Upprättande och Respirometric Bedömning av mitokondrier isolerade från skelettmuskulatur Tissue Erhålls genom perkutan nålbiopsi

Medicine
 

Summary

Metoder för biopsi av vastus later, beredning av renat mitokondrier, och respirometric profilering beskrivs. Användningen av små muskelvolym gör denna teknik som lämpar sig för kliniska forskningsansökningar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bharadwaj, M. S., Tyrrell, D. J., Lyles, M. F., Demons, J. L., Rogers, G. W., Molina, A. J. Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy. J. Vis. Exp. (96), e52350, doi:10.3791/52350 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Respirometric profilering av isolerade mitokondrier används ofta för att undersöka elektron transportkedjan funktion. Vi beskriver en metod för att erhålla prover av humana vastus later, isolera mitokondrier från minimala mängder skelettmuskelvävnaden, och platta baserad respirometric profilering använder ett extracellulärt flöde (XF) analysator. Jämförelse av respirometric profiler framställts på 1,0, 2,5 och 5,0 pg av mitokondrier visar att 1,0 mikrogram är tillräcklig för att mäta andning och att 5,0 mikrogram ger mest konsekventa resultat baserat på jämförelse av standardfel. Western blot-analys av isolerade mitokondrier för mitokondriell markör COX IV och icke-mitokondriell vävnadsmarkör GAPDH indikerar att det finns begränsad icke-mitokondriell kontamination användning av detta protokoll. Möjligheten att studera mitokondriella respiration i så lite som 20 mg muskelvävnad tillåter användare att utnyttja enskilda biopsier för flera studie endpoints i kliniskforskningsprojekt.

Introduction

Mitokondrier är de primära energi produktionsanläggningar i cellen och har viktiga roller i åldrandet samt olika åldersrelaterade sjukdomar såsom hjärt- och kärlsjukdomar, Alzheimers sjukdom, diabetes, cancer och fetma. Respirometric profilering av isolerade mitokondrier ger direkt analys av elektrontransportkedja (ETC) funktion och har bidragit avsevärt till vår förståelse av mitokondrie biologi och dess roll i hälsa och sjukdom. Isolerade mitokondrier används för att studera olika aspekter av bioenergetik gillar, substrattransport, ATP-syntas aktivitet, proton läcka, etc. Den metod som beskrivs i detta manuskript har optimerats för att tillåta respirometric analys av mitokondrier isolerade från skelettmuskel vävnadsbiopsier erhållits från människa. Den biopsi protokoll som beskrivs i detta manuskript har använts av vår personal under de senaste 12 åren. Vår grupp har utfört över 700 förfaranden för vuxna i olika åldrar,upp till 90 år gamla, och med olika kroniska sjukdomstillstånd utan några negativa säkerhetsfrågor. En viktig aspekt av detta protokoll är att den är speciellt utformad för att använda minimala mängder vävnad, vilket underlättar dess användning i kliniska forskningsstudier.

Olika protokoll har utvecklats för att isolera mitokondrier. Fernandez-Vizarra et al., 1,2 beskrivit ett förfarande för isolering av mitokondrier från olika råttvävnader såväl som odlade celler. Al. Garcia-Cazarin et 3 har rapporterat en metod för att isolera mitokondrier från skelettmuskler från råtta och mus. En metod för isolering av mitokondrier från råtthjärna har också rapporterats av Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross, et al. 5 rapporterade ett förfarande för isolering mitokondrier med hjälp av barocycler och / eller PCT dokumentförstörare. Nyligen, al. Franko et 6 rapporterade en metod för att isolera höganrikat mitokondrier använder anti-TOM22 Magnetiska pärlor.

Medan dessa protokoll ge utmärkta resultat, vävnadsstorlekskrav är höga jämfört med den metod som beskrivs i detta manuskript. Till exempel använde al. Gross et 5 1,5-1,8 g av gastrocnemiusmuskeln, och ca 2 g av njurvävnaden. Likaså al. Franco et 6 använde 500 mg muslevervävnad. Från vår erfarenhet, att typiska avkastning kan förväntas av perkutan nål biopsi av skelettmuskel (vastus later) varierar från 100-200 mg. Förmågan att bedöma mitokondriefunktion i 20-50 mg av muskelvävnad med hjälp av protokoll som beskrivs här tillåter användarna att utföra flera bedömningar per biopsi och att lagra prover för framtida användning i andra molekylärbiologiska experiment. Detta är ett kritiskt inslag i klinisk forskning och andra studier som kräver flitig användning av prover. Det bör noteras att tidigare frysta mitokondrierna är inte bra för att studera kopplade andning på grund av outer mitokondriell membranskada och förlust av cytokrom C-aktivitet. Vår metod har anpassats och modifierats metoden publiceras av Chappell och Perry 7.

Använda de metoder som beskrivs i detta manuskript, har vi nyligen rapporterat att respirometric profil mitokondrier isolerade från human Vastus later är direkt korrelerad med fysisk förmåga, mätt som gånghastighet 8.

Protocol

OBS: Protokollet som beskrivs godkändes av Institutional Review Board of Wake Forest School of Medicine. Informerat samtycke erhölls skriftligen. Alla deltagare var friska äldre vuxna (65-79 år) av båda könen, med BMI på mellan 23 till 35.

1. Skelettmuskelbiopsi

  1. Såsom tidigare beskrivits, 9 utföra alla biopsier i tidigt på morgonen efter en O / N snabbt. Be de ämnen att avstå från att ta aspirin, receptbelagda och receptfria icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel, eller andra föreningar som kan påverka blödning, blodplättar, eller blåmärken för veckan före biopsi. Be deltagarna att även avstå från all ansträngande aktivitet under minst 36 timmar före biopsi.
    OBS: Muskel erhålles från vastus lateralis använder perkutan nålbiopsi teknik med en perkutan nål under lokalbedövning med en% lidokain. Inga medicinska komplikationer eller other rapporterade biverkningar från förfarandet har inträffat i vår klinisk forskningsenhet.
  2. OBS! Biopsi förfarande som beskrivs är anpassad från den för Bergström 10.
    1. I korthet lokalt administrera 1% lidokain ta hand inte att infiltrera muskeln. Följ den här med en 10 min vänta period för att tillåta tillräcklig bedövande.
    2. Ta biopsier från magen av muskeln (mittregionen av muskler mellan insättning och ursprung) undvika subfascial och myotendonous områden.
      1. Använd perkutan nål (en sugan assisterad återanvändbar anordning med en sidoskärfönster och inre skärcylinder) och följer en fascian "pop" eller resistens av fascia som en guide.
      2. Uppskatta djupet med anestesi nålen, sedan igen känna det med den smala skalpellblad och göra en 4-5 mm snitt genom fascia. Advance nålen genom snittet tills det sätts in i muskeln.
      3. Samlamultipla prover med fönstret vänt i olika riktningar. Applicera kontinuerlig sug med hjälp av en 60 cc spruta samtidigt framåt och dra muskelprover i perkutan nålen två till fyra gånger i olika riktningar. Avbryt sug- och ta bort nålen.
        OBS: Varje pass (införande och avlägsnande av nålen) bör ta mindre än en minut.
      4. Låt en medhjälpare gäller fast tryck för att punktera plats för 5 minuter att upprätta hemostas. Koppla nålen från sugslang och ta försiktigt bort muskelprover från fönstret och fat.
    3. Gör en andra pass om mer muskler behövs genom att upprepa proceduren ovan.
    4. Ta bort alla synliga blodproppar från muskelprovet med pincett, väga provet, och omedelbart placera i ett rör innehållande iskalla DPBS.
      OBS: Den genomsnittliga avkastningen med hjälp av denna metod är 150 ± 20 mg.

2. Mitokondriell Isolering

<ol>
  • Färskt förbereda Chappel-Perry (CP) och mitokondrie analyslösningen (MAS) buffertar (Tabell 1) på dagen för experimentet, eller delprov och förvara dem vid -20 ° C. Förbered föreningarna i dimetylsulfoxid vid en koncentration av 2,5 mM och alikvot och förvara vid -20 ° C. Använd buffert och sammansatta portioner lagrade vid -20 ° C inom 2 månader från dagen för preparatet.
  • Ta bort synliga bindväv från provet med hjälp av vass sax och pincett; om det behövs, använd en dissekera mikroskop för detta steg. Tvätta prover 3-4 gånger med iskall DPBS buffert att ta bort blodet. Håll proverna på iskalla DPBS och processen så snart som möjligt, se till att inte överstiga mer än 45 min från biopsi. Ta försiktighetsåtgärder för att försiktigt ta bort eventuella senor eller fettvävnad från muskelprovet.
  • Hacka Omedelbart muskelvävnaden i fina bitar med en steril sax och suspendera i 500 l till 1 ml KPI innehåller proteinase (Nagarse) vid en koncentration av 0,2 mg / g vävnad. Följ med en 5 min inkubation vid RT och sedan överföra till is.
  • Homogeni de finhackade vävnader som behandlats med Nagarse använder en automatiserad homogenisator. Håll provet på is under hela denna process. Homogeni varje vävnadsprov fyra gånger, varje gång för en puls av 2 sek, med hjälp av automatiserade sator vid en hastighetsinställning på 10.000 rpm. Tvätta sonden med 70% etanol följt av destillerat vatten mellan vävnader.
  • Tvätta den homogeniserade vävnaden med en lika stor volym av CP I (500 | il till 1 ml) och 2x volym CP II (1 ml till 2 ml), och samla upp innehållet i ett centrifugrör och centrifugera vid 600 xg, 4 ° C under 10 min. Passera supernatanten genom ett fuktat ostduk, samla filtratet och kasta pelleten, vilket tar bort de flesta icke-mitokondriella fraktioner.
  • 3. Tvättning mitokondrierna

    1. Centrifugera supernatanten från det ovanstående steget vid 10,000 xg, 4 ° C under 10 min. Suspendera pelleten i 4 ml CP-buffert och ytterligare centrifugera vid 10000 xg, 4 ° C under 10 min.
      OBS: Vid sällsynta tillfällen är en tunn pellet av blod bildas under mitokondriella pelleten. I så fall, ta bort den mitokondriella pellets genom försiktig uppsugning med CPU-buffert. Detta steg kan undvikas genom att grundligt tvätta bort blod vid steg 2.
    2. Suspendera den erhållna pelleten i 2 ml CP-buffert. I detta skede använda en liten delmängd av denna suspension för proteinuppskattning. Resuspendera återstående provet i CP-buffert och centrifugera enligt ovan. Suspendera den slutliga pelleten i en minimal mängd (200 | il) av mitokondrie analyslösningen (MAS).
      OBS: Protein analyseras i detta skede eftersom CP-buffert inte har BSA, medan MAS där prover kommer att senare avbrytas har BSA i den.

    4. Uppskatta Mitochondrial innehåll genom mätning av protein Koncentration Använda en BCA Protein Assay Kit

    5. Utför XF-analyser som beskrivits av Rogers, GW, et al. 12

    OBS: Visualisera O 2 förbrukning (OCR) i pmol O2 / min, eller absoluta nivåer av O 2 och pH i datautgång.

    1. Använd 1x MAS att framställa föreningar som skall injiceras. Lägg en 10x koncentration av föreningarna till hamnar AD att ge en slutlig koncentration på följande: Port A, ADP [adenosin 5 '-diphosphate, 2 mM, 50 pl]; port B, oligomycinkänslig (2 iM, 55 pl); port C, FCCP [karbonyl cyanid 4- (trifluormetoxi) fenylhydrazon, 6 iM, 60 pl]; och port D, 2 iM antimycin-A (65 pl). Förberedtillräcklig volym av föreningar för det erforderliga antalet brunnar.
    2. Bestäm den optimala mängden av mitokondrier genom titrering. Till exempel, last 1,0 ng, 2,5 ng, och 5,0 pg av mitokondrier per brunn i en 50 ^ volym iskalla 1x MAS innehåller substrat. För att minimera variabiliteten mellan brunnar, späd först 10x mitokondrier i kallt 1x MAS + substrat. Därefter levererar 50 pl av denna suspension till varje brunn (förutom bakgrundskorrigerings brunnar).
    3. Centrifugera plattan vid 2000 xg, 20 min vid 4 ° C. Efter centrifugering, försiktigt lägga 450 pl 1x MAS + succinat (10 mM) och rotenon (2 M) (begynnelsevillkor, se nedan) till varje brunn. Visa mitokondrierna under mikroskop för att säkerställa homogen anslutning till väl före överföring plattan till XF analysatorn.
      OBS: De initiala betingelser som används kommer att bero på om andningen drivs av antingen ETC komplex I eller komplex II. För komplexa II driven andning, använd succinate (10 mM) och rotenon (2 pM) som begynnelsevillkor. Rotenon blockerar komplex I och succinat ger bränsle för komplex II (succinatdehydrogenas). Att studera andning drivs av komplex I, använda antingen pyruvat och malat, var och en vid en slutlig koncentration av 5 mM eller glutamat och malat vardera vid en slutlig koncentration av 10 mM som begynnelsevillkor. Det senare kan hjälpa skilja dysfunktion bland trikarboxylsyra cykeln och substrattransport. Att studera andning driven av både komplex I och komplex II, inkluderar pyruvat och succinat utan rotenon eller malat som begynnelsevillkor. Använd palmitoyl karnitin som substrat för β-oxidation.
    4. Sekventiellt mäta mitokondriella andning i realtid med hjälp av respirometer genom att programmera den som tidigare beskrivits 12. Använd inställningarna för respirometer i tabell 2.
      OBS: En kort förklaring av olika mitokondriella andningstillstånd är följande:
    5. o = icke-fosforylering andning inducerad av oligomycinkänslig; Statliga 3u = maximal okopplad andning stimuleras av frikopplare FCCP; Återstående icke-mitokondrie andning = andning efter komplex III hämning av antimycin-A. Det bör också påpekas att längden av OCR-mätning i kombination med den mitokondriella koncentrationen kan påverka data genom utarmning syre under mätperioderna.

    6. Western Blöt

    OBS: Bestäm mitokondriell markör COX IV och hela vävnads GAPDH med Western blotting för att försäkra anrikning av mitokondrier i det slutliga provet

    1. Separera den isolerade mitokondrier och hela vävnadsextrakt med 12% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgeler.
    2. Överför de proteiner på en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran.
    3. Inkubera med COX IV-antikropp (1: 20000), följt av pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad sekundära antikroppar. För GAPDH beslutsamhet, skala blot och sonden med en GAPDH monoklonal antikropp (1: 2000).
      OBS: Om skillnader i kontamination ER är av intresse, inkluderar ER markörer såsom ERp72, kalnexin eller kalretikulin i analysen.

    Representative Results

    Figur 1 visar ett detaljerat flödesschema över hela protokollet.

    Western blot profiler av COX IV / GAPDH (Figur 2) visar expressionen av den mitokondriella proteinet, COX IV, och den icke-mitokondriella markör, GAPDH. Uttryck av både COX IV och GAPDH är tydlig i hela muskeln lysatet. Efter mitokondrier isoleras med hjälp av teknik som beskrivs i detta protokoll, COX IV band är fortfarande påtaglig medan GAPDH är frånvarande på samma exponering. Längre exponeringar kan avslöja ett svagt GAPDH band. Dessa blottar indikerar att de isolerade mitokondrier har minimal icke-mitokondriell kontamination. Dessutom är COX IV uttryck i isolerade mitokondrier konsekvent mellan prover.

    Figur 3 visar typiska respirometric profiler som drivs av komplex II (succinat och rotenon) med 1,0 mikrogram, 2,5 mikrogram, och 5,0 pg av mitokondrier. Som väntat är övergripande OCR ökas wed större mängder av mitokondrier. Den beräknade respiratoriska reglerförhållande (RCR) för denna analys är 7,95, vilket indikerar att mitokondriella beredningen är av hög kvalitet. Dessutom är statlig 3u OCR något högre än för tillstånd 3, bekräftar mitokondriell kvalitet.

    För att jämföra konsekvens av resultaten vid profilering av olika mängder av mitokondrier, utförde vi ANOVA (variansanalys) och beräknade summan av kvadraterna (SS) som faktiska värden på varians med användning av 1,0 pg, 2,5 pg, och 5,0 | ig av mitokondrier laddades per väl (Figur 4). SS presenteras för staten 2, tillstånd 3, statlig 3u, antimycin A och RCR. För tillståndet 2 och stat 3 mätningar, var ett sätt ANOVA statistiskt signifikant (p <0,01 och p <0,05, respektive). Likaså var det ett sätt ANOVA statistiskt signifikant för antimycin och RCR (p <0,01 och p <0,0001, respektive. Ingen signifikant skillnad sågs för statlig 3u mellan grupperna. ThESE resultat indikerar att 5,0 ug av mitokondrier per brunn gav lägsta SS jämfört med andra koncentrationer och är den optimala mängden som ska användas i XF 24 systemet med vår befolkning av deltagarna.

    Figur 5 fungerar som en guide för att indikera hur kan förväntas mycket mitokondrie protein baserat på den initiala muskelprovstorleken. Som väntat finns det en stark korrelation mellan mängden muskler (mg) behandlas och den totala mitokondriella proteinhalt (mg) av det slutliga provet.

    Chappel-Perry buffert I (KPI)
    Kemisk Koncentration
    KCl 100 mM
    MOPS 50 mM
    EDTA 1 mm
    MgSO 4 5 mM
    ATP 1 mm pH 7,4
    Chappel-Perry buffert II (CPU)
    Kemisk Koncentration
    KCl 100 mM
    MOPS 50 mM
    EDTA 1 mm
    MgSO 4 5 mM
    ATP 0,2 mM
    Fettsyra-BSA 0,50%
    pH 7,4
    Mitokondriell analyslösningen (MAS) (2X)
    Kemisk Koncentration
    Sackaros 35 mM
    Mannitol 110 mM
    KH 2 PO 4 2,5 mm
    MgCl2 2,5 mm
    HEPES 1,0 mm
    EGTA 0,5 mM
    Fettsyra-BSA 0,10%
    pH 7,4
    Mitochondrial analyslösningen (MAS) med komplexa II begynnelsevillkor
    Kemisk Koncentration
    1X MAS
    Succinat 10 mM
    Rotenon 2 ^ M
    pH 7,4
    Mitochondrial analyslösningen (MAS) med komplexa I begynnelsevillkor
    Kemisk Koncentration
    1X MAS
    Pyruvat 5 mM
    Malate 5 mM
    pH 7,4
    * Alla buffertar som skall göras i avjoniserat vatten

    Tabell 1. Lösning och buffert recept.

    >
    Protokollsteg
    StartProtocol
    Kommando Tid (min) Port
    Kalibrera 0,00
    Vänta 10,00
    Blanda 1,00
    Vänta 3,00
    Blanda 1,00
    Vänta 3,00
    Blanda 0,50
    Åtgärd 3,00
    Blanda 1,00
    Åtgärd 3,00
    Blanda 0,50
    Injicera EN
    Blanda 1,00
    Åtgärd 6,00
    Blanda 1,00
    Injicera B
    Blanda 1,00
    Åtgärd 3,00
    Blanda 1,00
    Injicera C
    Blanda 1,00
    Åtgärd 3,00
    Blanda 1,00
    Injicera D
    Blanda 1,00
    Åtgärd 3,00
    EndProtocol

    Tabell 2. Blanda, mäta och blanda cykelinställning för respirometer.

    Figur 1
    Figur 1. Flödesschema av hela protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg "/>
    Figur 2. Ett representativt Western blot för hela skelettmuskelvävnaden samt isolerade mitokondrier. Hela vävnadsextrakt samt isolerade mitokondrier immunoblottades med COX IV antikropp som mitokondriell markör och GAPDH antikropp för icke-mitokondriell kontroll. Ingen GAPDH band observerades i isolerade mitokondrier indikerar liten eller ingen förorening från icke-mitokondriella källor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 3
    Figur 3. Representant respirometric profil mitokondrier isolerade från human Vastus later. Tre koncentrationer av isolerade mitokondrier, 5,0 mikrogram, 2,5 ug, och 1,0 pg vi re användes vid denna analys. Slutliga koncentrationer av föreningar efter injektioner hamn var 2 mM ADP (port A); 2 iM oligomycinkänslig (port B); 6 iM FCCP (port C); och 2 iM antimycin A (port D). Beräknat RCR för denna körning var 7,95. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 4
    Figur 4. Summan av kvadrater. Summan av kvadrat för de olika mitokondriella andningstillstånd och RCR använder 5,0 pg, 2,5 mikrogram, och 1,0 mikrogram mitokondrier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    ig5highres.jpg "/>
    Figur 5. Detta kan användas som en guide för att uppskatta mängden av mitokondriell protein som kan förväntas baserat på den initiala Regressionsanalys muskel prowikt:. Av mängden muskler (mg) och total mitokondrieproteinavkastningen (mg). Som väntat finns det en direkt positiv korrelation mellan mängden muskler och den totala mitokondriella proteinet erhålls.

    Discussion

    Isolerade mitokondrier används ofta i studier som undersöker den roll som ETC funktion, liksom andra mitokondriella aktiviteter, inklusive underbyggnads transporter och TCA cykeln funktion. Respirometric analyser som använder isolerade organ medger direkt undersökning av grundläggande processer av oxidativ fosforylering och inneboende egenskaper ETC. Respirometric profilering av isolerade mitokondrier i jämförelse med hela celler eller permeabilized muskelfibrer har fördelarna med relativt lätt tolkning av data och frånvaron av "störning" från icke-mitokondriella processer eller förändringar i mitokondriernas massa / biogenesis. Normalisering av data baseras på mitokondriell proteinhalt, vilket möjliggör enkel kors jämförelse av mitokondrier mellan prover. Respirometric profilering av isolerade mitokondrier är en föredragen metod när syftet med studien är att fastställa underliggande mekanismer och identifiera specifika mål såsom ETC komponents / komplex, eller mitokondriella transportmekanismer.

    Beskrivs är ett protokoll för muskelbiopsi och isolering av funktionella mitokondrier från små vävnadsprover. Denna metod ger reproducerbara resultat mellan användare på grund av utnyttjande av en automatiserad sator kontra handdriven dounce homogenizers. Isolering av mitokondrier kan utföras med så lite som 20 mg av muskelvävnad. Mängden isolerade mitokondrier som kan erhållas från denna urvalsstorleken är tillräcklig för att köra Seahorse plattbaserad respiration medan överskotts mitokondrier för andra experiment och lagring för ytterligare molekylära analyser. Det kan noteras att denna metod kan översättas till XF 96, där även mindre mängder mitokondrier kan användas (1-2 ug per brunn).

    Flera protokoll för isolering mitokondrier beroende dounce homogenizers för vävnadsstörningar initialt. En nackdel med denna metod är de praktiska naturen av den ursprungliga vävnadenhomogenisering. Kraften och hastigheten på mortelstöt i homogeniseringsanordningen kan variera kraftigt mellan operatörer 6. Detta kan resultera i experiment-till-experimentet variation, liksom labb-till-lab variation, och leder till svårigheter att jämföra data mellan experiment. Detta är särskilt oroande i humana interventionsstudier när data från deltagarna samlas vid skilda tidpunkter, vanligtvis före och efter behandlingen, och kan utsättas för flera webbplatser. Vi använder en automatiserad sator för en mer enhetlig metod som ger mer reproducerbara resultat med begränsad person-till-person-variation. Hastigheten för beredningen gör också detta tillvägagångssätt lämpar sig för hantering av flera prover samtidigt. Typiskt kan upp till tre experiment utföras på en enda dag.

    Potentiella begränsningar av den teknik som beskrivs här uppstår genom användning av isolerade organeller och användning av en platta-baserat format. Exempelvis Picard et al. har demonstrated att isolerade mitokondrier har funktionella egenskaper som skiljer sig väsentligt från dem som av intakta mitokondrier i permeabilized myofibers. De föreslog att mitokondriella isoleringstekniker leder till förändrad bioenergetisk funktion, såsom signifikant ökad RCR jämfört med permeabilized myofibers åtföljs av större reaktiva syreradikaler produktion 13. Jämfört med permeabilized muskelfibrer, isolering av mitokondrier kräver längre förberedelsetid. Också, förlust av cellulära halten minskar fysiologiska relevansen, något som kvarhålles i hela celler och till och med permeabiliserade fibrer. Användningen av plattbaserad respiration med de beskrivna tillstånden teknik replikera körningar per prov. Emellertid måste mitokondrier vidhäfta till botten av varje brunn. Denna konfiguration skiljer sig från deras normala miljö och kan påverka funktionella egenskaper. Dessutom bör det noteras att användning av detta protokoll för mitokondriell isolering, there kan fortfarande vara kontamination från endoplasmatiska retiklet (ER) i mitokondriella förberedelser. Skillnader i kontamination ER kan påverka bestämningen av mitokondriella avkastning och påverka resultatet.

    Sammanfattningsvis visar denna studie data som bekräftar att mitokondrier isolerade från vävnader med hjälp av detta förfarande är funktionellt aktiva och kan användas för studier / applikationer som kräver hög kvalitet isolerade mitokondrier från minimal mängd av skelettmuskelprover. Fördelen med denna metod är att: i) Det är möjligt att isolera mitokondrier från minimala mängder skelettmuskulaturen, ii) förfarandet är snabbt, iii) med plattan baserad teknik är det möjligt att köra flera prover samtidigt, och iv) det finns tillräckligt med överskott vävnad och isolerade mitokondrier efter bioenergetiska analysen för provförvaring och andra molekylärbiologiska undersökningar.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    Homogenizer Bio-Gen PRO200 BioExpress
    Eppendorf Centrifuge 5804 R Fisher Scientific
    Deepwell late Rotor  Fisher Scientific
    6 mm University College Hospital Needle Cadence
    60 cc syringe Fisher Scientific
    96-well plate reader Tecan (Genios-basic)
    Seahorse XF 24-3 analyzer Seahorse Biosciences, Inc.
    Protein gel system Life Technologies (Invitrogen)
    Kodak Gel Logic 112 Carestream Health, Inc
    Kodak camera assembly Carestream Health, Inc
    Consumables
    XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge Seahorse Bioscience 100850-001
    100867-100
    Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich Co 221473
    Hydrochloric acid (HCl) Acros 12421-0010
    Dulbecco's Phosphate buffered saline  Lonza 17-512F
    Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P333
    MOPS Fisher Scientific BP308
    EDTA Fisher Scientific BP118
    Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich Co M7506
    ATP Sigma-Aldrich Co A9187
    Fatty acid-free BSA Calbiochem 126575
    Sucrose Sigma-Aldrich Co S0389
    Bacterial proteinase Sigma-Aldrich Co P-8038
    D-Mannitol Sigma-Aldrich Co M9546
    KH2PO4 Fisher Scientific P284
    Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich Co M9272
    HEPES Sigma-Aldrich Co H3784
    EGTA Sigma-Aldrich Co E3889
    BCA protein assay kit Sigma-Aldrich Co PI23227
    Succinic Acid* Sigma-Aldrich Co S3674
    Pyruvic acid* Sigma-Aldrich Co P5280
    Malic acid* Sigma-Aldrich Co 2288
    ADP(K+ salt)* Sigma-Aldrich Co A5285
    XF Cell mito stress test kit Seahorse Biosciences 101706
    Tween-20 Santa Cruz Biotechnology, Inc.  SC-29113
    NuPAGE 12% Bis-Tris Gel Life Technologies (Invitrogen) NP0343BOX
    Immobilin Transfer Membranes (0.45 um) Millipore IPVH20200
    MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml Life Technologies (Invitrogen) NP0001
    NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter Life Technologies (Invitrogen) NP0006-1
    Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin) Abcam ab14734
    Primary antibodies (mAB to GAPDH) Abcam ab9484
    Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled PerkinElmer NEF822E001EA
    Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled PerkinElmer NEF812E001EA
    *ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only 

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).
    2. Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods. 26, 292-297 (2002).
    3. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (2011).
    4. Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA. Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).
    5. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).
    6. Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PloS One. 8, e82392 (2013).
    7. Chappell, J. B., Perry, S. V. The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria. The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).
    8. Tyrrell, D. J., et al. Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. (2014).
    9. Nicklas, B. J., et al. Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women. Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).
    10. Bergstrom, J. Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).
    11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746 (2011).
    12. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS One. 6, e18317 (2011).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics