3D organotypisk co-kultur Model Støtte medullær thymusepitelmonolag celleproliferation, differentiering og Promiskuøs Gene Expression

1Division of Developmental Immunology, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Genetics of Skin Carcinogenesis, German Cancer Research Center (DKFZ)
* These authors contributed equally
Published 7/30/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Pinto, S., Stark, H. J., Martin, I., Boukamp, P., Kyewski, B. 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression. J. Vis. Exp. (101), e52614, doi:10.3791/52614 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Intra-thymus udvikling T-celle kræver en indviklet tredimensional meshwork sammensat af forskellige stromale celler, dvs. ikke-T-celler. Thymocytter krydse denne stillads i en meget koordineret tidsmæssig og rumlig orden, mens sekventielt passerer obligatoriske kontrolpunkter, dvs T-celle linie engagement, efterfulgt af T-celle receptor repertoire generering og udvælgelse inden udførsel i periferien. De to store resident celletyper danner denne stillads er corticale (cTECs) og medullære thymiske epitelceller (mTECs). Et centralt element i mTECs er den såkaldte promiskuøs udtryk for talrige væv-begrænset antigener. Disse væv-begrænsede antigener præsenteres for umodne thymocytter direkte eller indirekte af mTECs eller thymiske dendritiske celler henholdsvis resulterer i selv-tolerance.

Egnede in vitro-modeller emulerer de udviklingsmæssige veje og funktioner cTECs og mTECs øjeblikket lackonge. Denne mangel på tilstrækkelige eksperimentelle modeller har eksempelvis vanskeligt at analysere promiskuøs genekspression, som stadig dårligt forstået på det cellulære og molekylære niveau. Vi tilpasset et 3D organotypisk co-kultur model til kultur ex vivo isolerede mTECs. Denne model blev oprindeligt udviklet til at dyrke keratinocytter på en sådan måde, at generere en hud ækvivalent in vitro. 3D-modellen bevarede centrale funktionelle funktioner i MTEC biologi: (i) spredning og terminal differentiering af CD80 lo, Aire-negative i CD80 hi, Aire-positive mTECs, (ii) lydhørhed over for RANKL, og (iii) vedvarende udtryk for FoxN1, Aire og væv-begrænset gener i CD80 hi mTECs.

Introduction

Udviklingslande thymocytter udgør omkring 98% af thymus, mens de resterende 2% består af en række celler, der tilsammen komponere thymiske stroma (dvs. epithelceller, dendritiske celler, makrofager, B-celler, fibroblaster, endotheliale celler). De ydre corticale epithelceller (cTECs) skaffe indvandring af pro-T-celler fra knoglemarven, T-celle afstamning induktion i multipotente præ-T-celler og positiv selektion af selv-MHC-begrænset umodne thymocytter. De indre medullære thymiske epitelceller (mTECs) er involveret i tolerance induktion af disse thymocytter med en høj affinitet TCR for self-peptid / MHC-komplekser ved enten at inducere negativ selektion eller deres afvigelse ind i T regulerende celle afstamning. I forbindelse med centrale tolerance induktion, mTECs er unikke i, at de udtrykker et bredt spektrum af væv-begrænset selv-antigener (TRA'ER) således spejling den perifere selv. Dette fænomen kaldes promiskuøs genekspression (pGE)1,2.

De fleste nuværende undersøgelser af denne fascinerende celletype stole på ex vivo isolerede celler, som forskellige kortfristede 2D dyrkningssystemer resulterede uvægerligt i tab af pGE og nøgleregulator molekyler ligesom MHC-klasse II, FoxN1 og Aire inden for de første 2 dage 3-6 . Det forblev dog uklart, hvilke særlige komponenter og funktioner i intakte 3D meshwork af thymus manglede i 2D-modeller. Re-aggregation thymus organkultur (RTOC) den har været hidtil eneste 3D system, der tillader undersøgelse af T-celle-udvikling på den ene side og stromal cellebiologi, på den anden side, i en intakt thymisk mikromiljø 7. Men RTOCs har visse begrænsninger, dvs., de allerede indeholder en kompleks blanding af celler, kræver input af føtale stromaceller og udholde en maksimal periode på 5 til 10 dages dyrkning.

Manglen på reduktionistiske in vitro dyrkningssystemer har hæmmet studiet afflere aspekter af T-celle udvikling og thymus organogenese ikke mindst den molekylære regulering af pGE og dens forhold til den udviklingsmæssige biologi mTECs.

På grund af den close-slægtskab af den strukturerede tilrettelæggelse af epitelceller af hud og thymus, vi har valgt en 3D organotypisk kultur (OTC) system, der var blevet udviklet oprindeligt at efterligne differentieringen af keratinocytter in vitro og dermed skabe en dermal tilsvarende. OTC-systemet består af en inert stillads matrix overlejret med dermale fibroblaster, der er fanget i en fibrin-gel, hvorpå keratinocytter udsås 8,9. Her har vi erstattet keratinocytter med oprensede mTECs. Mens du holder de grundlæggende funktioner i denne model, vi optimeret visse parametre.

I det vedtagne OTC model mTECs spredt, undergik terminal differentiering og vedligeholdt MTEC identitet og pGE, således tæt efterligne in vivo mTECs udvikling

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse er blevet godkendt af den etiske komité af Regierungspräsidium Karlsruhe. Alle dyr blev opstaldet under specifikke patogenfrie forhold på det tyske Cancer Research Center (DKFZ). For alle dyrkningseksperimenter museunger spænder fra 1 til 7 dage gamle, blev anvendt.

1. Isolering af mTECs fra Thymus

BEMÆRK: Følgende fordøjelse trin blev udført som beskrevet tidligere 1 under sterile betingelser med nogle modifikationer som følger.

  1. Halshugge musen hvalpe og fjern thymus. Placer Thymi på is i en Petri-plade indeholdende RPMI 1640 medium (indeholdende 5% FCS).
  2. Skær thymi i fine, små stykker og sted i en rund bund rør med ~ 5-30 ml RPMI medier og forsigtigt røre ved hjælp af en magnet i 10 minutter ved stuetemperatur.
  3. Derefter dekanteres supernatanten indeholdende hovedsagelig thymocyter og fordøje det resterende væv sekventielt med en runde af collagenaSE type IV (0,2 mg / ml og 57 U / ml endelig concentartion) i 15 min hver ved 37 ° C efterfulgt af collagenase / dispase (0,2 mg / ml og 1,2 U / ml slutkoncentration) i 25 min hver ved 37 ° C i et vandbad med magnetisk omrøring indtil Thymi fuldstændigt fordøjet. Brug 1 ml enzym pr 2-3 thymi.
  4. Agitere væv gang hver 7-10 min med en Pasteur-pipette. Pool collagenase / dispase fraktioner og filtreres gennem et 70 um gaze.
  5. Berige mTECs ved magnetisk cellesortering (MACS). Udføre oprensningen af mTECs ved magnetisk cellesortering som beskrevet tidligere 11, og vist i figur 1.
    BEMÆRK: magnetisk sortering af mTECs brugte vi følgende antistoffer: anti-CD80-PE (16-10A1, brug ved 1: 100 fortynding) og anti-EpCAM-bio (G8.8, brug på 1: 100 fortynding) 12. Umodne og modne mTECs hjælp MACS blev defineret som: CD45 - EpCAM + CD80 - og CD45 - CD80 + respektively.
  6. Efter MACS oprensning (renhed af umodne mTECs = 83,1 ± 6,3% og modne mTECs = 79,23 ± 3,42%), frø de mTECs onto organotypiske kulturer som beskrevet nedenfor (afsnit 2.3).
  7. Alternativt sortere mTECs ved FACS (ved hjælp af 100 um dyse) efter CD45 MACS udtømning ved hjælp af følgende antistoffer: anti-CD45-PerCP (30-F11, brug på 1: 100 fortynding), anti-Ly51-FITC (6C3, brug på 1 : 100 fortynding), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, anvendelse ved 1: 500 fortynding) og anti-CD80-PE (16-10A1, anvendelse ved 1: 100 fortynding). Udelukke døde celler ved anvendelse af propidiumiodid (1: 5000) (dag 4). Umodne og modne mTECs hjælp FACS blev defineret som: PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - og PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 + hhv.

2. 3D Organotypiske Co-kulturer (OTC)

BEMÆRK: 3D-dermal konstruktioner for organotypisk dyrkning af keratinocytes blev fremstillet som beskrevet tidligere 9,13. På alle trin celler blev inkuberet ved 37 ° C og 5% CO2. De OTC bruger mTECs blev forberedt med mindre ændringer som følger.

  1. Udarbejdelse af humane fibroblaster
    BEMÆRK: De menneskelige dermale fibroblaster blev opnået fra eksplantatkulturer af de-epidermised dermis som beskrevet tidligere 9.
    1. Kort fortalt, skåret strimler af menneskehud (~ 5 cm længde) og behandles med thermolysin (0,5 mg / ml i saltopløsning med 10 mM Hepes pH 7,4) O / N ved 4 ° C.
    2. Derefter adskille epidermis fra dermis ved anvendelse af pincetter.
    3. Fint skåret dermis i små stykker, sted i en 10 cm Petri plade og lad det tørre i 1-2 timer under en steril luftstrøm. Supplere eksplantaterne regelmæssigt med DMEM indeholdende 20% FBS.
    4. Split de out-voksende fibroblaster når sammenflydende (normalt omkring 3 uger) ved hjælp af 0,1% trypsin at sikre, at eksplantaterne fortsætte med at holde til pladen for yderligere conhinanden følgende runder af udvækst.
    5. Expand fibroblasterne fra de samme eksplantater i op til 3 gange i DMEM med 10% FBS og cryo-bevare dem 14. Brug den samme batch af fibroblaster for hver forsøgsrække.
      BEMÆRK: fibroblaster blev ikke bestrålet for opsætningen af ​​dermale ækvivalenter.
  2. Fremstilling af stilladset
    1. Skær 0,4-0,6 mm tyk viskose, nonwoven fiberholdigt materiale (produkt detaljer i støtte excel ark) i godt afgrænsede cirkler ved hjælp af en skarp 11 mm diameter metal puncher til præcis passer ind i 12 godt filter skær. Derefter placere den i 12- godt filterindsats (polyester kapillær pore membran 3 um porestørrelse) som et stillads. Placer komplette filter setup i en steril 12-brønds plade.
    2. Forbered fibrin under anvendelse af en fibrinlim-kit til kirurgi bestående af en kombination af fibrinogen og thrombin. Pre-fortynde en fibrinogen samt thrombin-komponent af kittet til 8 mg / ml og 10enheder / ml. For en enkelt brønd i en plade med 12 brønde anvendes følgende fremgangsmåde.
      1. Fortynd 100 pi fibrinogen (8 mg / ml) med 100 ul phosphatpufret saltvand (PBS) uden Ca 2 + og Mg 2 +, pH 7,0. Fortynd 100 pi thrombin (10 enheder / ml) med 100 pi FCS indeholdende 270.000 fibroblaster.
      2. Dispensere 200 pi af thrombin indeholdende fibroblaster celle-mix på stilladset, hvortil Tilsæt 200 pi fibrinogen (1: 1-blanding), hvilket resulterede i en slutkoncentration af fibrinogen på 2 mg / ml og af thrombin på 2,5 enheder / ml. Bland godt og distribuere jævnt over hele arealet af stilladset ved forsigtig pipettering (dag 1).
        BEMÆRK: Efter 30 minutter ved 37 ° C en blodprop omslutter fibroblasterne vil have dannet, påfyldning fuldstændigt de indre rum af stilladset og danner en glat øvre overflade.
  3. Co-kultur med mTECs
    1. For pre-kultur, submerse orgel kulturer iDMEM med 10% FBS, 50 pg / ml L-ascorbinsyre og 1 ng / ml TGF-β1 med et medium ændring hver anden dag i 4-5 dage.
    2. På dagen for MTEC podning udskifte mediet ved rFAD medium (1: 1 DMEM + DMEM / F12) med 10% FBS, 10 -10 M koleratoksin, 0,4 mg / ml hydrocortison, 50 pg / ml L-ascorbinsyre, RANK-ligand (0,1 ug / ml) og 500 enheder / ml aprotinin, hvilket forhindrer for tidlig fibrinolyse ved serinproteaser udskilles af fibroblaster.
    3. 7-8 timer senere, co-kulturer opsætning ved podning 250.000 mTECs (enten komplette mTECs eller CD80 lo og CD80 hi delmængder) i et volumen på 100 pi per brønd på toppen af fibroblast stilladset. Tæl celler ved hjælp af en Neubauer kammer (dag 4).
      BEMÆRK: På alle tidspunkter de thymus 3D organotypiske kulturer nedsænket i medier modsætning huden OTC, der er air-løftet.
    4. Efter 24 timers inkubation forsyne kulturerne med medium (total medium udveksling) som nævnt ovenfor (trin 2.3.2) nu containing reducerede mængder af aprotinin, 250 enheder / ml (dag 5).
    5. For at vurdere den proliferative aktivitet af mTECs tilsættes edu (6,7 uM / ml, dvs. 10 pM / brønd) til OTC i 4 timer før afslutning af kulturerne. Udfør farvningen af OTC cryo-sektioner som beskrevet i edu Imaging Kit kombineret med co-farvning af keratin 14. Bestem de proliferative indeks af mTECs, ved enten medregnet K14 + edu + celler i to sektioner af hver kultur prøve eller ved flow cytometri (edu flowcytometri, afsnit 1.7, men i stedet for Ly51-FITC bruge CDR1-PB 15 ved en 1: 100 fortynding og 2.3.6.4).
    6. Efter 4-7 dages co-kultur, opsige OTC og proces til RNA isolering, cryo-sektionering eller FACS-analyse (dag 8-11).
      1. Ophæve kulturerne ved hjælp af en pincet, adskillelse stilladset / dermale ækvivalent fra filteret af brønden insertet.
      2. For kryo-sektionering, integrere hele OTC i oktober sammensatte og fryse i liquid kvælstof damp før kryo-sektionering. Forbered 5-7 um tykke OTC sektioner ved hjælp af en kryostat og opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse. For immuno-histokemi af kryo-delt OTC bruge anti-keratin 14 (AF64, anvendelse ved 1: 1.000 fortynding), og anti-vimentin (GP53, anvendelse ved 1: 100 fortynding) antistoffer. Udfør den indirekte immuno-histokemi farvning anvendelse af respektive sekundære antistoffer.
      3. For RNA-isolering, tilsættes 1 ml denaturerende opløsning (indeholdende phenol og guanidiniumthiocyanat) i et skruelåg af et 2 ml RNase-frit rør. Skær hele OTC i stykker med en skalpel og tilføj ind i rør indeholdende denaturerende opløsning. Mekanisk makulere OTCs med FastPrep instrument to gange i 30 sekunder ved en hastighed på 6,0, placeres i mellem på is i 2 min (prøven kan opbevares ved -80 ° C efter dette punkt). Hvis frosset ved -80 ° C, optøs på is. Centrifuger rørene ved 11,500-13,000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten overføres til et frisk rør, inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur og fBenyt samme RNA-isolering protokoller under anvendelse Acid guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform-ekstraktion som beskrevet af producenten.
      4. For FACS-analyse, fjerne stilladset og adskille membranen fra fibrin / fibroblast / MTEC gel. Fint skåret af gelen med en skalpel og fordøje det i en FACS rør til ~ 20 min eller indtil fuldstændig fordøjet med 2 ml collagenase / dispase ved 37 ° C i et vandbad med magnetisk omrøring. Agitere enzymopløsningen med en Pasteur-pipette en gang hver 5 min. Efter fuldstændig spaltning filtreres cellesuspensionen gennem et 70 um filter; plette enkelt cellesuspension anvendelse af antistofferne som beskrevet i 1.7 og analysere ved flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi vedtaget en 3D organotypisk co-kultur model (3D OTC), der var oprindelig udviklet til in vitro sigt kultur af keratinocytter 9 lange. MACS-berigede mTECs (se MACS berigelse skema figur 1) blev podet på et stillads bestående af en fibringel og indesluttede fibroblaster. Fibroblasterne giver væsentlige ekstracellulære matrix (ECM) støtte mTECs in vitro. MTECs blev dyrket i OTC i 4-14 dage i overværelse af RANKL i nedsænkede kulturer modsætning keratinocytter, som er air-eksponerede efterligne deres in vivo miljø (se OTC opsætning ordning figur 2).

Begge MTEC undergrupper analyseret her (dvs. CD80 lo og CD80 hi mTECs) overlevede under hele dyrkningsperioden på op til 14 dage. MTECs blev identificeret ved keratin 14 udtryk og blev let skelnes fra vimentin-positive fibroblaster (figur 3B). Interessant, voksede umodne og modne mTECs i forskellige mønstre i kultur. CD80 lo mTECs typisk dannet bi-lag (i tæt kontakt med fibroblaster), mens CD80 hi mTECs tendens til at danne kompakte celleaggregater afgrænset af fibroblaster. Disse mønstre var meget reproducerbar.

De MTEC delmængder ikke kun overlevede, men også spredt under 3D OTC betingelser som vurderet af Edu inkorporering (figur 3C, 3D). Interessant, CD80 lo mTECs tilvækst med en højere hastighed i overværelse af RANKL, mens det omvendte var tilfældet for CD80 hi mTECs 10.

Derudover CD80 lo mTECs differentieret i CD80 hi mTECs i nærvær af RANKL inden 4 dages dyrkning, som indikeret ved den stærke opregulering af CD80. De differentierede mTECs fastholdt også udtryk for Aire, FoxN1 (gen og protein) samt promiskuøst udtrykte Aire-uafhængige og -afhængige TRA'er 10.

Figur 1
Figur 1. MACS berigelse af TECs. Efter filtrering blev mTECs beriget fra thymus enkelt cellesuspension under anvendelse af magnetisk cellesortering (MACS). Først blev de hæmatopoietiske cellelinjer depleteret anvendelse af anti-CD45 Microbeads. CD45 - celler blev derefter inkuberet med anti-CD80 PE-antistof efterfulgt af anti-PE Microbeads. Eluatet indeholdende CD80 + -mature mTECs var direkte dyrket på OTC, mens gennemløbet indeholdt CD80 - umodne mTECs og andre stromale celler. MTECs blev yderligere beriget ved hjælp anti-EpCAM-bio antistof og streptavidin Microbeads. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Ordning for trinvis opsætning af 3D OTC. Et stillads matrix blev anbragt i en 12-brønds filterindsats. De dermale fibroblaster fra eksplanteret huden (270.000 celler / OTC brønd) blev inokuleret i en fibrin-gel (bestående af 1: 1-forhold mellem fibrinogen og thrombin). Disse dermale ækvivalenter blev opretholdt i 4-5 dage med DMEM + næringsstoffer indtil mTECs (250.000 celler / OTC brønd) blev podet på toppen og dyrket med medium beriget med forskellige næringsstoffer (rFAD + næringsstoffer).

Figur 3
Figur 3. Vækst mønstre og spredning af mTECs i OTC. Den berigede CD80 lo mTECs tendens til at vokse som en bi-lag i tæt kontakt med fibroblaster (A), wh ereas de differentierede CD80 hi mTECs vokse som celleaggregater eller stramme klynger (B). OTC blev mærket på dag 4 i kultur med anti-keratin 14 (rød) og anti-vimentin antistoffer (grøn) sammen med nukleare farvning (Hoechst, blå). For at evaluere udbredelsen af mTECs blev OTC pulseret med EDU (6,7 uM / ml, dvs 10 pM / brønd) i 4 timer forud for opsigelsen af kulturerne. OTC cryo-sektioner blev derefter farvet med anti-keratin 14 (grøn), og EDU-Click-iT reaktionsblandingen (magenta) sammen med nukleare farvning (Hoechst, blå). Repræsentative billeder skildrer prolifererende Edu + CD80 lo mTECs (C) og Edu + CD80 hi mTECs (D) er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

"Cellspacing =" 0 "> Reaggregation thymus organkulturer (RTOC) Organotypiske co-kulturer (OTC) Nyttigt system til at studere cellulære interaktioner, som let kan overvåges og manipuleres ved hjælp af en stort set intakt 3D thymus arkitektur; udvikler sig til en velorganiseret struktur ved podning. Nyttigt system til at studere udviklingen og differentieringen af ​​berigede / rensede thymiske epitelceller i en kunstig 3D meshwork genereret af humane hudfibroblaster indesluttet i en fibrin stillads. Godt etableret til undersøgelse af udviklingen af ​​thymiske epitelceller og thymocyter ved anvendelse inhibitorer eller modificerende midler, som trænger kapslen. Medgørlige at manipulere thymus epithelial udvikling eller for at studere thymocytudvikling i co-kultur med TECs. Eftersom systemeter luft-løftes membranen porestørrelse (0,8 um) er afgørende, når tilførsel faktorer til RTOC: større molekyler kan ikke trænge gennem membranen og / eller kapsel. Kultur er nedsænket i medier, hvilket letter optagelsen af ​​stoffer / faktorer (med succes testet ved hjælp morpholino oligo'er). Voksen og postnatale TEC eller thymocytter kan spidse til føtale RTOCs. Postnatale TECs vokser bedre end voksne TECs; føtale TEC endnu ikke testet. Kræver embryonale E14-14.5 Thymi (optimal) for at muliggøre reaggregation og integration af den tilsatte ønskede population; vanskeligt at styre føtal thymus (acceptor) cellesammensætning; RTOCs kræver celler fra enten fluorescens-mærkede eller kongene mus som donor eller acceptor celler. Muligt at studere enkelte celler / kloner; kun "forureninger" er humane hudfibroblaster der kræves for at give ECM at støtte TEC. Imaging limited at indtrængningsdybde af levende to-foton mikroskopi; muligt at foretage en FACS-analyse eller sortering; genekspression undersøgelser kræver FACS sortering af den ønskede celletype efter dyrkning. Fuldt tilgængelige for billedbehandling; egnet til FACS-analyse, immuno-histokemi, og genekspressionsstudier.

Tabel 1. Sammenligning mellem to 3D thymiske dyrkningssystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sideløbende RTOCs har 3D OTC været langt overlegen i forhold til TEC differentiering og pGE vedligeholdelse / induktion (tabel 1) i forhold til andre (i) »forenklede 3D-kulturer 'med - fibroblaster alene uden stillads; (Ii) 2D systemer, der anvender - fibroblaster / feeder-celler co-dyrket med TECs 10, (iii) 3T3-J2 celler, hvor TEC kloner udvikle, men pGE er tabt, (iv) matrigel eller (v) ECM komponenter (upublicerede data). PGE blev opretholdt i op til 7 dage i 3D OTC, fire dage bliver det optimale tidspunkt-point derefter pGE begynder at falde. Andre morfologiske TEC funktioner blev opretholdt i op til 14 dage. Interessant, at OTC støttede slutstadiet af MTEC differentiering set af de lejlighedsvis dannede Hassall-lignende strukturer 10.

Den Thymi anvendes til OTC blev afledt fra unge postnatale mus da de har en højere tilbøjelighed til at overleve i kultur i forhold til voksne Thymi. TECs afledt from embryonale thymi endnu ikke er blevet afprøvet i OTC. Mere så efter den lange fordøjelse periode (ikke anvendelse af trypsin på grund af spaltning af visse epitoper) cellerne forekom mere levedygtige under anvendelse MACS snarere end FACS-sortering celler. Ved hjælp af en to-trins positiv berigelse protokol om MACS kolonner (anti-PE perler) af CD80 + mTECs desuden forbedret TEC renhed.

For OTC setup er det vigtigt at sørge for, at viskose, er nonwoven fiberholdigt materiale skåret i skarpe, godt afgrænsede kredse uden løse fragmenter eller savtakket ender som nævnt ovenfor, at netop passer ind i 12 godt kultur skær. Alternativt kan stilladser såsom BEMCOT- viskose visker M-3 (http://www.bemliese.com) også anvendes. Brønden størrelse for OTC er også kritisk og skal testes, om der skal benyttes andre undersøgelser end 6 brønde og 12-brønds formater plade formater.

Fibringelen skal udarbejdes således, at fibrinogen og thrombin komponenter ikke kommer i contact med hinanden, før at blive sat ind på OTC, skal du sørge for at udveksle pipettespidsen. De to komponenter blandes grundigt i plade over stilladset for at danne en glat øvre overflade. Forberede altid en test gel sammen i en brønd uden stillads for at kontrollere for korrekt koageldannelse og have et godt skøn over den tid, der kræves til koagulation. Sørg for, at fibringel i OTC har fuldstændig størknet før levere kulturerne med medierne.

Ved ophør af kulturerne seedede mTECs kan nemt hentes ved enzymatisk fordøjelse (collagenase / dispase), i fibringelen, som kan anvendes til karakterisering af dyrkede mTECs fx ved flowcytometri eller PCR

3D OTC beskrevet heri har potentiale til at studere eller manipulere flere TEC parametre nemlig: 1) at undersøge og / eller manipulere (via siRNA, morpholino oligo'er) udviklingsmæssige veje og funktioner mTECs; 2) at undersøge den rolle, mTECs i T-celle udvikleling; 3) at dyrke cTECs; 4) for at teste stamfader potentiale thymiske afledte stamceller; 5) til kultur menneskelige TECs og stamceller; 6) for at udføre enkelte TEC klonede analyser. 3D OTC repræsenterer en udførlige dyrkningsteknik efterligner en del af in vivo thymus mikromiljø. Det skal understreges, at eventuelle yderligere assays anvendes til TECs i den nuværende OTC setup skal testes grundigt og optimeres separat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen finansiel eller kommerciel interessekonflikt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 mice  Charles River WIGA
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
CD45 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Streptavidin Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) Ref. 12
CD80-PE antibody BD Pharmingen 553769
CD45-PerCP antibody BD Pharmingen 557235
Ly51-FITC antibody BD Pharmingen 553160
CDR1-Pacific Blue Ref. 15
Keratin 14 antibody Covance PRB-155P
Vimentin antibody Progen GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes (Invitrogen GmbH) A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Invitrogen C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10425
12-well filter inserts (thincerts) Greiner bio-one 657631
12-well plate Greiner 665180-01
Jettex 2005/45 ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
PBS Serva 47302.03
DMEM Lonza BE12-604F
DMEM/F12 Lonza BE12-719F
HEPES Gibco 15630-049 
FBS Gold GE Healthcare A11-151
Aprotinin (Trasylol) Bayer 4032037
Cholera toxin Biomol G117
Hydrocortisone Seromed (Biochrom) K3520
L-ascorbic acid Sigma A4034
TGF-ß1 Invitrogen PHG9214
RANKL R&D systems 462-TR-010
Thermolysin Sigma Aldrich  T-7902
OCT Compound TissueTek 4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) Invitrogen 10296028
FastPrep FP120 Thermo Scientific
Collagenase Type IV  CellSystems LS004189 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase) CellSystems LS002104 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I  Roche 11 284 932 001 25 µg/ml final conc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  2. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
  3. Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
  4. Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
  5. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  6. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  7. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. (2008).
  8. Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
  9. Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
  10. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  11. Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
  12. Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
  13. Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
  14. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
  15. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats