Transposon medierad Integrering av plasmid-DNA i subventrikulära zonen av neonatal möss att generera Nya Modeller av Glioblastoma

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Calinescu, A. A., Núñez, F. J., Koschmann, C., Kolb, B. L., Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma. J. Vis. Exp. (96), e52443, doi:10.3791/52443 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Glioblastoma multiforme (GBM) är den vanligaste (60%) primär hjärntumör hos vuxna, med en medianöverlevnad på 15-21 månader när de behandlas med kirurgi, strålbehandling och kemoterapi 1. Nya terapier för GBM är absolut nödvändigt. Experimentella terapier kräver tester i djurmodeller som på ett tillfredsställande återge de framträdande dragen i den mänskliga sjukdomen. Strategier för att inducera GBM hos gnagare inkluderar kemisk mutagenes med alkylerande medel, könsceller eller somatiska genetiska förändringar, eller transplantation med hjälp gliom cellinjer 2. De mest använda modellerna använder implantation av gliom cellinjer, antingen ortotopiskt, in i hjärnan eller subkutant med användning av syngena celler i djur med identisk genotyp; eller xenogena celler, oftast mänskliga GBM cellinjer, implanteras i immun äventyras möss 3. Xenografter erbjuder många fördelar för studier av intrakraniella tumörer: bekvämligheten med reproducerbarhet, standardized tillväxttakt, tid för död och tumörlokalisering. Men dessa modeller har begränsningar på grund av den konstgjorda, invasiv kirurgisk metod som används för implantationer och begränsad förmåga att korrekt återge histologiska funktioner karaktäristiska för human GBM (WHO grad IV): pseudo-pallisading nekros, nukleära atypias, diffus invasion, mikro-vaskulär proliferation och bildandet av glomeruloid kärlmissbildningar 4-7. Induktion av GBM genom att förändra genomet av somatiska celler med onkogen DNA, antingen med virala vektorer 8-12, eller med transposon-medierad integration 13, återger närmare etiologin av sjukdomar hos människan och rekapitulerar Histo-patologisk funktioner i den mänskliga GBM.

Historiskt tumörer i CNS har klassificerats utifrån den upplevda cellen ursprungs, vilket observerades, skulle vara en prediktiv faktor för överlevnad 14. Sandblästrat stål klassificeras i primära och sekundära. Emerging bevis today pekar på den mycket heterogena karaktären av primär glioblastom 15. Sekundär GBM (15%), resultatet av malign transformation av lågvärdiga astrocytom (WHO grad I) och anaplasic astrocytom (WHO grad II), är förknippade med tidigare debut av sjukdomen, bättre prognos och en "proneural" mönster av genuttryck , medan primär GBM (85%) visar en sen debut, dålig prognos och gliaceller (klassisk), neurala eller mesenkymala uttrycksmönster. Huruvida dessa mönster av genuttryck korrelerar med den faktiska cellen ursprungs av tumören fortfarande aktivt utreds. Ackumulerande data visar att kombinationen av genetiska mutationer associerade med sandblästrat stål är prediktiva för överlevnad. Till exempel är förlust av heterozygocity (LOH) kromosomer 1p / 19q, IDH1 mutationer, PDGFRα amplifieringar, associerad med sekundära sandblästrat stål, proneural uttrycksmönster och bättre prognos, medan EGFR-överuttryck, Notch och Sonic hedgehog vägsaktivering Nf1 och PTEN förlust och mutationer av p53 är korrelerade med neurala, klassisk, eller mesenkymala primära GBM och sämre prognos 16,17. Tillkomsten av storskaliga sekvenseringsprojekt och ackumuleringen av många patientprover tillgängliga för testning ger en mängd ny information avseende genetiska mutationer och vägar inblandade i GBM patogenes och progression och möjligheten till individualiserad medicin, där behandlingar kan skräddarsytt för de genetiska abnormiteter hos patienten. Ytterst bedöma det prediktiva värdet av dessa mutationer och vägar på ett systematiskt sätt, och för att testa möjliga behandlingar i varje enskilt fall, kräver djurmodeller av GBM med förutbestämda genetiska förändringar. Transposon medierad integration av genomiskt DNA erbjuder en genomförbar strategi.

Törnrosa transposon systemet, ledamot i TC1 / mariner klass transposoner, blev "väckt" (konstruerat) i en flerstegs förfass av platsspecifik mutagenes från en laxartad transposasgen, som blev vilande mer än 10 miljoner år sedan 18,19. I huvudsak DNA transposoner flankerad av specifika sekvenser (inverterade upprepningar / direkta upprepningar: IR / DR) kan integreras i genomet i en "klippa och klistra" sätt med hjälp av aktiviteten av Törnrosa transposaset. Den transposas erkänner ändarna av IR webbplatser, skär ut transposonen och integrerar det slumpmässigt in i en annan DNA-ställe mellan baserna T och A, baser som dupliceras vid varje ände av transposonet under införlivandet (Figur 1a). Törnrosa transposas består av tre domäner, en transposon bindande domän, en nukleär lokaliseringssekvens och en katalytisk domän. Fyra transposas molekyler måste ta de två ändarna av transposonen tillsammans och möjliggöra införlivande, men om alltför många molekyler av transposas är närvarande, de kan dimerisera och tetramerize att hämmainförlivandet reaktionen 20. En effektiv införlivande reaktion kräver ett optimalt förhållande mellan transposaset till transposoner. Den DNA som kodar för transposaset kan levereras samma plasmid med transposonen (i cis) eller på en annan plasmid (i trans). För att säkerställa optimala förhållandet mellan transposaset och transposoner, kan en promotor med tillräcklig aktivitet väljas för uttrycket av transposaset (för "cis" modellen) eller förhållandet mellan de plasmider i injektionslösningen kan optimeras (för "trans" modellen). Törnrosa transposon systemet kan användas med framgång för funktionell genomik, insertionsmutationer, genmodifiering och somatisk genterapi 21. Att vara en syntetisk konstruktion omskapas till en funktionell molekyl från ett vilande laxartade variant, inte Törnrosa transposaset inte binda till andra transposoner hos människor eller andra däggdjur 20. Sedan dess upptäckt, har molekylteknik tillbehöred effektiviteten införlivandet av SB transposon systemet genom förändringar i IR-sekvenser och tillägg av TATA dinukleotider flankerar transposon, vilket resulterar i pt2 transposoner. Dessa transposoner har optimerat bindning av SB till IR platsen och ökad effekt av excision. SB transposaset gick också signifikant förbättring; transposaset användes i experiment som presenteras häri är SB100X, en hyperaktiv transposas som genereras av en DNA-skyffling strategi som följts av en storskalig genetisk skärm i däggdjursceller 22.

I den här rapporten presenterar vi en snabb, mångsidig och reproducerbar metod för att framkalla inneboende GBM i möss med icke-virala, transposon-medierad integrering av plasmid-DNA i celler av underventrikulära zonen av neonatal möss 23. Vi presenterar ett enkelt sätt att skapa transposoner med nya gener som kan bli föremål för genomisk integrering med hjälp av Törnrosa transposaset och visa hur man kan övervaka plasmid upptag ochsjukdomsprogression använder bioluminiscens. Vi karakteriserar även histologiska och immun histokemisk funktioner av GBM återges med denna modell. Dessutom presenterar vi en snabb metod för att generera primära GBM cellinjer från dessa tumörer. Törnrosa-modellen, där tumörer induceras från celler original till djuret, medger funktionell bedömning av den roll som kandidat GBM gener i induktion och progression av tumörer. Detta system är också väl lämpad för testning av nya GBM behandlingar, inklusive immunterapier i immunkompetenta möss, utan behov av invasiva inflammatoriska kirurgiska ingrepp, vilket kan förändra den lokala mikromiljön.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla djurprotokoll har godkänts av University of Michigan kommitté för användning och skötsel av djur (UCUCA).

1. Kloning av sekvensen av intresse i Nya Sleeping Beauty Transposoner

OBS: Om du vill infoga gener eller hämmande element (som shRNA) med hjälp av Törnrosa transposaset systemet, klona sekvensen av intresse i ryggraden i en pKT eller pT2 plasmid. Rikta kloning så att de regulatoriska elementen, förbli genen av intresse och markörer flankeras av de inverterade upprepningarna (IR / DR). Ett exempel på kloning PDGFp i en pKT ryggrad beskrivs nedan (se även figur 1b).

  1. Digerera 5 | ag av plasmidvektor pKT-IRES-Katushka under 4 timmar vid 37 ° C med 5-10 enheter av Xbal / Xhol-restriktionsenzymer i 50 | il reaktionsvolym.
  2. Smälta den mPDGFβ cDNA från 5 pg av pGEM-T- mPDGFβ plasmid för 4 timmar vid 37 ° C med 5-10 enhetar av Ncol / Sacl restriktionsenzym.
  3. Fällning det totala DNA genom tillsats av 2,5 volymer av 100% etanol och 1/10 volym av 3 M Na-acetat, pH 5,8 och inkubera över natten vid -20 ° C.
  4. Centrifugera proverna vid 13.800 xg under 15 min.
  5. Tvätta DNA pelleten med 500 pl 70% etanol, centrifugera vid 13.800 xg under 1 minut, upprepa en gång och slamma i 19 l sterilt DNas fritt vatten.
  6. Följ tillverkarens anvisningar i snabb Blunting Kit att trubba ändar både vektorn (pKT-IRES-Katushka) och sätt (mPDGFβ).
  7. Ladda den trubbiga vektorn och sätt på en 1,2% etidiumbromidfärgad agarosgel och kördes vid 80 V under 40 min. Visualisera banden, skära dem med en ren rakblad och gel rena DNA med hjälp av en gel renande kit enligt tillverkarens protokoll.
  8. Ligate insatsen och vektor-DNA som renats i steg 1,7 genom tillsats av dem i ett rör på en 4: 1-molförhållande (insert: vektor). In i detta rör, pipette 1 pl T4 ligas och 2 pl T4-ligas buffert (innehållande ATP) och justera volymen till 20 l med sterilt vatten. Inkubera ligeringsreaktionen för 18 h vid 16 ° C.
  9. Omvandla kemiskt kompetenta DH5a bakterieceller med ligerade produkterna.
    1. Tina de behöriga cellerna på is.
    2. Lägg hela volymen av ligeringsreaktionen till 50 pl av kompetenta celler, försiktigt skaka röret och inkubera blandningen på is under 30 min. Värme chocka bakterierna för 45 sekunder vid 42 ° C och omedelbart återvända till isen; inkubera på is under ytterligare 2 minuter.
    3. Lägg 950 pl av Luria-buljong till kulturen och inkubera under skakning vid 37 ° C under 1 h. Centrifugera bakterier vid 2400 xg under 3 min och återsuspendera pelleten i 200 | il LB.
    4. Sprid de transformerade bakterierna på en Petri-skål belagd med LB-agaros och motsvarande antibiotikum. Inkubera plattan över natten vid 37 ° C.
    5. Slutligen, samla 5-10 bacteRial kolonier och kultur över natten vid 37 ° C i 5 ml LB media med antibiotika.
    6. Rena plasmid-DNA med användning av en plasmid-DNA-mini-kit enligt tillverkarens instruktioner. Utför en diagnostisk restriktionsklyvning för att kontrollera korrekt inkorporering av insatsen in i vektorn och lämna positiva kloner för DNA-sekvensering för att säkerställa rätt orientering av skäret.
  10. Välj de korrekta kolonier och skala upp DNA-produktion med användning av en hög kvalitet, endotoxinfritt plasmidberedning kit.
  11. Eluera DNA i sterilt vatten eller ett mM Tris-HCl. Affär DNA vid -20 ° C tills den ska injicera i nyfödda.

2. intraventrikulär Neonatal Injektioner

  1. Tre till fyra veckor före att experimentera, skapa en mus avel bur med en manlig och en kvinnlig mus, och en plast färgad igloo. Detta ger en berikad miljö och underlättar parning processen.
  2. När graviditeten är bekräftad, ta bort male till en ny bur. Arton dagar efter parning, övervaka buren dagligen för leverans. Utför intraventrikulära injektioner på postnatal dag 1 (P1).
  3. Beredning av injektionslösning
    OBS: Injektionslösningen framställs genom blandning av plasmid-DNA med transfektionsreagens att skapa partiklar för transfektion. Nedan är ett exempel på att förbereda ett injektionslösning med hjälp av en plasmid som kodar för Törnrosa transposaset och luciferas: pT2 / SB100x-Luc och två transposonmutanter plasmider: PT / CAGGS-NRASV12 och pT / CMV-SV40-LGT, i förhållandet 1: 2: 2. Samtliga plasmider ha en koncentration av 2 ug / ul. Viktig information om beredningen av injektionslösningen presenteras i diskussionen.
    1. Förbered DNA-lösningen genom att tillsätta: 4 mikrogram (2 l) av pT2 / SB100x-Luc, 8 mikrogram (4 pl) av Pt / CAGGS-NRASV12 och 8 ug (4 l) av PT / CMV-SV40-LGT och 10 pl av 10% glukos till en slutvolym av 20 | il vid en koncentration av 1 | ig / mlDNA och 5% glukos.
    2. Bered PEI-lösning genom att tillsätta 2,8 pl av in vivo-jet PEI, 7,2 | il sterilt vatten, och 10 pl av 10% glukos till en slutkoncentration av 5% glukos.
    3. Lägg den PEI-lösning till DNA-lösningen, blanda och vortexa och låt stå vid rumstemperatur (RT) under 20 min. Lösningen är nu färdig för injektion. Efter en timme vid RT, hålla lösningen på is.
    4. Montera ett 10 ni rent spruta försedd med en 30 gauge injektionsnål med 12,5 ° fasning in i mikro (Figur 2 # 1).
  4. För att verifiera väl fungerande insprutningssystemet, använda den automatiska injektorn (Figur 2 # 1) att dra tillbaka 10 l vatten i sprutan och sedan tömma sprutan helt
  5. Kyl den neonatal stereotaxic steg (fig 2 # 3) med en uppslamning av torris och alkohol till en temperatur av 2-8 ° C.
  6. Inducera anestesi genom att placera valparna på våt isi 2 min. Anestesi fortsätter på den kylda stereotaktisk ram för resten av proceduren. Under upprätthållande av temperaturen hos ramen ovanför fryspunkten, mellan 2-8 ° C kommer att förhindra termiska brännskador. Som speciella försiktighetsåtgärder valpar kan inlindad i gasbinda innan du lägger på våt is.
  7. Fyll sprutan med DNA / PEI-lösning.
  8. Immobilisera valpen i stereotaktisk ram genom att placera sitt huvud mellan gasväv täckt örat barer (figur 2b). Se till att den dorsala sidan av skallen är horisontell och parallell med ytan på ramen och att de kraniala suturerna är klart synliga. Torka av huvudet med 70% etanol.
  9. Sänk nålen på sprutan och justera stereotaktiska koordinater med hjälp urtavlor av stereotaktisk ram tills nålen rör vid lambda (mittlinjen korsningen mellan parietala och occipital ben) (Figur 2b).
  10. Lyft nålen och justera stereotaktiska koordinater till 0,8 mm i sidled och 1,5 mm rostralt om lambda (figur 2b).
  11. Sänk nålen tills den rör och något gropar i huden. Mät koordinaterna. Sänk nålen ytterligare 1,5 mm. Nålen kommer tränga huden och skallen, och passera genom cortex för att ange den laterala ventrikeln (figur 2c).
  12. Använda den automatiska injektorn, injicera 0,75 pl av DNA / PEI-lösning vid en hastighet av 0,5 | il / min
  13. Håll pup på ramen för en annan minut för att tillåta lösningen att dispergera i ventriklarna. Under tiden söva en annan valp, på is i 2 min i förberedelse för nästa injektion.
  14. Försiktigt och långsamt lyft nålen och placera valpen under värmelampa. Övervaka andning och aktivitet. Om det behövs, ge skonsam stimulering av armar och ben, tills första andning följer.
  15. Återgå valpen till sin mor efter att den har värmts upp, har nått en rosig färg, andas regelbundet och är aktiv, normalt 5-7 min. Om more än en valp injiceras i taget, hålla alla valpar tillsammans tills alla injektioner är klar. Om injektioner tar längre tid än 30 minuter, tillbaka hälften av valparna efter den första 30 min och resten vid slutet av förfarandet.
  16. Övervaka att dammen är lyhörd och vårda till sina valpar. Om det behövs, lägga till en surrogat mamma till buren.
  17. Se till att intervallet mellan placera pup på is och placera den under uppvärmningen lampan är mindre än 10 min. Ju snabbare förfarande desto bättre överlevnad. Vanligtvis, den tid det tar att söva och injicera en valp är 4 min.

3. Bioluminescens Övervakning av tumörbildning och Progression

3.1) Övervakning Plasmid Upptag Efter Injection

  1. 24-72 timmar efter injektion, ta bort alla valpar från moderns bur och placera i en 6 väl ren vävnadsodlingsskål, en valp per brunn.
  2. Bered en 30 mg / ml lösning av luciferin upplöst i normal koksaltlösning eller phosphate buffert. Bered denna lösning i förväg och förvara i små alikvoter vid -20 ° C.
  3. Med hjälp av en 1 ml spruta med en 30 gauge injektionsnål injicera 30 pl luciferin subkutant mellan skulderbladen av valpen. Se till att nålen inte tränga igenom några organ, genom att nypa i huden och lyfta den något innan du sätter nålen.
  4. Bild omedelbart, med ett in vivo mareld bildsystem. För IVIS Spectrum, använd följande inställningar för förvärv: automatisk exponering, stora binning och bländare f = 1.

3.2) Övervakning tumörbildning och Progression

OBS: Djur börjar bilda makroskopiska tumörer detekterbara genom bioluminiscens och histologi inom 2½-6 veckor, beroende på onkogena plasmider injicerade.

  1. Med hjälp av en 1 ml spruta med en 26 gauge nål injicera 100 pl av en 30 mg / ml luciferin lösning intraperitonealt.
  2. Placera djuret i anestesi kammaren. Injicera upp till fem djur samtidigt.
  3. Vänta 5 minuter sedan starta syrgas / isofluran flöde (1,5-2,5% isofluran) att söva djuren. Efter 3-4 min, ta bort djuren från anestesi kammaren, starta syre / isofluran flöde i mareld kammaren. Placera djuren i respektive slitsar som är utrustade med glas noskoner att möjliggöra anestesi och obehindrad passage av ljus.
  4. Vanligtvis förvärva en serie av sex bilder på 2 minuters intervall med en automatisk exponeringstid, median binning och en öppen bländare f = 1.
  5. Ställ regionen av intresse för alla djur avbildas, typiskt en oval över huvudet regionen och mät luminescensintensiteten med användning av de kalibrerade enheter fotoner / s / cm 2 / sr.
  6. Notera den maximala värdet för varje djur. Därefter kan inspelningar jämföras under progression av tumören för varje djur och / eller mellan djur, till exempel when olika behandlingar är anställda.

4. Histologisk och Immunohistokemisk Analys av New sandblästrat stål

OBS! När tumörerna har nått önskad experimentella tidspunkt, kan djuren offras, hjärnor perfusion, fasta och analyseras. För överlevnad analyserar döende stadium representerar slutpunkten av experimentet, då djuren humant sätt offras vid de första tecknen på tumörbörda, enligt definitionen i det kliniska stadiet när djuret blir symptomatisk visar nedsatt rörlighet, krökt kroppshållning och Josh päls. En kort beskrivning av de vanliga histologiska och immun histokemisk metoder som används presenteras nedan.

4,1) perfusion och Fixering

  1. Bedöva musen med ett intraperitonealt injektion av 100 mg / kg ketamin och 10 mg / kg av xylazin.
  2. Kontrollera pedalreflexen genom att klämma foten av musen. När denna reflex avskaffas, vilket indikerar djup anestesi, immobilize musen på en dissektion bräda med stift, öppna bukhålan, dissekera membranet och öppna brösthålan för att visualisera hjärtat.
  3. Sätt i en trubbig 20 gauge kanyl i vänster kammare i hjärtat. Anslut kanylen med plaströr som passerar genom en peristaltisk pump till en behållare med syresatt och hepariniserad Tyrodes lösning (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl2 2H 2 O, 0,005% NaH 2 PO 4, 0,1% glukos, 0,1% NaHCO 3, 0,02 % KCl). Starta flödet av Tyrodes lösning genom att reglera hastigheten på den peristaltiska pumpen för att säkerställa en långsam och konstant flöde, ungefär en droppe per sekund eller mindre om djuren är mindre.
  4. Gör ett litet snitt i det högra förmaket av hjärtat för att tillåta dränering av blod och Tyrodes.
  5. Övervaka perfusion effektiviteten genom att observera blanche av inre organ (mest uppenbara i lever och njure), eftersom de förlorat sitt blod.
  6. Närlösning dränering från hjärtat är klart (3-5 min), växla lösningarna från Tyrodes till 4% paraformaldehyd för fixering (4% PFA, pH 7,34 i fosfatbuffrad saltlösning).
  7. Övervaka god fixering av vävnader genom den ökade styvheten av halsen och svans.
  8. Halshugga musen och försiktigt dissekera hjärnan från skallen.
    1. Dra päls som täcker skallen rostrally, mot näsan, och ta tag i det ordentligt för att stabilisera huvudet, ryggsidan uppåt.
    2. Med användning av en skarp skalpell, skär nedåt längs kanten av den omloppsbana, att transekt orbital muskler och de underliggande okbågarna.
    3. Vrid huvudet ventrala sidan upp och ta bort bifogade nackmusklerna med hjälp av en rongeur. Krossa den första kotan och ta bort den från hjärnstammen.
    4. Visualisera snäckan, greppa den överliggande tinningbenet med rongeur och skapa en öppning mellan den tidsmässiga och pannben. Dra av occipital ben från ytan av lillhjärnan.
    5. Vrid huvudet ventrala sidan uppåt. Hjärnan kommer att glida ner från resten av skallen, anslutna nu enbart genom kranialnervema. Använda en liten sax klippa lukt, optik och trigeminala nerver. Detta kommer att släppa hjärnan.
  9. Placera hjärna i 4% PFA över natten vid 4 ° C under efter fixering.
  10. För histologisk analys och hematoxylin-eosin färgning, överföra hjärnor att fosfatbuffert under 24 timmar och sedan gå vidare till paraffininbäddning.
  11. För immuno-histologisk analys överför hjärnor i en 30% sackaroslösning i fosfatbuffrad saltlösning under 24 till 48 timmar (tills hjärnorna sjunka till botten av röret)
  12. Avsnitt hjärnor i hälften genom mitten av tumörområdet, placera snittetsidan ner i en frys mögel, bädda in Cryo-inbäddning media (OCT förening), och flash-frysa i en slurry av torr-is etanol, torr-is isopentan eller i flytande kväve. Håll frysta block vid -80 ° C tills sektione och färgning.

4.2) Hematoxylin-Eosin Färgning av Paraffin Embedded Brains för Histo-patologisk analys av Intrinsic sandblästrat stål

  1. Avsnitt paraffin inbäddade hjärnor vid 4 ^ m tjocklek, droppe i ett 42 ° C vattenbad och montera på objektglas.
  2. De-paraffinize diabilder genom att placera dem i 10 minuter i en ugn 60 ° och sedan överföra dem på 5 minuters intervall genom en serie av tre glid behållare fyllda med xylen.
  3. Hydrate bilderna genom en serie av etanol bad: 100% etanol i 2 min, upprepa en gång, 95% etanol i 2 min, upprepa en gång, 70% etanol i 2 min och sedan överföra bilder till vatten.
  4. Fläck bilderna genom att doppa dem i ett bildspel behållare fylld med Harris Hematoxylin 2 min.
  5. Skölj i kranvatten tills vattnet är klart.
  6. Doppa glider två gånger i blåelse lösning (0,1% natriumbikarbonat).
  7. Låt glasen står i kranvatten i 2 minuter, sedan överföra till 80% etanol under 2 minuter.
  8. Fläck glasen genom att doppa dem i en behållare fylld med Eosin för 5 minuter.
  9. Torka diabilder i en serie av etanol bad (80% etanol 3-4 dips, 95% etanol 2 min, upprepa en gång, 100% etanol 2 min, upprepa en gång).
  10. Klart med 3 i rad bad xylen, 3 min vardera.
  11. Täckglas med en xylen baserat monteringsmedel och låt torka på en plan yta vid rumstemperatur tills redo för avbildning. Förvara i rumstemperatur.

4.3) immunhistokemisk av Cryo-bevarade Embedded Brains för molekylär och cellulär karakterisering av De Novo inducerad sandblästrat stål

  1. Hämta frysta block från -80 ° C lagring, placera in kryostat och låta temperaturen i jämvikt under 30 minuter.
  2. Avsnitt 12-14 Um tjocka sektioner och montera 2-3 sektioner på positivt laddade glas. Klipp sektioner seriellt, genom att samla intilliggande sektioner på olika diabilder. Detta tillåter färgning med olika antikroppar på intilliggande vävnadssnitt inom tumören.
  3. Torra glasen i en exsickator i minst 1 timme efter sektione att möjliggöra god vidhäftning av vävnaden.
  4. Skapa en hydrofob barriär (med en hydrofob markör) vid vardera änden av sliden för att medge vätska att täcka sektionerna och att stanna på sliden under tvättar. Täck sektioner med en lösning av fosfatbuffrad saltlösning med 0,1% Triton-X (PBS 0,1% Tx) och försiktigt skaka i 5 min på en horisontell skakare att permeabilize vävnaden. Upprepa två gånger.
  5. Blockera icke-specifik bindning med en lösning av 10% normalt getserum (eller serum från djuret i vilket den sekundära antikroppen höjdes) under 30 min med försiktig skakning
  6. Förbered primära antikroppen lösning i 2% normalt getserum i PBS 0,1%Tx och pipettera lösningen över sektionerna. Placera objektglasen i en täckt fuktig kammare i mörker och hålla vid rumstemperatur över natten.
  7. Nästa dag, tvätta sektioner tre gånger under 5 min med PBS 0,1% Tx och inkubera i fluorescerande sekundär antikropp utspädd i 2% normalt getserum PBS 0,1% Tx under en timme.
  8. Tvätta sektioner tre gånger under 5 min med PBS 0,1% Tx, motfärga med en nukleär färgämne (t.ex., DAPI) under 2 min, tvätta en gång till, klart i vatten och täckglas med ett vattenbaserat monteringsmedel som kommer att bevara den fluorescens. Placera diabilder på en plan yta och låt dem härda i minst 24 timmar, i mörkret, tills klar för avbildning. Förvara vid 4 ° C därefter.

5. Generering av primärtumör cellinjer med särskilda genetiska förändringar.

  1. För att generera cellinjer från Törnrosa tumörbärande möss välja en mus med bekräftad stor tumör (bioluminiscens 10 7 -10 8 fotoner / s / cm2 / sr).
  2. Euthanize musen med en överdos av isofluran bedövningsmedel, halshugga djuret och försiktigt dissekera hjärnan från skallen (som beskrivs i avsnitt 4). Placera hjärnan i en ren petriskål.
  3. Med användning av ett rakblad, gör koronala snitt främre och bakre till tumören. Placeringen av tumören är vanligtvis igenkännbar på grund av insyn i hjärnan.
  4. Dissekera tumören, vanligtvis 5-7 mm i diameter med fin pincett och placera i ett 1,5 ml rör fyllt med 300 | il Neurala stamcellsmedier (NSC Media: DMEM / F12 med B-27 komplement, N2 supplement, och Normocin, kompletterat med human rekombinant EGF och bFGF vid en koncentration av 20 ng / ml vardera).
  5. Homogenisera försiktigt tumör med en plastmortelstöt, som passar till väggarna i röret.
  6. Tillsätt 1 ml enzymfri vävnadsdissociering lösning och inkubera vid 37 ° C under 5 min.
  7. Passera cellsuspension genom en 70 ìm cell sil, tvätta silen med 10 mlNSC media, centrifugera vid 300 xg under 4 min, Dekantera supernatanten och slamma pelleten i 7 ml NSC media.
  8. Plate på en T25 odlingskolv och kulturen vid 37 ° C i en vävnadsodlingsinkubator med och atmosfär av 95% luft och 5% CO2. Efter 3 dagar har vissa celler dött, vissa anslutit sig till botten av kulturen skålen, och vissa är bildar neurosfärer, fritt svävande i media.
  9. Ta bort dessa suspenderade celler och åter plattan på en T75 vävnadsodlingskolv.
  10. Efter ytterligare tre dagar av kultur, samla neurosfärer, dissociera som beskrivs i steg 5,6, stam genom cellfilter och räkna cellerna. Freeze alikvoter av celler i fetalt bovinserum 10% DMSO och passageceller vid en densitet av miljoner celler i 14 ml NSC kompletterad med EGF och FGF för en T75-flaska. Tillväxttakten kommer att bero på de onkogener som användes för att generera tumörer. Anpassa cellodlings villkor för att förhindra igenväxning och underhålla celler vid relativt hög densitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att karakterisera Histo-patologiska funktioner i SB-inducerade glioblastom, var C57 / BL6-neonatala möss injicerade på P1 med en plasmid som kodar för luciferas (pT2 / SB100x-Luc) i kombination med plasmider kodande transposoner med onkogent DNA, dvs NRAS (pT / CAGGS -NRASV12) och SV40 LGT (pT / CMVSV40-LGT) (figur 3c) eller en plasmid som kodar för en kort hårnål p53 med PDGFp och en GFP reporter (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) i kombination med NRAS (figur 3d). Djuren övervakades för bioluminescens dagen efter injektion (Figur 2a) och med jämna mellanrum tills den når den döende skede när de avlivades. Döende skede definieras som det kliniska stadiet när djuret blir symptomatisk visar nedsatt rörlighet, krökt kroppshållning, Josh päls och viktminskning. Ibland djur utvecklar kramper eller onormala rörelsemönster, som att gå i cirklar och plötslig hoppning. Vid slutet av experimentet djurs sövdes. Hjärnorna perfunderades, inbäddades i paraffin, och bearbetades för hematoxylin och eosinfärgning. Data visar tumörer visar kännetecken för human GBM (WHO grad IV) med blödningar (figur 3c), pseudo-pallisading nekros (Figur 3e) och perivaskulär och diffus invasion i hjärnparenkymet (figur 3g, f). Bildandet av pseudopallisades föregås av bristning i stora glomeruloid fartyg med läckande endotel (Figur 3i) som resulterar i regioner av blödning med massiv infiltration av mononukleära celler (Figur 3h). Atypiska mitoser (Figur 3j) och gigantiska multinukleära tumörceller (Figur 3k) är också patognomona av mänsklig GBM.

Glioblastom skapas med hjälp av Törnrosa transposaset systemet kan övervakas hela progression av tumörtillväxt med bioluminiscens, om plasmider injiceraskoda luciferas. Ett exempel experiment visas i figur 4a. Djur brukar duka av tumörbörda när luminiscens når en nivå på 10 7 -10 9 fotoner / s / cm2 / sr. Medianöverlevnaden för djur är förutsägbart beroende på kombinationerna av onkogena transposoner injicerade in i neonatal hjärna, såsom illustreras i kurvorna överlevnads presenteras i Figur 4b. Observera att de mest aggressiva tumörerna induceras med NRAS och SV40 LGT-antigen (medianöverlevnad på 30 dagar), medan medianöverlevnad på djur med GBM inducerade med shp53 NRAS och PDGF är 62,5 dagar och för djur injicerade med shp53 och NRAS 83 dagar.

De novo-bildade tumörer kan karakteriseras immuno-histokemiskt genom deras expression av molekyler som är karakteristiska för gliala tumörer. Figur 5 visar en begynnande tumör (22 dpi, bioluminiscens 2x10 5 fotoner / s / cm 2 / sr), inducerades med shp53och NRAS. Den injicerade shp53 plasmiden kodar för grönt fluorescerande protein (GFP) för att möjliggöra identifiering av transfekterade celler och deras avkomma (pT2 / shp53 / GFP). GFP + tumörceller uttrycker neurala stamceller markören nestin och vissa GFP + celler uttrycker också gliafibrillärt surt protein (GFAP). Figur 6 illustrerar en tumör från en döende djur på 56 dpi, tumör som också inducerades med shp53 / GFP och NRAS. Många GFAP + astrocyter som omger tumören. GFP + tumörceller uttrycker nestin, men inte GFAP.

En stor fördel när man använder denna teknik för att framkalla sandblästrat stål är förmågan att generera nya GBM cellinjer med unika genetiska förändringar med hjälp av transposoner injicerade. Dessutom kan anpassade cellinjer genereras med hjälp av transgena djur med specifika genetiska makeup. Dessa cellinjer är avgörande för att ställa många mekanistiska frågor med hjälp biokemiska analyser. De är idealiska för cytotoxicitetsstudier med romanen chemotherapeutic agenter. Figur 7 visar en neurosfär från en Törnrosa tumörinducerad med shp53, PDGF och NRAS, visar uttryck av GFP, som är kodad på en av de injicerade plasmider. Observera att uttrycket är inte lika intensiv i alla celler, vilket indikerar den heterogena karaktären av dessa primära GBM celler.

Figur 1
Figur 1: (a) Schematisk representation som illustrerar "klippa och klistra" mekanism som används av Sleeping Beauty transposas att integrera transposoner i värdens kromosomala DNA En givare transposon-plasmid avbildas med genen av intresse flankerad av inverterade upprepningar / direkta upprepningar. (IR / DR, röd pilrutorna) sekvenser. SB transposaset (grön) binder till IR / DR, punktskatter transposonen och reintegrates den i mellan slump TA dinukleotid baspar på värd kromosomalt DNA. (B) Exempel på kloningen gen av intresse (mPDGFβ) i ryggraden i en SB vektor (pKT-IRES-Katushka). SB vektorn innehåller två IR / DR upprepade sekvenser (röd) och en genexpressionskassett som inkluderar promotor och enhancersekvenser, en multipel kloningsställe (MCS, blå), interna ribosomala inträdesplatser (IRES), en fluorescerande reporter markör (Katushka: gul), och en polyadenilation webbplats (polyA). Den onkogenen av intresse (mPDGFβ; apelsin) ingår i en kloningsvektor pGEMT. Den onkogen, flankerad av specifika restriktionsställen (Ncol / SacI) släpps genom enzymatisk nedbrytning och trubbiga av avtrubbning enzymet. Vektorn linjäriseras och trubbiga också. Slutligen mPDGFβ onkogen insatt i donatorvektor med hjälp av en trubbig ände ligeringsreaktion att generera nya plasmiden transposonvektor:. PKT-mPDGFβ-IRES-Katushka Klicka här för att se en större version of denna figur.

Figur 2
Figur 2: Experimentell Setup och guider för intra kammar injektioner i neonatala möss (a) En stereotaktisk ram (2) med mikrometer rattar är utrustad med en automatisk injektor innehar en spruta 10 l (4). Inuti U ramen, är en neonatal adaptorram säkert fastsatta (3). Kontrollpanelen på den automatiska injektorn (1) möjliggör exakt val av sprutan, volym och flödeshastighet (b) Fotografera av en neonatal mus (P1) med en nål insatt på koordinaterna som krävs för injektioner i den laterala ventrikeln:. 1.5 mm ventrala och 0,8 mm lateralt till lambda. (c) Illustration av en koronalt snitt genom hjärnan på en neonatal mus (P1) belyser de relativa dimensioner och position kamrarna.


Figur 3: Tumörer inducerade med Törnrosa transposon systemet visar histologiska kännetecken human GBM (a) Bioluminescens bild av en neonatal valp 24 tim efter intraventrikulär injektion med plasmider som kodar NRAS, SV40 LGT (b) Bioluminescens bild av ett vuxet djur (. 50 dpi) med en stor tumör inducerad med shp53 NRAS och PDGF. (c) hematoxilin och eosin fläck av en koronala sektion från en hjärna av en döende mus med en tumör inducerad med NRAS och LGT (28 dpi). (d) Coronal avsnitt från en hjärna av en döende mus med en tumör framkallar med shp53 NRAS och PDGF. (e) Pseudopalisading nekros, histologiska kännetecken för human GBM observeras i de novo genererade tumörer. Pilen pekar på celler anordnade i palissader migrerar bort från det centrala området av nekros (N) (f) och (g) de novo genererade tumörer är mycket invasiva, visar invasion längs blodkärl (g) och diffusa (f) i normala hjärnparenkymet. (H) Region blödning med massiv invasion av mononukleära celler (pil), det inledande skedet av ett område med pseudopalisading nekros. (I) Stor glomeruloid kärl med läckande endotel (pil) till grund för diffuse blödning inuti en tumör inducerad med NRAS och SV40 -LgT. (j) Atypisk mitos i en tumörceller (pilspets). (k) Gigantisk tumörcell med flera stora kärnor (pilspets).

Figur 4
Figur 4: tumörbärande djur kan övervakas med mareld under hela sjukdomsförloppet. Medianöverlevnaden för djur som förutsagts av kombinationen avonkogent DNA injiceras. (A) Exempel på självlysande spår från en kohort av 7 C57 / BL6 möss. Observera att möss duka ungefär en vecka efter bioluminiscens når 10 8 fotoner / s / cm2 / sr. (B) Provöverlevnadskurvorna som jämför medianöverlevnad av djur med Törnrosa tumörer genererade med olika plasmid kombinationer. Medianöverlevnaden av tumörer inducerade med NRAS och SV40 LGT är 30 dpi medan djur med tumörer inducerade med shp53 NRAS och PDGF eller shp53 och NRAS är 62,5 dpi eller 83 dpi respektive. dpi: dagar efter injektionen.

Figur 5
Figur 5: Nascent makroskopisk GBM (22 dpi) induceras med shp53 och NRAS visar uttryck för nestin och GFAP i GFP + tumörceller (konfokala mikrofotografier) ​​Panel (a) visar en begynnande tumör uttrycker GFP.. Panel (b) representerar samma fält visar nestin uttryck. Panel (a) och (b) illustrerar samlokalisering av nestin och GFP. (D) GFP-uttryck i tumörceller. (E) GFAP-expression i vissa tumörceller och i celler som omger den begynnande tumör. (F) överlagring projektion av (d) och (e) illustrerar vissa tumörceller (vita) samuttrycker GFAP och GFP. Skala barer i (a) och (d) representerar 75 pm.

Figur 6
Figur 6: GBM inducerad med shp53, NRAS och PDGF från en döende djur (56 dpi) visar GFP och nestin uttryck i tumörceller och riklig färgning för den mogna gliaceller markör GFAP omger tumören Panel (a) representerar Nissl fläck av acoronal avsnitt. genom hjärnan av en döende djur med en tumör (intensiv blå färgning from ökade cellularitet) induceras med Törnrosa transposon system med shp53, PDGFp och NRAS. Panel (b), en koronalt intilliggande sektion till en illustrerad i panel (a) färgades med nukleär färgning DAPI, visande uttryck av GFP i tumörceller. Panel (c) representerar en konfokal mikroskop av tumören gränsen visar GFP uttryck i tumören, som identifierats av den höga kärntäthet med DAPI. Panel (d) visar samma synfält som i (a), visar intensiv GFAP uttryck i celler intill tumören. Panel (e) representerar den överlagring av paneler (c) och (d). Panel (f) är en konfokal mikroskopbild av tumören gränsen, som visar GFP-uttryck i tumörceller. Panel (g) representerar samma synfält som i (f), som visar uttryck av nestin i tumörceller. Panel (h) är overlay projektionen av paneler (f) och (g)

Figur 7
Figur 7: Neuro från en Törnrosa tumörinducerad med shp53, PDGF och NRAS efter 5 dagar i kultur, Panel (a) är passage 2. Cellerna uttrycker GFP kodas på shp53 PDGF plasmiden (pT2shp53 / GFP4 / mPDGF β). en ljusfältsmikrofotografi av en neurosfär. Panel (b) representerar en epi-fluorescensmikrofoto av samma vy som i (a) visar uttryck av GFP i de neurosfärceller. Panel (c) representerar den överlagring av paneler (a) och (b).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I den här artikeln, vi detalj en mångsidig och reproducerbar metod för att generera nya modeller av GBM använder SB transposase- medierad integrering av onkogen plasmid DNA i celler som omger subventrikulära zon neonatala möss. Vi presenterar ett protokoll för att generera transposonmutanter plasmider med nya gener av intresse, visar hur man kan övervaka utvecklingen av tumörerna med levande djur, och hur man karakterisera Histo-patologisk och immun histokemisk funktioner i dessa tumörer.

Som vårt labb (Figur 3) och övriga 13 har visat, denna modell skapar ett tillförlitligt tumörer med de framträdande egenskaperna hos human GBM inklusive (1) pseudo-palisading nekros, (2) vaskulär proliferation, (3) kärn atypia, (4) onormala mitoser och ( 5) perivaskulär och diffus invasion. Användningen av neonatal möss är optimalt ur ett logistiskt perspektiv, vilket ger en relativt lätt tekniskt förfarande med minimal utrustning och semendation / återhämtningstid, vilket möjliggör snabb generering av stora provstorlekar av tumörer med specifika genetiska förändringar. Dessa tumörer orsakar djuren att ge efter för tumörbörda med en förutsägbar medianöverlevnad beroende av de genetiska förändringar som induceras. Slutligen har SB-modellen använts som terapeutisk intervention skärm för behandlingssvar 24.

Det finns flera viktiga faktorer att tänka på när förbereder de lösningar som använts för neonatal injektioner. DNA-lösningar måste vara sterila, endotoxinfritt och koncentrerades (2-7 ug / ul) för att möjliggöra minimal volym av injektioner. Det optimala förhållandet mellan kväverester i polyetylenimin (PEI) till de fosfatrester i DNA (N / P-förhållande) är 7. Detta säkerställer bildningen av positivt laddade partikelkomplex som kommer att binda anjoniska delarna på cellytor och kommer att endocytoseras. Väl i cytoplasman, kommer osmotiska inflöde få partiklarna att brista och släppa encapsulatEd plasmid-DNA. Den in vivo-jet-PEI-lösningen har en koncentration av 150 mM uttryckt som kväverester. Med tanke på att en ug DNA har 3 nmol av anjoniska fosfat, mängden transfektionsreagens behövs kan beräknas med formeln:

l av in vivo jet-PEI = [(ig DNA x 3) x N / P kvoten] / 150.

Till exempel, för att framställa 40 pl av 0,5 ug / ul DNA-lösning med en N / P-förhållande av 7, 20 ^ g DNA behövs. Volymen av PEI som krävs kommer att vara 20 * 3 * 7/150 = 2,8 pl.

Upp till fem olika plasmider kan injiceras samtidigt. Experiment som presenteras häri leverera Törnrosa transposaset i träns på en plasmid som också kodar luciferas (SBLuc). Som nämndes i inledningen, är det viktigt att förhållandet mellan transposas molekyler till transposoner att säkerställa en optimal införlivande. Den optimala förhållandet (empiriskt etablerat) i SB100x plasmiden till transposon DNA-plasmid är en: 4. Därför, om man använder två olika transposonmutanter plasmider, T1 och T2 till exempel, är förhållandet mellan SBLuc: T1: T2 blir en: 2: 2; eller för totalt 20 | ig DNA i en 40 pl lösning 4 pg av SBLuc kommer att blandas med 8 pg av T1 och 8 pg av T2. För tre olika transposon plasmider förhållandet blir SBLuc: T1: T2: T3 = 1: 1.33: 1.33: 1.33 och fyra transposoner: 1: 1: 1: 1: 1.

Det är användbart för att kontrollera upptaget av plasmid-DNA genom bioluminescens 24-72 h efter injektion. Som djuren växer, den ökade optiska densiteten för päls, hud, skalle och hjärna, förhindrar övervakning av tumörprogression tills tumören har nått en tröskelstorlek, ungefär 1-2 mm 3 för mörkt pigmente C57BL6 möss. Bättre överföring av ljuset är möjligt i dessa möss om deras päls är rakat, eller vid användning av möss med vitt eller ingen päls.

Flera begränsningar måste beaktas vid användning av denna modell. Först, genentic material introduceras med de injicerade plasmider kan integreras slumpvis i värdgenomet på olika platser och antal kopior. Detta kan leda till variationer mellan tumörceller och mellan tumörer. För det andra, är det DNA introduceras insatt främst i introniska TA upprepade sekvenser DNA 25 förblir emellertid risken för störningar med kodnings värd iskt DNA. Tredje, intraventrikulära injektioner kan orsaka en liten men ihållande hastighet av hydrocefalus hos unga möss, som blir kliniskt synliga och symtomatisk i 3: e-4: e levnadsveckan. Vissa stammar av möss är mer benägna att hydrocefalus än andra (dvs, C57 / BL6 mer än FVB). För att minimera risken för att inducera hydrocefalus, rekommenderas att injicera en så liten volym som möjligt (mindre än 1 pl i C57 / BL6 möss), för att se till att nålarna är vassa, lösningarna har låg salthalt och ge växande valpar med berikad mat, i syfte att möjliggöra snabb benbildning av skallen bones. Slutligen tumörer sen fas utvecklar ofta nekros, vilket måste beaktas vid övervakning möss genom bioluminiscens. En lägre avläsning kan indikera en avancerad tumör med stora områden av nekros och inte nödvändigtvis en upplösning av tumören som en följd av behandling. Ytterst förblir histologisk analys den gyllene standarden för att bedöma tumörprogression.

Tillkomsten av tumör hela genom sekvense under de senaste åren har öppnat dörren för utforskning av den roll som återkommande muterade gener i GBM. Törnrosa-modellen är optimal för att validera potentiella onkogener eller tumörsuppressorer. Som i exemplet i detta papper med PDGFp ligand, kloning mus cDNA-sekvensen för en kandidat onkogen till en etablerad SB plasmidryggrad kommer att leda till konstitutivt uttryck inom transfekterade celler. Utvärdering av den roll som tumörsuppressorer kan effektivt utföras genom kloning in i ryggraden i SB plasmiden med kandidatsekvenser, (envailable exempelvis i RNAi Codex-databasen 26), för att skapa ett effektivt uttryck av andra generationens mir kort hårnålar.

En aktuell debatt inom GBM forskningen är relaterad till identiteten på den cell-of ursprung. Det har nyligen visats att i möss, tumörer som induceras av nedreglering p53 och NF1 i neurala stamceller, kommer från oligodendrocyt prekursorceller 27. Använda Törnrosa transposon modell, kan liknande studier utformas för att testa om andra genetiska förändringar företrädesvis rikta andra populationer av stamceller / prekursorceller att generera sandblästrat stål. Kunskap från sådana studier kommer att betydligt öka vår förståelse av GBM etiologi och ge möjligheter för nya behandlingsmetoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors Stoelting 51670 Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable 
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) Stoelting 53311 Injections can be made without it, ,but    the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience
10 μl 700 series hand fitted MICROLITER syringe Hamilton Model 701 This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used
30 gauge hypodermic needle
(1.25", 15o bevel) 
Hamilton S/O# 197462 This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced.
in vivo-jetPEI Polyplus Transfection 201-10G Aliquot in small volumes and keep at -20 oC 
D-Luciferin, Potassium Salt Goldbio.com LuckK-1g Other sources of firefly lucifierase are just as adequate
Hematoxylin Solution, Harris Modified Sigma Aldrich HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound Electron Microscopy Sciences 62550-01 For embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry
Advanced DMEM/F-12, no glutamine Life Technologies 12634-010 For the culture of neurospheres
B-27¨ Supplement (50X), serum free  Life Technologies 17504-044 Serum free supplement for the culture of neurospheres
N2 Supplement (100x) Life Technologies 17502-048 Serum free supplement for the culture of neurospheres
Normocyn InvivoGen ant-nr-1 Anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres
Recombinant Human EGF PEPROTECH AF-100-15 Growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Recombinant Human FGF-basic PEPROTECH 100-18B Growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Name Company Catalog Number Comments
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent  Thermo Scientific SV3003001 For the dissociation of neurospheres
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle Fisher Scientific K749510-0590 For the dissociation of freshly dissected tumors
Falcon Cell Strainers mesh size 70 um Fisher Scientific 08-771-2 For generating single cell suspensions of dissociated neurospheres
Xylenes Histological grade Fisher Scientific C8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified) Fisher Scientific 245-678
Protocol Eosyn Y Solution (intensified) Fisher Scientific 314-631

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet. Neuro Oncol. 15, (1), 4-27 (2013).
  2. Dai, C., Holland, E. C. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 1551, (1), M19-M27 (2001).
  3. Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model. Eur J Cancer Clin Oncol. 19, (6), 799-805 (1983).
  4. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (12), 6242-6244 (2000).
  5. Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. J Neurooncol. 85, (2), 133-148 (2007).
  6. Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59, (8), 1155-1168 (2011).
  7. Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study. J Neurosurg. 85, (6), 1078-1084 (1996).
  8. Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology. Translational Oncology. 2, (2), 89-95 (2009).
  9. Friedmann-Morvinski, D., et al. Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice. Science. 338, (6110), 1080-1084 (2012).
  10. Lynes, J., et al. Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. (2014).
  11. Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus. Cancer Res. 58, (23), 5275-5279 (1998).
  12. Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, (1), 110-116 (2009).
  13. Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, (2), 431-439 (2009).
  14. Bailey, O. T. Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas. Pediatr Neurosci. 12, (4-5), 261-265 (1985).
  15. Patel, A. P., et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science. 344, (6190), 1396-1401 (2014).
  16. Agnihotri, S., et al. Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61, (1), 25-41 (2013).
  17. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455, (7216), 1061-1068 (2008).
  18. Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (10), 5008-5013 (1996).
  19. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91, (4), 501-510 (1997).
  20. Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression. Adv Genet. 54, 189-232 (2005).
  21. Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. The Sleeping Beauty transposon toolbox. Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).
  22. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41, (6), 753-761 (2009).
  23. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (44), E2998-E3007 (2012).
  24. Fujita, M., et al. COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells. Cancer Research. 71, (7), 2664-2674 (2011).
  25. Geurts, A. M., et al. Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system. Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8, (1), 108-117 (2003).
  26. Dickins, R. A., et al. Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors. Nat Genet. 37, (11), 1289-1295 (2005).
  27. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, (2), 209-221 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics