3D organotypiques Co-culture Modèle Soutenir médullaire thymique des cellules épithéliales prolifération, la différenciation et Promiscuous Gene Expression

1Division of Developmental Immunology, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Genetics of Skin Carcinogenesis, German Cancer Research Center (DKFZ)
* These authors contributed equally
Published 7/30/2015
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Developmental Biology

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Pinto, S., Stark, H. J., Martin, I., Boukamp, P., Kyewski, B. 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression. J. Vis. Exp. (101), e52614, doi:10.3791/52614 (2015).

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Abstract

Le développement des cellules T intra-thymique nécessite un maillage tridimensionnel complexe composé de diverses cellules stromales, à savoir, les cellules non-T. Thymocytes traversent cette échafaudage dans un ordre temporel et spatial très coordonnée en passant séquentiellement points de contrôle obligatoires, à savoir, l'engagement de la lignée de cellules T, suivie par récepteur des cellules T génération et la sélection du répertoire avant leur exportation vers la périphérie. Les deux types de cellules résident principaux formant ce échafaudage sont des cellules épithéliales thymiques corticales (CTEC) et médullaires (mTECs). Une caractéristique clé de mTECs est l'expression que l'on appelle la promiscuité de nombreux antigènes tissulaires restreint. Ces antigènes de tissus soumis à des restrictions sont présentés pour les thymocytes immatures directement ou indirectement par mTECs thymiques ou les cellules dendritiques, ce qui entraîne respectivement à une auto-tolérance.

Appropriés modèles in vitro imitant les voies de développement et les fonctions du CTEC et mTECs sont actuellement lacroi. Ce manque de modèles expérimentaux adéquats a entravé par exemple l'analyse de l'expression génique promiscuité, qui est encore mal comprise au niveau cellulaire et moléculaire. Nous avons adapté un modèle organotypique 3D co-culture à la culture ex vivo mTECs isolés. Ce modèle a été conçu à l'origine pour cultiver des kératinocytes de manière à produire un équivalent de peau in vitro. Le modèle 3D conservé des caractéristiques fonctionnelles clés de mTEC biologie: (i) la prolifération et la différenciation terminale des CD80 lo, Aire-négatif en CD80 salut, Aire-positif mTECs, (ii) la réactivité de RANKL, et (iii) l'expression soutenue de Foxn1, Aire et les gènes de tissus restreinte dans CD80 mTECs hi.

Introduction

Thymocytes en voie de développement représentent environ 98% du thymus, tandis que les 2% restants se compose d'une variété de cellules qui composent collectivement le stroma thymique (c.-à cellules epitheliales, les cellules dendritiques, les macrophages, les cellules B, les fibroblastes, cellules endothéliales). Les cellules épithéliales corticales extérieures (CTEC) procurent immigration de cellules pro-T de la moelle osseuse, T lignée cellulaire induction dans les cellules multipotentes pré-T et la sélection positive de soi-CMH limités thymocytes immatures. Les cellules médullaires thymiques épithéliales internes (mTECs) sont impliqués dans l'induction de tolérance de ces thymocytes avec une haute affinité pour les complexes TCR auto-peptide / CMH soit par induction sélection négative ou leur déviation dans la lignée de cellules T régulatrices. Dans le cadre de la tolérance centrale induction, mTECs sont uniques en ce qu'ils expriment un large spectre des auto-antigènes tissulaires restreint (EMR) reflétant ainsi l'auto périphérique. Ce phénomène est appelé l'expression du gène de promiscuité (PGE)1,2.

La plupart des études actuelles sur ce type de cellule fascinante comptent sur ​​ex vivo des cellules isolées, que divers systèmes de culture 2D à court terme invariablement entraîné la perte de PGE et des molécules régulatrices clés comme le CMH de classe II, Foxn1 et Aire dans les 2 premiers jours 3-6 . Il restait toutefois incertaine, les composants et caractéristiques de la maillage 3D intacte du thymus particuliers étaient manquantes dans les modèles 2D. La culture d'organe thymique ré-agrégation (RTOC) a été jusqu'à présent le seul système 3D qui permet l'étude du développement des lymphocytes T, d'une part, et de la biologie des cellules stromales, d'autre part, dans un microenvironnement thymique intacte 7. Cependant, RTOCs ont certaines limites, à savoir, ils contiennent déjà un mélange complexe de cellules, exiger l'entrée de cellules stromales fœtales et supporter une période de culture maximal de 5 à 10 jours.

Le manque de réductionniste dans les systèmes de culture in vitro a entravé l'étude deplusieurs aspects du développement des cellules T et thymique organogenèse pas moins la régulation moléculaire de pGE et sa relation à la biologie du développement de mTECs.

En raison de la proximité-apparentement de l'organisation structurée des cellules épithéliales de la peau et du thymus, nous avons opté pour un système 3D culture organotypique (OTC) qui avait été développé à l'origine pour émuler la différenciation des kératinocytes in vitro et donc de créer un équivalent dermique. Le système se compose d'un OTC matrice inerte recouvert d'échafaudage avec des fibroblastes dermiques qui sont piégés dans un gel de fibrine, sur lequel les kératinocytes sont ensemencés 8,9. Ici, nous avons remplacé les kératinocytes avec mTECs purifiés. Tout en gardant les caractéristiques de base de ce modèle, nous avons optimisé certains paramètres.

Dans le modèle de gré à gré adoptée mTECs proliféré, a subi une différenciation terminale et maintenu identité mTEC et PGE, imitant ainsi étroitement vivo développement des mTECs dans

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Protocol

Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique de la Regierungspräsidium Karlsruhe. Tous les animaux ont été logés dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques du Centre de recherche allemand sur le cancer (DKFZ). Pour tous les petits expériences de culture de souris allant de 1 à 7 jours d'âge ont été utilisés.

1. Isolement de mTECs de Thymus

REMARQUE: Les étapes de digestion suivantes ont été réalisées comme décrit précédemment 1 dans des conditions stériles avec quelques modifications comme suit.

  1. Décapiter les souriceaux et retirer le thymus. Placez le thymus sur de la glace dans une boîte de Pétri contenant du milieu RPMI 1640 (contenant 5% de FCS).
  2. Couper le thymus en fines, de petits morceaux et les mettre dans un tube à fond rond avec ~ 5-30 ml du milieu RPMI et remuer doucement en utilisant un aimant pendant 10 min à température ambiante.
  3. Par la suite, décanter le surnageant contenant principalement thymocytes et digérer séquentiellement de tissu restant avec un tour de Collagenasoi de type IV (0,2 mg / ml et 57 U / ml concentartion finale) pendant 15 minutes chacun à 37 ° C, suivi par de la collagénase / dispase (0,2 mg / ml et la concentration finale de 1,2 U / ml) pendant 25 minutes chaque à 37 ° C dans un bain d'eau sous agitation magnétique jusqu'à ce que le thymus est complètement digéré. Utilisez 1 ml enzyme par deux à trois thymus.
  4. Agiter le tissu une fois tous les 7 à 10 min avec une pipette Pasteur. Réunir les fractions de la collagénase / dispase et filtrer à travers une gaze de 70 um.
  5. Enrichir les mTECs par la cellule tri magnétique (MACS). Effectuer la purification de mTECs par tri cellulaire magnétique 11 tel que décrit précédemment, et représenté sur la figure 1.
    NOTE: Pour tri magnétique des mTECs nous avons utilisé les anticorps suivants: anti-CD80-PE (16-10A1, utilisation à dilution 1: 100) et anti-EpCAM-bio (G8.8, l'utilisation à dilution 1: 100) 12. MTECs immatures et matures utilisant MACS ont été définies comme suit: CD45 - EpCAM + CD80 - et CD45 - CD80 + respectivEly.
  6. Après MACS purification (pureté de mTECs immatures = 83,1 ± 6,3% et mTECs matures = 79,23 ± 3,42%), ensemencer les mTECs sur les cultures organotypiques comme décrit ci-dessous (section 2.3).
  7. Alternativement, tri mTECs par FACS (en utilisant 100 buse de um) après CD45 MACS appauvrissement utilisant les anticorps suivants: anti-CD45-PerCP (30-F11, l'utilisation à dilution 1: 100), anti-Ly51-FITC (6C3, utiliser au 1 : 100 dilution), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, l'utilisation à dilution 1: 500) et l'utilisation anti-CD80-PE (16-10A1, au dilution 1: 100). Exclure les cellules mortes en utilisant l'iodure de propidium (1: 5000) (Jour 4). MTECs immatures et matures utilisant FACS ont été définies comme suit: PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - et PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 +, respectivement.

2. 3D organotypiques Co-cultures (OTSC)

NOTE: Les constructions 3D-cutanée pour la culture organotypique de keratinocytes ont été préparés comme décrit ci-dessus 9,13. A toutes les étapes cellules ont été incubées à 37 ° C et 5% de CO 2. Les médicaments en vente libre en utilisant mTECs ont été préparés avec de légères modifications comme suit.

  1. Préparation des fibroblastes humains
    REMARQUE: Les fibroblastes dermiques humains ont été obtenus à partir de cultures d'explants de dé-épidermisé derme comme décrit précédemment neuf.
    1. En bref, couper des bandes de peau humaine (~ 5 cm de longueur) et traiter avec la thermolysine (0,5 mg / ml dans une solution saline avec 10 mM Hepes pH 7,4) O / N à 4 ° C.
    2. Par la suite, séparer l'épiderme du derme à l'aide de forceps.
    3. Coupez finement le derme en petits morceaux, dans une plaque de 10 cm de Pétri et laisser sécher pendant 1-2 heures sous flux d'air stérile. Compléter les explants régulièrement avec DMEM contenant 20% de FBS.
    4. Diviser les fibroblastes sur plus quand confluentes (généralement autour de 3 semaines) en utilisant 0,1% de trypsine faire en sorte que les explants continuent à adhérer à la plaque pour plus contours consécutifs de l'excroissance.
    5. Développer les fibroblastes provenant de la même explants pour un maximum de trois fois dans du DMEM avec 10% de FBS et cryo-préservation eux 14. Utiliser le même lot de fibroblastes pour chaque série expérimentale.
      NOTE: Les fibroblastes ont pas été irradiées pendant le set-up des équivalents de derme.
  2. Préparation de la Échafaudages
    1. Couper les 0,4-0,6 mm d'épaisseur de viscose, matériau fibreux non tissé (des détails du produit à soutenir feuille Excel) dans les cercles bien délimitées en utilisant une forte 11 mm de diamètre perforateur métallique pour correspondre exactement en 12 inserts bien-filtre. Ensuite, placer dans le puits 12 insert de filtre (polyester membrane capillaire des pores, 3 um de taille de pores) comme échafaudage. Placez la configuration complète de filtre dans une plaque de 12 puits stérile.
    2. Préparer le gel de fibrine en utilisant un kit de colle de fibrine pour la chirurgie constitué d'une combinaison de fibrinogène et de thrombine. Pré-diluer le fibrinogène et la thrombine en tant que composants du kit à 8 mg / ml et 10unités / ml, respectivement. Pour un seul puits d'une plaque de 12 puits, procéder comme suit.
      1. Diluer 100 ul de fibrinogène (8 mg / ml) avec 100 ul de phosphate saline tamponnée (PBS) sans Ca2 + et Mg2 +, pH 7,0. Diluer 100 ul de thrombine (10 unités / ml) avec 100 ul de FCS contenant 270.000 fibroblastes.
      2. Distribuer 200 pl de la thrombine contenant des fibroblastes de cellules se mélangent sur l'échafaudage, ce qui ajoute à 200 ul de fibrinogène (mélange 1: 1), ce qui entraîne une concentration finale de fibrinogène de 2 mg / ml de thrombine et de 2,5 unités / ml. Mélangez bien et répartir uniformément sur toute la surface de l'échafaudage par pipetage doux (jour 1).
        Remarque: Au bout de 30 min à 37 ° C renfermant un caillot les fibroblastes se sera formée, remplissant complètement les espaces internes de l'échafaudage et en formant une surface supérieure lisse.
  3. Co-culture avec mTECs
    1. Pour pré-culture, plonger les cultures d'organes enDMEM avec 10% de FBS, 50 ng / ml d'acide L-ascorbique et de 1 ng / ml de TGF-β1 avec un changement de milieu tous les deux jours pendant 4-5 jours.
    2. Le jour de l'ensemencement mTEC, remplacer le milieu par du milieu FRDA (1: 1 de DMEM + DMEM / F12) avec 10% de FBS, 10 -10 M toxine du choléra, 0,4 mg / ml d'hydrocortisone, 50 pg / ml d'acide L-ascorbique, RANK ligand (0,1 pg / ml) et 500 unités / ml d'aprotinine, empêchant ainsi la fibrinolyse précoce par des serine proteases sécrétées par les fibroblastes.
    3. 7-8 heures plus tard, les co-cultures mis en place par l'ensemencement 250.000 mTECs (soit mTECs complets, ou CD80 lo et hi CD80 sous-ensembles), dans un volume de 100 l par puits sur le dessus de l'échafaudage des fibroblastes. Compter les cellules en utilisant un Neubauer (Jour 4).
      NOTE: En tout temps les cultures organotypiques 3D thymus sont immergés dans les médias, contrairement OTC de la peau qui sont air-levée.
    4. Après 24 heures d'incubation, fournir les cultures avec un milieu (de change moyen total) comme mentionné ci-dessus (étape 2.3.2) maintenant containing réduit les montants de l'aprotinine, 250 unités / ml (Jour 5).
    5. Afin d'évaluer l'activité proliférative des mTECs, ajouter EdU (6,7 uM / ml, soit 10 uM / puits) de médicaments en vente libre pendant 4 heures avant la fin des cultures. Effectuer la coloration de gré à gré cryo-sections comme décrit dans le Kit EdU imagerie combinée avec le co-coloration de la kératine 14. Déterminer les indices de prolifération de mTECs, soit par les cellules de la K14 + Edu + comptage dans deux sections de chaque spécimen de culture ou de débit cytométrie (EdU cytométrie de flux, la section 1.7, mais au lieu de Ly51-FITC utilisent CDR1-PB 15 à une dilution de 1: 100 et 2.3.6.4).
    6. Après 4-7 jours de co-culture, de résilier les OTC et le processus d'isolement de l'ARN, cryo-sectionnement ou analyse FACS (jour 8-11).
      1. Mettre fin à la culture à l'aide d'une pince, en séparant l'équivalent échafaudage / dermique à partir du filtre de l'insert de puits.
      2. Pour cryo-sectionnement, intégrer l'ensemble de gré à gré dans le composé PTOM et geler en livapeur d'azote quid avant cryo-sectionnement. Préparer 5-7 sections um d'épaisseur de gré à gré en utilisant un cryostat et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation. Pour immuno-histochimie des OTC de cryo-coupe utiliser anti-kératine 14 (AF64, l'utilisation au 1: 1000 dilution), et anti-vimentine (gp53, l'utilisation au 1: 100 dilution) anticorps. Effectuer la coloration immuno-histochimie indirecte utilisant des anticorps secondaires respectifs.
      3. Pour l'isolement de l'ARN, ajouter 1 ml de solution (contenant du phénol et de guanidinium thiocyanate) dans un bouchon à vis d'un tube 2 ml sans RNase de dénaturation. Couper l'ensemble de gré à gré en morceaux avec un scalpel et ajouter dans le tube contenant la solution de dénaturation. Mécaniquement déchiqueter les médicaments en vente libre avec l'instrument FastPrep deux fois pendant 30 secondes à une vitesse de 6,0, se placent entre sur la glace pendant 2 min (l'échantillon peut être conservé à -80 ° C après ce point). Si congelé à -80 ° C, dégel sur la glace. Centrifuger les tubes à 11,500-13,000 rpm pendant 10 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un tube frais, incuber pendant 5 minutes à température ambiante et fprotocoles d'isolement d'ARN en utilisant l'acide uivez guanidinium thiocyanate-extraction au phénol-chloroforme comme décrit par le fabricant.
      4. Pour l'analyse FACS, retirez l'échafaud et séparer la membrane de la / des fibroblastes gel de fibrine / mTEC. Finement coupé le gel avec un scalpel et digérer dans un tube FACS pour ~ 20 minutes, ou jusqu'à complètement digéré avec 2 ml de collagénase / dispase à 37 ° C dans un bain d'eau sous agitation magnétique. Agiter la solution d'enzyme avec une pipette Pasteur, une fois toutes les 5 min. Après digestion complète, on filtre la suspension de cellules à travers un filtre de 70 um; tacher la suspension de cellules individuelles en utilisant les anticorps tels que décrits en 1.7 et analysent par cytométrie de flux.

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Representative Results

Nous avons adopté une organotypique modèle de co-culture 3D (3D OTC) qui avait été développé à l'origine pour une longue terme de culture in vitro de kératinocytes 9. MTECs MACS-enrichis (voir MACS enrichissement régime Figure 1) ont été ensemencées sur un échafaudage comprenant un gel de fibrine et de fibroblastes piégées. Les fibroblastes fournissent la matrice extracellulaire essentiel (ECM) supportant mTECs in vitro. MTECs ont été cultivées dans OTC pour 4-14 jours en présence de RANKL dans les cultures submergées contrairement kératinocytes, qui sont exposées à l'air imitant leur environnement in vivo (voir OTC set-up régime Figure 2).

Les deux sous-ensembles MTEC analysés ici (c.-à-CD80 lo et hi CD80 mTECs) ont survécu pendant la période de jusqu'à 14 jours de culture entière. MTECs ont été identifiés par la kératine 14 expression et étaient facilement reconnaissables à partir de fibroblastes de vimentine positif (Figure 3B). Fait intéressant, mTECs immatures et matures ont augmenté dans différents modèles dans la culture. Le CD80 lo mTECs typiquement formée bi-couches (en contact étroit avec des fibroblastes), tandis que CD80 mTECs hi ont tendance à former des agrégats cellulaires compacts délimités par les fibroblastes. Ces modèles ont été hautement reproductible.

Les sous-ensembles MTEC non seulement survécu mais aussi proliféré dans des conditions 3D de gré à gré comme évalué par EdU incorporation (figure 3C, 3D). Fait intéressant, le CD80 lo mTECs proliféré à une vitesse plus élevée en présence de RANKL, alors que l'inverse était vrai pour CD80 mTECs hi 10.

En outre, CD80 lo mTECs différenciée en CD80 mTECs hi en présence de RANKL dans les 4 jours de culture, comme indiqué par la forte régulation positive de CD80. Les mTECs différenciées également maintenu l'expression d'Aire, Foxn1 (gène et protein) ainsi que la promiscuité exprimé Aire-indépendante et dépendante EMR 10.

Figure 1
Figure 1. MACS enrichissement de TEC. Après filtration, mTECs ont été enrichies de la suspension thymus d'une seule cellule en utilisant cellulaire tri magnétique (MACS). Tout d'abord, les lignées de cellules hématopoïétiques ont été épuisées en utilisant des microbilles anti-CD45. Les cellules CD45 - ont ensuite été incubées avec un anticorps anti-CD80 PE, suivie par des microbilles anti-PE. L'éluat contenant CD80 + -mature mTECs était directement cultivées sur l'OTC, tandis que l'écoulement contenait CD80 - mTECs immatures et d'autres cellules stromales. MTECs se sont encore étoffés à l'aide d'anticorps et streptavidine microbilles anti-EpCAM-bio. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Schéma de l'installation progressive de l'OTC 3D. Une matrice d'échafaudage a été placé dans une cartouche filtrante 12 de puits. Les fibroblastes dermiques de la peau explantée (270 000 cellules / OTC puits) ont été inoculées dans un gel de fibrine (composé de 1: 1 rapport de fibrinogène et de thrombine). Ces équivalents dermiques ont été soutenus pendant 4-5 jours avec DMEM + nutriments jusqu'à mTECs (250.000 cellules / OTC puits) ont été ensemencées sur le dessus et cultivées avec milieu enrichi en nutriments différents (FRDA + nutriments).

Figure 3
Figure 3. Les schémas de croissance et la prolifération des mTECs au sein de l'OTC. La enrichi CD80 lo mTECs ont tendance à grandir comme une bi-couche en contact étroit avec les fibroblastes (A), wh EREA les CD80 mTECs hi différenciés poussent comme des agrégats de cellules ou grappes serrées (B). OTC ont été marqués au jour 4 de la culture avec des anti-kératine 14 (rouge) et des anticorps anti-vimentine (vert) ainsi que la coloration nucléaire (Hoechst, bleu). Pour évaluer la prolifération des mTECs, les médicaments en vente libre ont été puisées avec Edu (6,7 uM / ml, soit 10 uM / puits) pendant 4 heures avant la cessation des cultures. Les cryo-sections de gré à gré ont ensuite été colorées avec des anticorps anti-kératine 14 (vert), et le mélange réactionnel EdU-Cliquez-iT (magenta) avec coloration nucléaire (Hoechst, bleu). Des images représentatives dépeignant prolifération EdU + CD80 lo mTECs (C) et Edu + CD80 mTECs hi (D) sont présentés. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

"Cellspacing =" 0 "> Des cultures d'organes thymiques réagrégation (RTOC) Co-cultures organotypiques (OTC) Système utile pour étudier les interactions cellulaires qui peuvent être facilement contrôlés et manipulés en utilisant une architecture thymique 3D en grande partie intact; se développe en une structure bien organisée sur le greffage. Système utile pour étudier le développement et la différenciation des cellules enrichies / epitheliales thymiques purifiés dans un maillage 3D artificiel généré par les fibroblastes de peau humaine piégées dans un échafaudage de fibrine. Eh bien établi pour l'étude du développement des cellules et thymocytes utilisant des inhibiteurs ou des modificateurs, qui pénètrent la capsule épithéliales thymiques. Prête à manipuler thymus développement épithélial ou pour étudier le développement des thymocytes en co-culture avec les TEC. Comme le systèmel'air est soulevé, la taille des pores de la membrane (0,8 um) est essentielle lors de la fourniture à la RTOC facteurs: des molécules plus grandes ne peuvent pas pénétrer à travers la membrane et / ou une capsule. Culture est immergé dans les médias, ce qui facilite l'absorption de substances / facteurs (testé avec succès en utilisant les oligos morpholino). Adultes et les TEC ou thymocytes post-natales peuvent être injectés dans RTOCs fœtales. TEC post-natals poussent mieux que les TEC adultes; TEC fœtales non encore testées. Exiger thymus de E14-14.5 embryonnaire (optimale) pour permettre réagrégation et l'intégration de la population souhaitée ajoutée; difficile de contrôler la composition de cellules du thymus foetal (accepteur); RTOCs nécessitent soit des cellules provenant de souris congéniques ou marquées par fluorescence que les cellules du donneur ou accepteur. Possible d'étudier simples cellules / clones; seulement «contaminants» sont des fibroblastes de peau humaine nécessaires pour fournir ECM pour soutenir les TEC. Imagerie limited pour la profondeur de pénétration du direct microscopie à deux photons; favorable à l'analyse FACS ou de tri; des études d'expression de gènes nécessitent tri FACS du type cellulaire souhaité après culture. Entièrement accessible à l'imagerie; adapté à l'analyse FACS, immuno-histochimie, et des études d'expression génique.

Tableau 1. Comparaison entre deux systèmes de culture thymiques 3D.

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Discussion

Parallèlement RTOCs, l'OTC 3D ont été de loin supérieur en termes de différenciation des TEC et pGE entretien / induction (tableau 1) par rapport aux autres (i) «cultures 3D simplifiées 'aide - fibroblastes seul, sans l'échafaud; (Ii) les systèmes 2D utilisant - cellules fibroblastes / nourricier co-cultivées avec les TEC 10, (iii) les cellules 3T3-J2 dans laquelle clones TEC développent, mais pGE est perdu, (iv) matrigel ou (v) les composants de l'ECM (données non publiées). PGE a été maintenue pendant jusqu'à 7 jours à l'OTC 3D, 4 jours étant le point de temps optimal par la suite, pGE commence à décliner. Autres caractéristiques morphologiques TEC ont été maintenus pendant jusqu'à 14 jours. Curieusement, l'OTC a soutenu le stade terminal de différenciation mTEC vu par les Hassall-comme des structures parfois formés 10.

Le thymus utilisé pour OTC ont été prélevé sur de jeunes souris post-natales car ils ont une plus forte propension à survivre dans la culture par rapport à thymus adulte. TEC dérivé from thymus embryonnaire n'a pas encore été testée dans OTC. Plus encore, après la période de digestion de temps (sans usage de la trypsine due au clivage de certains epitopes) les cellules sont apparues plus viable en utilisant MACS plutôt que des cellules de tri FACS. L'utilisation d'un protocole en deux étapes d'enrichissement positif sur colonnes MACS (perles anti-PE) de CD80 + mTECs pureté en outre améliorée de TEC.

Pour la configuration de gré à gré, il est essentiel de veiller à ce que la viscose, matériau fibreux non tissé est découpé en cercles tranchants, bien délimitées, sans fragments détachés ou dentelé extrémités comme indiqué ci-dessus que correspondre exactement en 12 inserts bien-culture. Alternativement, échafaudages tels que BEMCOT- viscose glace M-3 (http://www.bemliese.com) peuvent également être utilisés. La taille de puits pour le DUT est également critique et doit être testé, si les formats de plaques autres que les formats à 6 puits et 12 puits devraient être utilisés.

Le gel de fibrine doit être préparé de telle sorte que les composants de fibrinogène et de thrombine ne viennent pas en contact uns avec les autres avant d'être mis sur le gré à gré, assurez-vous d'échanger la pointe de la pipette. Mélanger les deux composants dans la plaque au-dessus de l'échafaudage pour former une surface supérieure lisse. Toujours préparer un gel de test à côté dans un puits sans échafaudage pour vérifier la formation de caillots adéquate et d'avoir une bonne estimation du temps nécessaire pour la coagulation. Assurez-vous que le gel de fibrine dans l'OTC a complètement coagulé avant d'alimenter les cultures avec les médias.

Lors de la résiliation des cultures les mTECs ensemencées peuvent être facilement récupérés par digestion enzymatique (collagénase / dispase) du gel de fibrine, qui peut être utilisé pour la caractérisation des mTECs cultivées par exemple, par cytométrie en flux ou PCR

Les médicaments en vente libre 3D décrits ici a le potentiel d'étudier ou de manipuler plusieurs paramètres TEC à savoir: 1) d'étudier et / ou de manipuler (via siRNA, oligos morpholino) les voies de développement et les fonctions de mTECs; 2) d'étudier le rôle des cellules T dans mTECs développerment; 3) CTEC de culture; 4) à tester le potentiel de progéniteurs de cellules souches dérivées du thymus; 5) à la culture TEC humains et les cellules souches; 6) pour effectuer des analyses clonales TEC simples. L'OTC 3D représentent une technique de culture élaborée émulant partie du thymus vivo microenvironnement. Il convient de souligner que les analyses supplémentaires appliquées aux CET dans la configuration actuelle de gré à gré devront être soigneusement testés et optimisés séparément.

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Disclosures

Les auteurs déclarent aucun conflit financier ou d'intérêt commercial.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 mice  Charles River WIGA
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
CD45 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Streptavidin Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) Ref. 12
CD80-PE antibody BD Pharmingen 553769
CD45-PerCP antibody BD Pharmingen 557235
Ly51-FITC antibody BD Pharmingen 553160
CDR1-Pacific Blue Ref. 15
Keratin 14 antibody Covance PRB-155P
Vimentin antibody Progen GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes (Invitrogen GmbH) A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Invitrogen C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10425
12-well filter inserts (thincerts) Greiner bio-one 657631
12-well plate Greiner 665180-01
Jettex 2005/45 ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
PBS Serva 47302.03
DMEM Lonza BE12-604F
DMEM/F12 Lonza BE12-719F
HEPES Gibco 15630-049 
FBS Gold GE Healthcare A11-151
Aprotinin (Trasylol) Bayer 4032037
Cholera toxin Biomol G117
Hydrocortisone Seromed (Biochrom) K3520
L-ascorbic acid Sigma A4034
TGF-ß1 Invitrogen PHG9214
RANKL R&D systems 462-TR-010
Thermolysin Sigma Aldrich  T-7902
OCT Compound TissueTek 4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) Invitrogen 10296028
FastPrep FP120 Thermo Scientific
Collagenase Type IV  CellSystems LS004189 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase) CellSystems LS002104 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I  Roche 11 284 932 001 25 µg/ml final conc.

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References

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