3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

1Division of Developmental Immunology, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Genetics of Skin Carcinogenesis, German Cancer Research Center (DKFZ)
* These authors contributed equally
Published 7/30/2015
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Developmental Biology

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Pinto, S., Stark, H. J., Martin, I., Boukamp, P., Kyewski, B. 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression. J. Vis. Exp. (101), e52614, doi:10.3791/52614 (2015).

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Abstract

Desenvolvimento de células T intra-timo requer uma malha tridimensional complexa composta por várias células do estroma, ou seja, células não-T. Timócitos atravessar este andaime em uma ordem temporal e espacial altamente coordenada enquanto sequencialmente passar pontos de verificação obrigatórios, ou seja, T compromisso linhagem de células, seguido de geração repertório receptor de células T e seleção antes da sua exportação para a periferia. Os dois tipos de células residentes principais que formam este andaime são células epiteliais do timo corticais (CTECs) e medular (células mTEC). Uma característica chave de células mTEC é o chamado promíscuo expressão de numerosos antigénios restrita a um tecido. Estes antigénios restrita a um tecido são apresentados para os timócitos imaturos, directa ou indirectamente por células mTEC ou células dendríticas do timo, respectivamente, resultando em auto-tolerância.

Adequados in vitro modelos emulando as vias de desenvolvimento e as funções de CTECs e células mTEC Atualmente lacrei. Esta falta de modelos experimentais adequados, por exemplo, tem dificultado a análise da expressão do gene promíscuo, que ainda está mal compreendida no nível celular e molecular. Nós adaptamos um modelo de co-cultura 3D organotípico à cultura ex vivo células mTEC isoladas. Este modelo foi inicialmente criado para cultivar queratinócitos, de modo a gerar um equivalente de pele in vitro. O modelo 3D preservou as características funcionais do MTEC biologia: (i) a proliferação e diferenciação terminal de CD80 lo, Aire-negativo em CD80 oi, Aire-positivo células mTEC, (ii) capacidade de resposta a RANKL, e (iii) a expressão sustentada de Foxn1, Aire e genes restrita de tecidos em células mTEC CD80 hi.

Introduction

Timócitos desenvolvimento perfazem cerca de 98% do timo, enquanto que os restantes 2% é composto por uma variedade de células que compõem colectivamente o estroma tímico (isto é, células epiteliais, células dendríticas, macrófagos, células B, f ibroblastos, células endoteliais). As células epiteliais cortical exterior (CTECs) adquirir imigração de células pro-T a partir de medula óssea, t indução linhagem celular em células pré-T multipotentes e selecção positivo de auto-MHC restrita timócitos imaturos. As células interiores medulares do timo epiteliais (células mTEC) estão envolvidas na indução de tolerância desses timócitos com um TCR de elevada afinidade para complexos de auto-péptido / CPH por indução ou selecção negativa ou seu desvio para a linhagem de células T reguladora. No contexto da indução de tolerância central, células mTEC são únicos na medida em que expressam uma ampla gama de auto-antigénios restrita a um tecido (TRAs) espelhamento assim a auto periférica. Este fenômeno é chamado de expressão gênica promíscua (PGE)1,2.

A maioria dos estudos actuais sobre este tipo de célula fascinante dependem ex vivo células isoladas, como vários sistemas de cultura de curto prazo 2D invariavelmente resultou na perda de moléculas de PGE e como regulador chave do MHC de classe II, e Foxn1 Aire dentro dos primeiros 2 dias 06/03 . Ele permaneceu no entanto claro, que determinados componentes e características da malha 3D intacta do timo estavam faltando em modelos 2D. A cultura de órgão tímico re-agregação (RTOC) tem sido até agora o único sistema 3D, que permite o estudo do desenvolvimento de células T, por um lado, e da biologia celular de estroma, por outro lado, em um micro-ambiente do timo 7 intacto. No entanto, RTOCs tem certas limitações, isto é, que já contêm uma mistura complexa de células, requerem a utilização de células estromais fetais e suportar um período de cultura máxima de 5 a 10 dias.

A falta de redutora em sistemas de cultura in vitro tem dificultado o estudo dovários aspectos do desenvolvimento de células T do timo e organogênese não menos importante a regulação molecular da PGE e sua relação com a biologia do desenvolvimento de células mTEC.

Devido à estreita-relação da organização estruturada das células epiteliais da pele e do timo, optamos por um sistema 3D cultura organotípicas (OTC), que tinha sido desenvolvido originalmente para emular a diferenciação de queratinócitos in vitro e, assim, criar um equivalente dérmico. O sistema OTC consiste em uma matriz de andaime inerte coberto com fibroblastos dérmicos que estão presos em um gel de fibrina, na qual os queratinócitos são semeados 8,9. Aqui, nós substituímos queratinócitos com células mTEC purificados. Mantendo as características básicas deste modelo, nós otimizamos determinados parâmetros.

No modelo adotado OTC células mTEC proliferaram, foram submetidos a diferenciação terminal e mantido identidade MTEC e PGE, assim estreitamente imitando in vivo células mTEC desenvolvimento

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Protocol

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Regierungspräsidium Karlsruhe. Todos os animais foram alojados em condições específicas isentos de agentes patogénicos no centro de pesquisa alemão do cancro (DKFZ). Para todas as experiências de cultura de filhotes de rato que variam de 1 a 7 dias de idade foram usados.

1. Isolamento de células mTEC de Thymus

NOTA: As etapas seguintes de digestão foram realizadas conforme descrito anteriormente 1 sob condições estéreis, com algumas modificações como se segue.

  1. Decapitar os filhotes de rato e remover o timo. Coloque a timos em gelo em uma placa de Petri contendo meio RPMI 1640 (contendo FCS a 5%).
  2. Corte o thymi em finos, pequenos pedaços e coloque em um tubo de fundo redondo com ~ 5-30 ml de meio RPMI e misture delicadamente usando um ímã para 10 min a RT
  3. Depois disso, decantar o sobrenadante contendo principalmente timócitos e digerir o tecido restante sequencialmente com uma rodada de collagenaSE tipo IV (0,2 mg / ml e 57 U / ml de concentartion final) durante 15 minutos cada, a 37 ° C, seguido de colagenase / dispase (0,2 mg / ml e a concentração final de 1,2 U / ml) durante 25 min cada a 37 ° C em um banho de água com agitação magnética até a timos são completamente digerido. Use 1 ml de enzima por 2-3 thymi.
  4. Agita-se o tecido uma vez a cada 7-10 min com uma pipeta de Pasteur. Reunir as fracções de colagenase / dispase e filtrar através de uma gaze 70 mm.
  5. Enriqueça as células mTEC por célula magnética triagem (MACS). Realizar a purificação de células mTEC por célula magnética triagem como descrito anteriormente 11, e mostrado na Figura 1.
    NOTA: Para triagem magnética de células mTEC foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-CD80-PE (16-10A1, use a diluição 1: 100) e anti-EpCAM-bio (G8.8, uso a diluição 1: 100) 12. Células mTEC imaturos e maduros usando MACS foram definidos como: CD45 - EpCAM + CD80 - e CD45 - CD80 + respectivEly.
  6. Após purificação MACS (pureza de células mTEC imaturos = 83,1 ± 6,3% e células mTEC maduros = 79,23 ± 3,42%), semear as células mTEC para as culturas organotípicas conforme descrito abaixo (Seção 2.3).
  7. Alternativamente, células mTEC ordenar por FACS (utilizando 100 bocal mm) após a depleção de CD45 MACS utilizando os seguintes anticorpos: anti-CD45-PerCP (30-F11, em utilização diluição 1: 100), anti-FITC-Ly51 (6C3, usar a 1 : 100 de diluição), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, a utilização de 1: 500 de diluição) e utilização de anti-CD80-PE (16-10A1, a diluição 1: 100). Excluir células mortas, utilizando iodeto de propídio (1: 5000) (Dia 4). Células mTEC imaturos e maduros usando FACS foram definidos como: PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - e PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 +, respectivamente.

2. organot�icas 3D Co-culturas (OTCs)

NOTA: As construções em 3D-dérmica para o cultivo de organotípico keratinocytes foram preparados como descrito anteriormente 9,13. Em todos os passos células foram incubadas a 37 ° C e 5% de CO 2. Os OTC utilizando células mTEC foram preparadas com pequenas modificações como se segue.

  1. Preparação de fibroblastos humanos
    NOTA: Os fibroblastos dérmicos humanos foram obtidos a partir de culturas de explantes de derme epidermised-de 9, como descrito anteriormente.
    1. Em breve, cortar tiras de pele humana (aproximadamente 5 cm de comprimento) e trata-se com termolisina (0,5 mg / ml em solução salina com 10 mM de Hepes pH 7,4) O / N a 4 ° C.
    2. Em seguida, separar a epiderme da derme utilizando pinças.
    3. Finamente cortada a derme em pedaços pequenos, coloque em uma placa de 10 centímetros de Petri e deixar secar durante 1-2 horas sob um fluxo de ar estéril. Suplemento os explantes regularmente com DMEM contendo 20% de FBS.
    4. Divida os fibroblastos em crescimento fora quando confluentes (geralmente em torno de 3 semanas), utilizando 0,1% de tripsina certificando-se que os explantes continuar a aderir à placa para obter mais conrounds consecutivos de crescimento.
    5. Expandir os fibroblastos a partir de explantes para os mesmos até 3 vezes em DMEM com FBS a 10% e crio-conservação 14. Utilizar o mesmo lote de fibroblastos para cada série experimental.
      NOTA: Os fibroblastos não foram irradiadas para o set-up dos equivalentes dérmicos.
  2. Preparação do andaime
    1. Corte as 0,4-0,6 mm de espessura de viscose, material fibroso não tecido (detalhes do produto no apoio folha de excel) em círculos bem demarcadas usando uma afiada 11 mm de diâmetro de metal perfurador para caber exatamente em 12 inserções bem-filtro. Em seguida, coloque-o na 12- elemento filtrante bem (poliéster poros da membrana capilar, 3 mm de tamanho de poro) como um andaime. Coloque a configuração completa em um filtro estéril de 12 poços.
    2. Prepara-se o gel de fibrina utilizando uma cola de fibrina kit para a cirurgia que consiste de uma combinação de f ibrinogénio e trombina. Pré-diluir a fibrinogen-, bem como o componente de trombina do kit para 8 mg / ml e 10unidades / ml, respectivamente. Para um único poço de uma placa de 12 poços proceder da seguinte forma.
      1. Dilui-se 100 ul de fibrinogénio (8 mg / ml) com 100 ul de solução salina tamponada de fosfato (PBS) sem Ca 2+ e Mg 2+, pH 7,0. Dilui-se 100 ul de trombina (10 unidades / ml) com 100 ul de FCS contendo 270.000 fibroblastos.
      2. Dispensar 200 ul de trombina a fibroblastos de células contendo-o para misturar andaime, a qual Adicionar 200 ul de fibrinogénio (mistura 1: 1), resultando numa concentração final de fibrinogénio de 2 mg / ml de trombina e de 2,5 unidades / ml. Misturar bem e distribua uniformemente sobre toda a área do andaime por pipetagem suave (Dia 1).
        NOTA: Depois de 30 min a 37 ° C de um coágulo que encerra os fibroblastos se ter formado, enchendo completamente os espaços internos do andaime e formar uma superfície superior lisa.
  3. Co-cultura com células mTEC
    1. Para pré-cultura, mergulhe as culturas de órgãos emDMEM com FBS a 10%, 50 ug / ml de ácido L-ascórbico e de 1 ng / ml de TGF-β1 com uma mudança de meio todos os outros dias durante 4-5 dias.
    2. No dia da sementeira MTEC, substituir o meio por meio RFAD (1: 1 DMEM + DMEM / F12) com 10% de FBS, 10 -10 M a toxina da cólera, 0,4 mg / ml de hidrocortisona, 50 ng / ml de ácido L-ascórbico, ligando RANK (0,1 ug / ml) e 500 unidades / ml de aprotinina, evitando assim a fibrinólise precoce por serina-proteases secretadas pelos fibroblastos.
    3. 7-8 horas mais tarde, as set-up co-culturas, semeando 250.000 células mTEC (quer células mTEC completos, ou CD80 lo e subconjuntos CD80 hi), num volume de 100 ul por poço em cima do andaime de fibroblastos. Contar as células usando uma câmara de Neubauer (dia 4).
      NOTA: Em todas as vezes as culturas organotípicas 3D timo estão submersos em meio ao contrário OTCs pele que são levantadas ao ar.
    4. Após 24 horas de incubação, fornecer as culturas com meio (câmbio médio total) como mencionado acima (passo 2.3.2) agora containing reduziram quantidades de aprotinina, 250 unidades / ml (dia 5).
    5. A fim de avaliar a actividade proliferativa de células mTEC, adicionar EdU (6,7 uM / ml, ou seja, 10 pM / poço) para OTC durante 4 horas antes da terminação das culturas. Realizar a coloração de OTC crio-secções, como descrito no kit de EdU de imagem conjugados com co-coloração de queratina 14. Determinar os índices proliferativas de células mTEC, tanto por contagem de células K14 + edu + de duas secções de cada espécime de cultura ou por fluxo citometria (EdU citometria de fluxo, Secção 1.7, mas em vez de utilizar Ly51-FITC CDR1 PB-15 a uma diluição de 1: 100 e 2.3.6.4).
    6. Na sequência de 4-7 dias de co-cultura, encerrar os OTCs e processo para isolamento do RNA, crio-seccionamento ou análise FACS (dia 11/08).
      1. Terminar as culturas usando uma pinça, que separa o andaime / equivalente dérmico do filtro do poço de inserção.
      2. Para crio-seccionamento, incorporar toda a OTC em composto outubro e congelar na livapor de nitrogênio quid antes de crio-seccionamento. Prepare 5-7 uM secções espessas OTC utilizando um criostato e armazenar a -20 ° C até à sua utilização. Para imuno-histoquímica de OTC crio-seccionado usar anti-queratina 14 (AF64, a utilização de 1: 1000 de diluição), e anti-vimentina (gp53, utilização em diluição 1: 100) de anticorpos. Realizar a coloração imuno-histoquímica indireta usando anticorpos secundários respectivos.
      3. Para o isolamento do RNA, adicionar 1 ml de solução (contendo fenol e tiocianato de guanidina) em uma tampa de rosca de um 2 ml RNase livre tubo de desnaturação. Cortar toda a OTC em pedaços com um bisturi e adicionar para dentro do tubo contendo solução de desnaturação. Mecanicamente triturar os OTC com instrumento FastPrep duas vezes durante 30 segundos a uma velocidade de 6,0, em colocar entre em gelo durante 2 minutos (a amostra pode ser armazenada a -80 ° C após este ponto). Se congeladas a -80 ° C, descongelar em gelo. Centrifugar os tubos a 11,500-13,000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco, incubar durante 5 min à temperatura ambiente e fprotocolos de isolamento de ARN Realize as utilizando ácido extracção tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio, tal como descrito pelo fabricante.
      4. Para a análise FACS, remover o andaime e separar a membrana da fibrina / fibroblastos / gel MTEC. Finamente cortada do gel com um bisturi e digeri-la num tubo de FACS durante ~ 20 min, ou até estarem completamente digeridas com 2 ml de colagenase / dispase a 37 ° C num banho de água com agitação magnética. Agita-se a solução de enzima com uma pipeta de Pasteur, uma vez a cada 5 minutos. Após a digestão completa, filtra-se a suspensão de células através de um filtro de 70 um; manchar a suspensão de célula única usando os anticorpos, tal como descrito em 1.7 e análise por citometria de fluxo.

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Representative Results

Adotamos um modelo 3D organotípico co-cultura (3D OTC) que tinha sido originalmente desenvolvido para o cultivo in vitro de longa duração dos queratinócitos 9. Células mTEC MACS enriquecidos (ver esquema de enriquecimento MACS Figura 1) foram semeadas em um andaime que compreende de um gel de fibrina e fibroblastos aprisionadas. Os fibroblastos proporcionar a matriz extracelular essencial (ECM) que suporta células mTEC in vitro. Células mTEC foram cultivadas em OTCs para 4-14 dias na presença de RANKL em culturas submersas ao contrário queratinócitos, que são expostos ao ar imitando seu ambiente in vivo (ver OTC regime de set-up Figura 2).

Ambos os subconjuntos MTEC aqui analisados ​​(isto é, CD80 e CD80 lo células mTEC hi) sobreviveram durante todo o período de cultura de até 14 dias. Células mTEC foram identificados pela expressão da queratina 14 e eram facilmente distinguíveis dos fibroblastos vimentina-positivo (Figura 3B). Curiosamente, células mTEC imaturas e maduras cresceu em padrões diferentes em cultura. O CD80 lo células mTEC tipicamente formadas bi-camadas (em estreito contacto com os fibroblastos), enquanto CD80 células mTEC hi tendiam a formar agregados celulares compactos delimitados por fibroblastos. Estes padrões foram altamente reprodutíveis.

Os subconjuntos MTEC não só sobreviveu, mas também proliferaram em condições OTC 3D como avaliado por Edu incorporação (Figura 3C, 3D). Curiosamente, o CD80 eis células mTEC proliferaram a uma taxa mais elevada na presença de RANKL, enquanto o inverso era verdade para células mTEC CD80 hi 10.

Além disso, a CD80 eis células mTEC diferenciadas em células mTEC hi CD80 na presença de RANKL a 4 dias de cultura, tal como indicado pela forte sobre-regulação de CD80. As células mTEC diferenciadas também manteve a expressão de Aire, Foxn1 (gene e protein), bem como promiscuamente expressa Aire-independente e dependente de TRAs 10.

Figura 1
Figura 1. MACS enriquecimento da TEC. Depois de se filtrar, células mTEC foram enriquecidas a partir da suspensão de células individuais utilizando células do timo de triagem magnética (MACS). Em primeiro lugar, as linhagens de células hematopoiéticas foram esgotados usando microesferas anti-CD45. As CD45 - células foram então incubadas com anticorpo anti-CD80 de PE, seguido por anti-PE microesferas. O eluato contendo CD80 + -mature células mTEC foi directamente cultivadas na OTC, enquanto o fluxo através continha CD80 - células mTEC imaturos e outras células do estroma. Células mTEC foram ainda mais enriquecida utilizando anticorpos e estreptavidina Microbeads-anti-EpCAM bio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Esquema para a instalação gradual do OTCs 3D. Uma matriz de andaime foi colocado num dispositivo de filtração de 12 poços. Os fibroblastos dérmicos de pele explantado (270.000 células / poço OTC) foram inoculadas num gel de fibrina (consistindo de 1: 1 razão de fibrinogénio e trombina). Estes equivalentes dérmicos foram sustentados por 4-5 dias com DMEM + nutrientes até células mTEC (250.000 células / OTC bem) foram semeadas em cima e cultivadas com meio enriquecido com nutrientes diferente (RFAD + nutrientes).

Figura 3
Figura 3. padrões de crescimento e proliferação de células mTEC dentro do OTCs. O enriquecido CD80 lo células mTEC tendem a crescer como uma bi-camada em estreito contacto com os fibroblastos (A), wh ereas as células mTEC CD80 hi diferenciadas crescer como agregados celulares ou clusters apertados (B). OTC foram marcados no dia 4 de cultura com anticorpo anti-queratina 14 (vermelho) e anticorpos anti-vimentina (verde) juntamente com coloração nuclear (Hoechst, azul). Para avaliar a proliferação de células mTEC, os OTC foram pulsadas com EdU (6,7 uM / ml, isto é, 10 uM / poço) durante 4 horas antes da terminação das culturas. Os crio seções OTC foram então coradas com anti-queratina 14 (verde), e mistura da reacção EDU-clique nele (magenta), juntamente com coloração nuclear (Hoechst, azul). Imagens representativas que descreve proliferando EdU + CD80 lo células mTEC (C) e Edu + CD80 células mTEC hi (D) são apresentados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

"Cellspacing =" 0 "> Culturas de órgãos tímicos reagregação (RTOC) Organot�icas co-culturas (OTC) Sistema útil para estudar as interacções celulares que podem ser facilmente controlados e manipulados utilizando uma arquitectura tímico 3D praticamente intacto; desenvolve em uma estrutura devidamente organizada sobre enxertia. Sistema útil para estudar o desenvolvimento e diferenciação das células enriquecidas / epiteliais tímicas purificadas numa malha 3D artificial gerado pelos fibroblastos de pele humana aprisionadas num andaime de fibrina. Bem estabelecido para o estudo do desenvolvimento de células epiteliais tímicas e timócitos usando inibidores ou modificadores, que penetram a cápsula. Passíveis de manipular timo desenvolvimento epitelial ou para estudar o desenvolvimento de timócitos em co-cultura com TEC. Uma vez que o sistemaé levantada ao ar, o tamanho dos poros da membrana (0,8 um) é crucial quando o fornecimento de factores para a RTOC: moléculas maiores não podem penetrar através da membrana e / ou da cápsula. Cultura é submersa em meios de comunicação, o que facilita a absorção de substâncias / fatores (testado com sucesso usando oligos morfolino). Adultos e TEC pós-natais ou timócitos pode ser cravado em RTOCs fetais. TEC pós-natais crescer melhor do TEC adultos; TEC fetais ainda não testado. Requerem timos E14-14.5 embrionário (óptima) para permitir a reagregação e integração da população desejada adicionado; difícil controlar a composição de células do timo fetal (aceitador); RTOCs requerem células de ratinhos, quer marcados com fluorescência ou cong�icas como células do doador ou aceitador. Possível estudar individuais células / clones; apenas "contaminantes" são os fibroblastos de pele humana para fornecer ECM necessários para suportar a TEC. Imagem limited à penetração profundidade de microscopia de dois fótons ao vivo; permitir a análise FACS ou triagem; estudos de expressão gênica requerem FACS classificação do tipo de célula desejada depois cultura. Totalmente acessível a imagem; adequado para análise FACS, imuno-histoquímica, e os estudos de expressão gênica.

Tabela 1. Comparação entre dois sistemas de cultura de timo 3D.

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Discussion

Ao lado RTOCs, o OTCs 3D têm sido, de longe, superior em termos de diferenciação do TCE e PGE manutenção / indução (Tabela 1) em comparação com outros (i) 'culturas 3D simplificadas' usando - fibroblastos sozinho, sem o cadafalso; (Ii) sistemas 2D utilizando - células fibroblastos / alimentador de co-cultivadas com TEC 10, (iii) células 3T3-J2 em que os clones TEC desenvolver, mas é perdida PGE, (iv) Matrigel ou (v) de componentes da matriz extracelular (dados não publicados). PGE foi mantida durante até 7 dias no OTC 3D, 4 dias, sendo o ponto de tempo óptimo, posteriormente, PGE começa a declinar. Outras características morfológicas do TCE foram mantidas por até 14 dias. Curiosamente, o OTCs apoiou o estágio final de diferenciação MTEC visto pelos Hassall-estruturas como, ocasionalmente, formados 10.

O thymi usado para OTCs foram derivadas de camundongos jovens pós-natais como eles têm uma maior propensão a sobreviver na cultura em comparação com thymi adulto. TEC derivadas from embrionário timos ainda não foram testados em OTC. Mais ainda, depois do período de digestão longo (não utilizando tripsina devido a clivagem de certos epitopos) as células apareceram mais viável utilizando MACS em vez de células de triagem FACS. Usando um protocolo de enriquecimento positivo de duas etapas em colunas MACS (esferas anti-PE) de CD80 + células mTEC adicionalmente melhorada TEC pureza.

Para a configuração OTC é essencial para se certificar de que a viscose, material fibroso não tecido é cortado em círculos afiados, bem demarcadas sem fragmentos soltos ou serrilhada extremidades como dito acima que exatamente se encaixam em 12 inserções bem-cultura. Alternativamente, suportes tais como viscose BEMCOT- limpador H-3 (http://www.bemliese.com) também pode ser usado. O tamanho bem para a OTC é também crítica e deve ser testado, se diferentes de 6 poços de 12 poços e formatos de placas formatos deve ser usado.

O gel de fibrina deve ser preparado de tal modo que os componentes de fibrinogénio e de trombina não entrar em contact um com o outro antes de ser definida para a OTC, certifique-se de trocar a ponta da pipeta. Misturar os dois componentes completamente na placa sobre o andaime para formar uma superfície superior lisa. Sempre preparar um gel de teste ao lado de um poço sem andaime para verificar se há formação de coágulos adequada e ter uma boa estimativa do tempo necessário para a coagulação. Certifique-se de que o gel de fibrina na OTC completamente coagulado antes de fornecer as culturas com a mídia.

Após o término das culturas das células mTEC semeados podem ser facilmente recuperados por digestão enzimática (colagenase / dispase) do gel de fibrina, que pode ser usado para a caracterização de células mTEC cultivadas, por exemplo, por citometria de fluxo ou de PCR

Os OTCs 3D aqui descritos tem o potencial para estudar ou manipular vários parâmetros TEC a saber: 1) estudar e / ou manipular (via siRNA, oligos morfolino) vias de desenvolvimento e as funções de células mTEC; 2) para estudar o papel das células T em células mTEC desenvolvermento; 3) para CTECs cultura; 4) para testar o potencial de células progenitoras de células-tronco derivadas do timo; 5) para humanos TEC cultura e células-tronco; 6) para realizar solteiro TEC ensaios clonais. O OTCs 3D representam uma técnica de cultura elaborada emulando parte do microambiente in vivo timo. Deve-se ressaltar que quaisquer ensaios adicionais aplicadas a TEC na configuração atual OTC terá de ser exaustivamente testado e otimizado separadamente.

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Disclosures

Os autores declaram que não há conflito financeiro ou comercial de interesse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 mice  Charles River WIGA
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
CD45 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Streptavidin Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) Ref. 12
CD80-PE antibody BD Pharmingen 553769
CD45-PerCP antibody BD Pharmingen 557235
Ly51-FITC antibody BD Pharmingen 553160
CDR1-Pacific Blue Ref. 15
Keratin 14 antibody Covance PRB-155P
Vimentin antibody Progen GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes (Invitrogen GmbH) A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Invitrogen C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10425
12-well filter inserts (thincerts) Greiner bio-one 657631
12-well plate Greiner 665180-01
Jettex 2005/45 ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
PBS Serva 47302.03
DMEM Lonza BE12-604F
DMEM/F12 Lonza BE12-719F
HEPES Gibco 15630-049 
FBS Gold GE Healthcare A11-151
Aprotinin (Trasylol) Bayer 4032037
Cholera toxin Biomol G117
Hydrocortisone Seromed (Biochrom) K3520
L-ascorbic acid Sigma A4034
TGF-ß1 Invitrogen PHG9214
RANKL R&D systems 462-TR-010
Thermolysin Sigma Aldrich  T-7902
OCT Compound TissueTek 4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) Invitrogen 10296028
FastPrep FP120 Thermo Scientific
Collagenase Type IV  CellSystems LS004189 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase) CellSystems LS002104 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I  Roche 11 284 932 001 25 µg/ml final conc.

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References

  1. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  2. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
  3. Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
  4. Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
  5. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  6. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  7. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. (2008).
  8. Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
  9. Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
  10. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  11. Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
  12. Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
  13. Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
  14. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
  15. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).

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