णन है। 1.0, 2.5 और माइटोकॉन्ड्रिया के 5.0 माइक्रोग्राम प्रति का उपयोग कर प्राप्त respirometric प्रोफाइल के तुलना 1.0 माइक्रोग्राम प्रति श्वसन मापने के लिए पर्याप्त है कि संकेत मिलता है और 5.0 माइक्रोग्राम प्रति मानक त्रुटियों की तुलना के आधार पर सबसे अनुरूप परिणाम प्रदान करता है। माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर कॉक्स चतुर्थ और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऊतक मार्कर GAPDH के लिए पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण इस प्रोटोकॉल का उपयोग सीमित गैर माइटोकॉन्ड्रियल संदूषण है कि वहाँ से संकेत मिलता है। मांसपेशियों के ऊतकों के रूप में छोटा रूप में 20 मिलीग्राम में mitochondrial respirometry अध्ययन करने की क्षमता उपयोगकर्ताओं नैदानिक ​​में कई अध्ययन समापन के लिए व्यक्तिगत बायोप्सी का उपयोग करने की अनुमति देता हैअनुसंधान परियोजनाएं।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया कोशिका में प्राथमिक ऊर्जा उत्पादन साइटों रहे हैं और उम्र बढ़ने में महत्वपूर्ण भूमिका के रूप में भी इस तरह के हृदय रोग, अल्जाइमर रोग, मधुमेह, कैंसर, और मोटापे के रूप में विभिन्न आयु संबंधी विकारों है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के Respirometric रूपरेखा इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) समारोह का सीधा विश्लेषण प्रदान करता है और mitochondrial जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ और स्वास्थ्य और रोग में अपनी भूमिका के लिए काफी योगदान दिया है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया इस पांडुलिपि में वर्णित पद्धति मानव विषयों से प्राप्त कंकाल की मांसपेशी ऊतक बायोप्सी से अलग माइटोकॉन्ड्रिया के respirometric विश्लेषण की अनुमति के लिए अनुकूलित किया गया है आदि सब्सट्रेट परिवहन, एटीपी synthase गतिविधि, प्रोटॉन रिसाव, जैसे बायोइनरजेटिक्स के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इस पांडुलिपि में वर्णित बायोप्सी प्रोटोकॉल पिछले 12 वर्षों के लिए हमारे कर्मचारियों द्वारा उपयोग किया गया है। हमारे समूह, विभिन्न उम्र के वयस्कों पर 700 से अधिक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया है90 साल की उम्र तक है, और किसी भी प्रतिकूल सुरक्षा के मुद्दों के बिना विभिन्न पुरानी बीमारी शर्तों के साथ। इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू यह विशेष रूप से इस तरह नैदानिक ​​अनुसंधान अध्ययन में इसके उपयोग को सुविधाजनक बनाने, ऊतक की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करने के लिए बनाया जाता है।

विभिन्न प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रिया अलग-थलग करने के लिए विकसित किया गया है। फर्नांडीज-Vizarra एट अल। 1,2 विभिन्न चूहे के ऊतकों के रूप में अच्छी तरह से संवर्धित कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया अलग-थलग करने के लिए एक विधि का वर्णन किया। गार्सिया-Cazarin एट अल। 3 चूहा और माउस से कंकाल की मांसपेशियों से माइटोकॉन्ड्रिया अलग-थलग करने के लिए एक विधि की सूचना है। चूहे के मस्तिष्क से माइटोकॉन्ड्रिया अलग-थलग करने के लिए एक विधि भी इग्लेसियस-गोंजालेस एट अल। 4 सकल द्वारा सूचित किया गया है, एट अल। 5 barocycler और / या पीसीटी तकलीफ का उपयोग कर माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने की एक विधि की सूचना दी। हाल ही में, Franko एट अल। 6 विरोधी का उपयोग करते हुए अत्यधिक संवर्धित माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने की एक विधि सूचना दी-TOM22 चुंबकीय मोती।

इन प्रोटोकॉल उत्कृष्ट परिणाम उपज है, जबकि ऊतक आकार की आवश्यकताओं को इस पांडुलिपि में वर्णित विधि की तुलना में अधिक हैं। उदाहरण के लिए, सकल एट अल। 5 gastrocnemius मांसपेशियों की 1.5-1.8 जी, और गुर्दे ऊतक के बारे में 2 जी का इस्तेमाल किया। इसी तरह, फ्रेंको एट अल। 6 500 मिलीग्राम माउस जिगर ऊतक का इस्तेमाल किया। हमारे अनुभव से, ठेठ पैदावार कंकाल की मांसपेशी (vastus lateralis) के percutaneous सुई बायोप्सी से उम्मीद की जा करने के लिए 100-200 मिलीग्राम से लेकर। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग मांसपेशियों के ऊतकों की 20-50 मिलीग्राम में mitochondrial समारोह का आकलन करने की क्षमता अन्य आणविक जीव विज्ञान के प्रयोगों में भविष्य में इस्तेमाल के लिए बायोप्सी प्रति और दुकान के नमूने के लिए कई आकलन प्रदर्शन करने के लिए उपयोगकर्ताओं को अनुमति देता है। इस नैदानिक ​​अनुसंधान और नमूने के मेहनती उपयोग की आवश्यकता होती है कि अन्य अध्ययन में एक महत्वपूर्ण विशेषता है। यह पहले से जमे हुए माइटोकॉन्ड्रिया oute के लिए युग्मित श्वसन के कारण अध्ययन के लिए अच्छा नहीं कर रहे हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिएmitochondrial झिल्ली को नुकसान और साइटोक्रोम ग गतिविधि का नुकसान आर। हमारे विधि अनुकूलित और चैपल और पेरी 7 द्वारा प्रकाशित विधि से संशोधित किया गया है।

इस पांडुलिपि में वर्णित विधियों का उपयोग करना, हम हाल ही में मानव vastus से अलग माइटोकॉन्ड्रिया के respirometric प्रोफ़ाइल सीधे चाल की गति के रूप में 8 मापा शारीरिक क्षमता, साथ जोड़ा जाता है lateralis कि सूचना दी है।

Protocol

नोट: मेडिसिन जागो वन स्कूल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था वर्णित प्रोटोकॉल। जानकार सहमति लिखित रूप में प्राप्त हुई थी। सभी प्रतिभागियों को 23-35 लेकर BMIs साथ, दोनों लिंग के स्वस्थ पुराने वयस्कों (65-79 वर्ष) थे।

1. कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी

  1. पहले से वर्णित के रूप में, 9 एक हे / एन तेजी के बाद सुबह में सभी बायोप्सी प्रदर्शन करते हैं। बायोप्सी के लिए पहले सप्ताह के लिए खून बह रहा है, प्लेटलेट्स, या चोट को प्रभावित कर सकता है कि एस्पिरिन, पर्चे और अधिक-काउंटर गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवाओं, या अन्य यौगिकों लेने से बचना करने के लिए विषयों से पूछो। यह भी बायोप्सी करने से पहले कम से कम 36 घंटे के लिए किसी भी ज़ोरदार गतिविधि से बचना करने के लिए प्रतिभागियों से पूछो।
    नोट: स्नायु 1% lidocaine के साथ स्थानीय संज्ञाहरण के तहत एक percutaneous सुई के साथ percutaneous सुई बायोप्सी तकनीक का उपयोग कर lateralis vastus से प्राप्त किया जाता है। कोई चिकित्सा जटिलताओं या ओवहाँ प्रक्रिया से प्रतिकूल घटनाओं हमारे नैदानिक ​​अनुसंधान इकाई में हुई है की सूचना दी।
  2. नोट: वर्णित बायोप्सी प्रक्रिया बर्गस्ट्रॉम 10 के उस से अनुकूलित है।
    1. संक्षेप में, स्थानीय स्तर पर पेशी में घुसपैठ के लिए नहीं 1% lidocaine देखभाल प्रशासन। पर्याप्त स्तब्ध की अनुमति के लिए एक 10 मिनट के इंतजार की अवधि के साथ इस का पालन करें।
    2. Subfascial और myotendonous क्षेत्रों से परहेज पेशी (प्रविष्टि और मूल के बीच पेशी के मध्य क्षेत्र) के पेट से बायोप्सी ले लो।
      1. Percutaneous सुई (खिड़की और भीतरी काटने सिलेंडर काटने एक पक्ष के साथ एक चूषण सहायता प्रदान की पुन: प्रयोज्य डिवाइस) का प्रयोग करें और एक गाइड के रूप में प्रावरणी की एक प्रावरणीय "पॉप" या प्रतिरोध का पालन करें।
      2. संज्ञाहरण सुई के साथ गहराई का अनुमान तो फिर संकीर्ण स्केलपेल ब्लेड के साथ यह महसूस करते हैं और प्रावरणी के माध्यम से एक 4-5 मिमी चीरा बनाते हैं। यह मांसपेशियों में डाला जाता है, जब तक चीरा के माध्यम से सुई अग्रिम।
      3. लीजिएखिड़की के साथ कई नमूने अलग अलग दिशाओं में बदल गया। आगे बढ़ने के लिए और अलग अलग दिशाओं में percutaneous सुई में दो से चार बार पेशी के नमूने वापस लेने, जबकि एक 60 सीसी सिरिंज का उपयोग निरंतर चूषण लागू करें। सक्शन बंद और सुई को हटा दें।
        नोट: प्रत्येक दर्रा (प्रविष्टि और सुई को हटाने के) एक मिनट से भी कम समय लेना चाहिए।
      4. 5 मिनट रक्तस्तम्भन स्थापित करने के लिए एक सहायक साइट पंचर करने के लिए फर्म दबाव लागू है। सक्शन ट्यूबिंग से सुई डिस्कनेक्ट और ध्यान से खिड़की और प्रति बैरल से पेशी के नमूनों को हटा दें।
    3. अधिक मांसपेशियों उपरोक्त प्रक्रिया को दोहरा द्वारा की जरूरत है अगर एक दूसरा पास बनाओ।
    4. संदंश का प्रयोग, मांसपेशियों नमूना से किसी भी दृश्य रक्त के थक्के निकालें नमूना वजन है, और तुरंत ठंडा DPBS युक्त एक ट्यूब में जगह है।
      नोट: इस पद्धति का उपयोग औसत उपज 150 ± 20 मिलीग्राम है।

2. Mitochondrial अलगाव

<राजभाषा>
  • हौसले प्रयोग, या विभाज्य के दिन Chappel-पेरी (सीपी) और mitochondrial परख समाधान (मास) बफ़र्स (1 टेबल) तैयार करने और -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान। -20 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 मिमी की एकाग्रता और विभाज्य और दुकान पर डाइमिथाइल sulfoxide में यौगिकों तैयार करें। तैयारी के दिन से दो महीने के भीतर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत बफर और यौगिक aliquots का प्रयोग करें।
  • तेज कैंची और चिमटी का उपयोग नमूना से दिखाई संयोजी ऊतक निकालें; उपयोग इस कदम के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप अगर जरूरत है। अच्छी तरह से खून निकालने के लिए बर्फ ठंड DPBS के बफर के साथ नमूनों में 3-4 बार धो लें। बायोप्सी से अधिक से अधिक 45 मिनट से अधिक नहीं ख्याल रख रही है, जितनी जल्दी हो सके बर्फ ठंड DPBS और प्रक्रिया पर नमूने रखें। ध्यान से पेशी नमूना से किसी भी tendons या वसा ऊतकों को हटाने के लिए एहतियात रखना।
  • इसके तत्काल बाद कैंची की एक बाँझ जोड़ी का उपयोग ठीक टुकड़ों में मांसपेशियों के ऊतकों को काटना और 1 मिलीलीटर भाकपा युक्त जनसंपर्क के लिए 500 μl में निलंबित0.2 मिलीग्राम / छ ऊतक के एक एकाग्रता में oteinase (Nagarse)। आरटी पर एक 5 मिनट ऊष्मायन के साथ इस का पालन करें और फिर बर्फ के लिए स्थानांतरण।
  • एक स्वचालित homogenizer का उपयोग कर Nagarse के साथ इलाज कीमा बनाया हुआ ऊतकों homogenize। इस प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर नमूना रखें। 10,000 आरपीएम की गति सेटिंग में स्वचालित homogenizer का उपयोग करते हुए, 2 सेकंड की एक नाड़ी के लिए प्रत्येक ऊतक का नमूना चार बार, हर बार homogenize। ऊतकों के बीच आसुत जल के द्वारा पीछा 70% इथेनॉल के साथ जांच धो लें।
  • सी.पी. मैं (1 मिलीलीटर के लिए 500 μl) और सी.पी. द्वितीय के 2x मात्रा (2 मिलीलीटर 1 मिलीलीटर) की एक समान मात्रा के साथ homogenized ऊतक धो लें, और 600 XG, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कम से एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सामग्री इकट्ठा दस मिनट। एक गीला पनीर कपड़े के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला दर्रा छानना इकट्ठा करने और इस प्रकार गैर-माइटोकॉन्ड्रियल अंशों के बहुमत को दूर करने, गोली त्यागें।
  • 3. धुलाई Mitochondria

    1. 10 में से ऊपर कदम से सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र,000 XG, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस। 10,000 XG, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सी.पी. द्वितीय बफर और आगे सेंट्रीफ्यूज के 4 मिलीलीटर में गोली निलंबित।
      नोट: दुर्लभ अवसरों पर, खून की एक पतली गोली माइटोकॉन्ड्रियल गोली नीचे बनाई है। उस मामले में, CPII बफर के साथ कोमल आकांक्षा से माइटोकॉन्ड्रियल गोली निकालें। इस कदम को अच्छी तरह से 2 कदम पर खून दूर धोने से बचा जा सकता है।
    2. सी.पी. मैं बफर के 2ml में प्राप्त की गोली निलंबित। इस अवस्था में प्रोटीन के आकलन के लिए इस निलंबन से एक छोटे से विभाज्य का उपयोग करें। मैं ऊपर के रूप में बफर और अपकेंद्रित्र सीपी में शेष नमूना Resuspend। Mitochondrial परख समाधान (मास) की एक न्यूनतम राशि (200 μl) में अंतिम गोली निलंबित।
      नोट: सी.पी. मैं बफर बीएसए के पास नहीं है, क्योंकि प्रोटीन के नमूने इसे बाद में बीएसए है निलंबित कर दिया जाएगा जिसमें मास, जबकि इस स्तर पर assayed है।

    4. अनुमान बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता को मापने के द्वारा Mitochondrial सामग्री

    रोजर्स, गीगावॉट, एट अल द्वारा वर्णित के रूप में 5. एक्सएफ assays के प्रदर्शन। 12

    नोट: pMoles हे में 2 / मिनट ओ 2 की खपत की दर (ओसीआर) कल्पना, या डेटा उत्पादन में ओ 2 और पीएच के निरपेक्ष स्तरों।

    1. यौगिकों तैयार करने के लिए 1x मास का प्रयोग करें इंजेक्शन जा। इस प्रकार के रूप में एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए बंदरगाहों ई यौगिकों के एक 10x एकाग्रता जोड़ें: पोर्ट ए, ADP [एडेनोसाइन 5 '-diphosphate, 2 मिमी, 50 μl]; पोर्ट बी, oligomycin (2 माइक्रोन, 55 μl); पोर्ट सी, FCCP [कार्बोनिल साइनाइड 4- (trifluoromethoxy) phenylhydrazone, 6 माइक्रोन, 60 μl]; और बंदरगाह विकास, 2 माइक्रोन antimycin-ए (65 μl)। तैयार करनाकुओं की अपेक्षित संख्या के लिए यौगिकों की पर्याप्त मात्रा।
    2. अनुमापन द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया की अधिकतम राशि का निर्धारण करते हैं। उदाहरण के लिए, भार 1.0 माइक्रोग्राम प्रति, 2.5 माइक्रोग्राम प्रति, और सब्सट्रेट युक्त ठंडा 1x मास की 50 μl मात्रा में अच्छी तरह से प्रति माइटोकॉन्ड्रिया के 5.0 माइक्रोग्राम प्रति। पहले ठंड 1x मास + सब्सट्रेट में 10x माइटोकॉन्ड्रिया पतला, कुओं के बीच परिवर्तनशीलता को कम से कम करने के लिए। अगला, (पृष्ठभूमि सुधार कुओं को छोड़कर) के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए इस निलंबन के 50 μl उद्धार।
    3. 2000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट पर थाली अपकेंद्रित्र। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए, (नीचे देखें प्रारंभिक स्थितियों) centrifugation के बाद, धीरे 1x मास + succinate (10 मिमी) और rotenone (2 माइक्रोन) के 450 μl जोड़ें। एक्सएफ विश्लेषक के लिए थाली में परिवर्तित करने के लिए अच्छी तरह से पहले समरूप पालन सुनिश्चित करने के लिए खुर्दबीन के नीचे माइटोकॉन्ड्रिया देखें।
      नोट: श्वसन या तो आदि जटिल मैं या जटिल द्वितीय द्वारा संचालित है पर निर्भर करेगा इस्तेमाल प्रारंभिक स्थितियों। जटिल द्वितीय संचालित श्वसन के लिए, सु का उपयोगccinate (10 मिमी) और प्रारंभिक स्थितियों के रूप में rotenone (2 माइक्रोन)। Rotenone ब्लॉक जटिल मैं और succinate जटिल द्वितीय (succinate डिहाइड्रोजनेज) के लिए ईंधन प्रदान करता है। जटिल मैं द्वारा संचालित श्वसन का अध्ययन करने के लिए, प्रारंभिक स्थितियों के रूप में 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में 5 मिमी या ग्लूटामेट और Malate प्रत्येक का एक अंतिम एकाग्रता में पाइरूवेट और Malate, प्रत्येक या तो उपयोग करें। उत्तरार्द्ध tricarboxylic एसिड चक्र और सब्सट्रेट परिवहन के बीच में शिथिलता भेद में मदद कर सकते हैं। , दोनों जटिल मैं और जटिल द्वितीय द्वारा संचालित श्वसन अध्ययन प्रारंभिक स्थितियों के रूप में rotenone या Malate बिना पाइरूवेट और succinate शामिल करने के लिए। Β ऑक्सीकरण के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में palmitoyl Carnitine का प्रयोग करें।
    4. क्रमिक रूप से पहले से 12 के रूप में वर्णित यह प्रोग्रामिंग द्वारा respirometer का उपयोग कर वास्तविक समय में mitochondrial श्वसन उपाय। तालिका 2 में प्रदान की respirometer के लिए सेटिंग्स का प्रयोग करें।
      नोट: इस प्रकार के रूप में विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन राज्यों का एक संक्षिप्त विवरण इस प्रकार हैं:
    5. ओ = गैर phosphorylating श्वसन; राज्य 3U = uncoupler FCCP द्वारा प्रेरित अधिकतम uncoupled श्वसन; Antimycin-ए द्वारा जटिल III के निषेध के बाद अवशिष्ट गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन = श्वसन। यह भी माइटोकॉन्ड्रियल एकाग्रता के साथ संयोजन में ओसीआर माप की लंबाई माप अवधि के दौरान ऑक्सीजन घट द्वारा डेटा को प्रभावित कर सकता है, ने बताया कि किया जाना चाहिए।

    6. वेस्टर्न ब्लाट

    नोट: अंतिम नमूने में माइटोकॉन्ड्रिया के संवर्धन को आश्वस्त करने के लिए पश्चिमी सोख्ता द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर कॉक्स चतुर्थ और पूरे ऊतक GAPDH का निर्धारण करते हैं

    1. 12% सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जैल से पृथक माइटोकॉन्ड्रिया और पूरे ऊतक निकालने अलग करें।
    2. एक polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली पर प्रोटीन स्थानांतरण।
    3. कॉक्स चतुर्थ एंटीबॉडी (1: 20,000) के साथ सेते हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) द्वारा पीछा किया, माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित। GAPDH दृढ़ संकल्प के लिए, एक GAPDH मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (: 2000 1) के साथ दाग और जांच पट्टी।
      नोट: ईआर संदूषण में मतभेद चिंता का विषय हैं, तो इस तरह के विश्लेषण में ERp72, calnexin, या calreticulin के रूप में ईआर मार्कर शामिल हैं।

    Representative Results

    चित्रा 1 पूरे प्रोटोकॉल का विस्तृत फ़्लोचार्ट दर्शाया गया है।

    कॉक्स चतुर्थ / GAPDH (चित्रा 2) के पश्चिमी धब्बा प्रोफाइल के माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन, कॉक्स चतुर्थ, और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर, GAPDH की अभिव्यक्ति को दर्शाती है। कॉक्स चतुर्थ और GAPDH दोनों की अभिव्यक्ति पूरे मांसपेशी lysate में स्पष्ट कर रहे हैं। माइटोकॉन्ड्रिया इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीक का उपयोग कर अलग कर रहे हैं के बाद GAPDH ही जोखिम में अनुपस्थित है, जबकि कॉक्स चतुर्थ बैंड अभी भी स्पष्ट कर रहे हैं। लंबे समय तक निवेश जोखिम एक बेहोश GAPDH बैंड प्रकट हो सकता है। ये दाग पृथक माइटोकॉन्ड्रिया न्यूनतम गैर माइटोकॉन्ड्रियल संदूषण है कि संकेत मिलता है। इसके अलावा, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में कॉक्स चतुर्थ अभिव्यक्ति नमूने के बीच संगत है।

    चित्रा 3 1.0 माइक्रोग्राम प्रति, 2.5 माइक्रोग्राम प्रति, और माइटोकॉन्ड्रिया के 5.0 माइक्रोग्राम प्रति का उपयोग कर जटिल द्वितीय (succinate और rotenone) द्वारा संचालित ठेठ respirometric प्रोफाइल को दर्शाता है। जैसी कि उम्मीद थी, समग्र ओसीआर डब्ल्यू बढ़ जाती हैith माइटोकॉन्ड्रिया की उच्च मात्रा। इस परख के लिए गणना की श्वसन नियंत्रण अनुपात (रेसकोर्स रोड) माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी उच्च गुणवत्ता की है कि, यह दर्शाता है 7.95। इसके अलावा, राज्य 3U ओसीआर माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता की पुष्टि राज्य के तीन की तुलना में थोड़ा अधिक है।

    माइटोकॉन्ड्रिया के विभिन्न मात्रा की रूपरेखा जब परिणामों की स्थिरता की तुलना करने के क्रम में, हम एनोवा (विचरण के विश्लेषण) प्रदर्शन किया और का उपयोग कर विचरण के वास्तविक मूल्यों के रूप में चौकों (एसएस) की राशि की गणना 1.0 माइक्रोग्राम प्रति, 2.5 माइक्रोग्राम प्रति, और माइटोकॉन्ड्रिया के 5.0 माइक्रोग्राम प्रति प्रति लोड अच्छी तरह से (चित्रा 4)। एसएस राज्य 2, राज्य 3, राज्य 3U, antimycin ए, और रेसकोर्स रोड के लिए प्रस्तुत किया है। राज्य में 2 और राज्य 3 माप के लिए, एक ही रास्ता एनोवा (क्रमशः, पी <0.01 और पी <0.05) सांख्यिकीय महत्वपूर्ण था। इसी तरह, एक तरह से एनोवा antimycin और रेसकोर्स रोड (पी <0.01 और पी <.0001 के लिए सांख्यिकीय महत्वपूर्ण था, क्रमशः। कोई महत्वपूर्ण अंतर यह है कि समूहों के बीच राज्य 3U के लिए देखा गया था। गुछात्र अध्ययन के परिणामों के प्रति अच्छी तरह माइटोकॉन्ड्रिया के 5.0 माइक्रोग्राम प्रति अन्य सांद्रता की तुलना में सबसे कम एसएस दिया और प्रतिभागियों के बारे में हमारी आबादी के साथ एक्सएफ 24 प्रणाली में उपयोग करने के लिए अधिकतम राशि है कि संकेत मिलता है।

    चित्रा 5 बहुत माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन प्रारंभिक मांसपेशी नमूना आकार के आधार पर उम्मीद की जा सकती है कि कैसे इंगित करने के लिए एक गाइड के रूप में कार्य करता है। जैसी कि उम्मीद थी संसाधित पेशी (एमजी) की राशि और अंतिम नमूना की कुल माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन सामग्री (एमजी) के बीच एक मजबूत संबंध है।

    Chappel-पेरी बफर मैं (सीपीआई)
    रासायनिक कंसंट्रेशन
    KCl 100 मिमी
    MOPS 50 मिमी
    EDTA 1 मिमी
    MgSO 4 5 मिमी
    एटीपी 1 मिमी पीएच 7.4
    Chappel-पेरी बफर द्वितीय (CPII)
    रासायनिक कंसंट्रेशन
    KCl 100 मिमी
    MOPS 50 मिमी
    EDTA 1 मिमी
    MgSO 4 5 मिमी
    एटीपी 0.2 मिमी
    फैटी एसिड मुक्त बीएसए 0.50%
    पीएच 7.4
    Mitochondrial परख समाधान (मास) (2x)
    रासायनिक कंसंट्रेशन
    सुक्रोज 35 मिमी
    Mannitol 110 मिमी
    के.एच. 2 पीओ 4 2.5 मिमी
    2 MgCl 2.5 मिमी
    HEPES 1.0 मिमी
    EGTA 0.5 मिमी
    फैटी एसिड मुक्त बीएसए 0.10%
    पीएच 7.4
    जटिल द्वितीय प्रारंभिक शर्तों के साथ mitochondrial परख समाधान (मास)
    रासायनिक कंसंट्रेशन
    1X मास
    Succinate 10 मिमी
    Rotenone 2 माइक्रोन
    पीएच 7.4
    जटिल मैं प्रारंभिक शर्तों के साथ mitochondrial परख समाधान (मास)
    रासायनिक कंसंट्रेशन
    1X मास
    पाइरूवेट 5 मिमी
    Malate 5 मिमी
    पीएच 7.4
    * सभी बफ़र्स विआयनीकृत पानी में किए जाने के लिए

    तालिका 1. समाधान और बफर व्यंजनों।

    >
    प्रोटोकॉल कदम
    StartProtocol
    आदेश समय (मिनट) बंदरगाह
    जांचना 0.00
    इंतज़ार 10.00
    मिश्रण 1.00
    इंतज़ार 3.00
    मिश्रण 1.00
    इंतज़ार 3.00
    मिश्रण 0.50
    उपाय 3.00
    मिश्रण 1.00
    उपाय 3.00
    मिश्रण 0.50
    इंजेक्षन एक
    मिश्रण 1.00
    उपाय 6.00
    मिश्रण 1.00
    इंजेक्षन बी
    मिश्रण 1.00
    उपाय 3.00
    मिश्रण 1.00
    इंजेक्षन सी
    मिश्रण 1.00
    उपाय 3.00
    मिश्रण 1.00
    इंजेक्षन डी
    मिश्रण 1.00
    उपाय 3.00
    EndProtocol

    तालिका 2 मिक्स, माप, और respirometer के लिए चक्र सेटिंग मिश्रण।

    चित्र 1
    चित्रा पूरे प्रोटोकॉल का 1. फ़्लोचार्ट। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    चित्रा 2. पूरे कंकाल मांसपेशियों के ऊतकों के रूप में अच्छी तरह से अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया के लिए एक प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा। पूरे ऊतक निकालने के साथ ही अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया गैर माइटोकॉन्ड्रियल नियंत्रण के लिए माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर और GAPDH एंटीबॉडी के रूप में कॉक्स चतुर्थ एंटीबॉडी के साथ immunoblotted थे। कोई GAPDH बैंड गैर माइटोकॉन्ड्रियल स्रोतों से कम या कोई संदूषण का संकेत पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में मनाया गया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    मानव vastus से अलग माइटोकॉन्ड्रिया की चित्रा 3. प्रतिनिधि respirometric प्रोफाइल lateralis। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के तीन सांद्रता, 5.0 माइक्रोग्राम प्रति, 2.5 माइक्रोग्राम प्रति, और 1.0 माइक्रोग्राम प्रति हम इस परख में इस्तेमाल कर रहे हैं। पोर्ट इंजेक्शन के बाद यौगिकों के अंतिम सांद्रता 2 मिमी ADP (पोर्ट ए) थे; 2 माइक्रोन oligomycin (पोर्ट बी); 6 माइक्रोन FCCP (बंदरगाह ग); और 2 माइक्रोन ए (बंदरगाह डी) antimycin। इस दौड़ के लिए परिकलित रेसकोर्स रोड 7.95 था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    5.0 माइक्रोग्राम प्रति, 2.5 माइक्रोग्राम प्रति, और 1.0 माइक्रोग्राम प्रति माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग कर विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन राज्यों और रेसकोर्स रोड के लिए चौकों की चित्रा 4 वर्गों का योग। योग करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    । चित्रा 5. यह प्रारंभिक मांसपेशी नमूना वजन प्रतिगमन विश्लेषण के आधार पर उम्मीद की जा सकती है कि माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की मात्रा का अनुमान लगाने के लिए एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है: पेशी (एमजी) और कुल माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन उपज (एमजी) की राशि का। जैसी कि उम्मीद थी, मांसपेशियों की राशि और प्राप्त कुल माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के बीच एक सीधा सकारात्मक संबंध है।

    Discussion

    पृथक माइटोकॉन्ड्रिया अक्सर सब्सट्रेट परिवहन और TCA चक्र समारोह सहित आदि समारोह की भूमिका है, साथ ही अन्य माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधियों की जांच कि पढ़ाई में उपयोग किया जाता है। अलग अंगों का उपयोग कर Respirometric assays के ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के बुनियादी प्रक्रियाओं और आदि के आंतरिक गुणों का सीधा परीक्षा की अनुमति पूरे कोशिकाओं या permeabilized मांसपेशी फाइबर की तुलना में अलग माइटोकॉन्ड्रिया के Respirometric रूपरेखा अपेक्षाकृत आसान डेटा व्याख्या के फायदे और mitochondrial जन / जीवजनन में गैर-माइटोकॉन्ड्रियल प्रक्रियाओं या परिवर्तन से "हस्तक्षेप" का अभाव है। डेटा का सामान्यीकरण जिससे नमूनों के बीच माइटोकॉन्ड्रिया का सीधा पार तुलना की इजाजत दी माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन सामग्री पर आधारित है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के Respirometric रूपरेखा अध्ययन का उद्देश्य अंतर्निहित तंत्र और आदि जैसे घटक के रूप में विशिष्ट लक्ष्यों की पहचान निर्धारित करने के लिए जब एक पसंदीदा तरीका हैएस / परिसरों, या माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन तंत्र।

    छोटे ऊतकों के नमूनों से पेशी बायोप्सी और कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल है वर्णित है। हाथ Dounce homogenizers संचालित बनाम इस विधि की वजह से एक स्वचालित homogenizer का उपयोग करने के लिए उपयोगकर्ताओं के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम पैदावार। माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव मांसपेशियों के ऊतकों के रूप में छोटा रूप में 20 मिलीग्राम के साथ किया जा सकता है। इस नमूने का आकार से प्राप्त किया जा सकता है कि पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की राशि आगे आणविक विश्लेषण के लिए अन्य प्रयोगों और भंडारण के लिए अधिशेष माइटोकॉन्ड्रिया जाते वक्त Seahorse थाली आधारित respirometry चलाने के लिए पर्याप्त है। यह इस विधि माइटोकॉन्ड्रिया की भी छोटी मात्रा (प्रति अच्छी तरह से 1-2 माइक्रोग्राम प्रति) का इस्तेमाल किया जा सकता है, जहां एक्सएफ 96, करने के लिए अनुवाद किया जा सकता है कि उल्लेख किया जा सकता है।

    अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया के लिए कई प्रोटोकॉल प्रारंभिक ऊतक विघटन के लिए Dounce homogenizers पर भरोसा करते हैं। इस पद्धति का एक दोष यह है कि हाथ पर प्रारंभिक ऊतक का स्वभाव हैhomogenization के। homogenizer में मूसल की शक्ति और गति ऑपरेटरों 6 के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं। यह प्रयोग करने के लिए प्रयोग भिन्नता है, साथ ही प्रयोगशाला करने वाली प्रयोगशाला विभिन्नता में परिणाम है, और प्रयोगों के बीच डेटा की तुलना में कठिनाई की ओर जाता है सकते हैं। प्रतिभागियों से डेटा आम तौर पर इलाज से पहले और बाद में, और संभवतः कई स्थलों पर, अलग समय बिंदुओं पर एकत्र कर रहे हैं जब यह मानव हस्तक्षेप के अध्ययन में विशेष चिंता का विषय है। हम सीमित व्यक्ति-से-व्यक्ति भिन्नता के साथ और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम है कि पैदावार अधिक सुसंगत दृष्टिकोण के लिए एक स्वचालित homogenizer का उपयोग करें। तैयारी की गति भी एक ही समय में कई नमूने से निपटने के लिए उपयुक्त इस दृष्टिकोण बनाता है। आमतौर पर, अप करने के लिए तीन प्रयोगों में एक ही दिन में किया जा सकता है।

    यहाँ वर्णित तकनीक की क्षमता सीमाओं पृथक organelles के उपयोग और एक प्लेट आधारित प्रारूप के उपयोग से उत्पन्न होती हैं। उदाहरण के लिए, पिकार्ड एट अल। दानव हैपृथक माइटोकॉन्ड्रिया permeabilized myofibers में बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया के उन लोगों से मौलिक रूप से अलग है कि कार्यात्मक विशेषताओं के अधिकारी उस strated। वे माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव तकनीक ऐसे अधिक से अधिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन में 13 के साथ permeabilized myofibers की तुलना में काफी वृद्धि हुई है रेसकोर्स रोड के रूप में बदल bioenergetic समारोह में परिणाम है कि प्रस्ताव रखा। Permeabilized मांसपेशी फाइबर की तुलना में, माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव अब तैयारी के समय की आवश्यकता है। इसके अलावा, सेलुलर सामग्री के नुकसान के शारीरिक प्रासंगिकता, पूरे कोशिकाओं और भी permeabilized फाइबर में बनाए रखा है कि कुछ घटता है। वर्णित तकनीक परमिट के साथ थाली-आधारित respirometry के उपयोग के प्रति नमूना रन दोहराने। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रिया में अच्छी तरह से प्रत्येक के नीचे का पालन करना होगा। यह विन्यास अपने सामान्य वातावरण से अलग है और कार्यात्मक विशेषताओं को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग, वहाँई अभी भी माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी में endoplasmic जालिका (ईआर) से संदूषण हो सकता है। ईआर संदूषण में मतभेद माइटोकॉन्ड्रियल उपज और प्रभाव के परिणाम के निर्धारण को प्रभावित कर सकता है।

    अंत में, इस अध्ययन में इस प्रक्रिया का उपयोग कर ऊतकों से अलग माइटोकॉन्ड्रिया कार्यात्मक रूप से सक्रिय हैं और अध्ययन / कंकाल की मांसपेशी नमूनों की न्यूनतम राशि से उच्च गुणवत्ता वाले पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की आवश्यकता होती है अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि पुष्टि की है कि डेटा प्रस्तुत करता है। इस पद्धति का लाभ यह है कि: मैं) यह कंकाल पेशी के न्यूनतम मात्रा से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने के लिए संभव है, द्वितीय) प्रक्रिया, तृतीय) थाली आधारित तकनीक के साथ, यह एक ही समय में कई नमूने को चलाने के लिए संभव है, जल्दी है और चतुर्थ) नमूना भंडारण और अन्य आणविक जैविक जांच के लिए bioenergetic परख के बाद पर्याप्त अधिशेष ऊतक और पृथक माइटोकॉन्ड्रिया है।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    Homogenizer Bio-Gen PRO200 BioExpress
    Eppendorf Centrifuge 5804 R Fisher Scientific
    Deepwell late Rotor  Fisher Scientific
    6 mm University College Hospital Needle Cadence
    60 cc syringe Fisher Scientific
    96-well plate reader Tecan (Genios-basic)
    Seahorse XF 24-3 analyzer Seahorse Biosciences, Inc.
    Protein gel system Life Technologies (Invitrogen)
    Kodak Gel Logic 112 Carestream Health, Inc
    Kodak camera assembly Carestream Health, Inc
    Consumables
    XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge Seahorse Bioscience 100850-001
    100867-100
    Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich Co 221473
    Hydrochloric acid (HCl) Acros 12421-0010
    Dulbecco's Phosphate buffered saline  Lonza 17-512F
    Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P333
    MOPS Fisher Scientific BP308
    EDTA Fisher Scientific BP118
    Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich Co M7506
    ATP Sigma-Aldrich Co A9187
    Fatty acid-free BSA Calbiochem 126575
    Sucrose Sigma-Aldrich Co S0389
    Bacterial proteinase Sigma-Aldrich Co P-8038
    D-Mannitol Sigma-Aldrich Co M9546
    KH2PO4 Fisher Scientific P284
    Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich Co M9272
    HEPES Sigma-Aldrich Co H3784
    EGTA Sigma-Aldrich Co E3889
    BCA protein assay kit Sigma-Aldrich Co PI23227
    Succinic Acid* Sigma-Aldrich Co S3674
    Pyruvic acid* Sigma-Aldrich Co P5280
    Malic acid* Sigma-Aldrich Co 2288
    ADP(K+ salt)* Sigma-Aldrich Co A5285
    XF Cell mito stress test kit Seahorse Biosciences 101706
    Tween-20 Santa Cruz Biotechnology, Inc.  SC-29113
    NuPAGE 12% Bis-Tris Gel Life Technologies (Invitrogen) NP0343BOX
    Immobilin Transfer Membranes (0.45 um) Millipore IPVH20200
    MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml Life Technologies (Invitrogen) NP0001
    NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter Life Technologies (Invitrogen) NP0006-1
    Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin) Abcam ab14734
    Primary antibodies (mAB to GAPDH) Abcam ab9484
    Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled PerkinElmer NEF822E001EA
    Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled PerkinElmer NEF812E001EA
    *ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only 

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    References

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