Imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour T CD8 + Analyse des réponses spécifiques de l'antigène de cellule après nanoparticules vaccination

Immunology and Infection

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Ochyl, L. J., Moon, J. J. Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination. J. Vis. Exp. (98), e52771, doi:10.3791/52771 (2015).

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Abstract

Introduction

Développement traditionnel de vaccin a principalement utilisé l'approche empirique de l'essai-erreur. Cependant, avec le développement récent d'un large éventail de biomatériaux et de découverte de déterminants moléculaires de l'activation immunitaire, il est maintenant possible de concevoir rationnellement des formulations de vaccins avec des indices biophysiques et biochimiques dérivées d'agents pathogènes 1,2. En particulier, diverses plates-formes de distribution de médicaments particulaires ont été examinés en tant que supports de vaccins, car ils peuvent être co-chargés avec des antigènes de sous-unités et agents immunostimulants, protéger les composants du vaccin contre la dégradation, et de renforcer leur collaboration livraison à cellules présentatrices d'antigène (CPA) résidant dans la lymphe nœuds (LNS), maximisant ainsi la stimulation et l'activation immunitaire 3-5. Dans ce rapport, nous décrivons la synthèse d'un système de nanoparticules "pathogène imitant", appelé interbilayer réticulé vésicules multilamellaires (ICMVs), qui ont déjà été démontrées comme un platfor de vaccin puissantm pour le déclenchement de solide lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et des réponses immunitaires humorales dans les deux compartiments de tissus muqueux et systémiques 9.6. En particulier, la vaccination avec ICMVs atteint des niveaux d'IgG sérique sensiblement améliorée contre un antigène de la malaria, par rapport à la vaccination avec des adjuvants classiques (par exemple, l'alun et Montanide) 7 et également provoqué des réponses CTL puissantes contre les cellules tumorales et des modèles de provocation virale chez la souris 9. Ici, en utilisant ICMVs comme un système de nanoparticules de vaccin de modèle, nous décrivons des procédés de caractérisation de vaccins nano-formulations, y compris la taille des particules et des mesures de potentiel zêta et le suivi du trafic de particule de ganglions drainants (DLNS) en utilisant l'imagerie confocale des tissus cryosectioned 7. En outre, nous présentons une méthode d'analyse de l'expansion de réponses CTL chez des souris après le transfert adoptif de lymphocytes T CD8 + spécifiques de l'antigène exprimant la luciférase basé 9,10-imagerie-ensemble des animaux. Enfin, nous avons describe coloration tétramère de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) pour la quantification longitudinal de réponses de cellules T endogènes dans les souris vaccinées avec des nanoparticules 6,9.

ICMVs sont une formulation de nanoparticules à base de lipides synthétisés par fusion contrôlée de liposomes multilamellaires à des structures simples, qui sont ensuite stabilisés chimiquement par des groupes de reticulation tête de phospholipides à fonction maléimide à l'intérieur de couches lipidiques avec des agents de reticulation 6 dithiol. Une fois ICMVs sont synthétisés, une petite fraction de nanoparticules peut être utilisée pour déterminer la taille des particules et le potentiel zêta (c.-à-charge de surface des particules) d'un système de diffusion de lumière dynamique (DLS) et un analyseur potentiel zêta. DLS mesure les changements dans la diffusion de lumière dans des suspensions de particules, permettant de déterminer le coefficient de diffusion et la taille hydrodynamique des particules 11. Atteindre la taille des particules cohérente de lot à la synthèse des lots est essentielleétant donné que la taille des particules est un des principaux facteurs qui influent sur ​​le drainage lymphatique de particules de vaccin à DLNS et l'absorption cellulaire ultérieur par des APC 12,13. En outre, le potentiel zêta peut être obtenue par mesure de la vitesse des particules quand un courant électrique est appliqué, ce qui permet la détermination de la mobilité électrophorétique des particules et la surface de la charge particulaire 11. Assurer des valeurs de potentiel zêta de particules cohérentes est important car la charge de surface des particules détermine la stabilité colloïdale, ce qui a un impact direct sur ​​la dispersion de particules pendant le stockage et après l'administration in vivo 14,15. Afin de suivre la localisation des particules à DLNS, ICMVs peuvent être marquées par des fluorophores désirés, y compris les colorants lipophiles et les antigènes de façon covalente-marqués. Après immunisation, les souris peuvent être euthanasiés à différents points dans le temps, DLNS réséqués, cryosectioned, et analysées par microscopie confocale. Cette technique permet de visualiser drai lymphatiquening des deux porte-vaccins de nanoparticules et de l'antigène à DLNS. Les sections de tissu peuvent en outre être colorés avec des anticorps marqués par fluorescence et utilisé pour obtenir plus d'informations, tels que les types de cellules associées à l'antigène et la formation de centres germinatifs comme nous l'avons indiqué précédemment 7.

Une fois la synthèse des particules est optimisée et le trafic aux DLNS est confirmé, il est important de valider le déclenchement de l'expansion dans vivo de CTL. Afin d'analyser le déclenchement des cellules spécifiques de l'antigène T CD8 + en réponse à la vaccination de nanoparticules, nous avons utilisé un antigène modèle, l'ovalbumine (OVA), avec de l'OVA 257-264 peptide (SIINFEKL) d'un epitope immunodominant de cellule T CD8 +, ce qui permet des analyses immunologiques détaillées des réponses de cellules T spécifiques de l'antigène pour 16,17 initiale de développement d'un vaccin. En particulier, pour interroger la dynamique d'expansion et de la migration des cellules spécifiques de l'antigène T CD8 +, nous avons généré unmodèle de la double-souris transgénique en traversant la luciférase de luciole exprimant souris transgéniques (Luc) avec des souris transgéniques OT-I qui possèdent des cellules avec le récepteur des cellules T (TCR) spécifique pour SIINFEKL (en association avec H-2K b) T CD8 +. A partir de ces souris OT-I / Luc, exprimant la luciférase, les cellules OT-I T CD8 + peuvent être isolées et préparées pour le transfert adoptif dans des souris C57BL / 6 naïves. Une fois ensemencée, l'immunisation réussie avec des nanoparticules contenant OVA se traduira par l'expansion des cellules T transférées, qui peuvent être suivis en surveillant le signal de bioluminescence avec un ensemble de 9,10 Système d'imagerie par animal. Cette technique d'imagerie du corps entier non invasif a été utilisé avec d'autres antigènes viraux ou tumoraux dans le passé 18 à 20, les processus impliqués dans l'expansion des cellules T dans les tissus lymphoïdes et la diffusion dans les tissus périphériques de manière longitudinale révélateur.

Complémentaire à l'analyse des adoptive cellules spécifiques de l'antigène transférés T CD8 +, endógenoles réponses des lymphocytes nous T après la vaccination peut être examiné avec le complexe peptide-complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de dosage de tétramère 21, dans lequel un complexe tétramère peptide-CMH, composé de quatre fluorophore marqués MHC-molécules de classe I chargé avec des epitopes peptidiques, est utilisé à lier le TCR et l'étiquette des cellules T CD8 + d'une manière spécifique à un antigène. L'essai de tétramère MHC-peptide peut être effectuée soit dans des études d'autopsie terminaux afin d'identifier les cellules T CD8 + spécifiques de l'antigène dans les tissus périphériques et lymphoïde ou dans des études longitudinales avec des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) obtenues à partir de sang en série tire. Après coloration des lymphocytes avec un peptide tétramère MHC, la cytométrie en flux analyse est effectuée pour des analyses détaillées sur le phénotype des CTL ou la quantification de leur fréquence chez les cellules T CD8 +.

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Protocol

Toutes les expériences décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité de l'Université sur l'utilisation et l'entretien des animaux (UCUCA) à l'Université du Michigan et réalisés selon les politiques et les lignes directrices établies.

1. Synthèse et caractérisation de ICMVs Co-chargé avec de la protéine antigène et adjuvant Molécules

  1. Mélanger 1: 1 de rapport molaire de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC) et de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butyramide] (MPB) dans du chloroforme, en maintenant la quantité de lipides totaux à 1,26 umol par lot (par exemple, 500 pg de DOPC et 630 ug de MPB) dans un flacon en verre de 20 ml (diamètre = 28 mm et hauteur = 61 mm).
  2. Ajouter médicaments lipophiles, tels que le monophosphoryl lipide A (MPLA) ou des colorants lipophiles (par exemple, a fait), à la solution de lipides à la concentration souhaitée. Bien enlever le solvant organique par purge à nitroge extra-secn gaz et plaçant les échantillons sous vide O / N.
  3. Hydrater le film de lipide par addition de 200 ul de 10 mM de bis-tris propane (BTP, pH 7,0) contenant des médicaments solubles dans l'eau (par exemple, des antigènes de protéines). Vortex pendant 10 secondes toutes les 10 minutes pendant 1 heure à température ambiante.
  4. Transférer le contenu du flacon en verre dans un tube de 1,5 ml, placer les échantillons dans un bain d'eau glacée, et soniquer en continu pendant 5 min en utilisant le réglage sur une 125 W / 20 kHz pointe de sonde sonicator intensité de 40%.
  5. Ajouter 4 pi de dithiothréitol 150 mM (DTT) à chaque lot (concentration de travail de 2,4 mM), vortex et centrifuger brièvement en utilisant une microcentrifugeuse de table.
  6. Ajouter 40 ul de 200 mM de CaCl2 et mélanger avec la pipette (concentration de travail de 33 mm). Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 heure pour permettre la réticulation du MPB-contenant des couches lipidiques avec la TNT.
  7. Centrifuger les échantillons à 20000 g pendant 15 min, retirer le surnageant et remettre en suspension dans 200 pi de ddiH 2 O.
  8. Répétez l'étape 1.7 et centrifuger à nouveau après le deuxième ddiH 2 O lavage pour éliminer CaCl 2, qui n'a pas réagi de la TNT, et des matériaux de fret non encapsulées à partir du surnageant.
  9. Préparer 10 mg / ml de 2 kDa polyéthylène glycol-thiol (PEG-SH) en ddiH 2 O. Remettre en suspension chaque échantillon ICMV dans 100 ul de solution de PEG-SH et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
  10. Effectuer deux ddiH 2 O lavages (étape 1.7) et remettre le culot ICMV finale dans PBS et conserver à 4 ° C. Avant l'utilisation, mélanger la suspension ICMV, comme des particules peuvent se déposer au fond après un stockage prolongé.
  11. Pour la caractérisation de particules, retirer une petite quantité aliquote (~ 10%) du ICMVs de chaque lot individuel et diluer à un volume total de 1 ml de ddiH 2 O. Placer un échantillon unique dans une cellule Zetasizer taille et la mesure des particules, l'indice de polydispersité, et le potentiel zêta des échantillons en utilisant un système DLS et de mesure de potentiel zêta (selon le protocole du fabricant).

2. Examen des ganglions lymphatiques Evacuation des ICMVs fluorescence étiqueté avec la microscopie confocale

  1. Préparation de ICMVs chargé avec un antigène marquée par un fluorophore et un colorant fluorescent lipophile
    1. Préparer fluorophore protéine à marquage, tel que mis à réagir avec de l'ovalbumine Alexa Fluor 555-succinimidyl ester, selon les instructions du fabricant.
    2. Pour préparer ICMVs marqués avec fluorophore dans l'enveloppe lipidique, ajouter lipophile colorant fluorescent, (par exemple, 1,1 dioctadécyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) pendant la préparation du film lipidique (Étape 1.2) à 0,05% quantité de lipides molaire. Pour le film lipidique hydratation (Étape 1.3), tampon d'utilisation contenant l'antigène marquée par un fluorophore, et la synthèse de ICMV complète telle que décrite dans les étapes 1.4 à 1.11.
  2. Administration sous-cutanée de nanoparticules à base de la queue
    1. Anesthésier la souris au moyen d'un évaporateur à flux contrôlé équipé d'une chambre d'induction utilizing 3% d'isoflurane et 1,5 l / min de débit d'oxygène selon l'une IACUC a approuvé le protocole de l'animal. Une fois que la souris est inconscient, effectuez les étapes suivantes rapidement avant l'anesthésie se dissipe pour permettre un accès optimal au site de l'injection et de minimiser l'inconfort à l'animal. Vous pouvez également utiliser un cône de nez bon raccord pour maintenir l'anesthésie. Si les souris sont anesthésiées pendant plus de 5 minutes, appliquer du lubrifiant nécessaire de minimiser l'irritation de l'oeil après l'intervention.
    2. Pulvériser la base de la queue avec 70% d'éthanol pour désinfecter et mouiller la fourrure partie les cheveux mouillés pour exposer une petite parcelle de peau visible, qui peut être utilisé pour visualiser l'aiguille sous la peau.
    3. Préparez particule suspension injectable contenant la quantité désirée de l'antigène et de l'adjuvant pour 100 ul de dose de vaccination dans du PBS (par exemple, 10 pg d'OVA et 0,3 ug MPLA pour 100 ul de dose d'injection a été utilisé dans le passé de 6,9).
    4. Dessinez le int suspension de particulesoa seringue avec une aiguille 27-29 G et insérer l'aiguille à la base de la queue (~ 5 mm de la racine des cheveux) avec le biseau vers le haut et injecter 50 pi de la suspension de particules 22.
    5. Attendez quelques secondes pour que la pression pour égaliser à prévenir tout refoulement excessive et retirez l'aiguille. Répéter l'injection de l'autre côté de la base de la queue de cibler les ganglions inguinaux de drainage.
  3. Préparation des lymphatiques cryosections de noeuds et de l'examen par microscopie confocale.
    1. Euthanasier la souris avec CO 2 asphyxie, suivie d'un pneumothorax induite selon un IACUC approuvé le protocole de l'animal. Extrait ganglions inguinaux selon le protocole démontré dans Bedoya 23 et laver le sang en plaçant les tissus dans 1 ml de 4 ° C PBS.
    2. Absorber le PBS à partir des tissus avec les tissus et les placer dans le tissu cryomoules de tissus (10 x 10 x 5 mm 3) pré-remplie à ras OCT milieu de congélation 24. Aligner geler le tispoursuivre bloc dans l'azote liquide pendant 30 sec. Sinon, placez bloc de tissu sur glace sèche pendant 30 min. Stockez tissu congelé à -80 ° C dans le congélateur.
    3. Couper des sections de tissus 5-10 um d'épaisseur dans un cryostat fixé à -20 ° C 24.
    4. Si nécessaire, effectuez l'étiquetage d'immunofluorescence, et d'examiner le tissu avec la microscopie confocale comme précédemment démontré 24.

3. Suivi Expansion de l'antigène spécifique, la luciférase exprimant T CD8 + après vaccination avec des nanoparticules entier imagerie animale

  1. Isolement de OVA257-264 spécifique de cellules de luciférase exprimant CD8 + T de souris transgénique OT-I / Luc
    1. Euthanasier une souris transgénique OT-I / Luc avec CO 2 asphyxie et d'induire un pneumothorax selon un IACUC approuvé le protocole de l'animal. Récolter la rate d'une manière stérile en accédant à la cavité péritonéale et soigneusement détacher le tissu du pancréas 23, etdans 5 ml de PBS à 4 ° C + 2% de FBS pour le transfert de la culture de tissus capot.
    2. Placer la rate sur un tamis en nylon de 70 pm sur un tube de centrifugation conique de 50 ml (jusqu'à 3 rates à la fois). L'utilisation d'un plongeur d'une seringue de 3 ml, broyer les cellules à travers le tamis.
    3. Laver le piston et la crépine avec PBS + 2% de FBS et le jeter. Porter le volume total à 10 ml / rate dans le tube de 50 ml, prendre un petit échantillon de la suspension cellulaire de compter avec un hémocytomètre, et centrifuger pendant 10 min à 300 x g.
    4. Utilisation d'un kit disponible dans le commerce de sélection négative magnétique, isoler la population de cellules T CD8 + en suivant les instructions du fabricant.
    5. Après avoir lavé les cellules avec du PBS, compter le nombre de cellules T CD8 + isolées. Afin d'évaluer la pureté des cellules T CD8 + isolées, incuber ~ 20.000-30.000 cellules dans 20 ul de CD16 de souris / anticorps 32 (0,025 mg / ml) pendant 10 min, puis ajouter 20 ul d'anticorps αCD8-APC (0,005 mg / ml) et incuber pendant 30 min. Perform toutes les incubations à 4 ° C dans du PBS + 1% p / v de BSA. Effectuer flux analyse cytométrique 25.
  2. Le transfert adoptif de lymphocytes T CD8 + isolés et la visualisation de leur vaccination l'expansion de poste
    1. Effectuer le transfert adoptif de cellules isolées OT-I / Luc T CD8 + naïfs en C57BL / 6 souris par administration de 1 à 10 x 10 5 cellules dans un volume de 200 ul de PBS par voie intraveineuse via la queue injection dans la veine 22 (jour -1). Considérant que la fourrure et de la peau noire correctifs dans C57BL / 6 peut interférer avec le signal de bioluminescence, albinos rasé souris C57BL / 6 sont idéales pour ces études.
    2. Après une journée (jour 0), administrer le vaccin comme décrit précédemment (section 2.2).
    3. Administrer 150 mg de luciférine par kg de poids corporel de la souris par voie intraperitoneale dans un volume de 300 ul de PBS. Après 10 min, anesthésier les souris avec l'isoflurane (comme à l'étape 2.2.1) et visualiser les cellules OT-I / Luc T CD8 + par l'acquisition du signal de bioluminescence pendant 5-10 min wvec tout un système d'imagerie animale (IVIS; se référer à Wilson 26 pour des instructions détaillées). Répéter au besoin pour les études longitudinales.

Les cellules T CD8 + peptide-CMH 4. La coloration tétramère de PBMC pour l'analyse de l'antigène-spécifiques

Remarque: La procédure de protocole qui suit peut être effectuée en utilisant soit des souris C57BL / 6 avec des cellules transférées de manière adoptive OT-I / Luc T CD8 + ou des souris C57BL / 6 sans le transfert adoptif.

  1. A un point de temps souhaité après la vaccination, de recueillir environ 100 pi de sang (4-6 gouttes) de souris via submandibular technique de saignements 27 dans un tube revêtu de K 2 EDTA et inverser plusieurs fois pour empêcher la coagulation.
  2. Transférer 100 ul de sang dans un tube à centrifuger, ajouter 1 ml de tampon de lyse, et incuber pendant 2 à 3 min pour éliminer les globules rouges (hématies). Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 1500 xg et retirer le surnageant. Si la pastille encoreppears rouges (indiquant une élimination incomplète des globules rouges), répéter l'étape de lyse avec une brève incubation (<1 min) de tampon de lyse.
  3. Laver les PBMC restantes avec 1 ml de tampon FACS (PBS + 1% p / v de BSA) et centrifuger à 1500 g pendant 5 min.
  4. Aspirer le surnageant et remettre en suspension l'échantillon dans 20 pi de CD16 / 32 anticorps de souris (0,025 mg / ml) pour bloquer la liaison non spécifique d'anticorps et à médiation par FcR. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
  5. Transfert cellules de microtubes en 4 ml tubes FACS à fond rond. Ajouter 20 pi de H-2K b solution OVA Tétramère-SIINFEKL-PE selon les spécifications du fabricant pour chaque échantillon et incuber pendant 30 min sur la glace.
  6. Préparer le cocktail d'anticorps (par exemple, αCD8-APC, αCD44-FITC, et αCD62L-PECy7 anticorps (0,005, 0,005 et 0,002 mg / ml concentration, respectivement)). Ajouter 20 ul à chaque échantillon expérimental, et incuber pendant 20 min sur de la glace. Préparer des témoins fluorophores simples par laBeling cellules avec chaque anticorps tétramère ou fluorophore marqués à la concentration indiquée ci-dessus.
  7. Laver deux fois avec du tampon FACS et remettre en suspension le culot final dans du tampon FACS contenant 2 ug / ml de DAPI. Les cellules sont maintenant prêts pour l'analyse par cytométrie en flux (détails et des exemples peuvent être trouvés dans Scheffold 25).

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Representative Results

Les étapes impliquées dans la synthèse de ICMVs sont illustrés sur la figure 1 6. En bref, un film lipidique contenant des médicaments lipophiles ou des colorants fluorescents est hydraté en présence de médicaments hydrophiles. Les cations divalents, tels que Ca2 +, sont ajoutés pour conduire la fusion de liposomes anioniques dans des vésicules multilamellaires. Dithiol agent de reticulation, tel que le DTT, est ajoutée aux lipides à fonction maléimide "discontinues" apposant sur des couches lipidiques, et enfin les groupes maléimide restants externes sont trempés dans une réaction avec des fractions de PEG-thiolés. Une petite fraction de chaque lot peut être facilement soumis à des mesures de contrôle de qualité par la détermination de la taille des particules, l'indice de polydispersité, et le potentiel zêta avec un DLS et zêta système d'analyse potentiel. Les particules résultantes sont relativement homogène avec une taille moyenne de 130 ± 20 nm, indice de polydispersité de 0,22 ± 0,02, et le potentiel zêta de -54 mV ± 3 pour encapsuler p-OVAarticles (Figure 1B et 1C). Rendement typique de particules, mesurée en poids sec de particules, est ~ 50% 6.

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, ICMVs peut être co-chargé avec un antigène de protéine à étiquette fluorophore et le colorant lipophile fluorescent, ce qui permet la visualisation de l'antigène et de livraison nanoparticule in vivo. Pour comparer les modèles de prestation de l'antigène sous forme soluble par rapport au ICMVs, souris C57BL / 6 ont été administrés sc à la base de la queue avec 100 ug de AlexaFluor555 marqués OVA soit dans ganglions inguinaux solubles ou avez-étiquetés formulations ICMV, et drainage ont été excisées à divers points de temps pour la préparation des tissus DLn cryo-sections. Visualisation en microscopie confocale a indiqué que l'antigène soluble atteinte rapidement les DLNS dans 4 h, mais a également été éliminé très rapidement avec 24 heures (Figure 2) 7. En revanche, ICMVs OVA-chargé ont été détectées à la périphérie de DLNS par 24 heures, avec accumulation continuecomme examiné au jour 4, le dépôt d'une grande quantité d'OVA-ICMVs dans DLNS (Figure 2). Micrographies confocales ont également montré la co-localisation des AlexaFluor555 marqués OVA et ICMVs sein DLNS at-étiquetés, ce qui suggère que ICMVs permettent stable co-administration d'antigènes protéiques et d'autres agents immunostimulants encapsulées dans ICMVs 7.

Isolement de cellules T CD8 + à partir de OT-I / Luc souris transgénique peut être facilement réalisée avec le kit disponible dans le commerce de sélection négative magnétique, ce qui donne ~ 8-12 x 10 6 cellules par une rate de la souris. La figure 3 montre souris C57BL / 6 par transfert adoptif par 5 x 10 5 cellules OT-I / Luc CD8 + T le jour -1, et immunisés au jour 0 avec l'administration sous-cutanée de 10 pg d'OVA et 0,3 pg du MPLA soit dans des formulations solubles ou ICMV. imagerie par bioluminescence avec IVIS effectuée le jour 0 avant la vaccination a montré minimale de signal OT-I / Luc. Cependant, au jour 4 après la vaccination, les souris immuniséesavec l'OVA / MPLA-ICMVs avait signal de bioluminescence robuste au sein de ganglions inguinaux, qui sont ganglions drainant la région de base de la queue 28. En revanche, les souris immunisées avec la forme soluble du vaccin ont montré beaucoup dilatation réduite de cellules OT-I / Luc T CD8 + à l'intérieur de DLNS inguinaux.

Utilisation de l'OVA comme antigène modèle permet de contrôler l'expansion de cellules T CD8 + spécifiques endogènes à immunodominant peptide OVA 257-264 (SIINFEKL). Par exemple, les souris C57BL / 6 ont été immunisées aux jours 0, 21, et 35 l'administration sous-cutanée de 10 pg d'OVA et 0,3 ug MPLA soit ICMVs ou sous forme soluble, et des fréquences de cellules SIINFEKL-spécifiques T CD8 + chez les lymphocytes T CD8 + dans des PBMC ont été déterminés par le débit analyse cytométrique des PBMC colorées avec SIINFEKL-H-2K b tétramère-PE. Figure 4A montre flux représentant cytométrie diagrammes de dispersion de SIINFEKL-H-2K b tétramère + cellules parmi des cellules T CD8 + dans les CMSP le jour 41 6. Figure 4B montre des diagrammes de dispersion représentatifs de cellules CD44 + CD62L + avec centrale phénotype de mémoire parmi SIINFEKL-tétramère + cellules T CD8 +. Suivi hebdomadaire des PBMC représentés sur la figure 4C a indiqué que vaccin OVA soluble a provoqué un gonflement minimal de cellules spécifiques de l'antigène T CD8 +, alors que la vaccination ICMV a suscité beaucoup plus forte des réponses de lymphocytes T CD8 +, la réalisation d'un 28% SIINFEKL-tétramère pic + cellules T dans le CD8 + T population de cellules par jour 41 6. En utilisant le protocole tétramère de coloration présenté ici, on a observé la fréquence de 0,11% de base ± cellules spécifiques à l'OVA 0,04% T (N = 15) chez les animaux non traités ou traitées avec du STP, et on peut détecter augmentation statistiquement significative de lymphocytes T CD8 + des fréquences de cellules spécifiques de l'antigène aussi faibles que 0,46% ± 0,05% (valeur p <0,005, données non présentées).

Figure 1
(A) ICMVs sont synthétisés dans les quatre étapes suivantes. (I) les tensioactifs anioniques, les liposomes fonctionnalisés de maléimide est préparé à partir de films lipidiques séchées; (Ii) des cations divalents sont ajoutés pour induire la fusion des liposomes et la formation de vésicules multilamellaires; (Iii) dithiols la membrane perméable sont ajoutés, réticulant maléimide-lipides sur les bicouches lipidiques apposées dans les parois des vésicules; et (iv) les particules de lipide résultantes sont pégylée avec PEG à terminaison thiol. (B) de la distribution des particules représentant comme analysé par DLS est affiché. (C) de taille moyenne hydrodynamique, l'indice de polydispersité, et le potentiel zêta de ICMVs co-chargée avec de l'OVA et du MPLA sont présentés. Panneau (A) a été modifié depuis la Lune et al. 6. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

Figure 2
Figure 2. Analyse de vidange antigène dans les ganglions lymphatiques par microscopie confocale. C57BL / 6 ont été immunisées avec 100 ug MPLA fluorophore conjugué à l'OVA (en rouge) et 5 ug soit en solution ou ICMVs (en bleu). Les ganglions lymphatiques inguinaux ont été excisés à des points de temps indiqués, cryosectioned, et imagées par microscopie à foyer commun. Micrographies confocales représentatifs sont présentés. Signaux roses indiquent co-localisation d'OVA et ICMVs. Ce chiffre a été modifié de Moon et al. 7. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Monitorinl'expansion des cellules T g après la vaccination. C57Bl / 6 souris albinos ont été adoptive transféré iv avec 5 x 10 5 cellules Luc + OT-I T CD8 + le jour -1. Au jour 0, les animaux ont été administrés avec 10 pg d'OVA et 0,1 pg de MPLA soit en tant que formulations solubles ou ICMV. Les animaux ont été anesthésiés avec de l'isoflurane et administrés avec de la luciférine (150 mg / kg, 300 pl ip injecté), et le signal de bioluminescence de cellules Luc + OT-1 T CD8 + a été acquise avec IVIS. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Expansion des cellules endogènes spécifiques d'OVA T CD8 + après la vaccination ICMV. C57BL / 6 ont été immunisées avec 10 ug d'OVA et 0,1 pg du MPLA soit in solution ou ICMVs aux jours 0, 21 et 35 (flèches). La fréquence des cellules T spécifiques d'OVA chez les cellules mononucléaires du sang périphérique a été évaluée dans le temps par analyse de cytométrie en flux de SIINFEKL-tétramère MHC-I + cellules T CD8 +. (A) de flux Représentant cytométrie diagrammes de dispersion de chaque souris à 41 jours spectacle SIINFEKL-CMH-I tétramère + cellules T CD8 + et (B) des cellules CD44 + CD62L +, marqueur des cellules T mémoire centrales. (C) La cinétique globale de l'expansion des cellules T et de la contraction est signalée. Ce chiffre a été modifié de Moon et al. 6. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

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Discussion

Le protocole fourni dans cet article décrit la synthèse et la caractérisation d'un nouveau système de nanoparticules à base de lipides, appelé ICMVs, et fournit le processus de validation efficacité des formulations de vaccins à base de nanoparticules à induire CD8 + réponses des lymphocytes T spécifiques de l'antigène. Synthèse ICMV est terminée dans tous les état ​​aqueuse, qui est un avantage majeur par rapport aux autres systèmes couramment utilisés polymères de nanoparticules (par exemple, le poly (lactide-co-glycolide) des particules acides), qui nécessitent généralement des solvants organiques pour la préparation, ce qui entraîne souvent une perte de antigénicité des protéines antigènes 29,30. En outre, ICMVs bénéficier de vaste stabilité et la capacité d'encapsuler des molécules à la fois hydrophobes et hydrophiles 6, permettant ainsi la co-délivrance des antigènes et des adjuvants ciblées pour le même compartiment intracellulaire dans les APC 31,32. Utilisation ICMVs comme une nanoparticule de vaccin modèle, ici, nous avons décrit les procédurespour (1) la synthèse de nanoparticules et caractérisation, (2) validation de nanoparticule drainage à DLNS, et l'examen de déclenchement de T CD8 + des réponses de lymphocytes spécifiques de l'antigène en utilisant (3) une technique d'imagerie par bioluminescence non invasive et (4) le peptide-CMH tétramère coloration test sur des PBMC.

Il est essentiel pour assurer l'uniformité dans la synthèse de nanoparticules d'un lot à, en particulier pour la taille des particules et la charge de surface car ils peuvent grandement affecter le drainage lymphatique et l'absorption par les APC lors de l'administration in vivo. DLS et analyse du potentiel zeta fournissent des méthodes rapides de vérification de la qualité sur la taille des particules et la charge de surface. Pour des analyses plus détaillées sur la morphologie des particules individuelles, ces techniques peuvent être complétées par microscopie électronique à haute résolution, comme cryo-microscopie électronique (cryo-EM) qui préserve la morphologie des particules "molles" dans la couche aqueuse vitrifiés 6,33,34 . L'encapsulation d'antigènes et d'efficacité adjuvfourmis doivent également être déterminés et maintenus uniforme entre synthèses. Des adjuvants, comme MPLA, peuvent être marqués avec un fluorophore 6 alors que les antigènes protéiques peuvent être quantifiés en utilisant des kits protéine quantification absorbance- et basées sur la fluorescence, ou analysés en utilisant SDS-PAGE 35 et de Coomassie ou coloration à l'argent 36, et quantifiés sur la base de l'intensité de la bande . Incohérences dans la préparation de particules peuvent résulter de réactifs périmés ou mal stockés, comme une réactivité optimale est nécessaire pour la synthèse complète. A cet effet, maleimide- et thiol réactifs fonctionnalisés doivent être conservés en petites aliquotes à -80 ° C sans fréquents cycles de gel-dégel.

Particules inférieures à 100 nm sont généralement pensés pour saisir efficacement les vaisseaux lymphatiques et du trafic vers DLNS 13, alors que les particules plus grosses (500-2000 nm) nécessitent le transport actif par les CD de tissus-résident 12,37. Dans nos mains, ICMVs avec la taille hydrodynamique allant de 150 à 250 nm efficacement localisé et a persisté dans le DLn, résultant en une vaste CTL et réponses humorales 6,7. De 24 h d'administration, ICMVs ont été associés avec les macrophages sous-capsulaire de sinus dans DLNS, et cytométrie en flux analyses effectuées aux jours 1 et 4 indiquent que la plupart des ICMVs sein DLNS ont été repris par des APC LN-résidents avec seulement une petite portion de particules associée à Langerhans et DCS dermiques 7. Ces résultats indiquent que le transport passif est le principal mode de ICMV traite à DLNS. Ces études ont utilisé des nanoparticules fluorophores marqués et antigènes protéiques pour délimiter leurs habitudes de localisation et de distribution dans DLNS. La microscopie confocale de DLNS cryosectioned permet histochimie d'immunofluorescence supplémentaire pour l'identification de structures de LN (par exemple, GL-7 expression dans les centres germinatifs) et les cellules qui interagissent avec les composants de la formulation (par exemple, les DC - CD11c, les macrophages - F4 / 80, CD169, et B- cellules & #8211; B220) 7,9. Cette technique peut être effectuée en parallèle avec les analyses de cytométrie de flux de cellules récoltées à partir de DLNS pour délimiter les sous-ensembles de CPA chargées de particules absorption 7,9 ou avec l'imagerie animal entier pour quantifier l'administration de vaccins à partir du site d'injection à DLNS 38,39, à condition que les signaux fluorescents sont solides et autofluorescence de tissu ne gêne pas les signaux.

Immunisation efficace nécessite l'activation robuste et expansion des cellules T cytotoxiques spécifiques de l'antigène, qui peuvent être suivis par bioluminescence imagerie du corps entier après le transfert adoptif de bioluminescent, les cellules T transgéniques spécifiques de l'antigène, suivie de la vaccination. L'avantage de cette méthode est la possibilité pour la visualisation répétée de la traite des CTL chez les mêmes animaux pendant une période prolongée, ce qui réduit le nombre d'animaux requis pour les analyses immunologiques et évitant l'utilisation de laborieux procedur d'isolement des celluleses. En utilisant cette technique de formation d'image, nous avons récemment démontré que l'administration pulmonaire de ICMVs co-chargé avec un antigène de protéine et un agent immunostimulant conduit à déclenchement puissant des cellules spécifiques de l'antigène T CD8 + dans les poumons et les ganglions médiastinaux et diffusion ultérieure de LTC aux tissus distaux muqueuses , y compris les plaques de Peyer, cæcum, et les voies vaginale 9. Les analyses par cytométrie de flux a montré que ces cellules T CD8 + ont été récemment étendues marquées avec un phénotype "muqueuse-homing" caractérisé par α 4 β 7 + expression de l'intégrine et des réponses immunitaires protectrices contre la muqueuse médiée provocation virale neuf. L'imagerie animal entier de cellules T CD8 + bioluminescents a également été récemment utilisée par Hailemicheal et al., Qui a démontré que l'antigène tumoral peptide formulé dans de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA, huile-dans-eau) a donné lieu à la séquestration des lymphocytes T sur le site de l'injectionavec un vaccin «dépôt» loin des masses tumorales, conduisant à un dysfonctionnement des lymphocytes T et 40 deletion.

Coloration tétramère a été largement utilisée dans le passé pour quantifier le niveau de réponses CTL endogènes résultant de diverses 21 formulations de vaccins. Cette technique est également pertinente et couramment utilisé dans des essais humains début d'immunothérapie du cancer cliniques pour confirmer réponses CTL aux antigènes associés aux tumeurs spécifiques 41,42. PBMC peuvent être facilement collectées à partir des souris et préparés pour la cytométrie de flux; toutefois, il peut ne pas révéler toute l'étendue de l'expansion des cellules T en raison de la localisation cellulaire de vaccins dépôt formant comme mentionné précédemment ou à l'intérieur de tumeurs dans des modèles de cancer, ce qui nécessite une analyse plus approfondie. Compatibilité avec cette méthode de cytométrie en flux permet la détermination des cellules T spécifiques de l'antigène avec des marqueurs de mémoire (CD44, CD62L, CD127, Bcl-2, et KLRG-1) pour distinguer effecteur, la mémoire centrale et la mémoire effectrice thislls parmi les tétramère + cellules T 43 ou CTL résidents tissus de longue durée 44,45 (tels que résumés dans des études récentes 46,47). Cependant, le test de coloration tétramère ne fournit que l'évaluation initiale des réponses CTL puisque les cellules T spécifiques de l'antigène hautement expansées peuvent présenter des signes d'épuisement immunitaire 48,49. Evaluation fonctionnelle des réponses CTL peut être réalisée en examinant la libération de cytokines immuno-enzymatique avec (ELISpot) 50 ou une coloration intracellulaire des cytokines 51 après stimulation ex vivo de lymphocytes avec des epitopes minimaux ainsi que par la mesure des taux intracellulaires de la perforine et granzyme B 52 extracellulaire et expression de CD107a et CD107b sur la dégranulation 53. En outre, la fonction cytolytique des CTL peut être évaluée directement avec des dosages de cytotoxicité des CTL effectuées in vitro ou in vivo de 54 à 56.

L'induction de réponses immunitaires humoralesaprès la vaccination de nanoparticules peut être étudié en parallèle avec la cellule T CD8 + analyses présentées ici. Les titres d'anticorps peuvent être analysés par la méthode traditionnelle d'enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), tandis que l'affinité de l'anticorps et de l'étendue de la reconnaissance d'épitopes peuvent être évalués en modifiant le protocole ELISA à l'aide d'un agent chaotrope (par exemple, l'urée) au cours de l'anticorps se liant à la substrat et l'utilisation de sous-domaines à l'intérieur des antigènes en tant que substrats, respectivement 7. Le déclenchement de réponses humorales puissantes exige l'expansion de cellules auxiliaires T CD4 + folliculaire (T fh) 57. Pour étudier l'expansion des cellules T de fh en réponse à la vaccination des particules, le protocole présenté ici peut être facilement adapté pour l'isolement de cellules T CD4 + spécifiques de l'antigène provenant de souris transgéniques OT-II, suivie par le transfert de cellules adoptif dans des souris receveuses naïfs. Après la vaccination, les tissus lymphoïdes peuvent être récoltées et analysées avec cytométrie de flux analyses pour dissuaderexpansion de la mine de cellules T spécifiques de l'antigène fh (identifiés par leur CD4 + CXCR5 + PD-1 + phénotype) 7.

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Disclosures

Perkin Elmer à condition que le coût de production encourus lors de la publication de cet article.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par l'Institut national de la santé accorde 1K22AI097291-01 et par le Centre national pour l'avancement des sciences translationnelle des Instituts nationaux de la santé en vertu Prix Nombre UL1TR000433. Nous reconnaissons également professeur Darrell Irvine au MIT et professeur Matthias Stephan au Fred Hutchinson Cancer Center pour leur contribution sur le travail initial sur les nanoparticules de vaccins et les souris transgéniques OT-I / Luc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) Avanti Polar Lipids, INC. 870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, INC. 850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) Avanti Polar Lipids, INC. 699800
20 ml glass vials Wheaton 0334125D
Symphny Vacuum Oven VWR 414004-580
Ovalbumin (OVA) Worthington 3054
Bis-Tris Propane (BTP) Fisher BP2943
Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) Qsonica Q125-110
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) Laysan Bio MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP  Malvern
ZetaSizer Cuvettes Malvern DTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) Life Technologies D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) Life Technologies A37571
Tissue-Tek OCT freezing medium  VWR 25608-930
Tissue Cryomolds VWR 25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 mice Jackson 000664
Albino C57BL/6 mice Jackson 000058
OT-1 C57BL/6 mice Jackson 003831
70 μm nylon strainer BD 352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell 19853
IVIS® whole animal imaging system Perkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubes BD 365974
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01 
Anti-CD16/32 Fc Block Ebioscience 14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer MBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APC BD 553031
Anti-CD44-FITC BD 553133
Anti-CD62L-PECy7 Ebioscience 25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) SIGMA D8417-10MG
CyAn Flow Cytometer Beckman Coulter
FlowJo Software FlowJo

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