3D Organotypic Co-kultur Modell Stöd Medullary Thymic epitelcellproliferation, differentiering och promiskuös Gene Expression

1Division of Developmental Immunology, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Genetics of Skin Carcinogenesis, German Cancer Research Center (DKFZ)
* These authors contributed equally
Published 7/30/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Pinto, S., Stark, H. J., Martin, I., Boukamp, P., Kyewski, B. 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression. J. Vis. Exp. (101), e52614, doi:10.3791/52614 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Intra-tymisk T-cell utveckling kräver en invecklad tredimensionellt nätverket består av olika stromaceller, det vill säga icke-T-celler. Tymocyter passera denna byggnadsställning på ett mycket samordnat tid och rum ordning medan sekventiellt passerar obligatoriska kontrollpunkter, det vill säga, T-cells härstamning engagemang, följt av T-cellsreceptor repertoar generation och val före exporten i periferin. De två stora bosatt celltyper som utgör denna ställningen är kortikala (cTECs) och medullär tymiska epitelceller (mTECs). Ett viktigt inslag i mTECs är den så kallade promiskuösa uttryck av många vävnadsbegränsade antigener. Dessa vävnadsbegränsade antigener presenteras för omogna tymocyter direkt eller indirekt av mTECs eller tymiska dendritiska celler, respektive resulterar i självtolerans.

Lämpliga in vitro-modeller emulerar utvecklingsvägar och funktioner cTECs och mTECs finns för närvarande lackung. Denna brist på lämpliga experimentella modeller har till exempel svårare att analysera promiskuösa genuttryck, som fortfarande är dåligt känd på cellulär och molekylär nivå. Vi anpassade en 3D organotypic co-kultur-modellen till kultur ex vivo isolerade mTECs. Denna modell var ursprungligen tänkt att odla keratinocyter på ett sådant sätt för att generera en hudekvivalent in vitro. 3D-modellen bevaras viktiga funktionella egenskaper hos MTEC biologi: (i) spridning och terminal differentiering av CD80 lo, Aire-negativ till CD80 hej, Aire-positiva mTECs, (ii) mottaglighet för RANKL, och (iii) ihållande uttryck av FoxN1, Aire och vävnads begränsade gener i CD80 hi mTECs.

Introduction

Utvecklings tymocyter utgör omkring 98% av tymus, medan de återstående 2% består av en mängd celler som kollektivt komponera tymisk stroma (dvs., epitelceller, dendritiska celler, makrofager, B-celler, fibroblaster, endotelceller). De yttre kortikala epitelceller (cTECs) procure invandringen av pro-T-celler från benmärgen, T-cell lineage induktion hos multi pre-T-celler och positiv selektion av själv-MHC-begränsad omogna tymocyter. De inre medullär tymiska epitelceller (mTECs) är inblandade i toleransinduktion av dessa tymocyter med en hög affinitet TCR för själv-peptid / MHC-komplex genom att antingen inducera negativ selektion eller deras avvikelse i T reglerande cellhärkomst. I samband med centrala toleransinduktion, mTECs är unika genom att de uttrycker ett brett spektrum av vävnads begränsad självantigener (Trás) vilket speglar den perifera själv. Detta fenomen kallas promiskuöst genuttryck (PGE)1,2.

De flesta av dagens studier på denna fascinerande celltyp lita på ex vivo isolerade celler, som olika korttids 2D odlingssystem alltid resulterat i förlust av PGE och nyckelregulator molekyler som MHC klass II, FoxN1 och Aire inom de första 2 dagar 3-6 . Det förblev dock oklart, vilka särskilda komponenter och funktioner i den intakta 3D nätverket av tymus saknades i 2D-modeller. Åter aggregering tymisk organkultur (RTOC) har varit hittills den enda 3D-system som gör det möjligt att studera T-cell utveckling, å ena sidan, och stromal cellbiologi, å andra sidan, i en intakt tymus mikro 7. Ändå RTOCs har vissa begränsningar, dvs de redan innehåller en komplex blandning av celler, kräver inmatning av fetala stromaceller och uthärda en maximal odlingsperiod på 5 till 10 dagar.

Bristen på reduktionistisk i odlings vitro-system har försvårat studiet avflera aspekter av T-cellutveckling och tymus organogenesen inte minst molekylär reglering av PGE och dess relation till utvecklingsbiologi av mTECs.

På grund av nära släktskap med strukturerad organisation av epitelceller i huden och bräss, valde vi en 3D organotypic kultur (OTC) system som hade utvecklats ursprungligen för att efterlikna differentieringen av keratinocyter in vitro och därmed skapa en dermal ekvivalent. OTC-systemet består av en inert ställningsmatris som överdras med dermala fibroblaster som är fångade i en fibringel, på vilket keratinocyter ympas 8,9. Här ersatte vi keratinocyter med renade mTECs. Medan hålla de grundläggande funktionerna i den här modellen, vi optimerat vissa parametrar.

I den antagna OTC-modellen mTECs frodats, genomgick terminal differentiering och underhållas MTEC identitet och PGE, alltså nära härma in vivo mTECs utveckling

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studien har godkänts av den etiska kommittén för Regierungspräsidium Karlsruhe. Alla djur inhystes under specifika patogenfria betingelser vid den tyska Cancer Research Center (DKFZ). För alla kulturexperiment musungar som sträcker sig från 1 till 7 dagar gamla, användes.

1. Isolering av mTECs från Thymus

OBS! Följande rötnings steg utfördes såsom beskrivits tidigare en under sterila betingelser med vissa modifieringar enligt följande.

  1. Halshugga musen valpar och ta bräss. Placera Thymi på is i en petriplatta innehållande RPMI 1640-medium (innehållande 5% FCS).
  2. Skär Thymi till fina, små bitar och lägg i en rundbottnad rör med ~ 5-30 ml RPMI-medium och försiktigt rör med hjälp av en magnet för 10 minuter vid RT
  3. Därefter dekantera supernatanten innehållande huvudsakligen tymocyter och smälta den återstående vävnaden i följd med en omgång av collagenaSE typ IV (0,2 mg / ml och 57 U / ml slut concentartion) under 15 min vardera vid 37 ° C, följt av kollagenas / dispas (0,2 mg / ml och 1,2 U / ml slutlig koncentration) under 25 minuter vardera vid 37 ° C i ett vattenbad med magnetomrörare tills Thymi är helt smälta. Använd 1 ml enzym per 02:58 Thymi.
  4. Skaka vävnaden gång varje 7-10 min med en pasteurpipett. Pool för kollagenas / dispase fraktionerna och filtrera genom ett 70 pm gasbinda.
  5. Berika de mTECs genom magnetisk cellsortering (MACS). Utför reningen av mTECs genom magnetisk cellsortering såsom beskrivits tidigare 11, och visas i Figur 1.
    OBS: För magnetisk sortering av mTECs använde vi följande antikroppar: anti-CD80-PE (16-10A1, använd vid 1: 100 utspädning) och anti-EpCAM-bio (G8.8, användning vid 1: 100 utspädning) 12. Omogna och mogna mTECs hjälp MACS definierades som: CD45 - EpCAM + CD80 - och CD45 - CD80 + respektivEly.
  6. Efter MACS rening (renhet av omogna mTECs = 83,1 ± 6,3% och mogna mTECs = 79,23 ± 3,42%), ympa mTECs på de organotypiska kulturer som beskrivs nedan (avsnitt 2.3).
  7. Alternativt, sortera mTECs genom FACS (med 100 pm munstycke) efter CD45 MACS utarmning med följande antikroppar: anti-CD45-PerCP (30-F11, användning vid 1: 100 utspädning), anti-Ly51-FITC (6C3, använd vid 1 : 100 utspädning), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, användning vid 1: 500 utspädning) och anti-CD80-PE (16-10A1, användning vid 1: 100 utspädning). Uteslut döda celler med hjälp av propidiumjodid (1: 5000) (Dag 4). Omogna och mogna mTECs hjälp FACS definierades som: PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - och PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 + respektive.

2. 3D Organotypiska Samkulturer (OTC)

OBS: 3D-dermal konstruktioner för organotypic odling av keratinocytes framställdes såsom beskrivits tidigare 9,13. Vid alla steg cellerna inkuberades vid 37 ° C och 5% CO2. De OTCs använder mTECs framställdes med smärre ändringar enligt följande.

  1. Framställning av humana fibroblaster
    OBS: De humana hudfibroblaster erhölls från Explantation kulturer av de-epidermised dermis som beskrivits tidigare 9.
    1. I korthet, skär remsor av human hud (~ 5 cm lång) och behandla med termolysin (0,5 mg / ml i saltlösning med 10 mM Hepes pH 7,4) O / N vid 4 ° C.
    2. Därefter, separera epidermis från dermis använder pincett.
    3. Fint skär dermis i små bitar, plats i en 10 cm Petri plattan och låt torka i 1-2 timmar under en steril luftflöde. Komplettera explantaten regelbundet med DMEM innehållande 20% FBS.
    4. Dela upp ur växande fibroblaster när konfluenta (vanligtvis runt 3 veckor) med 0,1% trypsin och se till att explantaten fortsätta att följa plattan för vidare convarandra följande rundor av utväxt.
    5. Expandera fibroblaster från samma explantat för upp till 3 gånger i DMEM med 10% FBS och Cryo-bevara dem 14. Använd samma sats av fibroblaster för varje experimentserie.
      OBS: De fibroblaster inte bestrålas under uppställningen av de dermala ekvivalenter.
  2. Framställning av scaffold
    1. Skär 0,4-0,6 mm tjock viskos, vävt fibermaterial (produktdetaljer för att stödja Excel-ark) i väl avgränsade cirklar med en skarp 11 mm metall diameter hålslag exakt passa in i 12 väl filterinsatser. Sedan placera den i 12- och filterinsatsen (polyester kapillär porer membran, 3 um porstorlek) som en byggnadsställning. Placera den kompletta filter installationen i en steril 12-brunnar.
    2. Förbered fibringelen använder ett fibrinlim-kit för kirurgi bestående av en kombination av fibrinogen och trombin. Pre-späda fibrinogen- samt trombin-komponenten i satsen till 8 mg / ml och 10enheter / ml, respektive. För en enda brunn i en 12-brunnar Gör så här.
      1. Späd 100 ul fibrinogen (8 mg / ml) med 100 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan Ca 2 + och Mg 2 +, pH 7,0. Späd 100 | il trombin (10 enheter / ml) med 100 | il FCS innehållande 270.000 fibroblaster.
      2. Dispensera 200 ul av trombin innehållande fibroblaster cell blandningen på ställningen, till vilka tillför 200 pl fibrinogen (1: 1 blandning), vilket resulterar i en slutlig koncentration av fibrinogen av 2 mg / ml och av trombin av 2,5 enheter / ml. Blanda väl och fördela jämnt över hela området av byggnadsställningen genom försiktig pipettering (Dag 1).
        OBS: Efter 30 minuter vid 37 ° C av en koagel som omsluter fibroblasterna kommer att ha bildats, fyller helt inre utrymmen i byggnadsställningen och bildar en slät övre yta.
  3. Samodling med mTECs
    1. För pre-kultur, Doppa kulturer organDMEM med 10% FBS, 50 | ig / ml L-askorbinsyra och 1 ng / ml TGF-β1 med ett mediumbyte varannan dag under 4-5 dagar.
    2. På dagen för MTEC sådd, byt mediet genom rFAD-medium (1: 1 DMEM + DMEM / F12) med 10% FBS, 10 -10 M koleratoxin, 0,4 mg / ml hydrokortison, 50 fig / ml L-askorbinsyra, RANK-ligand (0,1 | j, g / ml) och 500 enheter / ml Aprotinin, vilket förhindrar för tidigt utvecklad fibrinolys genom serinproteaser som utsöndrats av fibroblaster.
    3. 7-8 timmar senare ställt upp samkulturer genom ympning 250.000 mTECs (antingen hela mTECs eller CD80 lo och CD80 hi grupper), i en volym av 100 pl per brunn ovanpå fibroblast schavotten. Räkna celler med hjälp av en Neubauer kammare (Dag 4).
      OBS: Vid alla gånger bräss 3D organotypiska kulturer nedsänkt i media skillnad hud OTC som är luftkonditione lyftas.
    4. Efter 24 timmars inkubation, förse kulturerna med medelhög (total medel utbyte) som nämnts ovan (steg 2.3.2) nu containing reducerade mängder av Aprotinin, 250 enheter / ml (dag 5).
    5. För att bedöma den proliferativa aktiviteten av mTECs, till EDU (6,7 pM / ml, dvs 10 pM / brunn) till OTC för 4 h före terminering av kulturerna. Utför färgning av OTC Cryo-sektioner som beskrivs i edu Imaging Kit i kombination med co-färgning av keratin 14. Bestäm proliferativa indexen mTECs, antingen genom att räkna K14 + edu + celler i två sektioner av varje kultur prov eller genom flödes cytometri (EDU flödescytometri, avsnitt 1,7 men i stället för Ly51-FITC använda CDR1-PB 15 vid en 1: 100 spädning och 2.3.6.4).
    6. Efter 4-7 dagar av co-kultur, avsluta OTC och processen för RNA-isolering, kryo-sektionering eller FACS-analys (Dag 8-11).
      1. Avsluta kulturer med hjälp av en pincett, separera schavotten / huden motsvarande från filtret av brunnen insatsen.
      2. För Cryo-sektionering, bädda in hela OTC i OCT-förening och frysa i liquid kväveånga innan kryo-sektionering. Förbered 5-7 pm tjocka OTC sektioner med hjälp av en kryostat och förvara vid -20 ° C fram till användning. För immun histokemi av kryo-sektione OTC använda anti-keratin 14 (AF64, användning vid 1: 1000 utspädning), och anti-vimentin (GP53, användning vid 1: 100 utspädning) antikroppar. Utför indirekt immun histokemi färgning med hjälp av respektive sekundära antikroppar.
      3. För RNA-isolering, tillsätt 1 ml denatureringslösning (innehållande fenol och guanidintiocyanat) i ett skruvlock av en 2 ml RNas-fritt rör. Skär hela OTC i bitar med en skalpell och lägg i rör som innehåller denatureringslösning. Mekaniskt strimla OTC med FastPrep instrumentet två gånger under 30 sekunder med en hastighet av 6,0, placera däremellan på is under 2 min (provet kan lagras vid -80 ° C efter denna punkt). Om fryst vid -80 ° C, tina på is. Centrifugera rören vid 11,500-13,000 rpm i 10 min vid 4 ° C. Överför supernatanten till ett nytt rör, inkubera i 5 min vid RT och följ RNA-isoleringsprotokoll med användning av syra guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform-extraktion såsom beskrivs av tillverkaren.
      4. För FACS-analys, ta bort ställningen och separera membranet från fibrin / fibroblast / MTEC gel. Finskuren gelén med en skalpell och smälta det i en FACS-rör under ~ 20 min eller tills den är helt digererades med 2 ml kollagenas / dispas vid 37 ° C i ett vattenbad med magnetomrörare. Skaka enzymlösningen med en Pasteurpipett gång varje 5 minut. Efter fullständig digestion, filtrera cellsuspensionen genom ett 70 pm filter; färga encellssuspension med användning av de antikroppar som beskrivs i 1,7 och analysera genom flödescytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi antog en 3D organotypic co-kultur-modellen (3D OTC) som hade ursprungligen utvecklats för in vitro långtidsodling av keratinocyter 9. MACS-berikade mTECs (se MACS anrikningsschema Figur 1) såddes på en byggnadsställning bestående av en fibringel och infångade fibroblaster. Fibroblasterna ger den väsentliga extracellulära matrisen (ECM) uppbär mTECs in vitro. MTECs odlades i OTC för 4-14 dagar i närvaro av RANKL i submersa kulturer skillnad keratinocyter, som är luftexponerade härma deras in vivo-miljö (se OTC uppställningsschema Figur 2).

Båda MTEC delmängder analyseras här (dvs. CD80 lo och CD80 hi mTECs) överlevde under hela odlingsperioden på upp till 14 dagar. MTECs identifierades genom keratin 14 uttryck och var lätt att skilja från vimentin-positiva fibroblaster (Figur 3B). Intressant, omogna och mogna mTECs växte i olika mönster i odling. CD80 lo mTECs typiskt utformade dubbelskikt (i nära kontakt med fibroblaster), medan CD80 hi mTECs tenderade att bilda kompakta cellaggregat avgränsas av fibroblaster. Dessa mönster var mycket reproducerbar.

De MTEC delmängder inte bara överlevt utan också frodats i 3D OTC villkor som fastställdes genom edu inkorporering (Figur 3C, 3D). Intressant, CD80 lo mTECs frodats i högre takt i närvaro av RANKL, medan det omvända gällde för CD80 hi mTECs 10.

Dessutom CD80 lo mTECs differentierade till CD80 hi mTECs i närvaro av RANKL inom fyra dagars odling, vilket framgår av den starka uppreglering av CD80. De differentierade mTECs upprätthålls också ett uttryck för Aire, FoxN1 (genen och protein) samt promiskuöst uttryckte Aire oberoende och -beroende TRA 10.

Figur 1
Figur 1. MACS anrikning av TEC. Efter filtrering, var mTECs berikat från bräss enda cell suspensionen med hjälp av magnetisk cellsortering (MACS). Först var de hematopoetiska cellinjer utarmat med hjälp av anti-CD45 mikropärlor. CD45 - celler inkuberades sedan med anti-CD80 PE-antikropp, följt av anti-PE mikrokulor. Eluatet innehållande CD80 + -mature mTECs var direkt odlades på OTCs, medan genomflödet innehöll CD80 - omogna mTECs och andra stromaceller. MTECs ades ytterligare berikas med hjälp av anti-EpCAM-bio antikropp och streptavidin mikropärlor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. System för stegvis installationen av 3D OTC. Hängställning matris placerades i en 12-brunnars filterinsats. De dermala fibroblaster från explanterad huden (270.000 celler / OTC brunn) ympades i en fibringel (bestående av 1: 1-förhållande av fibrinogen och trombin). Dessa dermala medel kvarstod under 4-5 dagar med DMEM + näringsämnen tills mTECs (250.000 celler / OTC brunn) såddes på topp och odlades med medium berikat med olika näringsämnen (rFAD + näringsämnen).

Figur 3
Figur 3. Tillväxtmönster och spridning av mTECs inom OTCs. Den anrikade CD80 lo mTECs tenderar att växa som ett bi-skikt i nära kontakt med fibroblaster (A), wh ereas de differentierade CD80 hi mTECs växa som cellaggregat eller snäva kluster (B). OTC märktes på dag 4 av kultur med anti-keratin 14 (röd) och anti-vimentin antikroppar (grön) tillsammans med nukleär färgning (Hoechst, blå). För att utvärdera spridningen av mTECs ades OTC pulsade med EDU (6,7 pm / ml, dvs 10 iM / brunn) under 4 timmar före avslutning av kulturerna. OTC Cryo-sektioner färgades sedan med anti-keratin 14 (grön), och EDU-Click-iT reaktionsblandningen (magenta) tillsammans med nukleär färgning (Hoechst, blå). Bilderna skildrar förökande edu + CD80 lo mTECs (C) och Edu + CD80 hi mTECs (D) visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

"Cellspacing =" 0 "> Återaggregering tymiska kulturer organ (RTOC) Organotypiska samkulturer (OTC) Användbar system för att studera cellulära interaktioner som lätt kan övervakas och manipulerade med hjälp av en i stort sett intakt 3D thymic arkitektur; utvecklas till en väl organiserad struktur på transplantation. Användbar system för att studera utvecklingen och differentieringen av berikade / renade tymiska epitelceller i en konstgjord 3D-nätverket som genereras av humana hudfibroblaster infångade i en fibrin byggnadsställning. Väl etablerade för att studera utvecklingen av tymiska epitelceller och tymocyter med användning inhibitorer eller modifieringsmedel, som tränger kapseln. Mottaglig för manipulera bräss epitel utveckling eller att studera tymocyt utveckling i samarbete kultur med TEC. Eftersom systemetär luft-lyftes är membranet porstorlek (0,8 | j, m) avgörande när tillförsel faktorer till RTOC: större molekyler kan inte tränga genom membranet och / eller kapsel. Kultur är nedsänkt i media, vilket underlättar upptag av ämnen / faktorer (framgångsrikt testats med hjälp av morfolinogrupper oligos). Vuxna och efter förlossningen TEC eller tymocyter kan spetsas till foster RTOCs. Post-natal TEC växa bättre än vuxna TEC; foster TEC ännu inte testats. Kräver embryonala E14-14.5 Thymi (optimalt) för att möjliggöra för återaggregering och integrering av det tillsatta önskade populationen; svårt att kontrollera foster tymus (acceptor) cellkomposition; RTOCs kräver celler från antingen fluorescerande eller kongena möss som donator eller acceptor celler. Möjligt att studera enstaka celler / kloner; bara "föroreningar" är humana hudfibroblaster som krävs för att ge ECM att stödja TEC. Imaging limited penetrationsdjup av levande två-foton mikroskopi; mottagliga för FACS-analys eller sortering; genuttryck studier kräver FACS-sortering av den önskade celltypen efter odling. Fullt tillgänglig för bildbehandling; lämplig för FACS-analys, immun histokemi, och genuttryck studier.

Tabell 1. Jämförelse mellan två 3D tymiska odlingssystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vid sidan av RTOCs har 3D OTCs varit överlägset överlägsen när det gäller TEC differentiering och PGE underhåll / induktion (tabell 1) jämfört med andra (i) förenklade 3D ​​kulturer "med - fibroblaster ensam utan ställningen; (Ii) 2D system som använder - fibroblaster / matarceller samodlade med TEC 10, (iii) 3T3-J2 celler vari TEC kloner utvecklas, men PGE förloras, (iv) matrigel eller (v) ECM-komponenter (opublicerade data). PGE kvarstod i upp till 7 dagar i 3D OTCs, 4 dagar vara den optimala tiden punkten därefter börjar PGE sjunka. Andra morfologiska TEC funktioner kvarstod i upp till 14 dagar. Intressant, det OTC stödde slutstadiet av MTEC differentiering ses av tillfälligt bildade Hassall liknande strukturer 10.

Den Thymi används för OTC härleddes från unga postnatala möss, eftersom de har en högre benägenhet för att överleva i odling jämfört med vuxna Thymi. TEC härledd from embryonala Thymi har ännu inte testats i OTC. Mer så, efter den långa uppslutningsperioden (inte använder trypsin på grund av klyvning av vissa epitoper) cellerna verkade mer lönsamt att använda MACS snarare än FACS sortering celler. Med hjälp av en två-stegs positiv anrikning protokoll om MACS kolumner (anti-PE pärlor) av CD80 + mTECs ytterligare förbättrad TEC renhet.

För OTC-installationen är det viktigt att se till att viskos, är vävt fibermaterial skärs i skarpa, väl avgränsade cirklar utan lösa fragment eller sågtandade ändar enligt ovan att exakt passa in i 12 väl kulturinsatser. Alternativt kan ställningar såsom BEMCOT- viskos torkare M-3 (http://www.bemliese.com) också användas. Den väl storlek för OTC är också kritisk och bör testas, om andra än 6 brunnar och 12 brunnar format plattformat bör användas.

Fibringelen bör beredas så att fibrinogen och trombin komponenter inte kommer i contact med varandra innan de satt på OTC, se till att byta ut pipettspetsen. Blanda de två komponenterna noga i plattan över ställningen för att bilda en jämn övre yta. Förbereda alltid ett test gel tillsammans i en brunn utan byggnadsställning för att kontrollera korrekt proppbildning och att ha en god uppskattning av den tid som krävs för koagulering. Kontrollera att fibringelen i OTC har helt koagulerat innan leverera kulturerna med media.

Vid uppsägning av kulturerna seedade mTECs kan lätt hämtas genom enzymatisk spjälkning (kollagenas / dispas) av fibringelen, som kan användas för att karakterisera odlade mTECs t.ex. genom flödescytometri eller PCR

3D OTC som beskrivs här har potential att studera eller manipulera flera TEC parametrar nämligen: 1) för att studera och / eller manipulera (via siRNA, morfolino oligos) utvecklingsvägar och funktioner mTECs; 2) att studera betydelsen av mTECs i T-cell utvecklasning; 3) att odla cTECs; 4) för att testa stamfader potential tymiska härledda stamceller; 5) att odla mänskliga TEC och stamceller; 6) för att utföra enkla TEC klonala analyser. 3D OTC representerar en utarbetad odlingsteknik emulera en del av in vivo bräss mikro. Det bör understrykas att ytterligare analyser tillämpas på TEC i den aktuella OTC installationen måste noggrant testade och optimeras separat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar ingen ekonomisk eller kommersiell intressekonflikt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 mice  Charles River WIGA
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
CD45 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Streptavidin Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) Ref. 12
CD80-PE antibody BD Pharmingen 553769
CD45-PerCP antibody BD Pharmingen 557235
Ly51-FITC antibody BD Pharmingen 553160
CDR1-Pacific Blue Ref. 15
Keratin 14 antibody Covance PRB-155P
Vimentin antibody Progen GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes (Invitrogen GmbH) A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Invitrogen C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10425
12-well filter inserts (thincerts) Greiner bio-one 657631
12-well plate Greiner 665180-01
Jettex 2005/45 ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
PBS Serva 47302.03
DMEM Lonza BE12-604F
DMEM/F12 Lonza BE12-719F
HEPES Gibco 15630-049 
FBS Gold GE Healthcare A11-151
Aprotinin (Trasylol) Bayer 4032037
Cholera toxin Biomol G117
Hydrocortisone Seromed (Biochrom) K3520
L-ascorbic acid Sigma A4034
TGF-ß1 Invitrogen PHG9214
RANKL R&D systems 462-TR-010
Thermolysin Sigma Aldrich  T-7902
OCT Compound TissueTek 4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) Invitrogen 10296028
FastPrep FP120 Thermo Scientific
Collagenase Type IV  CellSystems LS004189 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase) CellSystems LS002104 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I  Roche 11 284 932 001 25 µg/ml final conc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  2. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
  3. Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
  4. Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
  5. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  6. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  7. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. (2008).
  8. Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
  9. Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
  10. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  11. Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
  12. Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
  13. Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
  14. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
  15. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats