설계 및 인공 세포 외 기질의 건설 (aECM) 단백질에서

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Low, P. S. J., Tjin, M. S., Fong, E. Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (100), e52845, doi:10.3791/52845 (2015).

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Abstract

Protocol

aECM 단백질 재조합 플라스미드 인코딩 1. 복제

  1. 기능 도메인 (예, 세포 결합 도메인과 엘라스틴 같은 반복)의 아미노산 서열을 디자인. 기능 영역의 단부의 측면에 디자인 제한 부위는 서브 클로닝 소프트웨어 명령에 따른 무료 소프트웨어를 사용하여 (예 http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/)을 용이하게한다. 여기서, 의도 사이트로 소화를 한정하기 위해 기능 도메인에 존재하지 않는 유일한 제한 효소 부위를 선택한다. 다중 클로닝 부위 호스트 벡터 (MCS)에 표시 제한 부위를 선택 (예를 들어, pET22b (+))의 서브 클로닝.
  2. 소프트웨어 명령어에 따라 웹 사이트를 이용하여 자유 염기 서열에 아미노산 서열을 해석 역방향. (예 http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). 확인 코돈은 E.에 최적화되어 있습니다 대장균 호스트.
  3. 관심의 유전자는 purchas 수 있습니다ED 상업적로서 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드는 DNA 및 어닐링을 수행 (올리고 <100 염기쌍 (BP)이있는 경우, 즉) (단계 1.4 참조) 비용을 감소시킨다. 그렇지 않으면, 100 염기쌍보다 큰 유전자들은 상업적인 회사에서 구입할 수있다.
  4. DNA 올리고 뉴클레오티드의 어닐링
    1. 원하는 유전자 서열을 얻기 위해 DNA 올리고머 어닐링. 1 μg의 / μL의 최종 농도 (여과 2- 아미노 -2- (히드 록시 메틸) 프로판 -1,3- 디올, pH가 8.0, 10 mM 트리스) DNA 올리고머 버퍼 DNA 올리고 뉴클레오티드를 녹인다.
    2. 총 40 ㎕의 혼합물을 달성하기 위해 DNA 어닐링 완충액 32 μL (10 mM의 트리스, 100 mM의 NaCl 내지 100nm의 MgCl 2)에 각 올리고머 4 μl를 추가.
    3. 핫 플레이트를 사용하여 물을 비이커를 삶아 5 분, 95 ° C의 혼합물을 담그지. 비커를 제거하고 점차적으로 스티로폼 상자 O / N에서 설정 전체를 냉각. 올리고머는 어닐링 및 소화 할 준비가되어있다.
    어닐링 올리고머 (즉, 삽입 라한다) 및 호스트 벡터 별도로 (즉, pET22b (+)를) 소화 해당 제한 효소를 추가합니다. 37 ℃에서 3-4 시간 동안 다음 레시피 (1-2 μg의 DNA 각각을 제한 효소 2㎕의, 총 50 ㎕의 혼합물을 10 배 제한 효소 완충액, 및 물을 최대 5 μL)을 사용.
    참고 : pET22b (+) 플라스미드 벡터는 암피실린 항생제 내성과 C- 말단에 6 배 - 그의 태그가 포함되어 있습니다. pET22b (+)에 존재하는 6 배-그의 태그는 7 단계에서 웨스턴 블로 팅을 통해 표적 단백질을 식별하기 위해 그의 - 태그 항체를 사용하여 우리를 할 수 있습니다.
  5. 각 소화 혼합물에 6 배 로딩 염료를 추가합니다. 별도로 100 V. 시각화 UV 광 조명과 1.2 %의 DNA 아가 로즈 겔에서 1 시간 동안 UV 형광 DNA 얼룩을 함유하는 1.2 % DNA 아가 로스 젤에서 DNA 사다리 포함 소화 혼합물을 실행.
  6. 상업 젤 정화 키트를 사용하여 소화 DNA 제품을 추출하기 위해 젤을 조각입니다. 엘 루트E 50-100 NG / μL의 최소 DNA 농도를 달성하기위한 최소한의 열을 사용하여 볼륨.
  7. 소화 된 DNA 인서트를 결찰하여 관심 순차적 유전자를 결합 (즉, DNA의 어닐링에 의해 얻어지는 엘라스틴 반복 또는 세포 결합 도메인)하기 배합하여 T4 리가 제를 사용하여 플라스미드 벡터로 (벡터의 2 μL, T4 리가 제 1 μL를, T4 내고 버퍼, X μL 삽입의 1.5 μL, 총 15 μL 혼합물 10.5-X μL 물). 2 시간 동안 실온에서 결찰 혼합물을 품어.
    참고 : 삽입하는 벡터의 몰 농도는 결찰 효율을 최적화하기 위해 변화되어야한다. 조리법에있는 X 설명 삽입물의 볼륨 단계 1.7에서 용출 DNA 농도에 따라 달라집니다.
  8. 해동 E. 대장균 DH5α 화학적으로 유능한 세포 (또는 복제 주) 얼음에. 따뜻한는 2xYT 아가 플레이트 암피실린 (25 μg의 / ㎖)를 함유하는 (표 1)에 37 ° C.
  9. 사용하여 세포를 형질열 충격 :
    1. 나누어지는 깨끗하고 사전 냉장 마이크로 원심 분리기 튜브에 유능한 세포의 50 μL. 피펫 5 μL 세포로 결찰 혼합물 (100 페이지 NG 100 사이), 피펫 팅 부드럽게 위아래로 혼합합니다. 20 분 동안 얼음에 혼합물을 남겨주세요.
    2. 2 분 동안 42 ° C의 물을 용기에 세포 혼합액을 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브를 담그고 2 분 동안 얼음에 돌려 보냈다. 세포에 열 손상을 최소화하기 위해 시간을 침지 시간.
    3. 마이크로 원심 분리기 튜브에 SOC 미디어 (표 1)의 500 μl를 추가하고 1 시간 동안 진탕 37 ° C에서 품어.
    4. 암피실린 (25 μg의 / ㎖)를 포함, 실온으로 미리 예열 된 함유하는 2 × YT 한천 플레이트에 세포 / 결찰 혼합물 (50) 500 μl를 확산하고 판을 37 주에서 거꾸로 품어 / N (12 ~ 16 시간) .
  10. 다음날, 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 한천 플레이트에서의 DNA 식민지를 선택합니다. (표 2YT 배지 5ml에 콜로니를 성장1)을 포함 암피실린 (25 μg의 / ㎖) O / N) 진동 (225 rpm으로 37 ° CO / N (12 ~ 16 시간)에서.
  11. 다음 날, 제조 업체의 프로토콜에 따라 고른 각 식민지에 대한 DNA 플라스미드를 추출하는 플라스미드 분리 키트를 사용합니다. 물 50 μL와 DNA를 용출시켰다.
  12. 37 ° C에서 2 시간 동안 배양 (5 μL의 DNA 각각을 제한 효소 0.2 μL, 총 10 ㎕의 혼합물을 1 μL 10 배 제한 효소 완충액 및 상부까지 물) : 시험은 다음의 레서피를 이용하여 제한 효소로 소화 수행 가능성이 단계 1.6에서 1.2 %의 DNA 아가로 오스 겔에 삽입하고 실행을 포함 식민지 화면.
    참고 : 소화시, 성공적인 결찰해야 두 밴드, 벡터 및 각각의 분자량에 해당 삽입 (그림 1)에 대한 하나의 각각의 결과.
  13. 앞으로 T7 프로모터를 사용하여 DNA 염기 서열에 대한 가능성이 식민지를 보내기 및 상업 시퀀서에 프라이머를 역.

  1. 시퀀싱 결과로부터 성공적으로 결찰 된 콜로니를 선택하고 E.로 형질 전환 DNA 플라스미드를 사용 대장균 발현 호스트.
  2. 해동 E. 대장균 발현 균주 얼음 (BL21 (DE3) pLysS를). 한편, RT를 암피실린 (25 μg의 / ㎖) 및 클로람페니콜 (34 μg의 / ㎖)를 함유하는 한천 판 따뜻한.
    주 : 박테리아에 존재 pLysS를 플라스미드는 BL21 (DE3) pLysS 균주는 클로람페니콜 내성 유전자를 포함 균주. pLysS를 플라스미드는 구조적으로 aECM 단백질의 새는 표현을 제한하는 표현 T7 리프레 유전자가 포함되어 있습니다. 클로람페니콜 pLysS 균주는 배양 중에 포함되어 박테리아 세포에 대해 선택하는 것이 필요하다.
  3. 단계를 반복 1.10 E. 변형을 구하는 인공 단백질을 발현 할 준비가 대장균 세포. 파라 필름에 한천 플레이트를 감싸고 4 거꾸로 저장 6; 최대 1 개월 C.

aECM 단백질의 3 세균 식

  1. 도 2를 피펫 팁으로 변환 된 한천 플레이트에서 식민지를 선택하고 멸균 좋아요 국물 (TB) 미디어 시험관에 암피실린과 클로람페니콜 항생제를 모두 포함 (표 1) 10 ㎖에 접종을 참조하십시오. 225 rpm으로 진탕 37 ° CO / N (12 ~ 16 시간)에서이 스타터 문화를 품어.
  2. 이전 3 L 삼각 플라스크에 같은 항생제로 보충 한 L 신선한 멸균 결핵 매체에 스타터 문화 10 ㎖. 2 ~ 3 시간 동안 225 rpm으로 진탕 37 ° C에서 문화를 품어과 문화 (OD 600)의 광학 밀도를 관찰 읽기 빈 큐벳에 문화 1 ㎖를 피펫 팅에 의해 0.6-0.8에 도달했습니다. 이전 SDS-PAGE 특성화 유도에 문화 1 ㎖를 저장합니다.
    1. 세포 배양액의 OD (600)를 측정하기 위해, 큐벳에서 TB 매체의 1 바이알을 제조빈 측정. 별도로, 새로운 빈 베트로 문화 플라스크에서 배양 1 ㎖를 전송합니다. 600 nm의 흡광도에서의 제어에 대해 빈 분광 광도계를 사용하여 배양 물의 광학 밀도를 측정한다.
    2. 2 분 동안 12,000 XG에 1.5 ml의 microcentrifuge 관, 원심 분리기로 문화 샘플의 1 ml에 전송하여 (이후의 SDS-PAGE 분석을위한) 샘플을 저장하고 상층 액을 가만히 따르다.
  3. 최종 농도 1 mM로 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 배양을 유도하고 다른 4 시간 동안 225 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 배양한다. SDS-PAGE 특성화를위한 4 시간에서 유도의 끝에서 문화 1 ㎖를 저장합니다.
  4. 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에서 1 리터의 원심 분리기 병 원심 분리기에 문화를 전송하여 세포를 수확. G / ㎖ 0.5 (pH는 8.0, 1 M 트리스, 0.01 M EDTA, 0.1 M의 NaCl), 상층 액을 버린다 TEN 버퍼에 세포 펠렛을 Resuspend 무게.

세균 배양 4. 용해

  1. -80 ° CO / N에서 다시 정지 세포 배양을 동결. 세포를 용해시키기 위해 RT 또는 얼음 수욕 냉동 세포 배양액을 해동. 해동 동안 10 μg의 / ㎖ 디옥시리보 뉴 클레아 제 I (DNase의 I), 10 μg의 / ㎖의 리보 뉴 클레아 제 A (의 RNase I) 및 50 μg의 / ㎖의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF)를 첨가하고, 천천히 교반하면서 용액을 균질화한다.
  2. 모든 세포를 재현 탁하고, 해동 후에 물 12 단백질의 용해도를 증가하여 pH 9.0 용액을 조정한다. 동질적인 일관성을 달성하기 위해 얼음에 교반 현명한 6 N NaOH를 드롭을 추가합니다. 2 mm 직경 플랫 팁, 5 초 펄스를 사용하여 얼음에 20 분 동안 초음파 중단에 의해를 Lyse.
  3. 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에 세포 용액을 원심 분리기. 나중에 정화 4 ℃에서 깨끗하고 빈 병 및 저장소에 뜨는을 전송합니다.
  4. 한편, -80 ° C에서 TEN 완충액 재 동결 다시 세포 펠렛을 재현 탁. 에세 번에 완전한 세포 용해를 반복 동결 / 해동 및 초음파 프로세스입니다. SDS-PAGE 특성 20 μL 세포 용 해물을 저장합니다.

역 전환 자전거를 사용 aECM 단백질의 정제 (5)

  1. 단계 4.3에서 세포 용 해물을 부씩과 엘라스틴 계 단백질 (21)의 정제를 위해 사용되는 것과 유사한 ITC를 사용 aECM 단백질을 정제로 진행. 사이클 4 ° C에있는 다른 온도로 수행되며, 37 ° C ( "콜드"라한다)는 각각 사이클 ( "웜"라 함).
  2. 4 ℃에서 2 시간 동안 40,000 XG에서 세포 50ml의 원심 분리기 병에 해물, 원심 분리를 분할합니다. 세포 펠렛의 모양은 암갈색하고 콧물 보일 것입니다.
  3. 펠렛에서 깨끗한 분리를 얻기 위해 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 깨끗한 병 원심 상등액을 수집하고 (3 M에서 최대) 1 M의 최종 농도의 NaCl를 추가한다. 따뜻한225 rpm으로 진탕 2 시간 동안 37 ° C의 솔루션입니다.
    참고 : 염화나트륨의 추가가 aECM 원인 집계 엘라스틴 성분의 전환을 트리거합니다. 상층 액을 탁 켜집니다. 단백질 농도가 충분히 높은 경우, 흰색 거품 단백질은 원심 분리 병의 측면에서 볼 수있다.
  4. 37 ℃에서 2 시간 동안 40,000 XG에 단계 5.3에서 뜨는을 원심 분리기. 뜨는을 가만히 따르다. 금속 주걱을 사용하여 펠렛을 분쇄 및 자기 교반 막대 및 플레이트를 이용하여 4 ℃에서 격렬히 교반 O / N와 빙냉 멸균 증류수 펠릿 비트 (50 ㎎ / ㎖)에 재현 탁. 펠렛을 완전히 용해한다.
  5. 반복 단백질의 높은 순도를 얻기 위해 5.2 다른 3-5 회 5.4 단계를 반복합니다.
  6. 정제의 최종 사이클 후, 4 ℃에서 증류수에 대하여 투석을하여 단백질 용액을 탈염. 물 매 4의 변화에​​ 2-3 일 동안은 물에 대한 단백질 용액을 투석시간 또는 O / N 8 시간. SDS-PAGE에 대한 정제 된 단백질의 20 μl를 저장하고 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 정제 된 단백질과 상점의 나머지 부분을 동결 건조.

SDS-PAGE 전기 영동을 사용하여 단백질의 aECM 6. 특성화

  1. (분자량이 큰 경우, 더 나은 분리를 위해 8 % SDS-PAGE 겔을 사용) 12 % SDS-PAGE 겔을 준비한다. 각 시료에 2 × SDS 로딩 버퍼를 추가 가열 샘플을 10 분 동안 100 ° C에서 실행 샘플을 겔에서 1 시간 동안 100 V 또는 aECM 단백질의 분자량에 상응하는 단백질 사다리의 중간에 도달 할 때까지 젤.
  2. 설정 SDS-PAGE에서 젤을 검색하고 페트리 접시에 1 시간 동안 젤 잠수함하는 볼륨 쿠마에게 브릴리언트 블루 얼룩 (표 2)를 추가합니다. 로커에 5 분 동안 탈색 용액 (표 2)에 린스 젤. 탈색 솔루션을 변경하고 T의 배경까지 흔들와 젤을 destain 계속그는 젤은 분명해진다. 단백질 밴드가 명확하게 볼 수 있어야합니다.
  3. 표적 단백질의 분자량을 결정하기 위해 단백질 래더 대해 표적 단백질의 위치를​​ 비교한다.
  4. 상기 표적 단백질의 존재를 확인하기 위해, 단계 7과 웨스턴 블롯을 수행한다.

웨스턴 블로 팅을 사용하여 aECM 단백질 7. 특성

  1. 아니오 염색 부 (6)에서와 같이 12 % SDS-PAGE 겔상에서 샘플을 실행.
  2. SDS-PAGE 젤보다 약간 큰 크기로 니트로 셀룰로오스 막 잘라. 동일한 크기의 여과지 4 조각을 잘라.
  3. 웨스턴 전송 버퍼 여과지 젖은 원피스 (20 % V / V를 메탄올, 25 mM 트리스, 190 mM의 글리신, pH를 8.3), 여과지의 다른 조각 뒤에 여과지 위에 SDS-PAGE 겔을 올려 다음, 니트로 셀룰로오스 막 및 필터 종이의 마지막 다른 두 조각. 확인 전체 셋업 충분한 서부 전송 버퍼로 침수입니다.
    참고 : 단백질이 접촉시 막에 결합 수로 젤 막은이 시점에서 접촉해서는 안된다.
  4. 니트로 셀룰로오스 막이어서 웨스턴 반건식 이송 유닛으로 두 여과지를 배치하여 니트로 셀룰로오스 막 상에 단백질을 전송하고, 신중 내에 멤브레인에 SDS-PAGE 겔을 배치, 마지막에 마지막 두 젖은 여과지를 배치 SDS-PAGE 젤. 45mA, 30 분에서 서쪽 전송을 실행합니다. 전압보다 높은 30 V. 경우 버퍼를 추가
    참고 : 바람직 시도와 멤브레인의 SDS-PAGE 젤을 배치하고 단백질이 접촉시 막에 결합시킬 수 있으므로 막에 불필요하게 젤을 이동하지 마십시오.
  5. 검색하고 RT에서 2 시간 동안 (여과지로 여과 PBS pH를 7.4에서 5 % 무 지방 우유) 차단 용액으로 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 차단. 버퍼를 차단 폐기와 린스 PBS를 추가합니다.
    참고 : 새 장갑으로 변경 원치 않는 보호 자전거와 막 오염을 방지하기 위해인.
  6. 1 PBS에 희석 차 안티 그의 항체를 품어 : 1,000 실온에서 1 시간 동안 락을 함께. 1000 항체의 1 μL (스톡 농도 1 ㎎ / ㎖)을 추가 희석 비율 (1)과, 예를 들어, 전체 막 잠길 수있는 부피 혼합물을 제조 한 용액 전체 혼합물을 999 ㎕의 PBS로.
  7. (0.1 % 트윈 20과 함께 PBS) PBST 5ml를 가진 막을 씻어.
  8. 1 PBS에 희석와 말 무 퍼 옥시 다제 (HRP)에 접합 된 이차 항체와 함께 품어 : 5,000 실온에서 1 시간 동안 락을 함께. 5000 항체의 1 μL (스톡 농도 1 ㎎ / ㎖)을 추가 희석 비율 (1)과, 예를 들어, 전체 막 잠길 수있는 부피 혼합물을 제조 5 ml의 전체 혼합물에 대한 4999 μL의 PBS로.
  9. PBST 5 mL로 막을 세척하고 두 번 반복합니다.
  10. 멤브레인을 커버하고 사용하는 기판의 지침에 따라 부화 볼륨 막에 화학 발광 기판을 적용합니다.
    참고 : 단백질 검출 기판의 감도가 다를 수 있습니다, 우리는 신호를 증가시키지 않습니다 항체 농도를 증가시 매우 낮은 신호를 최대 감도와 기판을 권장합니다.
  11. CCD 카메라 기반 이미 저를 사용하여 화학 발광 신호를 캡처. 신호가 약한 및 비특이적 인 경우 일차 및 이차 항체의 희석 비율을 조정한다. 배경 신호가 하이 인 경우 차단 용액에 이상 인큐베이션.

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Representative Results

엘라스틴 형상의 반복을 포함하는 융합 단백질을 설계에서, 전체 콘텐츠 엘라스틴, 융합 단백질 (18)의 충분한 부분을 유지하는 것이 중요하다. 이 융합 단백질 작 제물이 정제를 위해 ITC를 사용하기 위해, 그것의 엘라스틴과 같은 특성을 보유하고 있는지 확인하는 것이다. aECM 단백질 설계 및이 절에서 설명하는 순서는 특히 Tjin 등. (14)에 의해 직장에서 촬영되었다. 본 연구에서는 세 aECM 단백질은 성공적으로 pET22b (+) 발현 벡터에 클로닝 하였다. 순차 내고 먼저 엘라스틴 반복 셀 결합 도메인을 삽입하여 다음 애완 동물 벡터에 삽입 결찰 시작했다. 마지막 엘라스틴 반복의 마지막 세트는 동일한 방법을 사용하여 세포 결합 도메인의 말단에 삽입 하였다. 재조합 유전자가 성공적으로 구축 된 경우 확인하려면 각 재조합 플라스미드는 시험 37 ℃에서 3 시간 동안 XhoI에와 SalI로로 분해C.도 1은 시험 후의 소화 DNA 인서트 및 벡터 밴드를 나타낸다. aECM 단백질 각각에 대한 삽입물의 크기는 복제를 실제로 성공했음을 확인하는 유전자의 크기에 대응. DNA 서열 분석을 통해 확인도 또한 소화 시험 결과를 확인 하였다.

우리는 각 aECM 단백질에 주어진 ITC 충분한 엘라스틴 콘텐츠 본 통해 aECM 단백질을 정제 할 수 있었다. (2)가 전체 정제 공정의 개략도를 나타낸다. O / N 문화는 전형적인 시작 외경 0.01 (600)와 1 L 쉐이크 플라스크에 접종 하였다. 문화는 3-4 시간 후 0.6-0.8의 600 중독에 성장했다. 단백질 발현은 1mM의 IPTG를 사용하여 유도 하였다. 4 시간 후, 1.5의 일반적인 OD가 달성된다. 박테리아 문화는 수확 및 원심 분리 하였다. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 칭량 하였다. 세포 펠릿의 평균 중량은 약 3g / L이었다문화. 펠렛 TEN 완충액에 재현 탁하고 -80 ° CO / N에서 동결시켰다.

동결 / 해동 사이클의 일련의 용균하는데 사용되었다. 동결 - 해동 단계 팽윤 궁극적 동결 과정에서 형성된 얼음 결정으로 인한 파괴, 세포 축소시킨다. 이어서,과의 DNase I의 RNase I는 모든 DNA 및 RNA를 소화 세포 용 해물에 첨가 하였다. PMSF는 단백질 분해를 최소화하는 세포 용 해물을 첨가 프로테아제 억제제이다. 더욱 완전한 세포 용해를 보장하기 위해, 상기 초음파 해물 동안 얼음에 보관.

세포 용 해물이어서 ITC 정제 3 회 행 하였다. 3 사이클의 끝에서, 따뜻한 사이클이 종료 펠릿 일관성 꿀과 닮았다 약간 황색 착색했다. 펠렛을 물과 접촉시 켜져 투명하고 용이하게 진탕 예비 냉각 멸균 물에 용해시켰다. 정제 된 단백질은 잔여 S를 제거하는 투석ALT. 따뜻한 최종 사이클의 끝에서 얻어진 단백질 용액을 투석 튜브의 짧은 길이에 옮겼다 (12 kDa의 분자량 차단). 투석의 끝에서, 단백질 용액은 깨끗한 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 옮기고 -20 ℃에서 동결. 다음날, 냉동 된 단백질 용액은 물 함량을 제거하기 위해, 동결 건조 하였다. 전형적인 양모와 같은 외관을 갖는 3 투석 된 단백질의 이미지를 나타낸다.

유도는 SDS-PAGE 전기 영동으로 분석 하였다 후 단백질 발현이 참으로 유도하는지 확인하려면, 샘플은 이전에 수집. 여기서, 12 % SDS-PAGE 겔은 20 ~ 150 kDa의 분자량과 단백질을 분리하기에 충분했다. 분자량, 즉> 100 kDa의 8 % SDS-PAGE 겔은 더 단백질 분리를 위해 사용될 수있는 대형되는 경우이다.도 4를하면 유도 SA의 예측 된 분자량에 강한 단백질 밴드를 도시mple (레인 2). 정화가 개시되기 전에 일반적으로 SDS-PAGE 분석을 단백질 발현 후 즉시 수행되었다. 이어서, 샘플. 또한 표적 단백질의 효율적인 정제를 위해 SDS-PAGE 전기 영동을 이용하여 분석 될 수있는 정제 방법을 통해 취해진도 4를도 22 kDa의 (레인 4의 분자량을 갖는 정제 된 단백질 시료를 함유 한 SDS-PAGE 겔을 도시 ), LN-5 aECM 14에 대응. aECM 단백질의 추정 된 순도는 약 90 % -95 %이다; 이 값은 표적 단백질과 SDS 겔 (도 4, 레인 4) 상에 존재하는 다른 단백질 밴드의 밴드의 강도 비율을 비교하여 산출 하였다. 정제 된 단백질이 실제로 aECM 단백질 인 경우 마지막으로, 결정하기 위해, 웨스턴 블롯을 실시 하였다. 그 후, MALDI-TOF도 5도. 정확하게 정제 된 물질 (14)의 불순물 함량을 측정하기 위해 수행 번째의 단백질 순도를 도시 한그림 5A에서 SDS-PAGE 젤과 표적 단백질 골-IV aECM 및 LN-5 aECM의 존재를 보여주는 그림 5B 서부 블로 팅의 니트로 셀룰로오스 막의 이미지와 비교하는 전자 세 aECM 단백질은 안티를 사용하여 태그 말 - 무 퍼 옥시 다제 (HRP)와 복합 그의 태그 항체를 -6x. aECM 단백질의 최종 수율은 120 ㎎ / ℓ 60 ㎎ / ℓ 사이이다.

그림 1
aECM 단백질 그림 1. DNA의 아가 로스 겔 전기 영동. DNA는 제한을 통해 구축 최종 검증 aECM 단백질은 소화가 1.2 % DNA 아가 로스 겔상에서 실행 효소. aECM 단백질 각각에 대해 코딩하는 재조합 플라스미드 더블 37 ℃에서 3 시간 동안 효소 XhoI과 SalI로로 소화했다 삽입물의 크기는 각 aECM 단백질 유전자의 크기에 대응한다 (FN910 : 1.8KBP, 골-IV : 696 BP, LN-5 : 699 BP)과 사용 된 벡터의 크기 pET22b (+)는 5.5 KBP입니다.

그림 2
aECM 단백질의 단백질 발현, 용해 및 정제를위한 그림 2. 도식 흐름. 재조합 단백질 발현에 대한 기본 가이드, 작은 문화에 하나의 식민지의 접종에서 시작하여 1 L로 세포의 배양, 수확 및 재 부유를 확장, 단백질 용해 하였다. 단백질 정제는 인공적인 ECM 단백질에 존재하는 엘라스틴 같은 도메인 LCST 동작을 사용하여 수행 하였다. aECM 단백질은 ITC를 통해 정제된다. 다중 냉온 사이클은 목적 단백질의 높은 순도를 달성하기 위해 수행되었다. 최종적으로, 표적 단백질을 물로 투석하고 동결 건조하여 사용할 때까지 추가 하였다. = 하룻밤 "O / N". "S / N"= 상청액.


역 전환 사이클링. 동결 건조 LN5-aECM로 정제하여 동결 건조 aECM 단백질의 그림 3. 이미지는 울과 같은 모양을 가지고있다.

그림 4
aECM 단백질 (LN-5 aECM)도 4의 SDS-PAGE 겔 전기 영동. 레인 1 및 2는 이전과 단백질 유도 후 배양을 나타낸다. 22 kDa의 근처에 두꺼운 밴드의 존재는 LN-5 aECM이 성공적으로 표현 된 것을 알 수있다. 레인 4는 ITC의 3 사이클 후의 정제 aECM LN-5 단백질을 표시하는 동안 레인 3은 전체 세포 용 해물을 나타낸다.

그림 5
aECM 단백질도 5 (A) SDS-PAGE 젤. (B)의 골에 대한 그의 태그를 6 배에 대한 프로브 웨스턴 블롯-IV 및 LN-5 aECM 단백질. 두 골-IV 및 LN-5 aECM 단백질은 C- 말단 6xHis 태그가 포함되어 있습니다. 정제 된 단백질에 존재하는 6 배 그의 태그를 나타내는 샘플 골-IV aECM에 대한 샘플 LN-5 aECM 24 kDa의 22 kDa의에서 예측 분자량에서 관찰 긍정적 인 화학 발광.

<TD의 행 결합은 = "9">을 함유하는 2 × YT 미디어
미디어 / L 구성 요소 및 지침
SOC 미디어 20g 트립 톤
5g 효모 추출물
0.6 g의 염화나트륨
0.2 G의 KCl
940 ml의 물에 넣고 오토 클레이브,
다음 멸균 (살균 필터)를 추가
10 ml의 1 M의 MgCl 2
10 ml의 1 M 황산
40 ml의 20 % 포도당
16g 트립 톤
10g 효모 추출물
5g의 NaCl
15g 박토 한천 (만 한천 플레이트에 대한 추가)
물에 용해 1 L과 오토 클레이브까지 가기.
55 멋진 한천 플레이트를 준비하려면 항생제를 첨가하기 전에 C를 °.
페트리 접시에 쏟아져에 잘 이전에 섞는다.
한천이 응고 될 때까지 판을 냉각.
파라 필름에서 판을 감싸고 4 거꾸로 저장 ° C.
좋아요 국물 (TB) 12g 트립 톤
24g 효모 추출물
4 ML의 글리세롤
700 ml의 물과 오토 클레이브에 용해.
16.42 g을 K 2 HPO 4(머크)
2.31 G의 KH 2 PO 4 (머크)
보장하기 위해, 300㎖의 물에 용해 별도로 오토 클레이브 염을 완전히 용해시킨다.
냉각 후 매체와 염을 모두 결합합니다.

E를위한 SOC 미디어는 2xYT 미디어 / 한천 좋아요 국물. 미디어 1. 조리법 대장균 문화는 분자 복제 및 단백질 발현에 사용됩니다.

솔루션 / L 구성 요소 및 지침
쿠마 브릴리언트 블루 얼룩 0.25 G 쿠마 blueR250
100 mL의 빙초산
450 mL의 메틸 알콜
450 ml의 물
100 mL의 빙초산
400 mL의 메틸 알콜
500 ml의 물

표 얼룩에 대한 해결책 및 SDS-PAGE 젤 destain 2. 조리법. 염색 및 SDS-PAGE를 사용하여 특성화 탈색 솔루션 쿠마 브릴리언트 블루 R250.

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Discussion

재조합 단백질 공학은 상향식 접근을 사용하여 신규 한 단백질 물질을 생성하는 다용도 기술이다. 단백질 계 물질은 관심있는 용도에 따라, 복수의 기능을 갖도록 설계 맞추어 질 수있다. 인해 복제 및 단백질 발현을 증가시키는 기술의 발전에, 그것을 재현하고 확장 가능한 방식으로 인공 단백질의 다양성을 생성하기 위해 상대적으로 간단한 (그리고 비용 효율)이되었다. 엘라스틴 유사 도메인은 정제 태그로서 역할을 할뿐만 아니라, 기계적 특성을 부여하는 것으로, 인공 단백질의 수에 혼입되어왔다. 엘라스틴 유사 서열을 함유하는 단백질 인공 용이 비싼 정제 칼럼 및 항체에 대한 필요성을 제거 ITC을 사용하여 정제 할 수있다.

이 프로토콜은 aECM 단백질 인코딩 재조합 플라스미드를 구성하는 단계를 설명합니다. 엘라스틴 같은 반복 인코딩 유전자 구입 하였다. 용폴리펩티드처럼 엘라스틴 등 고도로 반복적 단백질 서열, 그것은 순환 방향 결찰 (RDL) 전략 22 사용될 수 있도록 클로닝 전략을 설계 권장한다. RDL을 사용하여 특정 쇄 길이를 가진 폴리펩티드는 반복적으로 합성 될 수 있고, 따라서 관심 유전자 짧은 단량체로 구입할 수있다.

모두 중앙 세포 결합 도메인의 모듈 스와핑을 허용 끝나는 우리의 연구에서, 세포 - 결합 도메인은 측면 효소 NheI 제한 부위를 포함하도록 설계되었다. 이것은 고유 및 기능적 도메인에 존재하는 다른 호스트 또는 벡터의 다중 클로닝 부위 (MCS)의 밖에없는 제한 부위를 선택하는 것이 중요하다. 이것은 의도 된 사이트에 삽입 또는 벡터의 소화를 한정하는 것입니다. 경우에 따라서는 종래의 기능성 도메인에 돌연변이를 삽입하여 숙주 벡터 신규 제한 부위를 도입하는 것이 필요할 수있다.

우리의클로닝 전략은 우리가 용이​​ aECM 단백질 3 변종을 얻기 중앙 세포 결합 도메인을 변경시켰다. 우리는 또한 라이신 잔류를 삽입하면 시작 메티오닌 이상 10 배 단백질 수율을 증가 후 지적했다. 단백질 수율이 크게 증가는 최종 단백질 수율이 60 ㎎ / ℓ로 5 ㎎ / ℓ로 증가 LN-5 aECM 단백질, 대부분의 분명했다.

다양한 E. 대장균 발현 용 호스트는 BL21 (DE3) pLysS를 E. 비교하였고 대장균 균주는 최고의 단백질 수율을했다. 단백질 발현이 이상 4 시간 동안 IPTG로 유도했을 때 단백질의 수율 개선은 최소한이었다. 1 mM의 IPTG보다 큰 농도에서 단백질 발현의 차이는 없었다. 가까이에 OD 0.6에서 유도 된 때, 단백질 발현이 가장 많았다.

ITC를 사용 aECM 단백질의 효과적인 복구를 위해, 원심 분리 장치의 온도가 중요하다. 시험을위한PLE, 정제 단계의 대부분은 aECM 단백질의 용해성을 최대한 보장하기 위해 냉장실 (4 ℃)에서 수행 하였다. 또한 필요할 수있다 (4 ° C)에 사전 진정에 원심 분리기 로터 O / N 전에 감기주기. 마찬가지로, 원심 로터는 단백질 용액의 온도가 T의 t 이상으로 유지되도록하여 따뜻한주기에 앞서 (37 ° C)로 예비 가열 하였다.

요약하면, 절차는 설계 및 인공 ECM 단백질을 코딩하는 클론의 재조합 플라스미드를 설명한다. 특히 ITC를 사용 aECM 단백질의 발현 및 정제를 약술한다. 마지막으로, SDS-PAGE 전기 영동 및 웨스턴 블로 팅을 사용하여 aECM 단백질의 특성을 설명했다.

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Disclosures

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 교육부의 AcRF 계층 1 (RG41)에서 자금을 인정하고 난양 기술 대학에서 부여를 시작하고 싶습니다. 저와 Tjin은 난양 기술 대학, 싱가포르에서 연구 학생 장학금 (RSS)에 의해 지원된다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET22b (+) Novagen 69744 T7 expression vectors with resistance to ampicillin 
BL21(DE3)pLysS  Invitrogen C6060-03 additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 plasmid isolation kit
T4 ligase New England Biolabs M0202S
Ampicillin Affymetrix 11259
Chloramphenicol Affymetrix 23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit Zymo Research D4001
XL10-gold strain Agilent Technologies 200315

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. Elastomeric biomaterials for tissue engineering. Prog Polym Sci. 38, (3-4), 584-671 (2013).
  2. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63, (4-5), 352-366 (2011).
  3. Kushner, A. M., Guan, Z. Modular Design in Natural and Biomimetic Soft Materials. Angewandte Chemie International Edition. 50, (39), 9026-9057 (2011).
  4. Gagner, J. E., Kim, W., Chaikof, E. L. Designing protein-based biomaterials for medical applications. Acta Biomater. 10, (4), 1542-1557 (2014).
  5. Gomes, S., Leonor, I. B., Mano, J. F., Reis, R. L., Kaplan, D. L. Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering. Prog Polym Sci. 37, (1), 1-17 (2012).
  6. Werkmeister, J. A., Ramshaw, J. A. M. Recombinant protein scaffolds for tissue engineering. Biomedical Materials. 7, (1), 012002 (2012).
  7. MacNeil, S. Biomaterials for tissue engineering of skin. Materials Today. 11, (5), 26-35 (2008).
  8. Fong, E., Tirrell, D. A. Collective Cell Migration on Artificial Extracellular Matrix Proteins Containing Full-Length Fibronectin Domains. Advanced Materials. 22, (46), 5271-5275 (2010).
  9. Ratner, B. D., Bryant, S. J. BIOMATERIALS: Where We Have Been and Where We are Going. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, (1), 41-75 (2004).
  10. Cai, L., Heilshorn, S. C. Designing ECM-mimetic materials using protein engineering. Acta Biomater. 10, (4), 1751-1760 (2014).
  11. Annabi, N., et al. Elastomeric recombinant protein-based biomaterials. Biochemical Engineering Journal. 77, (0), 110-118 (2013).
  12. Heilshorn, S. C., DiZio, K. A., Welsh, E. R., Tirrell, D. A. Endothelial cell adhesion to the fibronectin CS5 domain in artificial extracellular matrix proteins. Biomaterials. 24, (23), 4245-4252 (2003).
  13. Simnick, A. J., Lim, D. W., Chow, D., Chilkoti, A. Biomedical and Biotechnological Applications of Elastin-Like Polypeptides. Polymer Reviews. 47, (1), 121-154 (2007).
  14. Tjin, M. S., Chua, A. W. C., Ma, D. R., Lee, S. T., Fong, E. Human Epidermal Keratinocyte Cell Response on Integrin-Specific Artificial Extracellular Matrix Proteins. Macromolecular Bioscience. 14, (8), 1125-1134 (2014).
  15. MacNeil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445, (7130), 874-880 (2007).
  16. Kariya, Y., et al. Differential regulation of cellular adhesion and migration by recombinant laminin-5 forms with partial deletion or mutation within the G3 domain of α3 chain. J Cell Biochem. 88, (3), 506-520 (2003).
  17. Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., Quaranta, V. The LG3 module of laminin-5 harbors a binding site for integrin α3Β1 that promotes cell adhesion, spreading, and migration. J Biol Chem. 276, (35), 33045-33053 (2001).
  18. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Current Protocols in Protein Science. 6.11.1-6.11.16 (2010).
  19. Keeley, F. Ch. 4. Evolution of Extracellular Matrix.Biology of Extracellular Matrix. Springer. Berlin Heidelberg. 73-119 (2013).
  20. Le, D. H. T., et al. Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides. Biomacromolecules. 14, (4), 1028-1034 (2013).
  21. MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583 (2014).
  22. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3, (2), 357-367 (2002).

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