ट्यूमर स्ट्रोमल इंटरेक्शन के लिए तीन आयामी सह संस्कृति मॉडल

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Horie, M., Saito, A., Yamaguchi, Y., Ohshima, M., Nagase, T. Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction. J. Vis. Exp. (96), e52469, doi:10.3791/52469 (2015).

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Abstract

Protocol

नोट: इस अध्ययन उचित आचार समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था।

मानव फेफड़ों fibroblasts की 1. प्राथमिक संस्कृति

  1. फेफड़े के ऊतकों का संग्रह:
    1. सीधे सर्जिकल ऑपरेशन रूम से मानव फेफड़े के ऊतकों के नमूने प्राप्त करते हैं। के रूप में दूर संभव के रूप में ट्यूमर से एकत्र गैर कैंसर नमूने के साथ, कैंसर और गैर कैंसर फेफड़े के ऊतकों से लगभग 1 सेमी 3 ब्लॉक लीजिए।
    2. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 100 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.25 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / Amphotericin बी (सीरम मुक्त मध्यम) के साथ पूरक (DMEM) में नमूने निलंबित। बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में निलंबित कर दिया नमूने बनाए रखें और प्रयोगशाला के लिए स्थानांतरण।
      नोट: तंतुकोशिकाएं अत्यधिक प्रवासी हैं और इस तरह के उपकला, endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं, के साथ तुलना में proliferative। परिणाम विधि fibroblasts की इन सुविधाओं का लाभ, और outgro लेता हैऊतक वर्गों से विंग कोशिकाओं fibroblasts में प्रचुर मात्रा में हैं। कई सेल मार्ग के बाद, अन्य प्रकार की कोशिकाओं शुद्ध तंतुप्रसू सेल संस्कृतियों, जिसके परिणामस्वरूप में जीवित है और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ DMEM में प्रचार करने के लिए असफल। कोशिकाओं प्राथमिक संस्कृति निम्नलिखित 3-7 मार्ग में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. सेल परिणाम के लिए explant संस्कृति और कंडीशनिंग:
    1. संशोधनों 5 के साथ एक जैसा कि पहले बताया प्रोटोकॉल का उपयोग fibroblasts की प्राथमिक संस्कृति प्रदर्शन करते हैं।
    2. प्रयोगशाला में, संस्कृति के माध्यम के बिना एक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान पर ऊतक का नमूना जगह और छोटे वर्गों में कटौती ~ बाँझ संदंश और एक स्केलपेल का उपयोग आकार में 2-3 मिमी। इस प्रक्रिया के दौरान, अन्यथा सेल परिणाम की दक्षता बिगड़ा हुआ है, खंड सूखी बनाने से बचें।
  3. उपकला कोशिका परत और संयोजी ऊतक के पृथक्करण:
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए संस्कृति 2000 पु / मिलीलीटर dispase मैं युक्त मध्यम और संस्कृति में कटौती ऊतक वर्गों भिगोएँ। </ ली>
    2. एक डिश के लिए ऊतक वर्गों स्थानांतरण, और आसन्न संयोजी ऊतक से उपकला कोशिका परत अलग। सूक्ष्मजीवों के संक्रमण से बचने के लिए एक साफ बेंच में वर्गों की प्रक्रिया।
      नोट: उपकला कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृति की जरूरत है, तो चरण 1.3 प्रदर्शन करते हैं। केवल fibroblasts के अलग-थलग किया जाए तो बाद में explant संस्कृति और सेल मार्ग शुद्ध तंतुप्रसू आबादी उपज जो उपकला कोशिकाओं के लिए प्रतिकूल हैं, क्योंकि कदम 1.3 न आना।
  4. ऊतक वर्गों की कुर्की:
    1. दो नलियां का उपयोग कर एक मिमी टुकड़ों में ऊतकों कीमा। टुकड़े काफी छोटे नहीं हैं, वे पकवान से अधिक आसानी से अलग, और कोशिकाओं पकवान सतह पर विकसित हो जाना असफल हो जायेगी।
    2. प्रत्येक टुकड़ा आसपास के खाली स्थान बनाए रखने के लिए एक दूसरे से अलग छोटे फेफड़े के ऊतकों वर्गों रखें। ऊतक वर्गों की कुर्की की सुविधा के लिए एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग टिशू कल्चर पकवान की सतह पर खरोंच बनाओ।
      नोट: Scratchingयह भी कोशिकाओं की ओर पलायन कर सकते हैं जो साथ पटरियों को उपलब्ध कराने, सेल परिणाम की सुविधा के लिए प्रकट होता है।
      1. वैकल्पिक रूप से, व्यक्तिगत रूप से एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में कीमा बनाया हुआ ऊतक टुकड़े जगह है, और एक कवर पर्ची के साथ उन्हें कवर। सिलिकॉन तेल का उपयोग कर प्लेट की सतह को कवर पर्ची देते हैं।
      2. प्रत्येक अच्छी तरह से एक बाँझ पिन का उपयोग करने में 1.5 सेमी के अलावा दो बिंदुओं पर सिलिकॉन तेल रखें। ऊतक टुकड़े की कवरेज कई मार्ग निम्नलिखित सेल परिणाम और सेल प्रसार की प्रभावकारिता को बढ़ाता है।
  5. इसके बाद explant संस्कृति:
    1. नमूने बाहर सूखी अगर कुशल सेल परिणाम अधिकांश भाग के लिए खो दिया है के रूप में ऊतक वर्गों, बाहर सूखी पहले धीरे डिश के लिए संस्कृति के माध्यम जोड़ें। बहुत तेजी से ऊतक वर्गों को अलग होता है के रूप में मध्यम डालना मत करो।
    2. 10% FBS के साथ DMEM में संस्कृति कोशिकाओं। अतिरिक्त उछाल से सेना की टुकड़ी को बढ़ावा देता है, क्योंकि यह अस्थायी अनुमति देता है कि बहुत ज्यादा सिर्फ ऊतक को कवर करने के लिए पर्याप्त माध्यम का उपयोग, लेकिन नहींपकवान।
  6. सेल बीतने:
    1. संस्कृति डिश के दोहराया आंदोलनों ऊतक वर्गों की टुकड़ी का नेतृत्व कर सकते रूप में सभी समय पर देखभाल के साथ संस्कृति के माध्यम से संभालना।
    2. 5-7 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में संस्कृति बर्तन रखें। हर दूसरे दिन मध्यम ताज़ा करें, और मध्यम परिवर्तन के दौरान न्यूनतम संस्कृति बर्तन संभाल। Fibroblasts अगले कुछ हफ्तों में ऊतक वर्गों के किनारे से विकसित हो जाना।
      नोट: ~ 2-3 सप्ताह के बाद, outgrowing fibroblasts के लगभग सतह क्षेत्र की मात्रा पर निर्भर करता है, संगम तक पहुँचने।
    3. 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें, और मैं थाली करने के लिए trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. Trypsinization के बाद, 10% FBS के साथ पूरक DMEM के 9 मिलीलीटर का उपयोग कोशिकाओं को अलग। ऊतक वर्गों के साथ एक साथ, एक 10 मिलीलीटर ट्यूब में मध्यम में निलंबित कर दिया कोशिकाओं को इकट्ठा। सेल छर्रों के लिए फार्म centrifugation के बाद, नए माध्यम में जिसके परिणामस्वरूप छर्रों resuspend।
    5. एक नई संस्कृति पर कोशिकाओं और ऊतकों वर्गों बीजसंरचना पकवान, पर जो बात ऊतकों की कोशिकाओं का पालन करना और बढ़ने जबकि डिश के लिए संलग्न करने के लिए असफल। अगले दिन, आकांक्षा से अस्थायी ऊतक टुकड़े को हटाने, और मध्यम बदल जाते हैं। संलग्न fibroblasts के बाद संस्कृतियों के साथ प्रचार।

मानव फेफड़ों fibroblasts और कैंसर कोशिकाओं के 2. तीन आयामी सह संस्कृति

  1. कोशिकाओं और अभिकर्मकों की तैयारी:
    1. लगभग 2 x 10 5 उपकला कोशिकाओं और अच्छी तरह से प्रति 2.5 एक्स 10 5 fibroblasts का उपयोग करें। (3 मिलीग्राम / एमएल, पीएच 3), FBS के (100%), पुनर्गठन बफर (50 मिमी NaOH के, 260 मिमी 3 NaHCO, 200 मिमी HEPES), 5x DMEM, DMEM के तंतुप्रसू संस्कृति के लिए 10% FBS के साथ पूरक कोलेजन आइए प्रकार तैयार करें और एक 3 डी सह संस्कृति मध्यम (एक 1: कैंसर की कोशिकाओं के लिए तंतुप्रसू संस्कृति मध्यम और संस्कृति के माध्यम से एक मिश्रण)।
    2. संस्कृति A549 फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं, fibroblasts और DMEM में A549 3 डी सह संस्कृति 10% FBS के साथ पूरक।
  2. कोलेजन जेल चormation:
    1. 1x पीबीएस के साथ 10 सेमी पकवान पर सुसंस्कृत fibroblasts धो लें, और मैं थाली करने के लिए trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस ~ 5 मिनट के लिए trypsinization के बाद, 10% FBS के साथ पूरक 9 मिलीलीटर DMEM का उपयोग कोशिकाओं को अलग। एक 10 मिलीलीटर ट्यूब में मध्यम में निलंबित कर दिया कोशिकाओं को ले लीजिए, और सेल छर्रों के लिए फार्म 200-300 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र।
    2. 5 एक्स 10 5 / एमएल के एक घनत्व में 100% FBS के में जिसके परिणामस्वरूप छर्रों Resuspend।
    3. बर्फ पर कोलेजन जेल तैयार करें। निम्नलिखित प्रक्रिया के लिए पहले एक फ्रिज में अभिकर्मकों, pipettes और ट्यूबों कूल। यहां तक ​​कि बर्फ पर, इस मिश्रण को कुछ हद तक solidifies, और कुल मात्रा सभी घटकों की राशि से कम है।
    4. प्रत्येक कुएं में, FBS के में तंतुप्रसू निलंबन (2.5 x 10 5 कोशिकाओं) का 0.5 मिलीग्राम, 2.3 मिलीलीटर आइए प्रकार कोलेजन, 670 μl 5x DMEM, और 330 μl पुनर्गठन बफर मिश्रण से कोलेजन जेल तैयार करते हैं। जैल कमरे के तापमान पर आसानी से स्थापित करने के लिए अनुमति दें।
      1. सख्ती एक समरूप मील सुनिश्चित करने के लिए पिपेटxture। Pipetting प्रक्रिया के दौरान बुलबुले बनाने से बचें।
    5. 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए मिश्रण (3 मिलीलीटर) जोड़ें और 30-60 मिनट के लिए अशांति के बिना 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सरेस लगाना करने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. कोलेजन जेल पर कैंसर कोशिका संस्कृति:
    1. छह संशोधनों के साथ एक जैसा कि पहले बताया प्रोटोकॉल का उपयोग तीन आयामी सह संस्कृति प्रदर्शन करते हैं।
    2. 1 एक्स 10 5 / एमएल के घनत्व पर 3 डी सह संस्कृति माध्यम में (या A549 कोशिकाओं के मामले में 10% FBS के साथ DMEM में) resuspend कैंसर की कोशिकाओं।
    3. प्रत्येक जेल की सतह पर resuspended सेल समाधान (2 x 10 5 कोशिकाओं) के 2 मिलीलीटर डालो। प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर सह संस्कृति में कैंसर की कोशिकाओं या fibroblasts की सेल नंबर संशोधित करें।
  4. जेल संकुचन:
    1. कैंसर की कोशिकाओं को कोलेजन जेल का पालन कर सकते इसलिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात जैल सेते हैं। प्रत्येक जेल को अलग करें, और ओ अच्छी तरह से प्रत्येक में एक 'चल संस्कृति' उत्पन्न6 अच्छी तरह से थाली एफ।
      नोट: एक अस्थायी संस्कृति का उपयोग करके, जेल आकार में विभिन्न परिवर्तनों सह सुसंस्कृत कैंसर की कोशिकाओं और fibroblasts के बीच सेलुलर बातचीत के द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं, जो यांत्रिक तनाव और कोलेजन गिरावट, द्वारा प्रेरित कर रहे हैं।
    2. अच्छी तरह के किनारे से प्रत्येक जेल अलग करने के लिए एक angled 21 जी सुई या छोटा सा रंग का प्रयोग करें। हर 2-3 दिन, 3 डी सह संस्कृति के माध्यम से 2 मिलीलीटर के साथ कुओं को ताज़ा करें। 5 दिनों के लिए हर दिन प्रत्येक जेल के आकार को मापने।
  5. कोलेजन जैल का विश्लेषण:
    1. ऐसे Sircol परख के रूप में कोलेजन quantitation के तरीकों का उपयोग कर प्रत्येक जेल के कोलेजन सामग्री को मापने के। जैल 5 से शाही सेना को इकट्ठा करने के बाद transcriptomic विश्लेषण या मात्रात्मक आरटी पीसीआर प्रदर्शन करते हैं।

3. हवा तरल इंटरफेस संस्कृति और आक्रमण परख

  1. 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोलेजन जैल संवर्धन के बाद, नए 6- में एक जाल पर (70 माइक्रोन रोमकूप आकार) उन्हें रखने के द्वारा हवा करने के लिए अनुबंधित जैल का पर्दाफाशअच्छी तरह प्लेटें। फ्लो के लिए इस्तेमाल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल strainers से जाल बनाओ।
  2. धीरे 3 डी सह संस्कृति के माध्यम से 11 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक भरें।
  3. एक बाँझ चम्मच का उपयोग जाल पर जैल स्थिति, और जैल से किसी भी शेष मध्यम हटा दें। हवा के लिए जेल की ऊपरी सतह का पर्दाफाश करते हुए इस शर्त पर, मध्यम में जैल डूब। हवा तरल इंटरफेस के रूप में इस संस्कृति हालत को परिभाषित करें।
    नोट: इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर हवा तरल इंटरफ़ेस संस्कृति को बनाए रखने के 5-7 दिनों के बाद, आक्रामक कैंसर की कोशिकाओं को जेल में विस्थापित। सेल प्रकार पर और सेलुलर बातचीत का एक परिणाम के रूप में निर्भर करता है, कैंसर की कोशिकाओं में कोशिका रूपात्मक परिवर्तन के चर डिग्री हवा तरल इंटरफ़ेस संस्कृति से प्रेरित कर रहे हैं।
  4. ऊतकीय मूल्यांकन के लिए, कमरे के तापमान पर रातोंरात formalin समाधान में जेल को ठीक करने और आयल में एम्बेड। Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ खड़ी वर्गों (4 माइक्रोन) दाग। Immunohistochemical विश्लेषण ओ सम्पन्नएन वर्गों 4।

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Representative Results

यह सह संस्कृति विधि, ट्यूमर microenvironment नकल उतार, कोलेजन जैल में एम्बेडेड कैंसर की कोशिकाओं और fibroblasts के बीच बातचीत की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण है। कोलेजन जेल संकुचन, कैंसर सेल आक्रमण और रूपात्मक परिवर्तन: पिछले अध्ययन में, तीन मानकों इस प्रयोगात्मक मॉडल में मूल्यांकन किया गया। कैंसर सेल प्रसार भी Ki67 immunostaining के 4 का उपयोग कर अनुमान लगाया गया था। फेफड़े के ऊतकों के नमूनों एक resected फेफड़ों पालि (चित्रा 1 ए) के कैंसर और गैर कैंसर वर्गों से एकत्र किए गए थे। नमूने छोटे टुकड़ों में कीमा बनाया गया और DMEM में सुसंस्कृत 10% FBS के (चित्रा 1 बी) के साथ पूरक। ऊतक खंड से बाहर बढ़ती fibroblasts माइक्रोस्कोप (चित्रा 1C) के तहत मनाया गया। प्राथमिक सुसंस्कृत फेफड़ों fibroblasts के एक कोलेजन जेल में थे एम्बेडेड (2A चित्रा, एक) और A549 फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं को जेल पर सह सुसंस्कृत थे (2A चित्रा, ख)। फ्लोटिंग सी के बादमध्यम में ulture (2A चित्रा, ग), जेल हवा तरल इंटरफ़ेस की शर्त के तहत आगे सुसंस्कृत था (2A चित्रा, घ)। जेल formalin में तय की और immunohistochemical विश्लेषण (2A चित्रा, ई) के लिए इस्तेमाल किया गया था। हवा तरल इंटरफ़ेस संस्कृति के लिए, जेल 6 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से (चित्रा 2B) में एक जाल पर रखा गया था। जेल के histological विश्लेषण फेफड़ों के कैंसर से जुड़े fibroblasts (चित्रा 3) के साथ एम्बेडेड कोलेजन जेल में A549 कोशिकाओं के आक्रमण का पता चला।

चित्रा 1
चित्रा 1: शल्य चिकित्सा resected मानव फेफड़े के ऊतकों से fibroblasts की परिणाम। (ए) के नमूने एक resected फेफड़ों लोब के कैंसर और गैर कैंसर वर्गों से एकत्र किए गए थे। (बी) नमूने छोटे टुकड़ों में कीमा बनाया हुआ है और 10% FBS के साथ पूरक DMEM में सुसंस्कृत थे।(सी) Fibroblasts ऊतक खंड (तीर) से बाहर हो गया। कोशिकाओं संस्कृति डिश पर स्केलपेल ब्लेड द्वारा किए गए खरोंच के साथ चले कि ध्यान दें। स्केल बार, 200 माइक्रोन।

चित्रा 2
चित्रा 2:। कोलेजन जेल की हवा तरल इंटरफ़ेस संस्कृति A549 कोशिकाओं fibroblasts के साथ एम्बेडेड एक कोलेजन जेल पर सह सुसंस्कृत थे, और A549 कोशिकाओं की परत के माध्यम में एक जाल पर जेल रखकर हवा के संपर्क में था (ए। ) के सह-संस्कृति और हवा तरल इंटरफ़ेस तीन आयामी की प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं। (क) कोलेजन जेल फेफड़ों fibroblasts के साथ एम्बेडेड। (ख) कोलेजन जेल पर सह सुसंस्कृत A549 कोशिकाओं। (ग) फ्लोटिंग संस्कृति। (घ) एयर तरल इंटरफेस (अली)। Formalin में जेल (ई) फिक्सेशन। (बी) वीं के प्रतिनिधि तस्वीर6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में जाल पर रखा ई जेल। हे / एन: रातों रात।

चित्रा 3
चित्रा 3. Hematoxylin और A549 कोशिकाओं और मानव फेफड़ों fibroblasts की रचना की एक तीन आयामी सुसंस्कृत जेल के पार वर्गों की eosin धुंधला। कोलेजन जेल पर कि A549 कोशिकाओं सुसंस्कृत नोट fibroblasts (तीर) के साथ एम्बेडेड जेल पर आक्रमण किया। स्केल बार, 200 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Cafs कैंसर कोशिकाओं के आसपास के ईसीएम का एक प्रमुख घटक के रूप में और केवल ट्यूमर के लिए एक पाड़ प्रदान करते हैं, लेकिन यह भी सक्रिय रूप से ट्यूमर के विकास 7 में भाग नहीं। सबूत जमते सीएएफ की मध्यस्थता ट्यूमर प्रगति 8 की महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला, अंतिम रोग का निदान पर cafs या उनके संबंधित अणुओं के प्रभाव unravels।

पिछले अध्ययन में, हम फेफड़े cafs चार अलग करने के लिए परिणाम विधि कार्यरत हैं। इस प्रयोग में, पकवान की सतह पर ऊतक अनुभाग आसंजन के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है। प्रकोष्ठों संस्कृति के माध्यम में तैर ऊतक वर्गों से बाहर की ओर पलायन करने में असमर्थ हैं, और ऊतक वर्गों की सतह से अलग हो जाने के बाद, वे अब एक ही संस्कृति डिश पर सेल परिणाम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऊतक के काटने के पकवान की सतह के लिए कुर्की के लिए एक गोंद के रूप में सेवा जो exudates, अर्जित करता है। एक कवर पर्ची के साथ ऊतक अनुभाग फिक्सिंग करते हैं, का इस्तेमाल किया तेल की मात्रा को भी criti हैसीएएल। तेल की थोड़ी मात्रा अत्यधिक तेल सेल संस्कृति क्षेत्र obscures, जबकि संलग्न कवर पर्ची रखने के लिए असफल। एक कवर पर्ची और उचित दबाव का उपयोग ऊतक वर्गों की कुर्की भी सेल परिणाम को सुविधाजनक बनाने के लिए महत्वपूर्ण है।

कैंसर सेल प्रसार और आक्रमण के लिए प्रयोगात्मक मॉडल ज्यादातर दो आयामी monolayer के ऊतक संस्कृतियों या Boyden कक्ष assays के पर भरोसा किया है। बेहतर कहनेवाला संचार और कैंसर सेल के व्यवहार के ईसीएम निर्भर मॉडुलन समझने के लिए, तीन आयामी सह संस्कृतियों शक्तिशाली उपकरण हैं। वे उच्च तकनीकी कौशल की जरूरत है और प्रयोगात्मक शर्तों सीमित कर रहे हैं, हालांकि organotypic संस्कृतियों, भी बहुकोशिकीय बातचीत की जांच के लिए उपयोगी होते हैं।

हमारे सह-संस्कृति मॉडल ट्यूमर microenvironment नकल उतार शर्तों के तहत ट्यूमर स्ट्रोमल बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए एक मंच के रूप में कार्य करता है। विशिष्ट जीन overexpression या पछाड़ना साथ कोशिकाओं हमारे cultu में आसानी से लागू कर रहे हैंorganotypic संस्कृति पर एक फायदा है प्रणाली है, जो फिर से। विशेष रूप से, हमारे पिछले टिप्पणियों सह सुसंस्कृत fibroblasts के लिए सक्रिय रूप से कैंसर सेल भेदभाव और आक्रमण चार मिलाना का सुझाव दिया। यह ऐसी endothelial कोशिकाओं, भड़काऊ कोशिकाओं और गैर कैंसर उपकला कोशिकाओं के रूप में हमारे प्रयोगात्मक सेटिंग में संभव बहुकोशिकीय बातचीत, परीक्षण करने के लिए ब्याज की हो जाएगा।

Cafs की विशिष्ट विशेषताओं प्राथमिक सीएएफ संस्कृतियों और अपने सामान्य समकक्षों 9 का उपयोग कर, सह संस्कृति के अध्ययन में या जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के द्वारा प्रदर्शन किया गया है। दूसरी ओर, इन अध्ययनों से यह भी 11 या प्रतिलेखन कारक सक्रियण 12 संकेत वृद्धि कारक के विभिन्न स्तरों के कारण हो सकता है जो का हिस्सा cafs 10 के अंतर tumoral या अंतर-व्यक्तिगत विविधता दिखाई है। इस प्रकार, यह आगे कैंसर रोगियों में 13 से निकाली गई विषम cafs चिह्नित करने के लिए आवश्यक है। दोहराया सेल मार्ग के बाद,प्राथमिक सुसंस्कृत cafs की विशेषताओं को संशोधित किया जा सकता है। इसलिए, यह जल्दी मार्ग पर cafs चिह्नित करने के लिए बेहतर होगा।

Cafs बारी में, तनाव ट्रिगर सेल सिगनल के माध्यम से cafs सक्रिय कर सकते हैं जो ईसीएम बयान और remodeling, के लिए योगदान करते हैं। सीएएफ सक्रियण के इस तरह के एक mechanotransduction की मध्यस्थता फ़ीड आगे पाश 14 सुझाव दिया गया है, और हमारे कोलेजन जेल संकुचन मॉडल इन तंत्रों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। कोलेजन जेल संकुचन के तंत्र सेल संकुचन, प्रसार, प्रवास, भेदभाव, और कोलेजन remodeling के 15 शामिल हैं। Ligands के उपयोग करते हुए विस्तृत ऊतकीय अध्ययन और प्रयोगों, अवरोधकों, या आरएनएआई ट्यूमर स्ट्रोमल बातचीत में एक यंत्रवत जानकारी हासिल करने के लिए सहायक हो सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma-Aldrich D5796
FBS GIBCO 10437
Collagen type IA Nitta gelatin Inc. CELL-1A
Reconstitution buffer Nitta gelatin Inc.
Cover slip NUNC 174934
Silicone grease Dow Corning Toray High vacuum grease
Dispase I WAKO 386-02271
6-well plate BD Falcon 353046
Cell strainer (70 μm) BD Falcon 352350

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References

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  2. Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers. Cancer Microenviron. 3, (1), 167-176 (2010).
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