Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ochyl, L. J., Moon, J. J. Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination. J. Vis. Exp. (98), e52771, doi:10.3791/52771 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Traditionele ontwikkeling vaccin is vooral in dienst van de empirische benadering van trial-and-error. Echter, met de recente ontwikkeling van een breed scala van biomaterialen en de ontdekking van moleculaire determinanten van immuunactivatie is het nu mogelijk om rationeel ontwerpen vaccinformuleringen met biofysische en biochemische signalen afkomstig van pathogenen 1,2. In het bijzonder hebben verschillende deeltjes drug delivery platforms onderzocht als vaccin dragers als ze kunnen samen worden geladen met subunit antigenen en immuunstimulerende middelen, vaccin componenten te beschermen tegen afbraak, en het vergroten van hun co-levering aan antigen presenterende cellen (APC's) die in lymfe nodes (LNS), waardoor het maximaliseren immuunstimulatie en activering 3-5. In dit rapport beschrijven we de synthese van een "pathogeen-nabootsen" nanodeeltjes systeem, genaamd interbilayer-verknoopt multilamellaire blaasjes (ICMVs), die al eerder hebben aangetoond als een krachtige vaccin platform voor uitlokken van krachtige cytotoxische T lymfocyt (CTL) en humorale immuunresponsen bij zowel systemische als mucosale weefselcompartimenten 6-9. In het bijzonder, de gerealiseerde vaccinatie met ICMVs aanzienlijk serum IgG niveaus versterkt tegen een malaria-antigeen, in vergelijking met vaccinatie met conventionele adjuvantia (bijvoorbeeld, aluin en Montanide) 7 en ook opgewekt potente CTL-responsen tegen tumorcellen en virale uitdaging modellen in muizen 9. Hier, met behulp van ICMVs als model vaccin nanodeeltje systeem beschrijven we methoden voor de karakterisering van het vaccin nano-formuleringen, met inbegrip van de deeltjesgrootte en zetapotentiaal metingen en het bijhouden van de deeltjes mensenhandel aftappen LNS (DLNS) gebruik te maken van confocale beeldvorming van cryosectioned weefsels 7. Bovendien presenteren we een hele dier imaging-gebaseerde werkwijze voor het analyseren expansie van CTL-responsen bij muizen na adoptieve overdracht van luciferase-expressie antigeenspecifieke CD8 + T-cellen 9,10. Ten slotte hebben we deschrijver tetrameer kleuring van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) voor longitudinaal kwantificatie van endogene T cel responsen in muizen gevaccineerd met nanodeeltjes 6,9.

ICMVs zijn een lipide-gebaseerde nanopartikelformulering gesynthetiseerd door gecontroleerde fusie van eenvoudige liposomen in multilamellaire structuren, die vervolgens chemisch worden gestabiliseerd door verknoping-maleïmide gefunctionaliseerde fosfolipide kopgroepen binnen lipide lagen met dithiol crosslinkers 6. Zodra ICMVs worden gesynthetiseerd, kan een klein deel van nanodeeltjes worden gebruikt om deeltjesgrootte en zeta potentiaal (bijv oppervlaktelading van de deeltjes) met dynamische lichtverstrooiing (DLS) systeem en een zeta potentiaal analyzer bepaald. DLS maatregelen veranderingen in de lichtverstrooiing in deeltjessuspensies, waardoor de bepaling van de diffusiecoëfficiënt en de hydrodynamische grootte van de deeltjes 11. Het bereiken van consistente deeltjesgrootte van partij tot partij synthese is van cruciaal belangaangezien deeltjesgrootte een van de belangrijkste factoren die van invloed lymfatische drainage vaccin deeltjes DLN en daaropvolgende cellulaire opname door APCs 12,13. Bovendien kan zeta potentiaal worden verkregen door meting van de deeltjessnelheid bij een elektrische stroom wordt aangelegd, met behulp waarvan de elektroforetische mobiliteit van deeltjes en deeltjes oppervlaktelading 11 toelaat. Consistente zeta potentieel waarden van de deeltjes is belangrijk omdat oppervlakte lading van de deeltjes bepaalt colloïdale stabiliteit, die een directe impact op deeltjesdispersie tijdens opslag en na de in vivo toediening 14,15 heeft. Om het deeltje lokalisatie DLN's volgen, kan ICMVs met de gewenste fluoroforen zoals lipofiele kleurstoffen en covalent gelabeld antigenen worden geëtiketteerd. Na immunisatie kunnen muizen worden gedood op verschillende tijdstippen DLN gereseceerd, cryosectioned en geanalyseerd met confocale microscopie. Deze techniek maakt visualisatie van lymfatische draining van zowel de nanodeeltjes vaccin vervoerders en antigeen DLN. De weefselcoupes kunnen bovendien worden gekleurd met fluorescent gemerkte antilichamen en gebruikt om meer informatie te verkrijgen, zoals soorten cellen verbonden met het antigeen en de vorming van germinale centra zoals we eerder hebben 7 getoond.

Zodra het deeltje synthese wordt geoptimaliseerd en handel met de DLN wordt bevestigd, is het belangrijk uitlokken van in vivo CTL expansie valideren. Om uitlokken van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen te analyseren in respons op nanodeeltjes vaccinatie hebben we een model antigeen, ovalbumine (OVA) gebruikt, met OVA peptide 257-264 (SIINFEKL) immunodominante CD8 + T-celepitoop, dat gedetailleerde immunologische analyses toelaat antigeen-specifieke T cel responsen voor de eerste vaccinontwikkeling 16,17. In het bijzonder om de dynamiek van expansie en migratie van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen ondervragen, hebben we gegenereerd eendubbel transgeen muismodel door kruising firefly luciferase-expressie transgene muizen (Luc) met OT-I transgene muizen die CD8 + T-cellen met T-celreceptor (TCR) specifiek voor SIINFEKL (in samenwerking met H-2Kb) bezitten. Uit deze OT-I / Luc muizen-luciferase expressie, OT-I CD8 + T-cellen kunnen worden geïsoleerd en voorbereid voor adoptieve overdracht naïeve C57BL / 6-muizen. Eenmaal gezaaide zal succesvolle immunisatie met OVA bevattende nanodeeltjes resulteren in uitzetting van de overgedragen T-cellen, die kunnen worden gevolgd door het volgen van de bioluminescentie signaal met een geheel dier beeldvormingssysteem 9,10. Deze niet-invasieve whole-body imaging techniek is gebruikt met andere virale en tumor antigenen in het verleden 18-20, openbaren processen van T-cel expansie in lymfoïde weefsels en verspreiding perifere weefsels in een longitudinale wijze.

Aanvullende analyses van adoptief overgedragen antigeenspecifieke CD8 + T-cellen, endogenoons T cel responsen na vaccinatie kunnen worden onderzocht met peptide-major histocompatibility complex (MHC) tetrameer assay 21, waarbij een peptide-MHC tetrameer complex, bestaande uit vier-fluorofoor gelabeld MHC-klasse I moleculen geladen met peptide-epitopen wordt toegepast TCR label en CD8 + T-cellen binden in een antigeen-specifieke wijze. Het peptide-MHC tetrameer assay kan worden uitgevoerd in terminal necropsie onderzoeken antigeen-specifieke CD8 + T-cellen in lymfoïde en perifere weefsels te identificeren of longitudinale studies met perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) verkregen uit seriële bloedafnames. Na kleuren lymfocyten met peptide-MHC tetrameer, flowcytometrie analyse uitgevoerd voor gedetailleerde analyses op het fenotype van CTLs of kwantificatie van de frequentie tussen CD8 + T-cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten beschreven in dit protocol werden goedgekeurd door de Universiteit Comité voor gebruik en onderhoud van Dieren (UCUCA) aan de Universiteit van Michigan en uitgevoerd volgens het vastgestelde beleid en richtlijnen.

1. Synthese en karakterisering van ICMVs Co-geladen met eiwitantigeen en Adjuvant Moleculen

  1. Meng 1: 1 molaire verhouding van 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) en 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) boterzuuramide] (MPB) in chloroform, waarbij het ​​totale lipide bedrag 1,26 umol per batch (dwz 500 ug DOPC en 630 ug MPB) in een 20 ml glazen flesje (diameter = 28 mm en hoogte = 61 mm).
  2. Voeg lipofiele geneesmiddelen, zoals monofosforyllipide A (MPLA) of lipofiele kleurstoffen (bijvoorbeeld deed), aan de lipide oplossing gewenste concentratie. Grondig verwijder het organische oplosmiddel door spoelen met extra droge nitrogen gas en het plaatsen van de monsters onder vacuüm O / N.
  3. Hydrateren lipide film door toevoeging van 200 ui 10 mM bis-tris-propaan (BTP, pH 7,0) bevattende wateroplosbare geneesmiddelen (bijv eiwitantigenen). Vortex gedurende 10 sec elke 10 min gedurende 1 uur bij KT.
  4. Breng de inhoud van de glazen flacon in een 1,5 ml microcentrifugebuis, plaats monsters in een ijs-waterbad en ultrasone trillingen continu gedurende 5 minuten met behulp van de intensiteit van 40% instelling op een 125 W / 20 kHz probe-tip sonicator.
  5. Voeg 4 pi van 150 mM dithiothreitol (DTT) aan elke batch (werkconcentratie 2,4 mM), vortex en kort met een tafelblad centrifuge microcentrifuge.
  6. Voeg 40 ul van 200 mM CaCl 2 en meng met de pipet (werkconcentratie 33 mM). Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 1 uur tot verknoping van MPB-bevattende lipide lagen met DTT toe.
  7. Centrifugeer de monsters bij 20.000 xg gedurende 15 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer in 200 ul van ddiH 2 O.
  8. Herhaal stap 1.7 en centrifuge opnieuw na de tweede ddiH 2 O wassen om CaCl2, gereageerde DTT en ingekapseld lading materialen te verwijderen uit het bovenstaande.
  9. Bereid 10 mg / ml 2 kDa polyethyleenglycol-thiol (PEG-SH) in ddiH 2 O. Resuspendeer elk ICMV monster in 100 pl PEG-SH-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min.
  10. Voer twee ddiH 2 O wassen (stap 1.7) en resuspendeer de laatste ICMV pellet in PBS en bewaar bij 4 ° C. Voor gebruik meng de ICMV suspensie, als deeltjes naar de bodem na langdurige opslag.
  11. Voor de karakterisering van deeltjes verwijdert een kleine hoeveelheid (~ 10%) van ICMVs uit elke partij en verdun afzonderlijk in een totaal volume van 1 ml ddiH 2 O. Plaats een enkel monster in een Zetasizer en meet deeltjesgrootte polydispersiteit index en zeta potentiaal van de monsters met een DLS en zeta potentiaal meetsysteem (volgens het protocol van de fabrikant).

2. Onderzoek van lymfkliertest Aftappen van fluorescentie-gelabeld ICMVs met confocale microscopie

  1. Bereiding van ICMVs geladen met fluorofoor-gelabelde antigen en lipofiele fluorescente kleurstof
    1. Bereid fluorofoor-gelabeld eiwit, zoals ovalbumine omgezet met Alexa Fluor 555-succinimidyl ester, volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Om ICMVs gelabeld met fluorofoor in de lipide schaal bereiden, voeg lipofiele fluorescente kleurstof (bijvoorbeeld, 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) tijdens de bereiding van de lipide film (Step 1,2) en 0,05% mol lipide bedrag. Voor lipide film hydratatie (stap 1,3), gebruik buffer bevattende fluorofoor-gelabelde antigen, en volledig ICMV synthese zoals beschreven in stappen 1,4-1,11.
  2. Subcutane toediening van nanodeeltjes op de staart basis
    1. Verdoven muis met behulp van een gecontroleerde stroom verdamper voorzien van een inductie kamer utilizing 3% isofluraan en 1,5 l / min zuurstof stroom volgens een erkende IACUC dier protocol. Zodra de muis onbewust, de volgende stappen snel voorafgaande aan de narcose dragen buiten naar optimale toegang tot de plaats van de injectie mogelijk te maken en ongemak voor het dier. Alternatief, gebruik dan een goede montage neuskegel anesthesie te onderhouden. Indien muizen worden verdoofd langer dan 5 minuten, de ogen smeermiddel noodzakelijk irritatie te voorkomen na de procedure.
    2. Spuit de basis van de staart met 70% ethanol te zuiveren en bevochtig het pelsdeel het natte haar een klein stukje zichtbare huid, die kan worden gebruikt om de naald onder de huid zichtbaar bloot.
    3. Bereid injecteren van partikels suspensie die gewenste hoeveelheid antigeen en adjuvans per 100 gl vaccinatiedosis in PBS (bijvoorbeeld 10 ug OVA en 0,3 pg MPLA per 100 gl injectiedosis werd in het verleden 6,9).
    4. Teken het deeltje schorsing into een spuit met een 27-29 G naald en breng de naald in de basis van de staart (~ 5 mm van de haarlijn) met de schuine naar boven en injecteer 50 pl van de deeltjessuspensie 22.
    5. Wacht een paar seconden voor de druk gelijk aan overmatige back-flow te voorkomen en trek de naald uit. Herhaal de injectie aan de andere zijde van de staartbasis zowel aftappen inguïnale LNS richten.
  3. Voorbereiding van de lymfeklieren cryosecties en onderzoek met confocale microscopie.
    1. Euthanaseren de muis met CO 2 stikken, gevolgd door geïnduceerde pneumothorax volgens een IACUC goedgekeurd dier protocol. Extract inguïnale LNS volgens proefopzet aangetoond Bedoya 23 en was het bloed door het plaatsen van de weefsels in 1 ml 4 ° C PBS.
    2. Absorberen de PBS uit de weefsels met weefsels en plaats weefsel in weefsel cryomolds (10 x 10 x 5 mm 3) voorgevulde naar de top met oktober bevriezing medium 24. Snap bevriezen de tissue blok in vloeibare stikstof voor 30 sec. Als alternatief, plaats weefsel blok op droog ijs gedurende 30 min. Bewaar ingevroren weefsel in -80 ° C vriezer.
    3. Knip weefselcoupes 5-10 pm dik in een cryostaat ingesteld op -20 ° C 24.
    4. Indien nodig, voeren immunofluorescentie etikettering, en onderzoekt de weefsel met confocale microscopie als eerder aangetoond 24.

3. Controle Uitbreiding van antigeen-specifieke, Luciferase-expressie CD8 + T-cellen na vaccinatie met gehele nanodeeltjes Animal Imaging

  1. Isolatie van OVA-specifieke 257-264, luciferase-expressie CD8 + T-cellen van OT-I / Luc transgene muizen
    1. Euthanaseren een OT-I / Luc transgene muis met CO 2 stikken en leiden tot een pneumothorax volgens een IACUC goedgekeurd dier protocol. Oogst de milt op een steriele wijze door naar de peritoneale holte en zorgvuldig losmaken van het weefsel van de alvleesklier 23 enplace in 5 ml 4 ° C PBS + 2% FBS voor overdracht naar weefselkweek kap.
    2. Plaats de milt op een 70 micrometer nylon zeef over een 50 ml conische centrifugebuis (tot 3 milt tegelijk). Met behulp van een zuiger van een injectiespuit 3 ml, slijpen de cellen door de zeef.
    3. Was de zuiger en de zeef met PBS + 2% FBS en gooi. Breng het totale volume op 10 ml / milt in de 50 ml buis, neem een ​​monster van de celsuspensie te tellen met een hemocytometer en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.
    4. Met behulp van een commercieel verkrijgbare kit magnetische negatieve selectie, isoleer het CD8 + T-celpopulatie volgens de instructies van de fabrikant.
    5. Na wassen cellen met PBS, tel het aantal geïsoleerde CD8 + T-cellen. Om de zuiverheid van de geïsoleerde CD8 + T-cellen bepalen, incubeer ~ 20.000-30.000 cellen in 20 ul van muis CD16 / 32 antilichaam (0,025 mg / ml) gedurende 10 min en voeg 20 ul van αCD8-APC antilichamen (0,005 mg / ml) en incubeer 30 min. Perform alle incubaties bij 4 ° C in PBS + 1% w / v BSA. Voer flowcytometrische analyse 25.
  2. Adoptieve overdracht van geïsoleerde CD8 + T-cellen en visualisatie van hun expansie na vaccinatie
    1. Voer adoptieve overdracht van geïsoleerde OT-I / Luc CD8 + T cellen in naïeve C57BL / 6 muizen door toedienen van 1-10 x 10 5 cellen in 200 ul volume PBS via intraveneuze injectie in de staartader 22 (dag -1). Gezien het feit dat bont en zwarte vlekken op de huid in C57BL / 6 muizen kunnen interfereren met de lichtgevende signaal, geschoren albino C57BL / 6 muizen zijn ideaal voor deze studies.
    2. Na een dag (dag 0), het beheer van het vaccin zoals eerder beschreven (paragraaf 2.2).
    3. Dien 150 mg per kg muis luciferine lichaamsgewicht intraperitoneaal in een 300 ui volume van PBS. Na 10 min, verdoven de muizen met isofluraan (zoals in stap 2.2.1) en visualiseren OT-I / Luc CD8 + T-cellen door het verwerven van de bioluminescentie signaal voor 5-10 min wet een hele dier imaging-systeem (IVIS, zie Wilson 26 voor gedetailleerde instructies). Herhaal als nodig is voor longitudinale studies.

4. Peptide-MHC tetrameer kleuring van PBMC voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen

Opmerking: Het volgende protocol procedure kan worden uitgevoerd op basis van C57BL / 6-muizen adoptief overgedragen met OT-I / Luc CD8 + T cellen of C57BL / 6 muizen zonder de adoptieve overdracht.

  1. Op een gewenst tijdstip na vaccinatie verzamel ongeveer 100 pl bloed (4-6 druppels) van muizen via submandibular bloeden techniek 27 in een buis bekleed met K 2 EDTA en keer herhaaldelijk om stolling te voorkomen.
  2. Breng 100 pi van bloed naar een microcentrifuge buis, voeg 1 ml lysisbuffer, en incubeer gedurende 2-3 minuten om rode bloedcellen (RBCs) te verwijderen. Centrifuge monsters gedurende 5 minuten bij 1500 xg en verwijder het supernatant. Indien de pellet nogppears rood (met vermelding van onvolledige verwijdering van RBC), herhaal de lysis stap met een korte incubatie (<1 min) van lysisbuffer.
  3. Was de resterende PBMCs met 1 ml FACS-buffer (PBS + 1% w / v BSA) en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 5 min.
  4. Zuig het supernatant en resuspendeer de sample in 20 gl muis CD16 / 32 antilichaam (0,025 mg / ml) om niet-specifieke en FcR bemiddelde antilichaam blokkeert binding. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Transfer cellen van microcentrifugebuisjes in 4 ml ronde bodem FACS buizen. Voeg 20 ul van H-2Kb OVA tetrameer-PE SIINFEKL-oplossing volgens de specificaties van de fabrikant aan elk monster en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
  6. Bereid de antilichaam cocktail (bv αCD8-APC, αCD44-FITC en αCD62L-PECy7 antilichamen (0,005, 0,005 en 0,002 mg / ml concentratie, respectievelijk)). Voeg 20 ul aan elk experimenteel monster en incubeer gedurende 20 minuten op ijs. Bereid enkele fluorofoor controles door laBeling cellen met elk fluorofoor gelabeld tetrameer of antilichaam op het hierboven aangegeven concentratie.
  7. Was 2 maal met FACS-buffer en resuspendeer de uiteindelijke pellet in FACS buffer die 2 ug / ml DAPI. De cellen zijn nu gereed voor flowcytometrie-analyse (gegevens en voorbeelden zijn te vinden in Scheffold 25).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De stappen betrokken bij de synthese van ICMVs zijn aangegeven in figuur 1 6. Kort wordt een lipide film die één lipofiele geneesmiddelen of fluorescente kleurstoffen gehydrateerd in aanwezigheid van hydrofiele geneesmiddelen. Divalente kationen, zoals Ca2 +, worden toegevoegd om fusie van anionische liposomen multilamellaire vesicles rijdt. Dithiol crosslinker, zoals DTT, is op "nieten"-maleïmide gefunctionaliseerde lipiden toegevoegd op apposing lipide lagen, en ten slotte de resterende externe maleïmidegroepen zijn uitgeblust in een reactie met gethioleerde-PEG-groepen. Een klein deel van elke batch kan gemakkelijk worden onderworpen aan kwaliteitscontrole metingen door het bepalen van de deeltjesgrootte, polydispersiteitsindex en zeta potentiaal met DLS en zeta potentiaal analysesysteem. De resulterende deeltjes nagenoeg gelijk is met een gemiddelde grootte van 130 ± 20 nm, polydispersiteit index van 0,22 ± 0,02 en zeta potentiaal van -54 ± 3 mV voor OVA inkapselen partikelen (Figuur 1B en 1C). Typische opbrengst aan deeltjes, gemeten in droog gewicht van deeltjes is ~ 50% 6.

De hierboven beschreven protocol, ICMVs samen worden geladen met fluorofoor gemerkt eiwit antigeen en fluorescente lipofiele kleurstof, waardoor visualisatie van antigeen en nanodeeltjes delivery in vivo. Om het patroon van antigen verkrijgbaar vergelijk oplosbaar versus in ICMVs, C57BL / 6 muizen werd sc bij staartbasis met 100 ug AlexaFluor555-gelabeld OVA hetzij in oplosbare of hoe gelabelde ICMV formuleringen en aftappen inguinale LNS werden uitgesneden op verschillende tijdstippen voor de bereiding van DLN weefsel cryo-secties. Visualisatie met confocale microscopie bleek dat oplosbaar antigeen snel bereikt de DLN's binnen 4 uur, maar ook zeer snel geklaard met 24 uur (Figuur 2) 7. Daarentegen werden OVA-beladen ICMVs aan de omtrek van DLN's gedetecteerd door 24 uur onder voortgezet accumulatiezoals besproken op dag 4, afzetten van een grote hoeveelheid OVA-ICMVs in DLN's (figuur 2). Confocale microfoto toonde ook co-lokalisatie van AlexaFluor555-gelabeld OVA en deed-gelabelde ICMVs binnen DLN, wat erop wijst dat ICMVs toelaten stabiele co-levering van eiwit antigenen en andere immunostimulerende stoffen ingekapseld in ICMVs 7.

Isolatie van CD8 + T-cellen van OT-I / Luc transgene muis kan gemakkelijk worden uitgevoerd met in de handel verkrijgbare magnetische negatieve selectie kit, waarbij ~ 8-12 x 10 6 cellen per muis milt. Figuur 3 toont C57BL / 6-muizen met adoptief overgebracht 5 x 10 5 OT-I / Luc CD8 + T-cellen op dag -1 en geïmmuniseerd op dag 0 met sc toediening van 10 ug OVA en 0,3 pg MPLA hetzij in oplosbare of ICMV formuleringen. Bioluminescentie beeldvorming met IVIS uitgevoerd op dag 0 vóór de vaccinatie toonde minimale OT-I / Luc signaal. Echter, bij dag 4 na vaccinatie, muizen geïmmuniseerdmet OVA / MPLA-ICMVs hadden robuuste bioluminescentie signaal binnen lies LN, die LNS aftappen van de staart basis regio 28 zijn. In tegenstelling, muizen geïmmuniseerd met de oplosbare vorm van het vaccin vertoonden veel lagere uitzetting van OT-I / Luc CD8 + T cellen in inguinale DLN's.

Met behulp van OVA als model antigeen maakt bewaking van expansie van endogene CD8 + T-cellen die specifiek zijn voor OVA 257-264 immunodominante peptide (SIINFEKL). Zo werden C57BL / 6-muizen geïmmuniseerd op dagen 0, 21 en 35 met sc toediening van 10 ug OVA en 0,3 pg MPLA in ofwel ICMVs of oplosbare vorm, en de frequentie van SIINFEKL-specifieke CD8 + T-cellen tot CD8 + T-cellen in PBMC werden bepaald door flow cytometrische analyse van PBMCs gekleurd met SIINFEKL-H-2Kb tetrameer-PE. Figuur 4A toont representatieve doorstroomcytometrie puntgrafieken van SIINFEKL-H-2Kb tetrameer + cellen onder CD8 + T-cellen in PBMC op dag 41 6. Figure 4B toont representatieve puntgrafieken van CD62L + CD44 + cellen met centrale geheugen fenotype bij SIINFEKL-tetrameer + CD8 + T-cellen. Wekelijks te controleren PBMCs figuur 4C aangegeven die oplosbaar OVA vaccin wekte minimale uitzetting van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen, terwijl ICMV vaccinatie opgewekt significant sterker CD8 + T cel responsen, het bereiken van een piek 28% SIINFEKL-tetrameer + T cellen in de CD8 + T-celpopulatie na dag 41 6. De tetrameer kleuring protocol hier gepresenteerde we de achtergrondfrequentie van 0,11% waargenomen ± 0,04% OVA-specifieke T-cellen (N = 15) bij onbehandelde of PBS behandelde dieren, en we kunnen detecteren statistisch significante toename van antigeen-specifieke CD8 + T cel frequenties zo laag als 0,46% ± 0,05% (p-waarde <0,005, gegevens niet getoond).

Figuur 1
(A) ICMVs worden gesynthetiseerd in de volgende 4 stappen.; (I) anionische, maleïmide gefunctionaliseerde liposomen worden bereid uit gedroogde lipide films; (Ii) tweewaardige kationen worden toegevoegd om fusie van liposomen en de vorming van multilamellaire vesicles te induceren; (Iii) membraan-permeabele dithiolen toegevoegd, die maleimide-lipiden op apposed lipide bilagen in de vesicle wanden vernetten; en (iv) de verkregen lipidendeeltjes worden gePEGyleerd met-thiol afgesloten PEG. (B) Representatieve deeltje zoals geanalyseerd door DLS weergegeven. (C) Gemiddeld hydrodynamische grootte, polydispersiteitsindex en zetapotentiaal van ICMVs co-geladen met OVA en MPLA worden getoond. Panel (A) is gewijzigd van Moon et al. 6. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Analyse van antigen drainerende lymfeklieren met confocale microscopie. C57BL / 6-muizen werden geïmmuniseerd met 100 ug fluorofoor geconjugeerd OVA (getoond in rood) en 5 pg MPLA hetzij in oplossing of ICMVs (blauw). Drainerende inguinale lymfeknopen werden uitgesneden bij bepaalde tijdstippen cryosectioned en afgebeeld met confocale microscopie. Vertegenwoordiger confocale micrografen worden getoond. Pink signalen geven co-lokalisatie van OVA en ICMVs. Dit cijfer is aangepast van Moon et al. 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. monitoring T-cel expansie na vaccinatie. C57BL / 6 albino muizen werden adoptief overgebracht iv met 5 x 10 5 Luc + OT-I CD8 + T-cellen op dag -1. Op dag 0 werden de dieren toegediend met 10 ug OVA en 0,1 pg MPLA ofwel als oplosbare of ICMV formuleringen. De dieren werden verdoofd met isofluraan en toegediend met luciferine (150 mg / kg, 300 pi geïnjecteerd ip) en bioluminescentie signaal van Luc + OT-1 CD8 + T-cellen werd verworven met IVIS. Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.

Figuur 4
Figuur 4. Uitbreiding van endogene OVA-specifieke CD8 + T-cellen na vaccinatie ICMV. C57BL / 6-muizen werden geïmmuniseerd met 10 ug OVA en 0,1 pg MPLA hetzij in oplossing of ICMVs op dagen 0, 21 en 35 (pijlen). Frequentie van OVA-specifieke T-cellen onder perifeer bloed mononucleaire cellen werd mettertijd door flow cytometrische analyse van SIINFEKL-MHC-I tetrameer + CD8 + T-cellen. (A) Vertegenwoordiger flowcytometrie puntgrafieken van individuele muizen op dag 41 tentoonstelling SIINFEKL-MHC-I tetrameer + CD8 + T-cellen en (B) CD62L + CD44 + cellen, marker van centrale geheugen T-cellen. (C) De totale kinetiek van T-cel expansie en contractie weergegeven. Dit cijfer is aangepast van Moon et al. 6. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het protocol in dit artikel beschrijft de synthese en karakterisering van een nieuwe lipide-gebaseerde nanodeeltjes systeem, genaamd ICMVs en geeft het proces valideren doeltreffendheid van nanodeeltjes gebaseerde vaccinpreparaten antigeen-specifieke CD8 + T-cel responsen te induceren. ICMV synthese in elke waterige toestand, hetgeen een belangrijk voordeel ten opzichte van andere gebruikelijke polymere nanodeeltjes systemen (bijvoorbeeld poly (lactide-co-glycolide) zuurdeeltjes), die typisch vereist organische oplosmiddelen voor bereiding, vaak resulterend in verlies van voltooide antigeniciteit in eiwitantigenen 29,30. Daarnaast ICMVs profiteren van uitgebreide stabiliteit en het vermogen om in te kapselen zowel hydrofobe en hydrofiele moleculen 6, waardoor het mogelijk co-afgifte van antigenen en adjuvantia gericht op dezelfde intracellulaire compartiment binnen APC 31,32. Met behulp van ICMVs als model vaccin nanodeeltje, hier hebben we de procedures geschetstvoor (1) nanodeeltjes synthese en karakterisering, (2) de validatie van nanodeeltjes bronbemaling DLN en onderzoek uitlokken van antigeen-specifieke CD8 + T celresponsen (3) een niet-invasieve bioluminescentie beeldvormingstechniek en (4) het peptide-MHC tetrameer vlekken test op PBMC.

Het is cruciaal om uniforme nanodeeltjes synthese waarborgen van partij tot partij, vooral deeltjesgrootte en oppervlaktelading aangezien zij sterk kan beïnvloeden lymfatische drainage en opname door APC's na in vivo toediening. DLS en zeta potentiële analyse bieden snelle methoden van kwaliteitscontrole op de deeltjesgrootte en oppervlakte lading. Voor meer gedetailleerde analyse op morfologie van individuele deeltjes, kunnen deze technieken worden aangevuld met een hoge-resolutie elektronenmicroscopie, zoals cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) dat de morfologie van "zachte" deeltjes conserven in verglaasde waterlaag 6,33,34 . Inkapseling efficiëntie van antigenen en adjuvmieren moet worden bepaald en bewaard ongelijkmatig tussen syntheses. Adjuvantia zoals MPLA, kunnen worden gelabeld met een fluorofoor 6 dat eiwitantigenen kunnen worden gekwantificeerd met behulp absorbance- en op fluorescentie gebaseerde eiwit kwantificatie kits of geanalyseerd met gebruikmaking van SDS-PAGE en Coomassie 35 of zilverkleuring 36 en gekwantificeerd op basis band intensiteit . Inconsistenties in deeltjes preparaat kunnen voortvloeien uit verlopen of slecht opgeslagen reagentia, een optimale reactiviteit noodzakelijk voor volledige synthese. Daartoe maleimide- en thiol gefunctionaliseerde reagentia moeten in kleine porties bewaard bij -80 ° C zonder voortdurend vries-dooi cycli.

Deeltjes kleiner dan 100 nm zijn over het algemeen gedacht dat de lymfevaten en het verkeer naar DLNS 13 effectief in te voeren, terwijl grotere deeltjes (500-2,000 nm) moet actief transport door tissue-resident DC 12,37. In onze handen, ICMVs de hydrodynamische grootte variërend 150-250 Nm efficiënt gelokaliseerd en volhardde in de DLN, wat resulteert in een uitgebreide CTL en humorale reacties 6,7. Binnen 24 uur van toediening werden ICMVs geassocieerd met subcapsulaire sinus macrofagen in DLN en flowcytometrische analyses uitgevoerd op dagen 1 en 4 gaven aan dat de meeste ICMVs binnen DLN door LN-resident APCs werden met slechts een klein gedeelte van deeltjes geassocieerd met Langerhans en dermale DC 7. Deze resultaten gaven aan dat passief transport is de belangrijkste wijze van ICMV mensenhandel DLN. Deze studies hebben fluorofoor gelabeld nanodeeltjes en eiwitantigenen gebruikt om de lokalisatie en distributiepatroon bakenen in DLN's. Confocale microscopie van cryosectioned DLN maakt extra immunofluorescentie histochemie voor de identificatie van LN structuren (bv GL-7-expressie in kiemcentra) en cellen interactie met de formulering componenten (bijvoorbeeld, DC - CD11c, macrofagen - F4 / 80, CD169 en B- cellen & #8211; B220) 7,9. Deze techniek kan worden uitgevoerd in parallel met flowcytometrie analyse van cellen geoogst van DLN de subsets van APCs belast particle opname 7,9 bakenen of hele dieren imaging vaccinafgifte van injectie te kwantificeren DLN 38,39, mits de fluorescentiesignalen sterk en weefsel autofluorescentie niet interfereert met de signalen.

Effectieve immunisatie vergt robuuste activering en uitbreiding van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen, die kunnen worden gevolgd door het gehele lichaam bioluminescentie na adoptieve overdracht van bioluminescente, antigen-specifieke transgene T-cellen, gevolgd door vaccinatie. Het extra voordeel van deze methode is het potentieel voor herhaalde weergave van CTL handel in dezelfde dieren gedurende langere tijd, waardoor het aantal benodigde dieren voor immunologische analyses verminderen en vermijden van het gebruik van omslachtige celisolatie procedures. Met deze beeldvormende techniek, hebben we onlangs aangetoond dat pulmonaire toediening van ICMVs co geladen met eiwitantigeen en een immunostimulerend agens tot krachtige uitlokken van antigeen-specifieke CD8 + T cellen in de longen en mediastinale LNS en daaropvolgende verspreiding van CTLs distale mucosale weefsels , met inbegrip van Peyer's patches, blindedarm, en vaginale-darmkanaal 9. Flow cytometrische analyse liet zien dat deze onlangs uitgebreide CD8 + T-cellen werden bedrukt met een "mucosaal-homing" fenotype gekenmerkt door α β 4 7 + integrine expressie en gemedieerde beschermende immune responsen tegen mucosale virusbesmetting 9. Het hele dier beeldvorming van bioluminescente CD8 + T-cellen is onlangs gebruikt door Hailemicheal et al., Die toonde dat tumor-antigen peptide bereid in incompleet Freund's adjuvans (IFA, olie-in-wateremulsie) resulteerde in sequestratie van T-cellen op de plaats van de injectiemet vaccin "depot" weg van de tumormassa's, wat leidt tot T-cel dysfunctie en verwijdering 40.

Tetrameer kleuring is uitgebreid gebruikt in het verleden op het niveau van endogene CTL reacties na verschillende vaccinformuleringen 21 kwantificeren. Deze techniek is ook relevant en gewoonlijk gebruikt in vroege humane kanker immunotherapie klinische proeven om CTL responsen op specifieke tumor-geassocieerde antigenen 41,42 bevestigen. PBMCs kunnen gemakkelijk worden verzameld van muizen en voorbereid voor flowcytometrie; het kan echter niet onthullen de volledige omvang van T-cel-uitzetting cel lokalisatie depot-vormen vaccins zoals eerder vermeld of binnen tumors in kankermodellen, waardoor uitgebreidere analyse vereisen. Verenigbaarheid van deze methode met flowcytometrie basis hiervan kunnen antigenspecifieke T-cellen met markers geheugen (CD44, CD62L, CD127, Bcl-2 en KLRG-1) tot de effectorfunctie, centrale geheugen en effector geheugen ce onderscheidenlls onder de tetrameer + T-cellen 43 of langdurige weefsel resident CTL 44,45 (zoals samengevat in de laatste reviews 46,47). De tetrameer kleuring assay uitsluitend de eerste beoordeling CTL omdat zeer geëxpandeerde antigenspecifieke T-cellen tekenen van immune vermoeidheid 48,49 kunnen vertonen. Functionele evaluatie van CTL responsen kunnen worden uitgevoerd door het onderzoeken van cytokine afgifte met enzymgebonden immunospot (ELISPOT) 50 of intracellulaire cytokine kleuring 51 na ex vivo stimulatie van lymfocyten met minimale epitopen en door meting van de intracellulaire niveaus van perforine en granzyme B 52 en extracellulaire uitdrukking van CD107a en CD107b op degranulatie 53. Bovendien kan cytolytische functie van CTL's direct worden beoordeeld CTL-cytotoxiciteit assays in vitro of in vivo 54-56.

Inductie van humorale immuunresponsenNa nanodeeltjes vaccinatie worden bestudeerd in parallel met de CD8 + T-cel gepresenteerde analyses. Antilichaam titers kunnen worden geanalyseerd door de traditionele methode van enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA), terwijl antilichaamaffiniteit en breedte van epitoopherkenning kan worden bepaald door aanpassing van de ELISA-protocol met behulp van chaotrope agens (bijvoorbeeld ureum) gedurende antilichaambinding aan de substraat en het gebruik van subdomeinen binnen antigenen als substraten respectievelijk 7. Uitlokken van krachtige humorale responsen vereist uitbreiding van folliculaire helper CD4 + T-cellen (T fh) 57. Uitbreiding van T-cellen fh reactie op deeltjes vaccinatie onderzoeken kan de hier gepresenteerde protocol gemakkelijk worden aangepast voor isolatie van antigeen-specifieke CD4 + T-cellen van OT-II transgene muizen, gevolgd door adoptieve celoverdracht in naïeve ontvangende muizen. Na vaccinatie kunnen lymfeweefsel worden geoogst en geanalyseerd met flowcytometrische analyses om af te schrikkenmine uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen fh (geïdentificeerd door hun CD4 + CXCR5 + PD-1 + fenotype) 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Perkin Elmer mits de productie gemaakte kosten tijdens de publicatie van dit artikel.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door het National Institute of Health verlenen 1K22AI097291-01 en door het National Center for Advancing Translationeel Wetenschappen van de National Institutes of Health onder Award Number UL1TR000433. We hebben ook erkennen Prof. Darrell Irvine aan het MIT en Prof. Matthias Stephan bij Fred Hutchinson Cancer Center voor hun bijdrage aan de eerste werkzaamheden op het vaccin nanodeeltjes en OT-I / Luc transgene muizen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) Avanti Polar Lipids, INC. 870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, INC. 850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) Avanti Polar Lipids, INC. 699800
20 ml glass vials Wheaton 0334125D
Symphny Vacuum Oven VWR 414004-580
Ovalbumin (OVA) Worthington 3054
Bis-Tris Propane (BTP) Fisher BP2943
Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) Qsonica Q125-110
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) Laysan Bio MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP  Malvern
ZetaSizer Cuvettes Malvern DTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) Life Technologies D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) Life Technologies A37571
Tissue-Tek OCT freezing medium  VWR 25608-930
Tissue Cryomolds VWR 25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 mice Jackson 000664
Albino C57BL/6 mice Jackson 000058
OT-1 C57BL/6 mice Jackson 003831
70 μm nylon strainer BD 352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell 19853
IVIS® whole animal imaging system Perkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubes BD 365974
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01 
Anti-CD16/32 Fc Block Ebioscience 14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer MBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APC BD 553031
Anti-CD44-FITC BD 553133
Anti-CD62L-PECy7 Ebioscience 25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) SIGMA D8417-10MG
CyAn Flow Cytometer Beckman Coulter
FlowJo Software FlowJo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
  2. Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
  3. Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. (2014).
  4. Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
  5. Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
  6. Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
  7. Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
  8. DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
  9. Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130 (2013).
  10. Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
  11. Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
  12. Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
  13. Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
  14. Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
  15. Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  17. Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
  18. Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
  19. Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
  21. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. e2771 (2012).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. e50765 (2013).
  24. Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. (2011).
  25. Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. 476-502 (2009).
  26. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. e740 (2008).
  27. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
  28. Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
  29. Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
  30. Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
  31. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
  32. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  33. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
  34. Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
  35. Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
  36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
  37. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
  38. Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
  39. Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
  40. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465 (2013).
  41. Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
  42. Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
  43. Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
  44. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
  45. Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
  46. Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
  47. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
  48. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  49. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
  50. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
  51. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6, (Unit 6 24), (2007).
  52. Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3, (Unit 6 24), (2006).
  53. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
  54. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  55. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. e51105 (2013).
  56. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. e51627 (2014).
  57. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics