बैक्टीरिया, कीट कोशिकाओं और संयंत्र सिस्टम: पुनः संयोजक प्रोटीन विभिन्न Biofactories में अभिव्यक्ति का एक तुलनात्मक विश्लेषण

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Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. J. Vis. Exp. (97), e52459, doi:10.3791/52459 (2015).

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Abstract

संयंत्र आधारित प्रणाली उच्च गुणवत्ता, बायोएक्टिव उत्पादों की लचीली, कम लागत पर उत्पादन के लिए उनकी अच्छी तरह से प्रलेखित क्षमता का एक परिणाम के रूप में पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक मूल्यवान मंच माना जाता है।

इस अध्ययन में, हम क्षणिक और स्थिर दोनों संयंत्र आधारित अभिव्यक्ति प्रणाली, के साथ परंपरागत किण्वक आधारित सेल संस्कृतियों (बैक्टीरियल और कीट) में एक लक्ष्य मानव पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति की तुलना में।

प्रत्येक मंच के लिए, हम सेट अप, अनुकूलन और उत्पादन प्रक्रिया की लंबाई, अंतिम उत्पाद की गुणवत्ता और पैदावार में वर्णित है और हम चयनित लक्ष्य पुनः संयोजक प्रोटीन के लिए विशिष्ट अनंतिम उत्पादन लागत, मूल्यांकन किया है।

कुल मिलाकर, हमारे परिणाम बैक्टीरिया की वजह से अघुलनशील शामिल किए जाने के शरीर के भीतर अपनी संचय करने के लिए लक्ष्य प्रोटीन के उत्पादन के लिए अनुपयुक्त हैं कि संकेत मिलता है। दूसरी ओर, संयंत्र आधारित प्रणालियों बहुमुखी प्लेटफार्मों टी रहे हैंटोपी baculovirus / कीट सेल प्रणाली की तुलना में कम-लागत पर चयनित प्रोटीन के उत्पादन की अनुमति देते हैं। विशेष रूप से, स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों अंतिम उत्पाद के उच्चतम उपज और क्षणिक व्यक्त पौधों सबसे तेजी से विकास की प्रक्रिया का प्रदर्शन किया। लेकिन, नहीं सभी पुनः संयोजक प्रोटीन संयंत्र आधारित प्रणालियों से लाभ हो सकता है, लेकिन यहाँ वर्णित के रूप में सबसे अच्छा उत्पादन मंच, एक मामले दर मामले के दृष्टिकोण के साथ अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए।

Protocol

अभिव्यक्ति वैक्टर 1. निर्माण

  1. वाणिज्यिक पुनर्संयोजन क्लोनिंग प्रणाली:
    1. पहले से दो वर्णित के रूप में उपयुक्त प्राइमरों जीन की 5'-अंत में एक CACC दबाना के अलावा अनुमति के साथ लक्ष्य जीन (hGAD65mut) की पूरी लंबाई अनुक्रम बढ़ाना।
    2. एक दाढ़ अनुपात डालने: वेक्टर और एक μl के एक 1.5 का उपयोग करते हुए, 6 μl की कुल मात्रा में प्रतिक्रिया कोडांतरण द्वारा प्रविष्टि सदिश (topoisomerase बाध्य) में, दिशात्मक क्लोनिंग किट विनिर्देशों के अनुसार, जेल शुद्ध प्रवर्धन उत्पाद क्लोन नमक समाधान (0.01 2 MgCl 0.2 एम NaCl और)। कमरे के तापमान पर 5 मिनट (आरटी) के लिए सेते हैं।
    3. रासायनिक सक्षम में पूरे प्रतिक्रिया बदाल कॉलोनी पीसीआर 3 से दिशात्मक क्लोनिंग किट विनिर्देशों और स्क्रीन प्राप्त कालोनियों आगे M13 उपयोग करने और प्राइमरों रिवर्स के अनुसार कोलाई कोशिकाओं दिशात्मक क्लोनिंग किट में शामिल थे। एक PO से प्लाज्मिड पृथकम्यूटेशन 3 के अभाव सुनिश्चित करने के लिए प्राइमरों आगे M13 उपयोग करने और रिवर्स प्लास्मिड डीएनए तैयारी किट विनिर्देशों और अनुक्रम डालने के अनुसार sitive कॉलोनी।
    4. विशिष्ट गंतव्य वैक्टर के साथ लैम्ब्डा recombinase Clonase द्वितीय एंजाइम (एलआर) द्वारा पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया प्रदर्शन करने के लिए प्राप्त की प्रविष्टि क्लोन का उपयोग करें: pDEST17 (pDEST17.G65mut उपज) के साथ बैक्टीरियल कोशिकाओं में पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए, pK7WG2 साथ (क्षणिक या स्थिर) पौधों में 4 (Baculo.G65mut उपज) linearized वायरल डीएनए के साथ baculovirus / कीट सेल प्रणाली में, (pK7WG2.G65mut उपज)। प्रविष्टि वेक्टर के 100 एनजी, गंतव्य वेक्टर के 150 एनजी और 10 μl के अंतिम मात्रा में एंजाइम मिश्रण के 2 μl के साथ, clonase किट विनिर्देशों के अनुसार, प्रतिक्रिया इकट्ठा। 1 घंटे के लिए आरटी पर मिश्रण सेते हैं।
    5. रासायनिक सक्षम में पुनर्संयोजन उत्पाद रूपांतरण clonase किट विनिर्देशों के अनुसार कोलाई कोशिकाओं। पीसीआर 3 करके स्क्रीन प्राप्त कालोनियों
    6. एक वाणिज्यिक minipreparation डीएनए किट का उपयोग प्लास्मिड डीएनए को अलग और पिछले चरण में वर्णित एक ही विशिष्ट प्राइमर संयोजन का उपयोग, पीसीआर 3 से लक्ष्य अनुक्रम की उपस्थिति की पुष्टि।
    7. निम्न चरणों में वर्णित के रूप में पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए चुना मंच पर निर्भर करता है, अलग लक्ष्य जीवों को बदलने के लिए प्राप्त पीसीआर पॉजिटिव प्लास्मिड का प्रयोग करें।
  2. MagnICON प्रणाली 5-7:
    1. पहले से pICH31070.G65mut उपज विस्तार से 7 में वर्णित के रूप में, 3'-मॉड्यूल pICH31070 में लक्ष्य जीन क्लोन। यूज़विशिष्ट प्रतिक्रिया चक्र निम्नलिखित: 80 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस, 50 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट पर 30 मिनट के ऊष्मायन और फिर 5 मिनट।

2. पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. बैक्टीरिया कोशिका प्रणाली:
    1. में pDEST17.G65mut रूपांतरण कोली BL21 (DE3) निम्न transgene विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर कॉलोनी पीसीआर द्वारा एम्पीसिलीन युक्त (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) पर हो मानक तकनीक और स्क्रीन कालोनियों लेग-मध्यम, का उपयोग कर electrocompetent कोशिकाओं: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'और 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', 58 डिग्री सेल्सियस के एक annealing तापमान और 20 सेकंड का एक बढ़ाव समय के साथ। ट्यूब में एक प्लास्टिक की टिप के साथ बैक्टीरियल कोशिकाओं को भंग करने के बाद 20 μl की कुल मात्रा में पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए बाहर ले।
    2. एम्पीसिलीन युक्त (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) के 3 मिलीलीटर लेग-मध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक ही कॉलोनी टीका लगाना।
    3. जीवाणु संस्कृति एक पतला: ताजा लेग माध्यम की 100 100 एमएल (सहित ampicillऔर) में अंतिम ओवर ड्राफ्ट 0.8 से 600 तक 1-6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में isopropil-β-डी-1-tiogalattopiranoside (IPTG) के अलावा द्वारा पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित और जोरदार 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए झटकों के साथ संस्कृति सेते हैं।
    5. 20 मिनट के लिए 4000 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा और प्रोटीन निष्कर्षण (कदम 3.1.1.1) के लिए बैक्टीरिया गोली का उपयोग करें।
  2. Baculovirus / कीट सेल प्रणाली:
    1. बीज स्पोडोप्टेरा frugiperda (Sf9) 6 अच्छी तरह प्लेटों में कोशिकाओं (अच्छी तरह से प्रति 8 x 10 5 कोशिकाओं) और गैर-पूरक अनुग्रह कीट मध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ दो बार धो लें।
    2. मध्यम बूंद-वार अभिकर्मक मिश्रण (5 μl एलआर पुनः संयोजक प्रतिक्रिया, 6 μl Celfectin समाधान और 200 μl गैर पूरक अनुग्रह कीट मध्यम) के साथ निकालें और जगह।
    3. 5 घंटे के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
    4. निकालें और ताजा SF-9 के 2 मिलीलीटर के साथ अभिकर्मक मिश्रण की जगह10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / gentamycin और 100 माइक्रोन ganciclovir के साथ पूरक 00 मध्यम, पुनः संयोजक baculovirus क्लोन चयन करने के लिए।
    5. 27 डिग्री सेल्सियस पर 96 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में कोशिकाओं और बड़े मलबे और दुकान को हटाने के लिए 4000 XG पर मध्यम (v1 वायरल शेयर), अपकेंद्रित्र इकट्ठा।
    6. बीज प्रति 1 एक्स 10 6 Sf9 कोशिकाओं कुएं में 2.5 मिलीलीटर एस एफ 900 मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / gentamycin और 100 माइक्रोन ganciclovir युक्त और अच्छी तरह से हर में V1 के शेयर के 100 μl के साथ संक्रमित।
    7. 27 डिग्री सेल्सियस पर तीन दिनों के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    8. लीजिए और सेंट्रीफ्यूज मध्यम 4000 x जी पर।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला (V2 के उच्च अनुमापांक शेयर) की दुकान।
    10. बीज प्रति 1 एक्स 10 6 Sf9 कोशिकाओं कुएं में 2.5 मिलीलीटर एस एफ 900 मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / gentamycin और 100 माइक्रोन ganciclovir युक्त और अच्छी तरह से हर में V2 के शेयर के 25 μl के साथ संक्रमित।
    11. 27 डिग्री सेल्सियस पर तीन दिनों के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    12. 4000 XG पर अपकेंद्रित्र से कोशिकाओं को इकट्ठा और प्रोटीन निष्कर्षण (कदम 3.1.2। 1) के लिए कीट सेल गोली का उपयोग करें।
  3. निकोटियाना benthamiana क्षणिक अभिव्यक्ति सिस्टम:
    1. एन बढ़ो तापमान रेंज 18-23 डिग्री सेल्सियस के भीतर प्राकृतिक प्रकाश के तहत एक ग्रीन हाउस में benthamiana पौधों। Agroinfection के लिए 4-5 सप्ताह पुराने पौधों का उपयोग करें।
    2. एक 13 घंटा दिन / 11 घंटा रात photoperiod के साथ 22 डिग्री सेल्सियस पर एक जलवायु चैम्बर में agroinfected पौधों रखें।
    3. वाणिज्यिक पुनर्संयोजन क्लोनिंग प्रणाली:
      1. एग्रोबैक्टीरियम तनाव EHA105 electrocompetent कोशिकाओं tumefaciens में पहले से 8 के रूप में वर्णित pK7WG2.G65mut परिचय और 2 के बाद लेग मध्यम युक्त रिफाम्पिसिन (50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (300 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) और spectinomycin (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) पर हो कालोनियों स्क्रीन निम्नलिखित transgene विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर कॉलोनी पीसीआर 8 से 28 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के दिन: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; और 58 डिग्री सेल्सियस के एक annealing तापमान और 50 सेकंड का एक बढ़ाव समय के साथ 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ',। 20 μl की कुल मात्रा में पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए बाहर ले।
      2. 28 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए लेग मध्यम युक्त रिफाम्पिसिन (50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (300 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) और spectinomycin (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) के 30 मिलीलीटर में बैक्टीरिया टीका लगाना।
      3. घुसपैठ बफर के 10 एमएल में 20 मिनट और resuspend गोली (10 मिमी एमईएस, 10 मिमी 2 MgCl, 100 माइक्रोन acetosyringone, पीएच 5.6) के लिए 4000 XG पर centrifugation द्वारा बैक्टीरिया ले लीजिए। आयुध डिपो के 600 मूल्य उपाय और फिर एक ही बफर में गिराए द्वारा 0.9 करने के लिए इसे समायोजित करें।
        नोट: तीन एन घुसपैठ के लिए आवश्यक कुल मात्रा benthamiana संयंत्रों 30 मिलीलीटर है।
      4. एन में एग्रोबैक्टीरियम निलंबन घुसपैठ करने के लिए एक 2.5 मिलीलीटर needleless सिरिंज का प्रयोग करें benthamiana छोड़ देता है। ध्यान से और धीरे धीरे सिरिंज से निलंबन के साथ पत्ती पैनलों इंजेक्षन। तीन विस्तारित एल घुसपैठसंयंत्र प्रति ओरी और triplicates के रूप में तीन पौधों का उपयोग करें।
        नोट: स्वास्थ्य और सुरक्षा कारणों से घुसपैठ की प्रक्रिया के दौरान नेत्र सुरक्षा पहनने के लिए।
      5. तरल नाइट्रोजन में agroinfiltrated पत्तियों दो दिनों के बाद संक्रमण (डीपीआई) और फ्रीज लीजिए। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्लान्ट टिशू।
    4. MagnICON सिस्टम:
      1. 5 'मॉड्यूल (pICH20111), 3' मॉड्यूल (pICH31070.G65mut), और इंटिग्रेस मॉड्यूल (pICH14011) - - में MagnICON वैक्टर का परिचय मानक तकनीक का उपयोग कर GV3101 तनाव tumefaciens। युक्त लेग मध्यम पर हो कालोनियों, स्क्रीन 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / रिफाम्पिसिन और प्रत्येक वेक्टर के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कॉलोनी पीसीआर द्वारा उचित वेक्टर विशिष्ट एंटीबायोटिक (pICH20111 और pICH14011, 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / केनामाइसिन pICH31070 के लिए के लिए 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / कार्बेनिसिलिन),।
      2. अलग-अलग तीन टीका लगाना tumefaciens युक्त लेग मध्यम के 5 मिलीलीटर में उपभेदों 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / रिफाम्पिसिन और उपयुक्त वेक्टर विशिष्ट एंटीबायोटिकऔर 28 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात हिला।
      3. गोली रातोंरात बैक्टीरियल 20 मिनट के लिए 4000 XG पर centrifugation द्वारा संस्कृतियों और 10 मिमी एमईएस (5.5 पीएच) और 10 मिमी MgSO 4 की प्रारंभिक जीवाणु संस्कृति के दो संस्करणों में उन्हें resuspend।
      4. तीन वैक्टर युक्त जीवाणु निलंबन की बराबर मात्रा मिलाई और एन की सिरिंज घुसपैठ के लिए निलंबन मिश्रण का उपयोग benthamiana छोड़ देता है। संयंत्र में प्रति तीन विस्तारित पत्ते घुसपैठ।
      5. 4 डीपीआई पर agroinfiltrated पत्ते लीजिए और तरल नाइट्रोजन में फ्रीज।
      6. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्लान्ट टिशू।
  4. निकोटियाना tabacum स्थिर अभिव्यक्ति प्रणाली:
    1. आगे बढ़ें और एन के इन विट्रो पौधे बनाए रखने के ठोस संयंत्र संस्कृति के माध्यम पर tabacum (वर SR1।) (4.4 ग्राम / एल Murashige और Skoog - एमएस - मध्यम विटामिन, 30 ग्राम / एल सुक्रोज, पीएच 5.8, 7 ग्राम / एल संयंत्र अगर सहित) 25 में जलवायु चैम्बर में नियंत्रित परिस्थितियों 16 घंटा / 8 घंटा दिन / नी के साथ डिग्री सेल्सियसght शासन।
    2. के एक पूर्व संस्कृति प्रारंभ tumefaciens EHA105 (100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / spectinomycin, 300 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन, रिफाम्पिसिन 50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ तरल YEB मध्यम के 5 मिलीलीटर में अभिव्यक्ति वेक्टर pK7WG2.G65mut को शरण देने और एक कक्षीय प्रकार के बरतन सेट में 28 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बढ़ने 200 rpm पर।
    3. जीवाणु संस्कृति है, जब तक (100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / spectinomycin, 300 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन, रिफाम्पिसिन 50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) YEB मध्यम प्लस एंटीबायोटिक दवाओं में एक 50 मिलीलीटर एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति टीका लगाना और 24 घंटे के लिए विकसित करने के लिए प्री-संस्कृति के 1 मिलीलीटर का प्रयोग करें संतृप्त (आयुध डिपो 0.5-1.0 के 600 मूल्य)।
    4. तरल संयंत्र संस्कृति के माध्यम से 50 मिलीलीटर में 20 मिनट और resuspend गोली के लिए 4000 XG पर centrifugation द्वारा बैक्टीरिया ले लीजिए। पूरी तरह से एंटीबायोटिक दवाओं को दूर करने के लिए दो बार इस चरण को दोहराएँ।
    5. इन विट्रो तंबाकू के पौधों से पहले स्वस्थ पूरी तरह से विस्तार पत्ते ले लो और लगभग 1 सेमी वर्ग में उन्हें काटा।
    6. स्थानांतरण पत्ता टुकड़ेगहरी पेट्री डिश के लिए जीवाणु निलंबन युक्त और 20 मिनट के लिए अंधेरे में छोड़ दें।
    7. निलंबन से पत्ता टुकड़े निकालें और बाँझ फिल्टर पेपर पर शुष्क दाग।
    8. 1.0 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / 6-benzylaminopurine (सी.डी.) और 0.1 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / नेफ़थलीन एसिटिक एसिड (NAA) युक्त ठोस संयंत्र संस्कृति के माध्यम पर adaxial पक्ष के साथ पत्ती टुकड़े (ऊपरी पत्ती की सतह) प्लेस और नियंत्रित पर एक जलवायु चैम्बर में दो दिनों के लिए प्लेटें सेते शर्तों (25 डिग्री सेल्सियस, 16 घंटा दिन / 8 घंटा रात)।
    9. मध्यम के साथ संपर्क में abaxial सतह (पत्ती की निचली सतह) के साथ (1.0 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / सी.डी., 0.1 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / NAA, 500 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / cefotaxime, 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / केनामाइसिन सहित) ठोस संस्कृति माध्यम पर स्थानांतरण पत्ता टुकड़े।
    10. शूटिंग के गठन को प्रेरित करने के लिए 16 घंटा / 8 घंटा दिन / रात के शासन के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर जलवायु चैम्बर में 2-3 सप्ताह के लिए प्लेटें सेते हैं। उपसंस्कृति 1.0 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / सी.डी., 0.1 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / NAA, 500 युक्त ताजा ठोस संयंत्र संस्कृति के माध्यम से पत्ती explants स्थानांतरित द्वारा हर 2 सप्ताहमाइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / cefotaxime और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / केनामाइसिन।
    11. गोली मारता है 500 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / cefotaxime और जड़ गठन को प्रेरित करने के लिए 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / केनामाइसिन सहित ठोस संस्कृति के माध्यम से युक्त मैजेंटा बक्से के लिए उन्हें स्थानांतरित दिखाई देते हैं। 1-2 सप्ताह के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटा दिन / 8 घंटा रात photoperiod के साथ पौधे सेते हैं।
    12. जब जड़ों फार्म, ग्रीन हाउस में मिट्टी में पौधों हस्तांतरण।
    13. प्रत्येक संयंत्र के लिए एक पत्ता टुकड़ा लीजिए और एक व्यावसायिक किट के साथ जीनोमिक डीएनए अलग।
    14. विशिष्ट पीसीआर द्वारा transgene की उपस्थिति का पता लगाने। निम्नलिखित transgene विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करते हुए पीसीआर प्रवर्धन के लिए टेम्पलेट के रूप में जीनोमिक डीएनए के 30 एनजी का उपयोग करें: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'और 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', 58 डिग्री सेल्सियस के एक annealing तापमान और 20 सेकंड का एक बढ़ाव समय के साथ । 50 μl की कुल मात्रा में पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए बाहर ले।
    15. Tris- एसीटेट EDTA (TAE) बफर में 1% agarose जेल (40 मिमी tr पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा 220 बीपी उत्पाद का विश्लेषण करें) है, 20 मिमी एसिटिक एसिड, और 1 मिमी EDTA।
    16. लक्ष्य जीन से युक्त ट्रांसजेनिक पौधों का चयन करें।
    17. चयनित ट्रांसजेनिक संयंत्र से प्रत्येक से एक पत्ता टुकड़ा लीजिए और तुरंत तरल नाइट्रोजन में फ्रीज।
    18. संयंत्र पत्ता ऊतक (कदम 3.1.3) से कुल प्रोटीन के अर्क तैयार है और पहले से सबसे अच्छा पुनः संयोजक प्रोटीन व्यक्त तंबाकू के पौधे को चुनने के लिए दो वर्णित के रूप में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा प्रत्येक नमूने का परीक्षण करें।
    19. पार-परागण को रोकने के लिए खिलने से पहले चयनित अच्छा प्रदर्शन संयंत्र का थैला फूल।
    20. , खिल फल पकने और बीज सूखने के बाद, बैग ले लीजिए।
    21. फूस से अलग बीज और नियंत्रित तापमान (20-24 डिग्री सेल्सियस) पर एक सूखी कमरे में उन्हें दुकान।
    22. दूसरी पीढ़ी के ट्रांसजेनिक पौधों का उत्पादन और बाद में स्वयं परागण होने के लिए सबसे अच्छा प्रदर्शन संयंत्र का चयन करने के सूखे बीज बोना।
    23. बाद की पीढ़ियों के लिए 2.4.19-2.4.21 चरणों में वर्णित एक ही प्रक्रिया दोहराएँ।

    3. पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण

    1. कुल प्रोटीन निष्कर्षण:
      1. बैक्टीरियल कोशिकाओं:
        1. Tris बफर खारा के आधे संस्कृति मात्रा में, कदम 2.1.5 में वर्णित के रूप में एकत्र बैक्टीरियल सेल गोली, Resuspend (टीबीएस - 2 मिमी Tris / एचसीएल, 500 मिमी NaCl) 1 मिमी phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) के साथ पूरक 7.4 पीएच।
        2. बर्फ पर नमूना रखते हुए sonicate, आधा सत्ता पर 40 सेकंड के लिए सेल गोली तीन बार resuspended।
        3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 14,000 XG पर centrifugation द्वारा lysate स्पष्ट करें।
        4. स्थानांतरण एक स्वच्छ ट्यूब करने के लिए सतह पर तैरनेवाला और -80 डिग्री सेल्सियस पर अलग से सतह पर तैरनेवाला और गोली दोनों दुकान।
        5. जोरदार कमरे के तापमान पर रातोंरात झटकों से 6 एम यूरिया के साथ पूरक टीबीएस 8.0 पीएच के आधे सेलुलर lysate मात्रा में, गोली में एकत्र शामिल किए जाने निकायों, solubilize।
        6. कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र और एक स्वच्छ में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठाटूबे।
        7. -80 डिग्री सेल्सियस पर दोनों सतह पर तैरनेवाला और गोली स्टोर।
      2. कीट कोशिकाओं:
        1. (- 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 HPO 4, 1.8 मिमी के.एच. 2 पीओ 4 पीबीएस) 7.4 पीएच फॉस्फेट बफर खारा के 1 मिलीलीटर के साथ, कदम 2.2.12 में वर्णित के रूप में एकत्र संक्रमित कीट सेल गोली, धो लें।
        2. Lysis बफर के 200 μl में Resuspend कोशिकाओं (20 मिमी Tris / एचसीएल पीएच 8.0, 0.5 एम NaCl, 3 मिमी β-mercaptoethanol और 1% बीच 20) और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
        3. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 14,000 XG पर कोशिकाओं solubilized।
        4. -80 डिग्री सेल्सियस पर घुलनशील भिन्न और दुकान लीजिए और गोली त्यागें।
      3. संयंत्र पत्ता ऊतक:
        1. पीस एन benthamiana या एन मोर्टार और मूसल का उपयोग करते हुए तरल नाइट्रोजन में ठीक पाउडर के लिए tabacum ऊतक।
        2. निष्कर्षण बफर के 300 μl में जमीन ऊतक के 100 मिलीग्राम homogenize (40 मिमी Hepes पीएच 7.9, 5 मिमी डीटीटी, 1.5% CHAPS), supplप्रोटीज अवरोध करनेवाला कॉकटेल के 3 μl साथ emented और बर्फ पर पिघलना।
          नोट: संयंत्र के ऊतकों वजन (छ) के बीच चयनित अनुपात मात्रा (एमएल) है एक बफर करने के लिए: 3।
        3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 30,000 XG पर अपकेंद्रित्र निकाल सकते हैं।
        4. -80 डिग्री सेल्सियस पर एक साफ ट्यूब और दुकान में सतह पर तैरनेवाला लीजिए।
    2. Coomassie जेल धुंधला:
      1. निष्कर्षण बफर के 10 μl के अंतिम मात्रा के लिए कुल प्रोटीन के अर्क (जैसे, संयंत्र निकालने के 2 μl, बैक्टीरियल और कीट के अर्क के 5 μl) का एक उपयुक्त कमजोर पड़ने को तैयार है और 3x नमूना बफर के 5 μl जोड़ने (1.5 एम Tris / एचसीएल पीएच 6.8, एक अंतिम 1x एकाग्रता के लिए 3% एसडीएस, 15% ग्लिसरॉल, 4% β-mercaptoethanol)।
      2. 10 मिनट के लिए उबाल लें नमूने हैं।
      3. 10% एसडीएस पृष्ठ से अलग प्रोटीन।
      4. वैद्युतकणसंचलन के बाद, के बारे में दो मिनट के लिए एक माइक्रोवेव ओवन में Coomassie समाधान के लिए एक (0.05% खूब ब्लू आर-250, 25% isopropanol, 10% एसिटिक एसिड) की उपस्थिति में गर्मी जेलउबलते बिंदु तक एस।
      5. कोमल झटकों के साथ कमरे के तापमान को जेल शांत हो जाओ।
      6. त्यागें Coomassie धुंधला समाधान ए
      7. Coomassie समाधान बी की उपस्थिति में हीटिंग द्वारा Destain जेल (0.05% खूब ब्लू आर-250, 25% isopropanol), सी (0.002% खूब ब्लू आर-250, 10% एसिटिक एसिड) और डी (10% एसिटिक एसिड) हर बार धुंधला के लिए एक ही प्रोटोकॉल के बाद।
      8. पृष्ठभूमि 9 स्पष्ट है जब तक समाधान विकास के साथ पिछले हीटिंग कदम के बाद, जेल destaining छोड़ दें।
    3. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण:
      1. वैद्युतकणसंचलन के बाद, स्थानांतरण 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस 7.4 पीएच में मानक तकनीक और 4% दूध के साथ ब्लॉक का उपयोग कर एक nitrocellulose झिल्ली पर प्रोटीन अलग कर दिया।
      2. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात धब्बा सेते हैं या एक में लक्ष्य प्रोटीन के खिलाफ उठाया खरगोश प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त अवरुद्ध समाधान में कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए: 10,000 और 0.1% बीच 20 के साथ पूरक।
      3. प्राथमिक एंटीबॉडी लेबल के बादआईएनजी, 0.1% बीच 20 से युक्त अवरुद्ध समाधान के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए झिल्ली 3 बार धोएं।
      4. 1 पर हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) -conjugate विरोधी खरगोश एंटीबॉडी के साथ सेते: 10,000 घंटा 1.5 के लिए।
      5. धो झिल्ली 5 मिनट पीबीएस टी के साथ प्रत्येक के लिए 5 बार (पीबीएस 0.1% बीच 20 के साथ पूरक)।
      6. Chemiluminescent peroxidase सब्सट्रेट का उपयोग पश्चिमी धब्बा प्रक्रिया।
    4. Radioimmuno परख (रिया):
      1. अभिकर्मकों (सीरमरोधी, ट्रेसर और प्रोटीन एक Sepharose) कमरे के तापमान और pipet 12 x 75 मिमी polystyrene ट्यूबों में (पुनः संयोजक वाणिज्यिक hGAD65 की 300-2,400 एनजी / एमएल) से अलग सांद्रता में प्रोटीन निकालने के नमूने और मानकों के 20 μl तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं।
      2. सीरमरोधी के 20 μl जोड़ें, 01:30 एक T1D रोगी की plasmapheresis से सीरम गिराए तैयार किया।
      3. ट्रेसर (125-मैं-GAD65) के 50 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए सेते हैं। केवल कुल गतिविधि का अनुमान लगाने के लिए ट्रेसर के साथ एक ट्यूब सेट करें।
      4. 50 μl जोड़ेंऔर प्रोटीन एक Sepharose के कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
      5. ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1500 XG पर प्रत्येक ट्यूब और अपकेंद्रित्र में बफर बांटना।
      6. सतह पर तैरनेवाला निकालें और धीरे ट्यूब दोहन से कागज सोख्ता पर अवशिष्ट तरल अवशोषित करने के लिए ट्यूब छानना।
      7. उपाय एक गामा-काउंटर में 1 मिनट के लिए गिनती से सभी ट्यूबों में रेडियोधर्मिता immunoprecipitated।
      8. प्रवेश पैमाने में प्लॉट कुल गतिविधि से संबंधित Calibrators के बंधन दर (बी / टी%), मानक वक्र की स्थापना, और अंशांकन वक्र 10 बंद नमूनों की जीएडी एकाग्रता को पढ़ने के लिए।
        नोट: प्रतिबंधित क्षेत्रों भंडारण, हैंडलिंग और रेडियोधर्मी सामग्री के निपटान के लिए तैयार किया जाना चाहिए।

Representative Results

विभिन्न उत्पादन प्रणालियों में एक लक्ष्य पुनः संयोजक प्रोटीन की heterologous अभिव्यक्ति के लिए एक प्रयोगात्मक डिजाइन यहाँ वर्णित है। पहला फोकस प्रत्येक प्रणाली में लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए इष्टतम स्थितियों की स्थापना के द्वारा विभिन्न प्लेटफार्मों का सेट अप किया गया था।

लक्ष्य प्रोटीन, hGAD65mut की अभिव्यक्ति, तीन प्रतियों में प्रेरित किया गया था कोलाई संस्कृतियों। 37 डिग्री सेल्सियस पर अभिव्यक्ति की तीन घंटा के बाद, बैक्टीरियल कोशिकाओं centrifugation द्वारा एकत्र किए गए थे और sonication द्वारा lysed। एक centrifugation कदम के बाद, घुलनशील प्रोटीन अघुलनशील शामिल किए जाने के शरीर से अलग कर दिया और प्रारंभिक विश्लेषण (डाटा) नहीं दिखाया hGAD65mut अघुलनशील शामिल किए जाने के शरीर में prevalently संचित कि प्रदर्शन किया गया। पुनः संयोजक प्रोटीन solubilisation, अपनी मजबूत अप्राकृतिकरण गुणों के लिए, hGAD65mut के असंभव एक उचित मात्रा का ठहराव, जिससे रिया विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप जो यूरिया 6 एम, के उपयोग की आवश्यकता है। कई रणनीतियों हो गए हैंएन, शामिल किए जाने के निकायों के गठन को सीमित कम तापमान 11 पर माइक्रोबियल कोशिकाओं से बढ़ शामिल हैं के लिए सूचना दी। संस्कृतियों 15 डिग्री सेल्सियस और 20 डिग्री सेल्सियस पर बड़े हो रहे थे, और पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति एक ही तापमान पर प्रेरित किया गया था। चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, hGAD65mut की solubilisation फिर यूरिया (गलियों S2 है) की आवश्यकता है, दोनों तापमान पर उत्पादन किया। इस प्रकार, इस प्रयोग में कम तापमान अघुलनशील समुच्चय बनाने से hGAD65mut को रोकने के लिए नहीं है।

HGAD65mut अनुक्रम (Baculo.G65mut) युक्त baculovirus वैक्टर पक्षपाती Sf9 सेल संस्कृतियों में व्यक्त की गई थी। V1 और V2 उच्च अनुमापांक शेयरों तैयार थे और सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वाले संक्रमण शर्तों 5-50 μl से अलग वायरल शेयर संस्करणों का मूल्यांकन करने के लिए स्थापित किया गया था। चित्रा 1 बी में दिखाया गया है रिया द्वारा मूल्यांकन के रूप में, इष्टतम वायरल शेयर मात्रा, संस्कृति के माध्यम से मिलीलीटर प्रति पुनः संयोजक प्रोटीन की 11.8 ± 0.8 माइक्रोग्राम प्रति उपज, 25 μl के रूप में पहचान की गई थीविश्लेषण (1 टेबल)।

निम्नलिखित घुसपैठ, agroinfected एन के समय के पाठ्यक्रम विश्लेषण benthamiana पत्तियों दो क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणालियों में बाहर किया गया था। PK7WG2 आधारित प्रणाली के लिए, पत्ती के नमूने रेंज 1-5 डीपीआई में दैनिक जमा थे, कुल घुलनशील प्रोटीन (टीएसपी) निकाले गए थे और टीएसपी के बराबर मात्रा में पश्चिमी धब्बा (चित्रा 1C) द्वारा विश्लेषण किया गया। इस विश्लेषण लक्ष्य पुनः संयोजक प्रोटीन की अधिकतम संचय दो डीपीआई तक पहुँच जाता है कि प्रकाश डाला। इसलिए, पत्तियों दो डीपीआई काटा गया और प्रोटीन के अर्क 67.8 माइक्रोग्राम प्रति / छ विदेशी भाषा शाखा (ताजा पत्ती वजन, 1 टेबल) के एक औसत से पता चलता है जो पुनः संयोजक प्रोटीन संचय, को मापने के लिए रिया द्वारा विश्लेषण किया गया। पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर है, इस प्रणाली का उपयोग कर, आगे 12 प्रो P19 या कोर्ट की तरह पोस्ट-ट्रांस्क्रिप्शनल जीन मुंह बंद (PTGS) के एक शमन के साथ पत्तियों सह घुसपैठ करके, सुधार किया जा सकता है।

एक ही समय-कोर्स का पता लगाने एन के साथ बाहर किया गया benthamiana MagnICON वैक्टर के साथ agroinfected पत्ते: संक्रमित पत्तियों पश्चिमी धब्बा द्वारा विश्लेषण किया गया टीएसपी के 1-8 डीपीआई और बराबर मात्रा में एकत्र किए गए थे। इस विश्लेषण रिया द्वारा मूल्यांकन के रूप में अधिकतम पुनः संयोजक प्रोटीन संचय, 78.8 माइक्रोग्राम प्रति / छ विदेशी भाषा शाखा (तालिका 1) के संयोजक प्रोटीन के एक औसत संचय के साथ, 4 डीपीआई (चित्रा -1) प्राप्त की है कि प्रदर्शन किया।

ट्रांसजेनिक तंबाकू के पौधों में hGAD65mut की अभिव्यक्ति पहले से पुनः संयोजक प्रोटीन के स्तर को स्वतंत्र रूप से बदल लाइनों के बीच काफी विविध दिखा रहा है कि, 12 सूचित किया गया है। सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वाले hGAD65mut T1 के ट्रांसजेनिक संयंत्र स्वयं को पार कर गया था और व्युत्पन्न पौधों (टी 2) फिर से सबसे अच्छा एक प्रदर्शन कर चयन करने के लिए विश्लेषण किया गया। यह प्रक्रिया कोई जब तक रिया ने हर पीढ़ी में प्रदर्शन की जाँच, एक सजातीय उत्पादन प्लेटफार्म विकसित करने के लिए कई पीढ़ियों पर दोहराया गया थाआगे सुधार (नहीं दिखाया डेटा) हासिल की थी। चित्रा 1E में, T5 ट्रांसजेनिक पौधों की एक प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा पुनः संयोजक प्रोटीन की पैदावार की एकरूपता स्पष्ट है, जहां सूचना दी है। चित्रा 1F में दिखाया गया है, औसत hGAD65mut उपज चयन प्रक्रिया के दौरान 99.1 माइक्रोग्राम प्रति / छ विदेशी भाषा शाखा (तालिका 1) और, के स्तर तक पहुंच गया, T6 के लिए टी 2 से वृद्धि हुई है, अभिव्यक्ति के स्तर का मानक विचलन मना कर दिया।

चित्र 1
चित्रा 1:। प्लेटफार्म सेट अप ऊपर एक मंच में hGAD65mut अभिव्यक्ति के लिए की सबसे अच्छी स्थिति निर्धारित करें। (ए) ई कोलाई inducible अभिव्यक्ति मंच। बैक्टीरियल कोशिकाओं Coomassie के साथ दाग नियंत्रण लोड हो रहा है 15 डिग्री सेल्सियस या 20 डिग्री सेल्सियस। ऊपरी पैनल, सेल के अर्क में hGAD65mut के पश्चिमी धब्बा (लेन प्रति 2 माइक्रोग्राम प्रति टीएसपी)। लोअर पैनल में बड़े हो रहे थे। एन.सी। = नकारात्मक नियंत्रण, chloramphenicol प्रतिरोध जीन से युक्त pDEST17 वेक्टर के साथ बदल बैक्टीरियल कोशिकाओं; टी: कुल नमूने; एस 1: सतह पर तैरनेवाला sonication के और centrifugation के बाद; S2 और पी: सतह पर तैरनेवाला (1) और गोली (2) यूरिया युक्त बफर में solubilized नमूना के बाद centrifugation। (बी) baculovirus / कीट सेल मंच। निम्नलिखित वायरल शेयर संस्करणों का परीक्षण किया गया: 5, 25 और 50 μl ऊपरी पैनल, सेल के अर्क में hGAD65mut के पश्चिमी धब्बा (लेन प्रति 5 माइक्रोग्राम प्रति टीएसपी) के निचले पैनल, Coomassie के साथ दाग नियंत्रण लोड हो रहा है।।। नेकां नकारात्मक नियंत्रण, गैर तब्दील कीट कोशिकाओं के निकालने =। एन में (सी) क्षणिक अभिव्यक्ति pK7WG2 सदिश का उपयोग benthamiana पौधों। सैम्पल, दैनिक 1-5 डीपीआई (गलियों 1-5)। ऊपरी पैनल, पत्ती निष्कर्षों में hGAD65mut के पश्चिमी धब्बा (लेन प्रति 2.5 माइक्रोग्राम प्रति टीएसपी) एकत्र किए गए थे। लोअर पैनल, Coomassie, जहां बड़े सबयूनिट के साथ दाग नियंत्रण लोड हो रहा हैRubisco का पता चलता है। नेकां = नकारात्मक नियंत्रण, GFP मार्कर जीन ले जाने pK7WG2 वेक्टर साथ घुसपैठ पौधों। (डी) एन में क्षणिक अभिव्यक्ति MagnICON वैक्टर का उपयोग benthamiana पौधों। सैम्पल, दैनिक 1-8 डीपीआई (गलियों 1-8)। ऊपरी पैनल, पत्ती निष्कर्षों में hGAD65mut के पश्चिमी धब्बा (लेन प्रति 5 माइक्रोग्राम प्रति टीएसपी) एकत्र किए गए थे। लोअर पैनल, Coomassie के साथ दाग नियंत्रण लोड हो रहा है Rubisco की बड़ी सबयूनिट स्पष्ट है जहां । नेकां = नकारात्मक नियंत्रण, केवल pICH20111 5'-मॉड्यूल और pICH14011 इंटिग्रेस-मॉड्यूल के साथ घुसपैठ पौधों। नंबर केडीए में आणविक जन मार्कर संकेत मिलता है। पीसी = सकारात्मक नियंत्रण, baculovirus / कीट सेल प्रणाली में उत्पादित वाणिज्यिक hGAD65 के 15 एनजी। (ई) एन में स्थिर अभिव्यक्ति tabacum पौधों। पत्ता नमूने विभिन्न T5 पौधों (गलियों 1-11) से एकत्र किए गए थे। ऊपरी पैनल, पत्ती निष्कर्षों में hGAD65mut के पश्चिमी धब्बा (लेन प्रति 5 माइक्रोग्राम प्रति टीएसपी)। लोअर पैनल, लोडिंग नियंत्रण डब्ल्यू दागith Coomassie। नेकां नकारात्मक नियंत्रण, जंगली प्रकार के पौधों =। नंबर केडीए में आणविक जन मार्कर संकेत मिलता है। पीसी = सकारात्मक नियंत्रण, baculovirus / कीट सेल प्रणाली में उत्पादित वाणिज्यिक hGAD65 के 15 एनजी। (एफ) एन में स्थिर अभिव्यक्ति tabacum पौधों। से व्युत्पन्न कई पीढ़ियों से अधिक hGAD65mut संचय के Boxplot प्रतिनिधित्व रिया डेटा से गणना की माइक्रोग्राम प्रति / छ विदेशी भाषा शाखा के रूप में रिपोर्ट hGAD65mut T1 के ट्रांसजेनिक तंबाकू के पौधे-प्रदर्शन सबसे अच्छा है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रणाली [HGAD65mut] (g / एमएल) [HGAD65mut]
Baculo / कीट 117.5 ± 7.7 11.8 ± 0.8 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / मध्यम संस्कृति
TransienT 22.6 ± 0.9 67.8 ± 2.7 माइक्रोग्राम प्रति / छ विदेशी भाषा शाखा
MagnICON 26.3 ± 5.9 78.8 ± 17.8 माइक्रोग्राम प्रति / छ विदेशी भाषा शाखा
अभिजात वर्ग T6 33.0 ± 3.8 99.1 ± 11.3 माइक्रोग्राम प्रति / छ विदेशी भाषा शाखा

तालिका 1: - किण्वक आधारित (Baculo / कीट) और संयंत्र आधारित (एन benthamiana में pK7WG2- और MagnICON और एन tabacum में अभिजात वर्ग T6) hGAD65mut विभिन्न प्लेटफार्मों में hGAD65mut पैदावार पैदावार। दूसरे स्तंभ - प्रोटीन के अर्क में hGAD65mut एकाग्रता (g / एमएल)। तीसरे स्तंभ - संयंत्र आधारित प्लेटफॉर्म के लिए और किण्वक-आधारित प्लेटफॉर्म के लिए सेल संस्कृति माध्यम (g / एमएल) में ताजा पत्ती वजन (g / छ विदेशी भाषा शाखा) में hGAD65mut सामग्री।

Discussion

बैक्टीरियल कोशिकाओं, baculovirus / कीट कोशिकाओं और पौधे: इस अध्ययन में तीन अलग अलग प्लेटफार्मों एक पुनः संयोजक मानव प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए की तुलना में थे। (- MagnICON और pK7WG2 आधारित है - और स्थिर यानी, क्षणिक) संयंत्र आधारित प्लेटफॉर्म आगे तीन व्यापक रूप से इस्तेमाल अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकियों का शोषण द्वारा पता लगाया था। इस प्रयोग, hGAD65mut, के लिए चुना लक्ष्य प्रोटीन पहले से विभिन्न प्रणालियों 13 में व्यक्त किया गया है, और इसके उत्पादन और कार्यक्षमता आसानी से detectable और 14 औसत दर्जे का है।

HGAD65mut शामिल किए जाने के शव का गठन क्योंकि बैक्टीरियल कोशिकाओं इस प्रकार श्रमसाध्य solubilization की आवश्यकता होती है और इसके मूल रचना को प्राप्त करने के refolding, यहां तक ​​कि कम तापमान बढ़ती शर्तों पर, एक प्रभावी उत्पादन मंच नहीं थे। दरअसल, जटिल पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए इस मंच का मुख्य विफलता अंतिम उत्पाद की सही रचना है।

Baculovirus / कीट सेल मंच immunoreactive पुनः संयोजक प्रोटीन के एक उच्च अभिव्यक्ति मध्यस्थता, लेकिन यह अभिव्यक्ति प्रणाली की मुख्य सीमा कीट कोशिकाओं को विकसित करने के लिए आवश्यक संस्कृति मीडिया की उच्च लागत है। यह hGAD65mut की 1 ग्राम के लिए कुल उत्पादन लागत (आवश्यक कीट सेल संस्कृति मीडिया के नौ एल पर विचार कर) इस उत्पादन मंच में € 700 तक पहुंच सकता है कि अनुमान लगाया गया था। इस अभिव्यक्ति मंच की एक और सीमा सड़न रोकनेवाला हेरफेर कौशल के साथ कर्मियों की आवश्यकता है जो कीट कोशिकाओं की बाँझ खेती, की जरूरत है। कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल वायरल स्टॉक की मात्रा और वायरल संक्रमण का समय: दो महत्वपूर्ण मापदंडों को ध्यान से इस अभिव्यक्ति प्रणाली में नियंत्रित किया जाना चाहिए कुशल पुनः संयोजक प्रोटीन संचय सुनिश्चित करने के लिए। इसके अलावा, Sf9 कीट कोशिकाओं से कुल घुलनशील प्रोटीन निकासी के लिए इस्तेमाल किया डिटर्जेंट, काफी पुनः संयोजक प्रोटीन solubilisation प्रभावित करती है।

संयंत्र आधारित प्रणाली सबसे अधिक लाभकारी Platfo थेआरएम hGAD65mut व्यक्त करने के लिए: संयंत्र से बनाया पुनः संयोजक प्रोटीन immunoreactive और पत्ता ऊतकों में उच्च स्तरों पर जमा किया गया था। विभिन्न संयंत्र आधारित अभिव्यक्ति प्रणालियों की तुलना में, सबसे ज्यादा पैदावार स्थिर तब्दील तंबाकू के पौधों (1 टेबल) और में प्राप्त किया गया, एन की तुलना में तंबाकू की कुल बायोमास पर अगर क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया benthamiana, तंबाकू के समग्र उच्च उत्पादकता स्पष्ट है। हालांकि, स्थिर तब्दील तंबाकू संयंत्र आधारित मंच के मुख्य सीमा हमारे अध्ययन में 20 महीने लग गए जो प्रणाली का सेट-अप, के लिए आवश्यक समय है। दरअसल, एक समयुग्मक लाइन पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति एकरूपता के लिए चयनित किया जाना चाहिए और यह लाइनें व्यक्त उच्चतम T1 से शुरू करने, आत्म-पार चक्र दोहराया पड़ सकता है। चयनित T1 के ट्रांसजेनिक विशेषता के एक से अधिक प्रतिलिपि भालू, जब विशेष रूप से, प्रजनन कार्यक्रम तीन साल तक का समय लग सकता है।

क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणालियों की पेशकश कीकारण परिवर्तन और अभिव्यक्ति और अभिव्यक्ति मंच के सेट-अप के बीच एक संक्षिप्त अंतराल के लिए तेजी से बढ़ाने का लाभ चार दिनों की आवश्यकता है। हालांकि, संयंत्र आधारित क्षणिक प्रणालियों की एक सीमा कृषि घुसपैठ के लिए समर्पित उच्च ग्रेड उपकरणों का इस्तेमाल किया जाता है, जब तक कि उनके स्वचालन एक प्रयोगशाला पैमाने पर शायद ही लागू है। इसलिए, क्षणिक आधारित सिस्टम का उपयोग कर hGAD65 का बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक उचित गणना यहाँ नहीं किया जा सकता। दूसरी ओर, हम T6 स्थिर तंबाकू लाइन का उपयोग कर पुनः संयोजक प्रोटीन की 1 ग्राम के लिए कुल उत्पादन लागत (60 तंबाकू के पौधों को उगाने के लिए मिट्टी पर) कम से कम 5 यूरो में गणना की जा सकती है कि अटकलें। (, संयंत्र विकास मंच के बढ़ने और एग्रोबैक्टीरियम की घुसपैठ हालत) कई महत्वपूर्ण पैरामीटर सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए कुशल agroinfiltration और प्रोटीन के उत्पादन को सुनिश्चित करने, के रूप में पहले 15 सूचना दी। इसके अलावा, प्रत्येक अभिव्यक्ति के लिए किया जाना चाहिए एक विशेष समय के पाठ्यक्रम विश्लेषण प्रयोगपुनः संयोजक प्रोटीन के उच्चतम संचय की अनुमति देता है कि डीपीआई चयन करने के लिए प्रदर्शन किया।

यहाँ पर चर्चा उदाहरण पारंपरिक प्रणालियों पर संयंत्र आधारित उत्पादन के विशिष्ट लाभ में से कुछ पर प्रकाश डाला गया है कि एक सबूत के सिद्धांत मामले का अध्ययन, माना जा सकता है। विशेष रूप से, समान पुनः संयोजक प्रोटीन व्यक्त तंबाकू ट्रांसजेनिक लाइनों बड़े मात्रा में आवश्यक हैं कि पुनः संयोजक प्रोटीन का बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण मंच माना जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract Sigma Y1333
Tryptone Formedium TRP03
Agar Bacteriological Grade Applichem A0949
Sf-900 II SFM medium Gibco 10902-088
Grace’s Insect Medium, unsupplemented Gibco 11595-030
Cellfectin II Reagent Invitrogen 10362-100
MS medium including vitamins Duchefa Biochemie M0222
Sucrose Duchefa Biochemie S0809
Plant agar Duchefa Biochemie P1001
Ampicillin sodium Duchefa Biochemie A0104 Toxic
Gentamycin sulphate Duchefa Biochemie G0124 Toxic
Ganciclovir Invitrogen I2562-023
Carbenicillin disodium Duchefa Biochemie C0109 Toxic
Kanamycin sulfate Sigma K4000 Toxic
Rifampicin Duchefa Biochemie R0146 Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO
Streptomycin sulfate Duchefa Biochemie S0148 Toxic
Spectinomycin dihydrochloride Duchefa Biochemie S0188
IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside) Sigma I5502 Toxic
MES hydrate Sigma M8250
MgCl2 Biochemical 436994U
Acetosyringone Sigma D134406 Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Syringe (1 ml) Terumo
MgSO4 Fluka 63136
BAP (6-Benzylaminopurine) Sigma B3408 Toxic
NAA (Naphtalene acetic acid) Duchefa Biochemie N0903 Irritant
Cefotaxime Mylan Generics
Trizma base Sigma T1503 Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer
HCl Sigma H1758 Corrosive
NaCl Sigma S3014 1 M stock
KCl Sigma P9541
Na2HPO4 Sigma S7907
KH2PO4 Sigma P9791
PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride) Sigma P7626 Corrosive, toxic
Urea Sigma U5378
β-mercaptoethanol Sigma M3148 Toxic
Tween-20 Sigma P5927
Hepes Sigma H3375
DTT (Dithiothreitol) Sigma D0632 Toxic – 1 M stock, store at -20 °C
CHAPS Duchefa Biochemie C1374 Toxic
Plant protease inhibitor cocktail Sigma P9599 Do not freeze/thaw too many times
SDS (Sodium dodecyl sulphate) Sigma L3771 Flammable, toxic, corrosive – 10% stock
Glycerol Sigma G5516
Brilliant Blue R-250 Sigma B7920
Isopropanol Sigma 24137 Flammable
Acetic acid Sigma 27221 Corrosive
Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67 Sigma G5163 Do not freeze/thaw too many times
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody Sigma A6154 Do not freeze/thaw too many times
Sf9 Cells Life Technologies 11496
BL21 Competent E. coli New England Biolabs C2530H
Protein A Sepharose Sigma P2545
Cell culture plates Sigma CLS3516
Radio Immuno Assay kit Techno Genetics 12650805 Radioactive material

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References

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