दिमाग़ी Thymic उपकला सेल प्रसार, भेदभाव और अनेक जीन एक्सप्रेशन सहायक 3 डी Organotypic सह संस्कृति मॉडल

1Division of Developmental Immunology, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Genetics of Skin Carcinogenesis, German Cancer Research Center (DKFZ)
* These authors contributed equally
Published 7/30/2015
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Developmental Biology

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Pinto, S., Stark, H. J., Martin, I., Boukamp, P., Kyewski, B. 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression. J. Vis. Exp. (101), e52614, doi:10.3791/52614 (2015).

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Abstract

इंट्रा-Thymic टी सेल के विकास के विभिन्न stromal कोशिकाओं, यानी, गैर-टी कोशिकाओं से बना एक जटिल तीन आयामी meshwork की आवश्यकता है। क्रमिक रूप से यानी, टी सेल रिसेप्टर प्रदर्शनों की सूची पीढ़ी और चयन के बाद टी सेल वंश प्रतिबद्धता, पूर्व परिधि में अपने निर्यात के लिए अनिवार्य जाँच अंक गुजरते हुए Thymocytes एक अत्यंत समन्वित अस्थायी और स्थानिक क्रम में इस पाड़ पार। इस पाड़ के गठन के दो प्रमुख निवासी प्रकार की कोशिकाओं (cTECs) cortical और दिमाग़ी Thymic उपकला कोशिकाओं (mTECs) कर रहे हैं। MTECs की एक प्रमुख विशेषता कई ऊतक प्रतिबंधित एंटीजन की तथाकथित अनेक अभिव्यक्ति है। ये ऊतक प्रतिबंधित एंटीजन क्रमशः स्वयं सहिष्णुता, जिसके परिणामस्वरूप mTECs या Thymic वृक्ष के समान कोशिकाओं द्वारा सीधे या परोक्ष रूप से thymocytes अपरिपक्व करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं।

CTECs और mTECs के विकास के रास्ते और कार्यों की नकल इन विट्रो में उपयुक्त मॉडल वर्तमान लाख हैंराजा। पर्याप्त प्रयोगात्मक मॉडल की यह कमी उदाहरण के लिए अभी भी खराब सेलुलर और आणविक स्तर पर समझा जाता है जो अनेक जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण बाधा उत्पन्न की है। हम पूर्व vivo पृथक mTECs संस्कृति के लिए एक 3 डी organotypic सह संस्कृति मॉडल रूपांतरित किया। यह मॉडल मूल रूप से इन विट्रो में एक त्वचा समकक्ष उत्पन्न करने के लिए इस तरह के रूप में केरेटिनकोशिकाओं खेती करने के लिए तैयार किया गया था। , CD80 हाय, अरे पॉजिटिव mTECs, RANKL (ii) प्रतिक्रिया है, और FoxN1 (iii) निरंतर अभिव्यक्ति में (i) के प्रसार और CD80 लो, अरे नकारात्मक के टर्मिनल भेदभाव: 3 डी मॉडल mTEC जीव विज्ञान की कुंजी कार्यात्मक सुविधाओं संरक्षित अरे और CD80 हाय mTECs में ऊतक-प्रतिबंधित जीन।

Introduction

शेष 2% सामूहिक Thymic स्ट्रोमा रचना कि कोशिकाओं की एक किस्म के होते हैं, जबकि विकासशील thymocytes, थाइमस के बारे में 98% तक है (यानी, उपकला कोशिकाओं, वृक्ष के समान कोशिकाओं, मैक्रोफेज, बी कोशिकाओं, fibroblasts, endothelial कोशिकाओं)। बाहरी कॉर्टिकल उपकला कोशिकाओं (cTECs) multipotent पूर्व टी कोशिकाओं और आत्म MHC के सकारात्मक चयन में अस्थि मज्जा, टी सेल वंश प्रेरण से समर्थक टी कोशिकाओं के आव्रजन खरीद अपरिपक्व thymocytes प्रतिबंधित। भीतरी दिमाग़ी Thymic उपकला कोशिकाओं (mTECs) उत्प्रेरण नकारात्मक चयन या टी नियामक सेल वंश में अपने विचलन या तो द्वारा आत्म-पेप्टाइड / MHC परिसरों के लिए एक उच्च आत्मीयता TCR के साथ उन लोगों के thymocytes की सहिष्णुता प्रेरण में शामिल रहे हैं। केंद्रीय सहिष्णुता प्रेरण के संदर्भ में, mTECs वे इस प्रकार परिधीय स्वयं mirroring ऊतक प्रतिबंधित आत्म एंटीजन (Trás) की एक व्यापक स्पेक्ट्रम है कि एक्सप्रेस में अद्वितीय हैं। इस घटना अनेक जीन की अभिव्यक्ति कहा जाता है (PGE)1,2।

विभिन्न अल्पकालिक 2D संस्कृति प्रणालियों निरपवाद रूप से पहले 2 दिनों 3-6 भीतर MHC वर्ग द्वितीय, FoxN1 और आयरे तरह PGE के नुकसान और प्रमुख नियामक अणुओं के परिणामस्वरूप के रूप में इस आकर्षक सेल प्रकार पर सबसे मौजूदा अध्ययन, पूर्व vivo अलग कक्षों पर भरोसा । यह विशेष उपकरणों और थाइमस बरकरार 3 डी meshwork की सुविधाओं को 2 डी मॉडल में याद कर रहे थे, जो हालांकि यह स्पष्ट नहीं बना रहा। फिर से एकत्रीकरण Thymic अंग संस्कृति (RTOC) एक अक्षुण्ण Thymic माइक्रोएन्वायरमेंट 7 में, अब तक दूसरे हाथ पर केवल 3 डी एक हाथ पर, टी सेल के विकास के अध्ययन की अनुमति देता है कि प्रणाली है, और स्ट्रोमल कोशिका जीव विज्ञान, किया गया है। फिर भी, RTOCs वे पहले से ही भ्रूण stromal कोशिकाओं के इनपुट की आवश्यकता होती है और 5 से 10 दिनों के लिए अधिक से अधिक संस्कृति अवधि सहना, कोशिकाओं की एक जटिल मिश्रण होते हैं, यानी कुछ सीमाएं है।

इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों में न्यूनीकारक की कमी का अध्ययन बाधा उत्पन्न की हैटी सेल के विकास और Thymic जीवोत्पत्ति के कई पहलुओं को कम से कम नहीं आणविक PGE के नियमन और mTECs की विकासात्मक जीव विज्ञान के लिए अपने रिश्ते।

त्वचा और थाइमस की उपकला कोशिकाओं के संरचित संगठन के करीबी संबद्धता के कारण, हम इन विट्रो में केरेटिनकोशिकाओं के भेदभाव का अनुकरण और इस तरह एक त्वचीय समकक्ष बनाने के लिए मूल रूप से विकसित किया गया था कि एक 3 डी organotypic संस्कृति (ओटीसी) प्रणाली के लिए चुना। ओटीसी प्रणाली केरेटिनकोशिकाओं 8,9 वरीयता प्राप्त कर रहे हैं पर जो एक आतंच जेल में फंस रहे हैं कि चमड़े का fibroblasts के साथ मढ़ा एक निष्क्रिय पाड़ मैट्रिक्स के होते हैं। यहाँ, हम शुद्ध mTECs साथ केरेटिनकोशिकाओं बदल दिया। इस मॉडल की बुनियादी सुविधाओं को ध्यान में रखते हुए, वहीं हम निश्चित मापदंडों अनुकूलित।

MTECs proliferated अपनाया ओटीसी मॉडल में, इस प्रकार बारीकी विवो mTECs विकास में नकल उतार टर्मिनल भेदभाव कराना पड़ा और mTEC पहचान और PGE बनाए रखा

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Protocol

इस अध्ययन Regierungspräsidium कार्लज़ूए की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है। सभी जानवरों को जर्मन कैंसर रिसर्च सेंटर (DKFZ) में विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत रखे गए थे। उम्र के 1 से 7 दिन से लेकर सभी संस्कृति प्रयोगों माउस पिल्ले के लिए इस्तेमाल किया गया।

थाइमस से mTECs 1. अलगाव

नोट: के रूप में इस प्रकार है कुछ संशोधनों के साथ बाँझ शर्तों के तहत पहले से 1 वर्णित के रूप में निम्नलिखित पाचन चरणों का प्रदर्शन किया गया।

  1. माउस पिल्ले सिर काटना और थाइमस हटा दें। 1640 RPMI मध्यम (5% एफसीएस युक्त) युक्त एक पेट्री थाली में बर्फ पर thymi रखें।
  2. ~ 5-30 एमएल RPMI मीडिया के साथ एक दौर नीचे ट्यूब में अच्छा, छोटे टुकड़े और जगह में thymi कट और आरटी पर 10 मिनट के लिए एक चुंबक का उपयोग हलचल धीरे।
  3. इसके बाद, मुख्य रूप से thymocytes युक्त सतह पर तैरनेवाला छानना और collagena के एक दौर के साथ शेष ऊतक क्रमिक रूप से पचाने37 डिग्री पर 25 मिनट प्रत्येक के लिए collagenase / dispase (0.2 मिलीग्राम / एमएल और 1.2 यू / एमएल अंतिम एकाग्रता) द्वारा पीछा 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक (0.2 मिलीग्राम / एमएल और अंतिम concentartion 57 यू / एमएल) के 15 मिनट के लिए एसई प्रकार चतुर्थ, thymi तक चुंबकीय सरगर्मी के साथ एक पानी के स्नान में सी पूरी तरह से पच जाता है। तीन thymi करने के लिए दो प्रति 1 मिलीलीटर एंजाइम का प्रयोग करें।
  4. ऊतक पाश्चर विंदुक के साथ एक बार हर 7-10 मिनट के आंदोलन। Collagenase / dispase भिन्न के पूल और एक 70 माइक्रोन धुंध के माध्यम से फिल्टर।
  5. चुंबकीय सेल छँटाई (एमएसीएस) द्वारा mTECs को समृद्ध। पहले से 11 में वर्णित है, और चित्र 1 में दिखाया के रूप में छँटाई चुंबकीय सेल द्वारा mTECs की शुद्धि प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: विरोधी CD80 पीई (16-10A1, 1 पर उपयोग: 100 कमजोर पड़ने) और (1 पर G8.8, उपयोग: 100 कमजोर पड़ने) विरोधी EpCAM-जैव 12 mTECs के चुंबकीय छँटाई के लिए हम निम्न एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया। एमएसीएस का उपयोग कर अपरिपक्व और परिपक्व mTECs रूप में परिभाषित किया गया: CD45 - EpCAM + CD80 - और CD45 - CD80 + respectivइली।
  6. नीचे (धारा 2.3) के रूप में वर्णित एमएसीएस शुद्धि (अपरिपक्व mTECs की पवित्रता = 83.1 ± 6.3% और परिपक्व mTECs = 79.23 ± 3.42%) के बाद, organotypic संस्कृतियों पर mTECs बीज।
  7. वैकल्पिक रूप से, CD45 एमएसीएस कमी के बाद (100 माइक्रोन नोक का उपयोग) FACS द्वारा क्रमबद्ध mTECs निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग: विरोधी CD45-PerCP (30-F11, 1 पर उपयोग: 100 कमजोर पड़ने), विरोधी Ly51-FITC (6C3, 1 पर उपयोग : 100 कमजोर पड़ने), विरोधी EpCAM-Alexa647 (G8.8, 1 पर उपयोग: 500 कमजोर पड़ने) और 1 पर विरोधी CD80 पीई (16-10A1, उपयोग: 100 कमजोर पड़ने)। (4 दिन): propidium आयोडाइड (5,000 1) का उपयोग मृत कोशिकाओं को बाहर निकालें। क्रमश: EpCAM + CD80 + - CD45 - - Ly51 - EpCAM + CD80 - और पीआई - CD45 - Ly51 गड़बड़ी: FACS का उपयोग कर अपरिपक्व और परिपक्व mTECs के रूप में परिभाषित किया गया।

2. 3 डी Organotypic सह संस्कृतियों (OTCs)

नोट: keratinocyt के organotypic खेती के लिए 3 डी-त्वचीय निर्माणोंपहले से 9,13 के रूप में वर्णित तों तैयार थे। सभी चरणों में कोशिकाओं सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated और 5% थे। इस प्रकार के रूप mTECs का उपयोग कर OTCs मामूली संशोधनों के साथ तैयार थे।

  1. मानव fibroblasts की तैयारी
    नोट: 9 पहले से वर्णित के रूप में मानव त्वचीय fibroblasts के डे-epidermised डर्मिस के explant संस्कृतियों से प्राप्त किया गया।
    1. संक्षेप में, मानव त्वचा (~ 5 सेमी लंबाई) के स्ट्रिप्स में कटौती और thermolysin 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन (10 मिमी HEPES पीएच 7.4 से खारा में 0.5 मिलीग्राम / एमएल) के साथ व्यवहार करते हैं।
    2. इसके बाद, संदंश का उपयोग डर्मिस से एपिडर्मिस अलग।
    3. बारीक एक 10 सेमी पेट्री प्लेट में छोटे टुकड़े, जगह में डर्मिस में कटौती और एक बाँझ airflow के तहत 1-2 घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं। DMEM 20% FBS युक्त के साथ नियमित रूप से explants अनुपूरक।
    4. बाहर से बढ़ती fibroblasts के विभाजन जब मिला हुआ explants के आगे चुनाव के लिए थाली का पालन करने के लिए जारी कर सुनिश्चित करें कि 0.1% trypsin का उपयोग कर (आमतौर पर लगभग 3 सप्ताह)परिणाम की secutive दौर।
    5. ऊपर DMEM में 3 बार 10% के साथ एफ बी एस के लिए एक ही explants से fibroblasts के विस्तार और उन्हें 14 क्रायो रक्षा करता है। प्रत्येक प्रयोगात्मक श्रृंखला के लिए fibroblasts की एक ही बैच का प्रयोग करें।
      नोट: fibroblasts के त्वचीय समकक्षों के सेट अप के लिए किरणित नहीं थे।
  2. पाड़ की तैयारी
    1. वास्तव में 12 अच्छी तरह से फिल्टर आवेषण में फिट करने के लिए एक तेज 11 मिमी व्यास धातु पंचर का उपयोग कर अच्छी तरह से सीमांकन हलकों में 0.4-0.6 मिमी मोटी विस्कोस, nonwoven रेशेदार पदार्थ (एक्सेल शीट के समर्थन में उत्पाद विवरण) काटें। फिर एक पाड़ के रूप में 12- अच्छी तरह से फिल्टर डालने (पॉलिएस्टर केशिका ताकना झिल्ली, 3 माइक्रोन रोमकूप आकार) में जगह। एक बाँझ 12 अच्छी तरह से थाली में पूरा फिल्टर सेटअप रखें।
    2. फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन का एक संयोजन से मिलकर सर्जरी के लिए एक आतंच गोंद-किट का उपयोग कर आतंच जेल तैयार करें। Fibrinogen- के साथ ही 8 मिलीग्राम / एमएल और 10 के लिए किट की थ्रोम्बिन घटक प्री-पतलाक्रमशः इकाइयों / मिलीलीटर। इस प्रकार के रूप में एक 12 अच्छी तरह से थाली का एक भी अच्छी तरह से करने के लिए आगे बढ़ें।
      1. सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम + पीएच 7.0 के बिना 100 μl फाइब्रिनोजेन 100 μl फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ (8 मिलीग्राम / एमएल) पतला। 270,000 fibroblasts युक्त 100 μl एफसीएस के साथ 100 μl थ्रोम्बिन (10 इकाइयों / एमएल) पतला।
      2. 2 मिलीग्राम / एमएल और 2.5 इकाइयों / मिलीलीटर की थ्रोम्बिन के फाइब्रिनोजेन के अंतिम एकाग्रता, जिसके परिणामस्वरूप: (1 मिश्रण 1) 200 μl फाइब्रिनोजेन जो जोड़ने fibroblasts के पाड़ पर सेल-मिश्रण युक्त थ्रोम्बिन के 200 μl, को बांटना। अच्छी तरह मिक्स और कोमल pipetting (दिवस 1) द्वारा पाड़ के पूरे क्षेत्र भर में समान रूप से वितरित।
        नोट: 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के बाद fibroblasts के enclosing एक थक्का पूरी तरह से पाड़ की आंतरिक रिक्त स्थान को भरने के लिए और एक चिकनी ऊपरी सतह के गठन का गठन किया जाएगा।
  3. MTECs साथ सह संस्कृति
    1. पूर्व संस्कृति के लिए, में अंग संस्कृतियों डुबोनाएक मध्यम परिवर्तन के साथ 10% FBS के 50 माइक्रोग्राम / एमएल एल-एस्कॉर्बिक एसिड और 1 एनजी / एमएल TGF-β1 साथ DMEM 4-5 दिनों के लिए हर दूसरे दिन।
    2. MTEC बोने के दिन, rFAD मध्यम से मध्यम जगह (1: 1 DMEM + DMEM / F12) 10% FBS के साथ, 10 -10 एम हैजा विष, 0.4 मिलीग्राम / एमएल hydrocortisone, 50 माइक्रोग्राम / एमएल एल-एस्कॉर्बिक एसिड, दर्जा ligand के इस प्रकार fibroblasts द्वारा स्रावित सेरीन प्रोटिएजों द्वारा असामयिक फाइब्रिनोलयन रोकने (0.1 माइक्रोग्राम / एमएल) और 500 इकाइयों / Aprotinin मिलीलीटर,।
    3. 7-8 घंटे बाद, 250,000 mTECs बोने से सह संस्कृतियों के लिए सेट अप (पूरा mTECs, या तो या CD80 लो और CD80 हाय कैंपेन्स), तंतुप्रसू पाड़ के शीर्ष पर अच्छी तरह से प्रति 100 μl की एक मात्रा में। एक Neubauer कक्ष (4 दिन) का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
      नोट: थाइमस 3 डी organotypic संस्कृतियों एयर उठा रहे हैं जो त्वचा OTCs के विपरीत मीडिया में पानी में डुबोया जाता है हर समय।
    4. 24 घंटा ऊष्मायन के बाद, अब containi (कदम 2.3.2) के रूप में उपर्युक्त माध्यम के साथ संस्कृतियों (कुल मध्यम विनिमय) की आपूर्तिएनजी Aprotinin की मात्रा, 250 इकाइयों / एमएल (5 दिन) कम कर दिया।
    5. MTECs की प्रफलन गतिविधि का आकलन करने के लिए, संस्कृतियों की समाप्ति से पहले 4 घंटे के लिए OTCs (यानी 6.7 माइक्रोन / एमएल, अच्छी तरह / 10 माइक्रोन) edu जोड़ें। प्रत्येक संस्कृति का नमूना या प्रवाह से दो वर्गों में या तो गिनती K14 + edu + कोशिकाओं द्वारा, mTECs की प्रफलन सूचकांकों का निर्धारण करते हैं केरातिन 14 साल की सह-धुंधला के साथ संयुक्त edu इमेजिंग किट में वर्णित के रूप में ओटीसी क्रायो-वर्गों के धुंधला सम्पन्न cytometry (edu फ्लो, धारा 1.7, लेकिन इसके बजाय Ly51-FITC के 1 पर CDR1-पीबी 15 उपयोग: 100 कमजोर पड़ने और 2.3.6.4)।
    6. सह संस्कृति के 4-7 दिनों के बाद, शाही सेना अलगाव, क्रायो सेक्शनिंग या FACS विश्लेषण (दिवस 8-11) के लिए OTCs और प्रक्रिया को समाप्त।
      1. एक संदंश का उपयोग अच्छी तरह से डालने के फिल्टर से पाड़ / त्वचीय समकक्ष को अलग संस्कृतियों को समाप्त करें।
      2. क्रायो सेक्शनिंग के लिए, अक्टूबर परिसर में पूरे ओटीसी एम्बेड और ली में फ्रीजक्रायो सेक्शनिंग से पहले रुपये नाइट्रोजन वाष्प। उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर एक cryostat और स्टोर का उपयोग करते हुए 5-7 माइक्रोन मोटी ओटीसी वर्गों तैयार करें। एंटीबॉडी: (100 कमजोर पड़ने 1 पर GP53, का उपयोग करें), और विरोधी vimentin: क्रायो sectioned OTCs की इम्युनो ऊतकरसायनविज्ञान के लिए विरोधी केरातिन 14 (1,000 कमजोर पड़ने AF64, उपयोग 1 पर) का उपयोग करें। संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग अप्रत्यक्ष इम्युनो ऊतकरसायनविज्ञान धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
      3. शाही सेना के अलगाव के लिए, समाधान के लिए एक 2 मिलीलीटर RNase मुक्त ट्यूब के एक पेंच टोपी में (फिनोल और guanidinium thiocyanate युक्त) denaturing 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक स्केलपेल के साथ टुकड़ों में पूरे ओटीसी कट और denaturing समाधान युक्त ट्यूब में जोड़ें। यंत्रवत् 6.0 की गति से 30 सेकंड के लिए दो बार FastPrep यंत्र के साथ OTCs चूरे, 2 मिनट (नमूना इस बिंदु के बाद डिग्री सेल्सियस -80 पर संग्रहित किया जा सकता है) के लिए बर्फ पर बीच में जगह है। -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हैं, बर्फ पर पिघलना। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 11,500-13,000 rpm पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला आर टी और च पर 5 मिनट के लिए सेतेनिर्माता के रूप में वर्णित एसिड guanidinium thiocyanate-फिनोल के क्लोरोफॉर्म निकासी का उपयोग कर ollow शाही सेना अलगाव प्रोटोकॉल।
      4. FACS विश्लेषण के लिए, चबूतरा हटाने और आतंच / तंतुप्रसू / mTEC जेल से झिल्ली अलग। बारीक एक स्केलपेल के साथ जेल में कटौती और ~ के लिए एक FACS ट्यूब में 20 मिनट के लिए इसे पचाने या पूरी तरह से चुंबकीय सरगर्मी के साथ एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर collagenase / dispase के 2 मिलीलीटर के साथ पचा जब तक। एक बार एक पाश्चर विंदुक हर 5 मिनट के साथ एंजाइम समाधान आंदोलन। पूरा पाचन के बाद, एक 70 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन को फिल्टर; 1.7 में वर्णित है और फ्लो द्वारा विश्लेषण के रूप में एंटीबॉडी का उपयोग एकल कक्ष निलंबन दाग।

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Representative Results

हम मूल रूप से केरेटिनकोशिकाओं 9 की इन विट्रो दीर्घकालिक संस्कृति के लिए विकसित किया गया था, जो एक 3 डी organotypic सह संस्कृति मॉडल (3 डी ओटीसी) को अपनाया। एमएसीएस समृद्ध mTECs (एमएसीएस संवर्धन योजना चित्रा 1 देखें) एक आतंच जेल और फँस fibroblasts की जिसमें एक पाड़ पर वरीयता प्राप्त कर रहे थे। fibroblasts के लिए इन विट्रो में mTECs का समर्थन आवश्यक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रदान करते हैं। MTECs हवा उजागर उनके vivo वातावरण (ओटीसी सेट-अप स्कीम चित्र 2 देखें) नकल उतार रहे हैं जो केरेटिनकोशिकाओं विपरीत जलमग्न संस्कृतियों में RANKL की उपस्थिति में 4-14 दिनों के लिए OTCs में खेती कर रहे थे।

यहां का विश्लेषण दोनों mTEC कैंपेन्स (यानी, CD80 लो और CD80 हाय mTECs) अप करने के लिए 14 दिनों की पूरी संस्कृति की अवधि के दौरान बच गई। MTECs केरातिन 14 अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की और vimentin पॉजिटिव fibroblasts से आसानी से अलग पहचाना थे (चित्रा 3 बी)। दिलचस्प है, अपरिपक्व और परिपक्व mTECs संस्कृति में अलग पैटर्न में वृद्धि हुई। CD80 हाय mTECs fibroblasts द्वारा सीमांकित कॉम्पैक्ट सेल समुच्चय फार्म जाती थी, जबकि CD80 लो mTECs आमतौर पर, (fibroblasts के साथ निकट संपर्क में) द्वि-परतों का गठन। इन नमूनों अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थे।

mTEC कैंपेन्स बच गया लेकिन edu निगमन (चित्रा -3 सी, 3 डी) द्वारा मूल्यांकन के रूप में भी 3 डी ओटीसी शर्तों के तहत proliferated न केवल। रिवर्स CD80 हाय mTECs 10 के लिए सच था, जबकि दिलचस्प है, CD80 लो mTECs, RANKL की उपस्थिति में एक उच्च दर पर proliferated।

CD80 के मजबूत अप-विनियमन द्वारा संकेत के रूप में इसके साथ ही, CD80 लो mTECs, संस्कृति के 4 दिनों के भीतर RANKL की उपस्थिति में CD80 हाय mTECs में विभेदित। विभेदित mTECs भी अरे, FoxN1 (जीन और पी के अभिव्यक्ति बनाए रखाrotein) के साथ-साथ promiscuously आयरे स्वतंत्र और निर्भर Trás 10 व्यक्त किया।

चित्र 1
Tecs की चित्रा 1. एमएसीएस संवर्धन। छानने के बाद, mTECs चुंबकीय सेल छँटाई (एमएसीएस) का उपयोग थाइमस एकल कक्ष निलंबन से समृद्ध कर रहे थे। सबसे पहले, hematopoietic सेल प्रजातियों विरोधी CD45 microbeads का उपयोग कर समाप्त हो गया। CD45 - कोशिकाओं तो विरोधी पीई microbeads द्वारा पीछा किया, विरोधी CD80 पीई एंटीबॉडी के साथ incubated रहे थे। अपरिपक्व mTECs और अन्य stromal कोशिकाओं - प्रवाह के माध्यम से CD80 निहित है, जबकि CD80 + -mature mTECs युक्त eluate, OTCs पर सीधे सुसंस्कृत था। MTECs आगे विरोधी EpCAM-जैव एंटीबॉडी और streptavidin microbeads का उपयोग कर समृद्ध कर रहे थे। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
3 डी OTCs की चरणबद्ध स्थापना के लिए 2. योजना चित्रा। एक पाड़ मैट्रिक्स 12 अच्छी तरह से फिल्टर डालने में रखा गया था। explanted त्वचा से चमड़े का fibroblasts (270,000 कोशिकाओं / ओटीसी अच्छी तरह से) (: फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन के 1 अनुपात 1 से मिलकर) एक आतंच जेल में inoculated थे। ये त्वचीय समकक्ष (250,000 कोशिकाओं / ओटीसी अच्छी तरह से) शीर्ष पर वरीयता प्राप्त और विभिन्न पोषक तत्व (rFAD + पोषक तत्वों) के साथ समृद्ध माध्यम के साथ सुसंस्कृत थे mTECs तक DMEM + पोषक तत्वों के साथ 4-5 दिनों के लिए निरंतर थे।

चित्र तीन
चित्रा 3. विकास पैटर्न और OTCs भीतर mTECs के प्रसार। समृद्ध CD80 लो mTECs fibroblasts (ए), के साथ निकट संपर्क में एक द्वि-परत के रूप में विकसित करने के लिए करते हैं क ereas भेदभाव CD80 हाय mTECs सेल समुच्चय या तंग समूहों (बी) के रूप में विकसित। OTCs विरोधी केरातिन 14 (लाल) और परमाणु धुंधला के साथ-साथ विरोधी vimentin एंटीबॉडी (हरा) (Hoechst, नीला) के साथ संस्कृति के 4 दिन पर लेबल रहे थे। MTECs के प्रसार का मूल्यांकन करने के लिए, OTCs edu के साथ स्पंदित कर रहे थे (यानी 6.7 माइक्रोन / एमएल, 10 माइक्रोन / अच्छी तरह से) पहले संस्कृतियों की समाप्ति के लिए 4 घंटे के लिए। ओटीसी क्रायो वर्गों तो विरोधी केरातिन 14 (हरा) के साथ दाग, और edu-क्लिक-यह प्रतिक्रिया मिश्रण (मैजंटा) परमाणु धुंधला (Hoechst, नीला) के साथ किए गए थे। छवियों प्रतिनिधि दिखाए जाते हैं edu + CD80 लो mTECs (सी) और edu + CD80 हाय mTECs (डी) proliferating चित्रण। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

"Cellspacing =" 0 "> Reaggregation Thymic अंग संस्कृतियों (RTOC) Organotypic सह संस्कृतियों (ओटीसी) आसानी से नजर रखी और एक काफी हद तक बरकरार 3 डी Thymic वास्तुकला का उपयोग कर चालाकी से किया जा सकता है कि सेलुलर बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोगी प्रणाली; ग्राफ्टिंग पर एक ठीक से संगठित संरचना में विकसित करता है। उपयोगी प्रणाली एक आतंच पाड़ में फँस मानव त्वचा fibroblasts द्वारा उत्पन्न एक कृत्रिम 3 डी meshwork में समृद्ध / शुद्ध Thymic उपकला कोशिकाओं के विकास और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए। खैर Thymic उपकला कोशिकाओं और कैप्सूल घुसना जो inhibitors या संशोधक का उपयोग कर thymocytes के विकास के अध्ययन के लिए स्थापित किया गया। उत्तरदायी थाइमस उपकला विकास में हेरफेर करने के लिए या Tecs के साथ सह-संस्कृति में thymocyte विकास का अध्ययन करने के लिए। प्रणाली के बाद सेRTOC कारकों की आपूर्ति जब हवा-उठा लिया है, झिल्ली में छेद के आकार (0.8 माइक्रोन) महत्वपूर्ण है: बड़े अणुओं झिल्ली और / या कैप्सूल के माध्यम से प्रवेश नहीं कर सकता है। संस्कृति (सफलतापूर्वक morpholino oligos का उपयोग कर परीक्षण) पदार्थों / कारकों की तेज की सुविधा है, जो मीडिया में डूबे हुए है। प्रौढ़ और प्रसवोत्तर Tecs या thymocytes भ्रूण RTOCs में नुकीला किया जा सकता है। प्रसवोत्तर Tecs वयस्क Tecs की तुलना में बेहतर हो जाना; भ्रूण Tecs अभी तक जांच नहीं की। Reaggregation और कहा कि यात्रा की आबादी के एकीकरण के लिए अनुमति देने के लिए भ्रूण E14-14.5 thymi (इष्टतम) आवश्यकता होती है; भ्रूण Thymic (स्वीकर्ता) सेल संरचना को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल; RTOCs दाता या स्वीकर्ता कोशिकाओं के रूप में या तो fluorescently लेबल या congenic चूहों से कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। एकल कक्षों / क्लोन अध्ययन संभव; केवल "दूषित पदार्थों को" Tecs का समर्थन करने के ईसीएम प्रदान करने के लिए आवश्यक मानव त्वचा fibroblasts हैं। इमेजिंग Limiteडी लाइव दो photon माइक्रोस्कोपी का गहराई से प्रवेश करने के लिए; FACS विश्लेषण या छँटाई करने के लिए उत्तरदायी; जीन की अभिव्यक्ति के अध्ययन संस्कृति के बाद वांछित सेल प्रकार की FACS छँटाई की आवश्यकता होती है। इमेजिंग के लिए पूरी तरह से सुलभ; FACS विश्लेषण, इम्युनो ऊतकरसायनविज्ञान, और जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए उपयुक्त है।

तालिका दो 3 डी Thymic संस्कृति प्रणालियों के बीच 1. तुलना करें।

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Discussion

RTOCs के साथ, 3 डी OTCs टीईसी भेदभाव और PGE रखरखाव / प्रेरण अन्य (मैं) की तुलना में (तालिका 1) 'सरल 3 डी' संस्कृतियों का उपयोग करने के मामले में अब तक बेहतर से किया गया है - fibroblasts के अकेले पाड़ के बिना; (Ii) के 2 डी सिस्टम का उपयोग कर - (iii) 3T3-J2 कोशिकाओं टीईसी क्लोन विकसित जिसमें Tecs 10 के साथ सह सुसंस्कृत fibroblasts / फीडर कोशिकाओं, लेकिन PGE खो जाती है (चार) Matrigel या (v) के ईसीएम घटकों (अप्रकाशित डेटा)। पीजीई 3 डी OTCs में अप करने के लिए 7 दिनों के लिए बनाए रखा गया था, उसके बाद अधिकतम समय-बिन्दु रहा है 4 दिन, PGE गिरावट शुरू होता है। अन्य रूपात्मक टीईसी सुविधाओं अप करने के लिए 14 दिनों के लिए बनाए रखा गया। दिलचस्प, OTCs कभी कभी गठन Hassall संरचनाओं की तरह 10 से देखा mTEC भेदभाव के अंतिम चरण का समर्थन किया।

वे वयस्क thymi की तुलना में संस्कृति में जीवित रहने के लिए एक उच्च प्रवृत्ति के रूप में OTCs के लिए इस्तेमाल किया thymi युवा प्रसवोत्तर चूहों से प्राप्त किए गए। Tecs fro के व्युत्पन्नअभी तक OTCs में परीक्षण नहीं किया गया thymi एम भ्रूण। और हां, तो लंबे समय से पाचन अवधि (कारण कुछ epitopes की दरार को ट्रिप्सिन का उपयोग नहीं) के बाद कोशिकाओं एमएसीएस के बजाय FACS छँटाई कोशिकाओं का उपयोग और अधिक व्यावहारिक दिखाई दिया। CD80 + mTECs साथ ही सुधार हुआ टीईसी पवित्रता की एमएसीएस कॉलम (विरोधी पीई मोती) पर एक दो कदम सकारात्मक संवर्धन प्रोटोकॉल का उपयोग करना।

ओटीसी सेटअप के लिए यह वास्तव में 12 अच्छी तरह से संस्कृति आवेषण में फिट कि ऊपर कहा गया है के रूप में विस्कोस, nonwoven रेशेदार पदार्थ समाप्त होता है ढीला टुकड़े के बिना तेज, अच्छी तरह से सीमांकन हलकों में कटौती या दाँतेदार है सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के BEMCOT- विस्कोस वाइपर एम 3 (http://www.bemliese.com) के रूप में मचान भी इस्तेमाल किया जा सकता है। ओटीसी के लिए अच्छी तरह से आकार भी महत्वपूर्ण है और 6 अच्छी तरह से और 12 अच्छी तरह से प्रारूपों की तुलना में अन्य प्लेट स्वरूपों इस्तेमाल किया जाना चाहिए, तो परीक्षण किया जाना चाहिए।

आतंच जेल फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन घटकों को contac में नहीं आते हैं कि इस तरह तैयार किया जाना चाहिएओटीसी पर स्थापित किया जा रहा से पहले एक दूसरे के साथ टी, पिपेट टिप का आदान-प्रदान करने के लिए सुनिश्चित करें। एक चिकनी ऊपरी सतह बनाने के लिए चबूतरा पर थाली में अच्छी तरह से दो घटकों का मिश्रण। हमेशा पाड़ उचित थक्का बनने के लिए जाँच करने के लिए और थक्के के लिए आवश्यक समय का एक अच्छा अनुमान है करने के लिए बिना एक कुएं में अध्ययन के साथ एक परीक्षण जेल तैयार करते हैं। ओटीसी में आतंच जेल पूरी तरह से मीडिया के साथ संस्कृतियों की आपूर्ति से पहले पका हुआ है कि सुनिश्चित करें।

प्रवाह द्वारा वरीयता प्राप्त mTECs आसानी जैसे सुसंस्कृत mTECs के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो आतंच जेल, के enzymatic पाचन (collagenase / dispase) के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है संस्कृतियों cytometry, या पीसीआर की समाप्ति पर।

इस के साथ साथ वर्णित 3 डी OTCs अध्ययन या हेरफेर कई टीईसी मापदंडों अर्थात् करने की क्षमता है: 1) siRNA, morpholino oligos) mTECs के विकास के रास्ते और कार्यों के माध्यम से (अध्ययन और / या हेरफेर करने के लिए; 2) को विकसित टी सेल में mTECs की भूमिका का अध्ययन करने के लिएजाहिर; 3) संस्कृति cTECs करने के लिए; 4) Thymic ली गई स्टेम कोशिकाओं के पूर्वज क्षमता का परीक्षण करने के लिए; 5) संस्कृति मानव Tecs करने और स्टेम सेल; 6) एक टीईसी प्रतिरूप assays के प्रदर्शन करने के लिए। 3 डी OTCs vivo में थाइमस microenvironment के हिस्से की नकल एक विस्तृत संस्कृति तकनीक का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह मौजूदा ओटीसी सेटअप में Tecs के लिए आवेदन किया है किसी भी अतिरिक्त assays अच्छी तरह से जांच और अलग से अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी पर जोर दिया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखक ब्याज की कोई वित्तीय या वाणिज्यिक संघर्ष की घोषणा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 mice  Charles River WIGA
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
CD45 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Streptavidin Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) Ref. 12
CD80-PE antibody BD Pharmingen 553769
CD45-PerCP antibody BD Pharmingen 557235
Ly51-FITC antibody BD Pharmingen 553160
CDR1-Pacific Blue Ref. 15
Keratin 14 antibody Covance PRB-155P
Vimentin antibody Progen GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes (Invitrogen GmbH) A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Invitrogen C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10425
12-well filter inserts (thincerts) Greiner bio-one 657631
12-well plate Greiner 665180-01
Jettex 2005/45 ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
PBS Serva 47302.03
DMEM Lonza BE12-604F
DMEM/F12 Lonza BE12-719F
HEPES Gibco 15630-049 
FBS Gold GE Healthcare A11-151
Aprotinin (Trasylol) Bayer 4032037
Cholera toxin Biomol G117
Hydrocortisone Seromed (Biochrom) K3520
L-ascorbic acid Sigma A4034
TGF-ß1 Invitrogen PHG9214
RANKL R&D systems 462-TR-010
Thermolysin Sigma Aldrich  T-7902
OCT Compound TissueTek 4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) Invitrogen 10296028
FastPrep FP120 Thermo Scientific
Collagenase Type IV  CellSystems LS004189 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase) CellSystems LS002104 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I  Roche 11 284 932 001 25 µg/ml final conc.

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References

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