की खेती

Immunology and Infection
 

Summary

Heligmosomoides polygyrus बारीकी से बेहद प्रचलित मानव पेट का कीड़ा संक्रमण की उन जैसे लगते हैं कि शक्तिशाली immunomodulatory क्षमताओं के साथ एक murine निमेटोड है। यहाँ हम एच के लिए लंबी अवधि के रखरखाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन polygyrus जीवन चक्र।

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Johnston, C. J., Robertson, E., Harcus, Y., Grainger, J. R., Coakley, G., Smyth, D. J., McSorley, H. J., Maizels, R. Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products. J. Vis. Exp. (98), e52412, doi:10.3791/52412 (2015).

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Abstract

Heligmosomoides polygyrus (पूर्व Nematospiroides dubius के रूप में जाना जाता है, और भी एच BAKERI के रूप में कुछ लोगों द्वारा कहा जाता है) को बारीकी से चूहों में पुराने संक्रमण की स्थापना के लिए कई immunomodulatory तंत्र को रोजगार और कहा कि एक जठरांत्र पेट का कीड़ा प्रचलित मानव पेट का कीड़ा संक्रमण से मिलता-जुलता है। एच polygyrus पेट का कीड़ा व्युत्पन्न प्रतिरक्षा विनियमन के क्षेत्र में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है और potently (सक्रिय संक्रमण और पृथक स्रावित उत्पादों के साथ दोनों) एलर्जी और औतोइम्मुिनित की प्रयोगात्मक मॉडल को दबाने के लिए पाया गया है। इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल एच के प्रबंधन की रूपरेखा उनके मल त्यागने-स्रावी उत्पादों (HES) के अनुरूप L3 के लार्वा का उत्पादन, वयस्क परजीवी की वसूली, और संग्रह के लिए polygyrus जीवन चक्र।

Introduction

Heligmosomoides polygyrus बारीकी से बेहद प्रचलित मानव निमेटोड परजीवी एक से संबंधित है जो एक प्राकृतिक murine जठरांत्र पेट का कीड़ा है। ऐसे Nippostrongylus brasiliensis, एच के रूप में अन्य निमेटोड मॉडल के विपरीत polygyrus लगातार यह मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया दो को दबाने के लिए कार्यरत कई शक्तिशाली immunomodulatory तंत्र का एक सीधा परिणाम के रूप में चूहों में पुराने संक्रमण स्थापित करता है।

एच polygyrus एक प्रत्यक्ष जीवन चक्र है: संक्रामक L3 लार्वा feco-मौखिक संचरण द्वारा किया जाता है (या प्रयोगशाला स्थापित करने में मौखिक gavage द्वारा प्रशासित) कर रहे हैं, वे के रूप में आंत्र लुमेन लौटने से पहले ग्रहणी और encyst की subserosal परत को विस्थापित जिस लगभग आठ दिनों के आरंभिक संक्रमण के बाद वयस्क कीड़े। संभोग और अंडे का उत्पादन 10 दिन से होता है और यह दा से मल त्यागने-स्रावी उत्पादों की संस्कृति और संग्रह के लिए वयस्क कीड़े फसल के लिए संभव हैY 14 के बाद 3। एच polygyrus भी संक्रमित अतिसंवेदनशील चूहों 4-6, और एच के स्तर में वृद्धि में वृद्धि हुई lactobacilli साथ, खानेवाला microflora के साथ मौजूद सूचना का आदान प्रदान lactobacilli से 6 चूहों के प्रदर्शन के बाद polygyrus संक्रमण।

एच के साथ सक्रिय संक्रमण polygyrus औतोइम्मुिनित 7-10 के कई पशु मॉडल में इम्युनोपैथोलोजी के खिलाफ की रक्षा करने के लिए दिखाया गया है, 11,12 और एलर्जी 13-16 बृहदांत्रशोथ। फलस्वरूप इस परजीवी से मलोत्सर्ग-स्रावी अणुओं की क्षमता में बहुत रुचि नहीं किया गया है ("HES") विवो 17,18 में विकृति नीचे-मिलाना। दरअसल, सुरक्षात्मक प्रभाव अब 18,20 पहचान की जा रही है, जो रास्ते के माध्यम से HES उत्पादों 19 के साथ चूहों के इलाज के बाद देखा जाता है। यहाँ हम अपने स्रावित उत्पादों के विश्वसनीय Heligmosomoides polygyrus के उत्पादन और वसूली के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णनकि आगे कार्यात्मक जैव रासायनिक और प्रतिरक्षाविज्ञानी जांच की एक श्रृंखला के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में सभी प्रक्रियाओं यूनाइटेड किंगडम गृह मंत्रालय और एडिनबर्ग पशु चिकित्सा सेवा के विश्वविद्यालय द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे हैं।

Gavage द्वारा चूहों के 1. संक्रमण

  1. छह महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए आसुत जल में स्टोर Heligmosomoides polygyrus L3 लार्वा।
  2. उपयोग करने से पहले, आसुत जल में L3 लार्वा तीन बार धो: सेंट्रीफ्यूज (ब्रेक) के साथ 10 मिनट के लिए 300 XG पर, पानी की, लेकिन सभी 500 μl हटाने के लिए (परेशान pelleted L3 के लार्वा से बचने के लिए) और गोली हर बार resuspend।
  3. तीसरे धोने के लिए, अपने एपर्चर चौड़ा करने के लिए एक 200 μl टिप कटौती के साथ एक सटीक मात्रा (आमतौर पर 40 एमएल) और महाप्राण करने के लिए 20 μl पानी जोड़ें। (मोबाइल, और सबसे अच्छा एक विदारक माइक्रोस्कोप के साथ 50X बढ़ाई तहत देखा आमतौर पर) एक 60 मिमी संस्कृति डिश की सतह पर दो 20 μl नमूने प्लेस और L3 लार्वा गिनती। एक concentratio आसुत जल में अंतिम गोली Resuspendमिलीलीटर प्रति 2000 L3 के लार्वा के एन।
  4. जीवन चक्र उत्पादन के लिए, 400 एच के साथ आठ सप्ताह पुराने एफ 1 (C57BL / 6xCBA) चूहों को संक्रमित मौखिक gavage द्वारा आसुत जल के 200 μl में polygyrus L3 के लार्वा (गर्दन के कूड़ा द्वारा ईमानदार स्थिति में चूहों को नियंत्रित और धीरे पेट में मुंह और घेघा के माध्यम से कुंद gavage सुई से गुजारें)। आंदोलन प्रत्येक संक्रमण (लार्वा पानी में जल्दी से सुलझा लेते हैं) और महाप्राण 1 मिलीलीटर सिरिंज में 200 μl करने के लिए अच्छी तरह से पहले; एक गोल अंत के साथ एक समर्पित gavage सुई का उपयोग करें। युवा चूहों की प्रयोगात्मक संक्रमण (पुराने 6-8 सप्ताह), या अन्य जन्मजात उपभेदों (जैसे C57BL 6 / या BALBc) के लिए, 200 L3 के लार्वा के साथ चूहों को संक्रमित।

2. प्रचार और एच का रखरखाव polygyrus

  1. एक बड़े प्लास्टिक के टब के केंद्र में कोयला प्लेस और ठंडे पानी के नल में 30 मिनट की एक न्यूनतम के लिए इस पर चलाने की अनुमति (मैला सक्रिय लकड़ी का कोयला L3 के लार्वा को विषैला होता है)। टब से पानी के निकास और टी पर लकड़ी का कोयला जगहयह पूरी तरह से सूखा जब तक कमरे में हवा के संपर्क में छोड़ने शोषक कागज की परतों, Wo।
  2. अंडे की आवश्यकता होती है (यदि आवश्यक हो तो और कैंची), पहली संदंश के साथ बृहदान्त्र के बाहर मल परिमार्जन। L3 के लार्वा की एक बड़ी संख्या की जरूरत है, एक तार ग्रिड पर चूहों जगह है और कई दिनों में मल छर्रों इकट्ठा।
  3. सिर्फ कागज फिल्टर करने के लिए पालन करने के लिए पर्याप्त नम एक स्थिरता प्राप्त करने के लिए, 1: कम से कम एक एक के अनुपात में दानेदार लकड़ी का कोयला के साथ मल मिलाएं। एक पेट्री डिश में कुछ घटा फिल्टर पेपर के केंद्र पर एक पतली परत धब्बा और एक नम बॉक्स में इस जगह 12-14 दिनों के लिए अंधेरे में (कुछ नम कागज तौलिया और पानी की एक पकवान जोड़)।
  4. बाद दिन 7 से L3 के लार्वा निकालें, और कागज खारिज कर दिया है पहले कम से कम दो अवसरों उन पर इकट्ठा। लार्वा फिल्टर पेपर के किनारे के आसपास एक अंगूठी फार्म; पेट्री डिश के बाहर फिल्टर पेपर उठा और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में (एक पिपेट और प्लेट प्रति बाँझ पानी के 5 मिलीलीटर का उपयोग) थाली के छोड़ दिया जाता है कि लार्वा कुल्ला।
  5. लिफ़्टऔर फिल्टर पेपर बंद शेष लार्वा एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में आसुत जल के साथ थाली पर ही छोड़ दिया फसल। 10 मिनट के लिए 300 XG पर प्रवाह समाधान अपकेंद्रित्र। आसुत जल के साथ लार्वा तीन बार धोएं और जब तक आवश्यक है तो आसुत जल के ऊपर से 50 मिलीलीटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    नोट: लार्वा सक्षम रहते हैं और कम से कम छह महीने के लिए संक्रामक।

वयस्क एच 3. संग्रह polygyrus कीड़े

  1. चित्र 1 में दिखाया के रूप में अग्रिम में संशोधित Baermann उपकरण तैयार करें।
  2. चौदह दिनों के संक्रमण के बाद चुनना चूहों।
  3. 70% इथेनॉल के साथ पेट धो लें। पेट पर त्वचा में कटौती और पूर्वकाल पेट की दीवार प्रकट करने के लिए वापस खींच। पेरिटोनियल गुहा में प्रवेश करने के midline चीरा बनाओ।
  4. (डिस्टल मलाशय के लिए समीपस्थ ग्रहणी से) पूरे छोटी और बड़ी आंत निकालें। एक सूखी पेट्री डिश में रखें।
  5. इसकी पूरी लंबाई के साथ पेट को सीधा; मल युक्त पेट के आबकारी; बाद में अंडे की तैयारी के लिए एक अलग डिश में इस जगह है।
  6. कारण इंट्रा-luminal कीड़े को ग्रहणी और अक्सर एक लाल उपस्थिति के अपेक्षाकृत मोटी दीवार से -identified वयस्क कीड़े होता है कि छोटी आंत के समीपस्थ 20 सेमी आबकारी। हैंक्स 'समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ एक (100 मिमी व्यास) पेट्री डिश में रखें, 37 डिग्री सेल्सियस (पकवान प्रति दो नमूनों) को गरम।
  7. कैंची (राउंड समाप्त हो गया कैंची इसके लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं) के साथ अनुलंबीय कीड़ा-भरा समीपस्थ पेट भाग खोलें, और कीड़े दूर करने के लिए दो गिलास स्लाइड के साथ अस्तर पेट के अंदर को कुरेदना। तो साफ आंत की दीवार त्यागें।
  8. छोटे मलमल बैग में टिप कीड़े, प्रधान बंद कर दिया और कांच कीप (चित्रा 1) के किनारे के आसपास पेपर क्लिप के साथ सुरक्षित है।
  9. हैंक्स 'समाधान के साथ कीप भरें और प्रत्येक कीप में कीड़े के लगभग 4 पेट्री डिश में जोड़ें।
  10. 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें तंत्र, धीरे माध्यम से आधे रास्ते आंदोलनकारी बेदखलमलमल फिल्टर रोक देना हो सकता है कि पेट की तैयारी से मलबे। मलमल बैग के बाहर मलबे के spillage से बचने के लिए ध्यान रखना - इस अंतिम HES तैयारी के प्रदूषण का कारण होगा। वयस्क कीड़े धीरे धीरे मलमल का कपड़ा के माध्यम से चले गए और कांच टेस्ट ट्यूब के नीचे बसे होना चाहिए था। ध्यान से (इस बिंदु पर कीड़े खोने से बचने के ख्याल रख रही है) सिंक पर जोड़ने रबर की नली से टेस्ट ट्यूब अलग।
  11. एक प्लास्टिक विंदुक का प्रयोग, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में कीड़े हस्तांतरण और धोने छह बार हैंक्स के साथ 'समाधान (कीड़े एक stripette के साथ मीडिया, गुरुत्वाकर्षण के साथ समझौता दूर करने के लिए अनुमति देते हैं, जोड़ हैंक्स का 40 मिलीलीटर' समाधान और पांच बार दोहराने)।
    नोट: कीड़ा संस्कृति इस बिंदु के बाद से बाँझ रखा जाना चाहिए।
    1. एक लामिना का प्रवाह हुड के लिए ले जाएँ और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन, इन विट्रो संस्कृति के लिए तैयार के साथ पूरक बाँझ हैंक्स 'समाधान में एक और छह बार धो लें।
  12. गिनतीइसके एपर्चर चौड़ा करने के लिए एक पीले रंग की नोक कटौती के साथ उठाया 20 μl के दो नमूने लेने के द्वारा बरामद वयस्क कीड़े; टीका लार्वा की मात्रा का लगभग 50% की उम्मीद है।

मध्यम तैयार करना, वयस्क कीड़े वॉशिंग: 4. HES के लिए संस्कृतियों की स्थापना

  1. RPMI के लगभग 10 एमएल में 3.11 से कीड़े लेना कीड़े पूरी तरह से कवर कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए एक कोण पर ट्यूब विश्राम छोड़ रहा है, 20 मिनट के लिए 10% Gentamycin के साथ पूरक।
  2. एक लामिना का प्रवाह हुड में इस प्रदर्शन: हैंक्स 'समाधान के साथ फिर से छह बार धोने (5 यू के साथ पूरक / एमएल पेनिसिलिन और 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन)।
  3. एच तैयार करें polygrus मीडिया।
  4. 11.1 मिलीलीटर 45% ग्लूकोज (अंतिम एकाग्रता RPMI1640 0.2% ग्लूकोज होता है के रूप में 1.2%), 100x Peniclllin स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम एकाग्रता 5 यू / एमएल पेनिसिलिन के 5 मिलीलीटर के जोड़, 500 RPMI1640 की मिलीलीटर, एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझपन बनाए रखने 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन), एल glutamine के 5 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता 2 मिमी), औरGentamycin के 5 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता 1%)। एफसीएस न जोड़ें।
  5. निकाल T25 बोतल में विभाज्य कीड़े, लगभग। 15 मिलीलीटर एच में 1,000 कीड़े polygyrus कुप्पी प्रति मीडिया, और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (5% सीओ 2) 3 सप्ताह के लिए में ईमानदार जगह।

HES 5. तैयारी

  1. संस्कृति के 24 घंटे के बाद पहला संग्रह निवारक, प्रति सप्ताह दो बार की तुलना में अब नहीं के अंतराल पर संस्कृतियों से संस्कृति मीडिया HES युक्त लीजिए (कारण LPS के प्रदूषण और मेजबान प्रोटीन का उच्च स्तर के लिए - अलग से संसाधित या खारिज किया जा सकता है)। अलग और स्पष्ट रूप से तारीख और बैच नंबर के साथ लेबल प्रत्येक संग्रह रखने। एच के एक बराबर मात्रा के साथ बदलें प्रत्येक अवसर पर polygyrus मीडिया।
  2. अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 400 x जी पर मीडिया HES युक्त। फिर 50 मिलीलीटर ट्यूबों में 0.2 माइक्रोन कम प्रोटीन बाध्यकारी फिल्टर के माध्यम से बाँझ फिल्टर। -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर स्पष्ट रूप से HES सी का कीड़ा फसल की तारीख और तारीख के साथ लेबलollection।
  3. संस्कृति से HES संग्रह के 21 दिनों के बाद, कीड़े त्यागें।
  4. (आमतौर पर जमे हुए स्टॉक से, और पहले 24 घंटा संग्रह सहित) और नाइट्रोजन दबाव में ultrafiltration डिवाइस में एक 3000 MWCO फ़िल्टर पर ध्यान केंद्रित HES सतह पर तैरनेवाला के पूल 500-1,000 मिलीलीटर।
    नोट: फिल्टर रन सूख जाने के लिए नहीं बहुत सावधान रहना होगा।
    1. , फिल्टर डिवाइस की स्थापना की पहली सरगर्मी whilst के 3 एक्स 20 मिनट के लिए आसुत जल के साथ एक एक लीटर बीकर में नीचे तीन केडीए झिल्ली चमकदार पक्ष धोने के लिए। फिल्टर झिल्ली चमकदार पक्ष के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार ultrafiltration युक्ति इकट्ठे। 4 डिग्री सेल्सियस पर कैबिनेट में रखें और जमा HES ध्यान केंद्रित करने के लिए शुरू करने से पहले के माध्यम से आसुत जल का 50 मिलीलीटर से गुजरती हैं।
    2. मात्रा 2-5 मिलीलीटर करने के लिए नीचे ध्यान केंद्रित किया है, जब तक (प्रति दिन 100-140 मिलीग्राम) के रूप में आवश्यक छानने का काम डिवाइस में HES के प्रत्येक ट्यूब जोड़ें।
  5. Pyr की 50 मिलीलीटर, वह युक्त संस्कृति मीडिया से contaminants को दूर जोड़ने के लिए आदेश मेंऔर पीबीएस छानने का काम डिवाइस के लिए और ogen मुक्त तो लगभग 2 मिलीलीटर करने के लिए नीचे ध्यान केंद्रित। दो बार इस कदम (कुल पीबीएस के 150 मिलीलीटर) को दोहराएँ। एक लामिना का प्रवाह हुड में एक 15 मिलीलीटर ट्यूब (0.2 माइक्रोन फिल्टर के साथ) बाँझ फ़िल्टर में HES स्थानांतरण और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (= 10 ई 280) या ब्रैडफोर्ड परख द्वारा उपयोग करते हुए प्रोटीन एकाग्रता को मापने।
  6. विभाज्य, -80 डिग्री सेल्सियस पर बैच नंबर और तारीख, और फ्रीज के साथ लेबल।
  7. का उपयोग करने से पहले HES के प्रत्येक बैच पर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक वर्णजनीय लाल परख प्रदर्शन करते हैं। LPS के स्तर को एक माइक्रोग्राम प्रति प्रोटीन प्रति एक यू LPS से अधिक कर रहे हैं, तो इन विवो प्रयोगों के लिए या इन विट्रो संस्कृतियों में इस बैच का उपयोग नहीं मानते हैं।
  8. अलग-अलग ही तरीके से 24 घंटा में एकत्र HES प्रक्रिया; उपयुक्त नहीं कार्यात्मक प्रयोगों के लिए, यह मोनोक्लोनल एंटीबॉडी आत्मीयता शुद्धि द्वारा अलग किया जा सकता है कि व्यक्तिगत अणुओं का एक उपयोगी स्रोत है, जबकि LPS और कुछ मेजबान प्रोटीन होते हैं और करेंगे।

Representative Results

एच के साथ संक्रमण के लिए संवेदनशीलता polygyrus माउस तनाव (तालिका 1) के आनुवंशिक पृष्ठभूमि से एक बड़ी हद तक नियंत्रित किया जाता है; C57BL 6 / और CBA चूहों 21,22 अत्यधिक अतिसंवेदनशील होते हैं। परजीवी के जीवन चक्र के रखरखाव के लिए, इन दो नस्लों के बीच एफ 1 संकर या तो माता पिता का तनाव की तुलना में रुग्णता (अत्यधिक आंतों उपकला क्षति) के बिना काफी ज्यादा कीड़ा बोझ को झेलने की क्षमता के लिए चुना गया है। 400 L3 के लार्वा की मौखिक gavage आम तौर पर समयुग्मक जन्मजात उपभेदों में प्रयोगों (जैसे, C57BL / 6 के लिए प्रयोग किया जाता है 200 L3 के लार्वा की एक खुराक, जबकि (चित्रा 2 में दिखाया गया वयस्क कृमि बोझ में जिसके परिणामस्वरूप) एफ 1 चूहों में जीवन चक्र को बनाए रखने के लिए किया जाता है या BALBc)। हालांकि, इस खुराक ऐसे आंत वनस्पति में बदलाव के रूप में पशु की सुविधा है, के बीच भिन्न हो सकती है कि पर्यावरण सह कारकों पर निर्भर करता है कम होने की आवश्यकता हो सकती है।

HES के बैच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य effi सिद्ध कर दिया हैकार्यात्मक assays में और प्रोटीन संरचना में cacy; संस्कृति की एक के बाद एक सप्ताह से supernatants 4 सप्ताह की कुल करने के लिए, विश्लेषण किया गया जब इसके अलावा, प्रोटीन प्रोफाइल (चित्रा 3) HES एकाग्रता ब्रैडफोर्ड परख द्वारा मापा जाता है। (5.5 देखें) बहुत समान होना पाया गया है, कुल प्रोटीन आम तौर पर लगभग 1 मिलीग्राम / एमएल (चित्रा 4) है।

HES ध्यान केंद्रित का एक वैकल्पिक तरीका नमूने बफर लवण और कम आणविक भार घटकों को हटाने, एक स्विंग बाहर रोटर अपकेंद्रित्र में अप करने के लिए 4000 ग्राम पर घूमती है जो कर रहे हैं में एक केन्द्रापसारक concentrator (जैसे Vivaspin 3-केडीए कट-ऑफ झिल्ली), के साथ है। केन्द्रापसारक एकाग्रता सबसे छोटे प्रसंस्करण संस्करणों (1-10 मिलीग्राम) के लिए अनुकूल है और लगभग 30x की अधिकतम एकाग्रता कारक तक सीमित हैं।

HES एकत्रित करते समय, प्रदूषण से बचाव के लिए महत्वपूर्ण है। मेजबान अणुओं के साथ संक्रमण से बचने के लिए, हम HES-ऑन त्यागनेमाउस आंत से वयस्क कीड़ा फसल के बाद पहले 24 घंटे से संस्कृति मीडिया aining। हम यह भी एक chromogenic लाल परख (5.7 देखें) के साथ HES के प्रत्येक बैच में LPS के प्रदूषण का स्तर यों। LPS की एक यू ~ 100 पीजी LPS के लिए equates और इससे नीचे के स्तर के 23 नगण्य माना जाता है। हमारे हाथ में, वह की सबसे बैचों इस सीमा से नीचे काफी, 0.23 यू / माइक्रोग्राम प्रति किया जा रहा है HES में LPS का मतलब एकाग्रता (चित्रा 5) कर रहे हैं। विकृति के vivo मॉडल में LPS के प्रभाव (उदाहरण के लिए दमा प्रतिक्रियाओं का दमन) LPS के 23 में से कम से कम 10 एनजी की आवश्यकता है। इसलिए 100 पीजी LPS / माइक्रोग्राम प्रति HES के साथ एक बैच में से 5 माइक्रोग्राम प्रति HES की विवो प्रशासन में 500 पीजी LPs, अच्छी तरह से नीचे LPS एक समस्या बन जाता है, जहां प्रभावी एकाग्रता शामिल होंगे।

चित्र 1
चित्रा 1: Baermann उपकरण बेयरवयस्क एच के संग्रह के लिए मान उपकरण सेटअप polygyrus (धारा 2 में वर्णित के रूप में)।

चित्र 2
चित्रा 2: 14 दिन में 400 से L3 लार्वा मीन कृमि के साथ संक्रमण के बाद मीन कृमि बोझ 14 दिनों में 400 L3 के लार्वा के साथ संक्रमण के बाद बोझ। दिखाया गया डेटा बिंदुओं C57BL / 6xCBA चूहों के संक्रमण के 19 अलग-अलग दौर से कर रहे हैं। ± SEM के दिखाया मतलब है।

चित्र तीन
चित्रा 3: संस्कृति की लगातार हफ्तों में एकत्र HES प्रोटीन की संस्कृति एसडीएस पृष्ठ प्रोफ़ाइल में लगातार सप्ताह से HES के प्रोटीन प्रोफाइल।

चित्रा 4
चित्रा 4: 500 मिलीलीटर ते-युक्त संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के लगभग 500 मिलीलीटर से निकाली गई 11 विभिन्न बैचों से HES प्रोटीन की मीडिया उपज से HES की अंतिम मात्रा। ± SEM के दिखाया मतलब है।

चित्रा 5
चित्रा 5: Limulus ameobocyte परख द्वारा मापा HES के 41 बैचों में LPS के संदूषण की HES स्तर की LPS के संदूषण। माध्य LPS एकाग्रता = HES के 86 यू प्रति मिलीग्राम।

चित्रा 6
चित्रा 6: एच की एनिमेटेड योजनाबद्ध HES के अलगाव को लार्वा और वयस्क कीड़े की वसूली के माध्यम से L3 के लार्वा की मौखिक gavage, से महत्वपूर्ण जीवन चक्र के चरणों की polygyrus जीवन चक्र सारांश।


चित्रा 7: hes और अपने कार्यों HES के भीतर निहित घुलनशील मध्यस्थों और exosomes की कुंजी immunomodulatory प्रभाव की एनिमेटेड योजनाबद्ध।

जीनोटाइप (और पृष्ठभूमि तनाव) प्राथमिक संक्रमण Phenotype संदर्भ
जन्मजात उपभेदों
ए / जम्मू, CBA, C3H अत्यधिक अतिसंवेदनशील 22,29
C57BL 6 / और C57BL / 10 कोमल 22,30
BALB / ग, डीबीए / 2, 129 / जम्मू इंटर 22,31
एनआईएच, SJL, SWR कम संवेदनशीलता 22,32
साइटोकिन्स या साइटोकाइन रिसेप्टर्स के लिए ट्रांसजेनिक
आईएल 1β - / - अधिक अतिसंवेदनशील 33
आईएल 1R - / - कम संभावना (एक); कोई संवेदनशीलता में परिवर्तन लेकिन वृद्धि कणिकागुल्म (ख) (क) 33
(ख) 34
आईएल 2Rβ ट्रांसजेनिक (C57BL / 6) प्रतिरोधी 35
आईएल -4 / - - हायर उपजाऊपन 36
आईएल 4R - / - (C57BL 6 / या BALB / ग) अत्यधिक अतिसंवेदनशील 22
आईएल-6 - / - (BALB / ग या C57BL / 6) उच्च प्रतिरोधी 37
आईएल 9 ट्रांसजेनिक(FVB) प्रतिरोधी 38
आईएल 21R - / - (C57BL / 6) कमी Th2, ग्रेन्युलोमा gormation कमी आई 39,40
आईएल-25 - / - (BALB / ग) अधिक अतिसंवेदनशील 33
आईएल 33R (T1 / ST2) - / - (BALB / ग) संवेदनशीलता में कोई परिवर्तन नहीं 33
TGFβRIIdn (C57BL / 6) उच्च Th1, वृद्धि की संवेदनशीलता 41,42
टी सेल मार्करों के लिए ट्रांसजेनिक
CD28 - / - (BALB / ग) सीमांत रूप से अधिक उपजाऊपन 43
CD86 (B7-2) - / - (BALB / ग) हायर उपजाऊपन 44
OX40L - / - (BALB / ग) हायर उपजाऊपन और# 160; 45
सहज प्रतिरक्षा लोकी के लिए ट्रांसजेनिक
टाइप 1 इंटरफेरॉन रिसेप्टर (IFNAR) - / - (C57BL / 6) हायर उपजाऊपन, अधिक कणिकागुल्म 34
MyD88 - / - (C57BL / 6) अधिक प्रतिरोधी है, और अधिक कणिकागुल्म 34
सी-KitW / वेस्ट वर्जीनिया (WBB6) अधिक अतिसंवेदनशील 46,47

तालिका 1: एच के साथ प्राथमिक संक्रमण आनुवंशिक रूप से अलग और जीन-लक्षित माउस उपभेदों में polygyrus।

Discussion

एच के जीवन चक्र एक मज़बूती से लगातार फैशन में polygyrus आय। प्राकृतिक घूस या दिन शून्य पर L3 के लार्वा की मौखिक gavage के बाद, अल्सर दिन 10 से आंत लुमेन में वयस्क कीड़े के रूप में उभर तो लार्वा moults के लिए प्रगति और, दिन 5 से ग्रहणी serosa के तहत फार्म शुरू, अंडे से मल में देखा जा सकता है 14 दिन और कणिकागुल्म दिन 21. ऊपर वर्णित (और चित्रा 6 में संक्षेप) प्रोटोकॉल से ग्रहणी serosal सतह पर दिखाई दे रहे हैं एच के उच्च throughput उत्पादन के लिए अनुमति देता है भविष्य प्रयोगात्मक और जीवन चक्र के संक्रमण के लिए व्यवहार्य L3 के लार्वा के विश्वसनीय वसूली के अलावा polygyrus निकालनेवाला-स्रावी उत्पादों (HES),।

एच polygyrus संक्रमण ओवीए या der पी 1 (घर में धूल घुन allergen के) 14 पर निर्भर अस्थमा के मॉडल में रक्षात्मक होने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, airway सूजन के दमन सीडी 4 + CD25 + के साथ स्थानांतरित किया जा सकता है 14 या CD19 + CD23 हाय विनियामक बी कोशिकाओं से 24 एच, गैर अवगत polygyrus चूहों -infected। स्वरोगक्षमता, एच के मॉडल में polygyrus संक्रमण एकाधिक काठिन्य 9 की प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) मॉडल में दमनकारी होना दिखाया गया है, और दमन संक्रमित चूहों 24 से सीडी 4+ टी कोशिकाओं या CD19 + बी कोशिकाओं के साथ या तो स्थानांतरित किया जा सकता है।

, उत्तेजना से 25 वृक्ष के समान सेल जवाबदेही का एक) निषेध सीडी 4 की ख) शामिल: Heligmosomoides polygyrus निकालनेवाला-स्रावी उत्पादों (HES) सहित मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मिलाना और (चित्रा 7 में उल्लिखित) तंत्र की एक संख्या से Th2 की मध्यस्थता सूजन को दबाने + Foxp3 + विनियामक टी कोशिकाओं 18। और ग) आईएल-33 उत्पादन 20 की नाकाबंदी। एक दिलाई जब hes रक्षात्मक होने के लिए दिखाया गया हैटी संवेदीकरण या चुनौती अस्थमा 19 की ओवीए-फिटकिरी मॉडल में और भी जल्दी आईएल-33 रिहाई के दमन के माध्यम से, Alternaria निकालने allergen के 20 के साथ intranasally दिलाई है। HES की LPS के संदूषण से बचाव अक्सर भविष्य प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल में, इस को प्राप्त करने में महत्वपूर्ण कदम (2.10 देखें) और संस्कृति के पहले 24 घंटे से अलग ते समाधान सेट करने के लिए अंतिम HES तैयारी में प्रवेश नहीं करता Baermann उपकरण की मलमल बैग के भीतर निहित है कि मलबे सुनिश्चित करने के लिए कर रहे हैं (5.1 देखें)।

हाल के वर्षों में, वह अच्छी तरह से 26,27 पहचान 370 से अधिक विशिष्ट प्रोटीन के साथ प्रोटिओमिक स्तर पर बताया गया है। इसके अलावा, 4 चरण लार्वा से ते प्रोटिओमिक विश्लेषण 28 के अधीन कर दिया गया है। चल रहे काम तीन जोरदार immunogenic होने के लिए जाना जाता है HES के प्रमुख glycan घटकों, निस्र्पक भी शामिल है, और सूक्ष्म आर.एन. स्रावितकि 50-100 एनएम पुटिकाओं या exosomes (हिरन एट अल।, प्रकाशन के लिए प्रस्तुत) में समझाया जाता है। इस बेहद immunomodulatory परजीवी से, और hes के आणविक घटकों की पहचान व्यापक प्रोटिओमिक डेटा के साथ ते के संग्रह के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल की स्थापना के साथ, मंच अब पहचान और एच से व्यक्तिगत अणुओं के चिकित्सीय परीक्षण के लिए सेट किया गया है मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली पर महत्वपूर्ण प्रभाव मध्यस्थता कर सकते हैं कि polygyrus।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon concentrator Millipore 5112 Model 8050 50 ml
http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM
_NF-5122
Hanks’ buffered salt solution Sigma H9394 500 ml
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB
Penicillin streptomycin Invitrogen 15070-063 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063
L-glutamine Invitrogen 25030-081 200 MM 100ml
https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081
Activated charcoal Merck 1.09624.0500 18-35 mesh
http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624
Glucose solution Sigma G8769 100 ml 45% solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB
Falcon tubes Sarstedt 62.547.254 50 ml
http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon
T25 Flasks Sigma CLS430639  25cm vented flask
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB
Chromogenic LAL assay Lonza 50-647U QCL-1000 assay
http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx
Gentamicin Gibco 15710-049 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Gibco 11875093 500 ml; without L-glutamine
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093

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