人工細胞外マトリックス(AECM)タンパク質からの設計と構築

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Low, P. S. J., Tjin, M. S., Fong, E. Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (100), e52845, doi:10.3791/52845 (2015).

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Abstract

Protocol

AECMタンパク質のための組み換えプラスミドエンコーディングの1クローニング

  1. 機能的ドメイン( 例えば 、細胞結合ドメインとエラスチン様反復)のアミノ酸配列を設計します。機能的ドメインの末端に隣接するデザインの制限部位は、サブクローン化ソフトウェア命令に従ってフリーソフトウェアを使用して( 例えば 、http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/)を容易にします。ここでは、意図したサイトへの消化を閉じ込める機能ドメインに存在しないユニークな制限部位を選択します。サブクローン化のための宿主ベクター( 例えば 、たpET22b(+))のマルチクローニングサイト(MCS)に表示される制限部位を選択してください。
  2. ソフトウェア命令に応じて自由にウェブサイトを使用してヌクレオチド配列にアミノ酸配列を逆翻訳します。 ( 例えば 、http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html)。確認コドンは、Eのために最適化されています大腸菌ホスト。
  3. 目的の遺伝子はパーチャスすることができますED商業として一本鎖オリゴヌクレオチドは、DNAとアニールを行う(オリゴヌクレオチド<100塩基対(bp)の場合、すなわち、)(ステップ1.4参照)、コストを低減することができます。それ以外の場合は、100塩基対よりも大きい遺伝子について、それらは商業会社を通じて購入することができました。
  4. オリゴヌクレオチドのDNAアニーリング
    1. 所望の遺伝子配列を得るために、DNAオリゴマーをアニール。を1μg/μlの最終濃度まで(濾過2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル) - プロパン-1,3-ジオール、pH8.0の、10mMトリス)DNAオリゴマーバッファにおけるDNAオリゴヌクレオチドを​​溶解します。
    2. 合計40μlの混合物を達成するために、DNAのアニーリングバッファー(10mMトリス、100mMのNaClおよび100nMのMgCl 2)の32μlに各オリゴマーの4μlを添加します。
    3. ホットプレートを用いて水の入ったビーカーを沸騰させると5分、95°Cのための混合物を浸します。ビーカーを外し、徐々に発泡スチロールの箱O / Nに設定全体を冷却します。オリゴマーは、アニールし、消化のために準備ができているされています。
    アニーリングしたオリゴマー( すなわち 、インサートと呼ばれる)と宿主ベクター別々に( すなわちたpET22b(+))を消化するために対応する制限酵素を加えます。 37℃で3〜4時間以下のレシピ(DNAの1〜2μgの、それぞれの制限酵素2μlの、合計50μlの混合物に10倍制限酵素バッファー、水までの5μl)を使用してください。
    注:たpET22b(+)プラスミドベクターは、アンピシリン抗生物質耐性であり、C末端に6×Hisタグが含まれています。 6X-HisタグされたpET22b(+)に存在は、私たちは、ステップ7でウェスタンブロッティングを介して標的タンパク質を同定するためにHisタグ抗体を使用することができます。
  5. 各消化混合物に6×ローディング色素を追加します。 100 Vで1時間紫外線蛍光DNA染色を含むDNAのアガロースゲルはUV光照明で1.2%のDNAのアガロースゲルを視覚化し、1.2%に個別にDNAラダーを含む消化混合物を実行します。
  6. 商業ゲル精製キットを用いて消化DNA産物を抽出するために、ゲルをスライス。 ELUT電子50-100 ng /μLでの最小DNA濃度を達成するために、列の最小ボリュームを使用。
  7. 、ベクトルの(2μL、T4リガーゼ1μlの:消化されたDNAは、以下のレシピを使用して、T4リガーゼを用いてプラスミドベクター( すなわち、エラスチン反復またはDNAアニールにより得られた細胞結合ドメイン)を挿入連結することにより、目的の順次の遺伝子を組み合わせてT4ライゲーションバッファー1.5μlの、Xμlのインサートの、10.5-Xμlの合計15μlの混合物のための水)。室温で2時間ライゲーション混合物をインキュベートします。
    注:挿入するベクターのモル濃度は、ライゲーション効率を最適化するために変化されるべきです。レシピのxと記載インサートの体積は、ステップ1.7から溶出したDNA濃度に依存します。
  8. 雪解けE.氷の上で大腸菌 DH5α化学的コンピテント細胞(または任意のクローニング株)。ウォームする2×YT寒天プレートアンピシリン(25μg/ ml)を含有する( 表1)37℃です。
  9. 使用して細胞を形質転換ヒートショック:
    1. きれいな、予備冷却マイクロ遠心チューブに小分けしたコンピテント細胞を50μl。細胞内へのライゲーション混合物(100 ngの100 pgの間)ピペットを5μl、優しく上下にピペッティング混合します。氷上で20分間、混合物を残します。
    2. 2分間42℃の水浴中で細胞混合物を含むマイクロ遠心管を浸し、2分間氷上に戻しました。細胞への熱損傷を最小にするために、浸漬時間を時間。
    3. マイクロ遠心管にSOC培地( 表1)の500μl加え、1時間37℃で振盪しながらインキュベートします。
    4. 室温に予め温めてきたの2×YT寒天プレート上に細胞/ライゲーション混合物の50〜500μLを広げ、アンピシリン(25μg/ ml)を含有し、37°のCO / N(12〜16時間)でプレート逆さまをインキュベート。
  10. 次の日、きれいなピペットチップを使用して、寒天プレートからDNAのコロニーを選択します。 2YT培地( 5 mlにコロニーを育てます1)(225 rpm)し振とうしながら37°CO / N(12〜16時間)で、アンピシリン(25 / mlの)O / Nを含みます。
  11. 翌日、製造業者のプロトコルに従って選んだ各コロニーのためのDNAプラスミドを抽出するために、プラスミド単離キットを使用しています。水50μlのDNAを溶出します。
  12. (5μlのDNA、各制限酵素の0.2μlを、1μlの10×制限酵素バッファーとトップアップ合計10μlの混合物のための水)、37℃で2時間インキュベート:以下のレシピを使用して、制限酵素で消化試験を行いますそうインサートを含有し、ステップ1.6のように1.2%のDNAのアガロースゲルで泳動したコロニーをスクリーニングするため。
    注:消化すると、それぞれの分子量( 図1)に対応する1つ各ベクトルと挿入するための2つのバンドで成功したライゲーションすべき結果、。
  13. フォワードT7プロモーターを使用して、DNA配列決定のための可能性のコロニーを送ると商業シーケンサにリバースプライマー。

  1. 配列決定の結果から、正常にライゲートされたコロニーを選択し、Eへの形質転換のためのDNAプラスミドを使用大腸菌発現宿主。
  2. 雪解けE.氷の上で大腸菌発現株(BL21(DE3)pLysSを)。一方、RTにアンピシリン(25μg/ ml)およびクロラムフェニコール(34μgの/ ml)を含む暖かい寒天プレート
    注:細菌中に存在するpLysSをプラスミドはBL21(DE3)pLysSをクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む株。 pLysSをプラスミドは、構成AECMタンパク質の漏出性発現を制限するために表現されたT7プレッサー遺伝子が含まれています。クロラムフェニコールは、培養中pLysSをが含まれている細菌細胞を選択することが必要です。
  3. Eを形質転換し得るために、繰り返し手順1.10人工タンパク質を発現させるために準備ができている大腸菌細胞 。パラフィルムで寒天プレートをラップし、4で上下逆さまに保存 6; 1ヶ月までのためのC。

AECMタンパク質の3細菌発現

  1. 図2をピペットチップで形質転換した寒天プレートからコロニーを選択し、試験管にアンピシリンおよびクロラムフェニコール抗生物質の両方を含有する滅菌テリフィックブロス(TB)培地( 表1)の10ミリリットルに接種するために参照してください。 225rpmで振盪しながら37°CO / N(12〜16時間)で、このスターター培養をインキュベートします。
  2. 転送3 L三角フラスコ内の同じ抗生物質を補充した1 L新鮮な滅菌TB培地にスターター培養の10ミリリットル。 2-3時間、225rpmで振とうしながら37℃で培養をインキュベートし、培養物の光学密度を観察(OD 600)読書のための空のキュベットに1mlの培養物をピペットで0.6〜0.8に達しました。 SDS-PAGEの特徴付けのための誘導の前に1mlの培養物を保存します。
    1. 細胞培養物のOD 600を測定するために、キュベット内のTB培地の1バイアルを準備ブランク測定用。これとは別に、新しい空のキュベットに培養フラスコからの1mlの培養物を移します。 600 nmでの吸光度でブランク対照に対して分光光度計を用いて培養物の光学密度を測定します。
    2. 1.5 mlのマイクロチューブに培養サンプルの1ミリリットルを転送することによって(その後のSDS-PAGE分析のために)サンプルを保存して2分間12,000×gで遠心分離し、上清をデカント。
  3. 1mMの最終濃度までイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いて培養物を誘導し、さらに4時間、225rpmで振盪しながら37℃でインキュベートします。 SDS-PAGEの特徴付けのために4時間で、誘導の最後に1mlの培養物を保存します。
  4. 4℃で30分間12,000×gで1 Lの遠心ボトル及び遠心分離機に培養を転送することによって細胞を回収。上清を捨て、0.5グラム/ mlでTEN緩衝液(1Mトリス、0.01MのEDTA、0.1 MのNaCl、pH値= 8.0)で細胞ペレットを再懸濁の重量を量ります。

細菌培養の4溶解

  1. -80°CO / Nで再懸濁細胞培養をフリーズします。細胞を溶解し、室温でまたは氷上で水浴中で凍結した細胞培養物を解凍します。解凍しながら10 / mlのデオキシリボヌクレアーゼI(DNアーゼI)、10 / mlのリボヌクレアーゼA(RNアーゼI)、および50μg/ mlのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を追加し、ゆっくり攪拌しながら溶液を均質化します。
  2. すべての再懸濁した細胞を解凍した後、水12中のタンパク質の溶解度を増加させるためにpHを9.0に溶液を調整します。 6 N NaOHを均質な一貫性を達成するために氷上で撹拌しながら滴下して加えます。直径2mmの平坦な先端、5秒のパルスを用いて、氷上で20分間、超音波破砕によって溶解します。
  3. 4℃で30分間、12,000×gで細胞溶液を遠心。後の精製のために4℃で清潔、空き瓶や店舗に上清を移します。
  4. 一方、-80℃で10バッファおよび再凍結で再び細胞ペレットを再懸濁します。へ完全な細胞溶解、3回まで繰り返し凍結/解凍し、超音波処理プロセス。 SDS-PAGEの特徴付けのための20μlの細胞溶解物を保存します。

逆転移サイクリングを使用AECMタンパク質の5精製

  1. ステップ4.3からの細胞溶解物を照合し、エラスチンベース21タンパク質の精製に使用されるものと同様のITCを用いAECMタンパク質を精製するために進みます。サイクルは、それぞれ、4°C(「コールド」と呼ばれる)、37℃(「温かい」と呼ばれる)のサイクルであり、異なる温度で行われます。
  2. 4℃で2時間、40,000×gで50mlの遠心分離ボトル、遠心に細胞溶解液を分割します。細胞ペレットの外観は暗褐色であることと鼻水になります。
  3. ペレットからの明確な分離を得るために、ピペットで上清を取り除きます。きれいな遠心ボトルに上清を収集し、(3 Mの最大値に)1 Mの最終濃度までのNaClを追加します。暖かいです225rpmで振盪しながら2時間37℃を解決。
    注:塩化ナトリウムの添加はAECM引き起こす凝集のエラスチン成分の推移をトリガーします。上清を濁っになります。タンパク質濃度が十分に高い場合、白色泡状タンパク質は、遠心分離ボトルの側面に見られます。
  4. 37℃で2時間、40,000×gでステップ5.3から上清を遠心します。上清を除去。金属へらを使用して、ペレットを粉砕し、磁気攪拌棒と板を用いて、4℃で激しく撹拌しながらのO / Nで氷のように冷たいオートクレーブした蒸留水(50 mg / mlの)でペレットを再懸濁ビット。ペレットが完全に溶解する必要があります。
  5. 繰り返しは、タンパク質の高い純度を得るために、他の3倍から5倍のために5.2〜5.4を繰り返します。
  6. 精製の最終サイクルの後、4℃の蒸留水に対して、それを透析することによってタンパク質溶液を脱塩。水のすべての4の変化で2〜3日間水に対してタンパク質溶液を透析します時間またはO / Nのための8時間。 SDS-PAGEのために精製したタンパク質の20μLを保存し、さらに使用するまで-80℃で精製したタンパク質や店舗の残りの部分を凍結乾燥。

SDS-PAGE電気泳動を用いてAECMタンパク質の6キャラクタリゼーション

  1. (分子量が大きい場合には、より良好な分離のために、8%SDS-PAGEゲルを使用)を12%SDS-PAGEゲルを調製します。 AECMタンパク質の分子量に対応するタンパク質ラダーの中間に到達するまで、各サンプルに2×SDSローディング緩衝液を加え、100℃で10分間、試料を加熱し、100 Vまたはで1時間、ゲル上のサンプルを実行しますゲル。
  2. セットアップSDS-PAGEからゲルを取り出し、ペトリ皿に1時間ゲルを沈めるためのボリュームとクマシーブリリアントブルー染色した( 表2)を追加します。ロッカーで5分間脱色液( 表2)でゲルをすすぎます。脱色液を変更し、Tの背景まで揺動してゲルを脱色し続けます彼ゲルは透明になります。タンパク質バンドは明らかに見えるはずです。
  3. 標的タンパク質の分子量を決定するために、タンパク質ラダーに対する標的タンパク質の位置を比較します。
  4. さらに、標的タンパク質の存在を確認するには、ステップ7と同様にウェスタンブロッティングを行います。

ウエスタンブロッティングを使用してAECMタンパク質の7キャラクタリゼーション

  1. 無染色のセクション6のように、12%SDS-PAGEゲル上でサンプルを実行します。
  2. SDS-PAGEゲルよりも若干大きいサイズにニトロセルロース膜をカットします。同じ大きさにろ紙の4枚をカット。
  3. 濾紙の別の部分に続くウエスタントランスファーと濾紙の湿潤一体緩衝液(20%(v / v)のメタノール、25 mMトリス、190 mMのグリシン、pHは8.3)、濾紙の上にSDS-PAGEゲルを配置し、 、その後、ニトロセルロース膜、フィルターペーパーの最終的な他の二枚。全体のセットアップが十分な西部の転送バッファに沈めていることを確認します。
    注:タンパク質が接触した際に膜に結合することができるようにゲルと膜がこの時点で接触してはなりません。
  4. ニトロセルロース膜に続く西部の半乾燥転写部へ2の濾紙を配置することによりニトロセルロース膜にタンパク質を移し、慎重に膜内と上のSDS-PAGEゲルを置き、最後の最後の2湿った濾紙を配置SDS-PAGEゲル。 45ミリアンペア、30分で西部の転送を実行します。電圧が30 [V]よりも高い場合に、バッファを追加
    注:好ましくは、1つの試みで膜上のSDS-PAGEゲルを配置し、タンパク質が接触した際に膜に結合することができるように膜に不必要にゲルをシフトすることは避けてください。
  5. 取得し、RTで2時間(ろ紙でろ過PBSのpHは7.4、5%無脂肪乳)をブロッキング溶液でニトロセルロース膜をブロックします。ブロッキング緩衝液を処分し、すすぐためにPBSを追加します。
    注:不要なproteを有する膜を汚染しないために、新しい手袋に変更イン。
  6. 揺らしながら室温で1時間:1,000 1でPBS中に希釈で一次抗His抗体をインキュベートします。 1ミリリットル全混合物のために999μlのPBSに:抗体の1μlを添加1,000(1 mg / mlのストック濃度:)希釈率1で、例えば、膜全体を沈めることができ、ボリュームに混合物を準備します。
  7. PBST 5mlの(0.1%のTween20を含むPBS)で膜を洗浄します。
  8. 揺らしながら室温で1時間5,000:1でPBSで希釈ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)に結合した二次抗体とインキュベートします。 5ミリリットル全混合物のために4999μlのPBSに:抗体の1μlを添加、5,000(1 mg / mlのストック濃度:)希釈率1で、例えば、膜全体を沈めることができ、ボリュームに混合物を準備します。
  9. PBST 5mlでメンブレンを洗浄し、二回繰り返します。
  10. 膜をカバーし、使用する基板のための手順に従って、インキュベートするボリュームを有する膜に化学発光基質を適用します。
    注:タンパク質の検出に基板の感度が異なる場合があり、我々は、信号を増加させない抗体濃度を増加させる場合には、非常に低い信号に対して最大感度を有する基板を推奨します。
  11. CCDカメラベースのイメージャーを用いて化学発光信号をキャプチャします。信号が弱く、非特異的である場合は、プライマリおよび二次抗体の希釈率を調整します。バックグラウンド信号が高い場合、ブロッキング溶液中でより長くインキュベートします。

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Representative Results

エラスチン様反復を含む融合タンパク質を設計するには、全体のエラスチン含有量は、融合タンパク質18の十分大きな部分を維持することが重要です。これは、融合タンパク質構築物は、精製のためにITCを使用するために、そのエラスチン様特性を保持することを保証することです。このセクションで説明AECMタンパク質の設計および配列は、特にTjin によって研究から採取した。14。この研究では、三AECMタンパク質が正常たpET22b(+)発現ベクターにクローニングしました。シーケンシャル連結は、最初の細胞結合ドメインを挿入することにより、その後、エラスチン反復はpETベクターに挿入結紮から始まりました。最後に、エラスチン反復の最後のセットは、同じ方法を用いて、細胞結合ドメインの末端に挿入しました。組換え遺伝子が正常に構築されているかどうかを確認するには、それぞれの組換えプラスミドは、試験37℃で3時間、XhoIおよびSalIで消化し、C. 図1は、テスト消化後にDNAインサートとベクターのバンドを示しています。 AECMタンパク質のそれぞれについて、インサートのサイズは、クローニングが実際に成功したことを確認し、遺伝子の大きさに対応しました。 DNA配列決定を介して更なる検証は、テスト消化の結果を確認しました。

我々は、各AECMのタンパク質に存在ITC与えられた十分なエラスチンのコンテンツを通じてAECMのタンパク質を精製することができました。 図2は 、全体的な精製プロセスの概略図を示します。 O / N培養物は、典型的な出発0.01 OD 600で1 Lの振盪フラスコに接種しました。文化は3-4時間後に0.6〜0.8の600を ODまで成長しました。タンパク質発現は、IPTGを1mMのを使用して誘導しました。 4時間後、1.5の典型的なODが達成されます。細菌培養物を回収し、遠心分離にかけました。上清を捨て、細胞ペレットを秤量しました。細胞ペレットの平均重量は、約3g / Lでした文化。ペレットをTEN緩衝液に再懸濁し、CO / N -80℃で凍結しました。

凍結/融解サイクルの一連の細胞を溶解するために使用しました。凍結融解工程は、最終的に凍結プロセス中に形成される氷の結晶に起因する破壊、細胞が膨張し、収縮させます。その後、DNアーゼIおよびRNase Iは、すべてのDNAおよびRNAを消化するために、細胞溶解物に添加しました。 PMSFが、タンパク質分解を最小限にするために、細胞溶解物に添加されたプロテアーゼ阻害剤です。氷上に保持しながら、さらに完全な細胞溶解を確実にするために、溶解物をさらに超音波処理しました。

細胞溶解物は、その後、ITC精製の3サイクルに供しました。 3サイクルの終了時に、暖かいサイクルの終了時にペレットを一貫で蜂蜜に似ていたし、わずかに黄色に着色していました。ペレットを水との接触時に透明に、かつ容易に振盪しながら、予め冷却したオートクレーブを水に溶解しました。精製されたタンパク質は、任意の残留を除去するために透析しALT。最終的な加温サイクルの終了時に得られたタンパク質溶液を透析チューブの短い長さに移した(12kDaの分子量カットオフ)。透析の最後に、タンパク質溶液を清潔な50mLの遠心分離管に移し、-20℃で凍結しました。次の日に、凍結したタンパク質溶液を、水分を除去するために凍結乾燥した。 図3は、一般的なウールのような外観を有し、透析タンパク質の画像を示します。

タンパク質の発現を実際に誘導されたか否かを決定するために、誘導の前後に採取した試料を、SDS-PAGE電気泳動により分析しました。ここでは、12%SDS-PAGEゲルは、20〜150キロダルトンの分子量を有するタンパク質を分離するのに十分でした。分子量が大きい場合には、 すなわち 、> 100kDaの、8%SDS-PAGEゲルは、より良好なタンパク質分離のために使用することができる。 図4は、誘導された、SAでの予測分子量に強いタンパク質バンドを示しmple(レーン2)。精製を開始する前に典型的には、SDS-PAGE分析は、タンパク質の発現後すぐに行きました。続いて、精製工程を経て採取されたサンプルは、標的タンパク質の効率的な浄化を保証するために、SDS-PAGE電気泳動を用いて分析することができる。 図4はまた、22キロダルトン(レーン4の分子量を有する精製されたタンパク質試料を含むSDS-PAGEゲルを示します)、LN-5 AECM 14に対応します。 AECMタンパク質の推定純度は約90%〜95%でした。この値は、標的タンパク質とSDSゲル( 図4、レーン4)上に存在する他のタンパク質バンドのバンド強度の比を比較することによって誘導しました。精製されたタンパク質が実際AECMタンパク質であれば最終的に決定するために、ウェスタンブロッティングを行いました。続いて、MALDI-TOFも正確に精製された材料14の不純物含有量を決定した。 図5番目のタンパク質純度を示し抗を使用して、タグ付けされた電子3 AECMタンパク質図5AのSDS-PAGEゲルとし、標的タンパク質COL-IV AECMとLN-5 AECMの存在を示す、 図5(b)のウェスタンブロッティングのためにニトロセルロース膜の画像と比較するために、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)と結合したHisタグ抗体を-6x。 AECMタンパク質の最終的な収量は120 mg / Lで60 mg / Lでの範囲でした。

図1
AECMタンパク質の図1. DNAのアガロースゲル電気泳動。最終AECM蛋白質DNAの確認は、制限を介して構築消化が1.2%のDNAのアガロースゲル上で実行した酵素。 AECMのタンパク質の各々をコードする組換えプラスミドは、二重、37℃ 3時間、XhoIおよびSalIで消化し ​​、インサートのサイズが各AECMタンパク質遺伝子の大きさに対応して(FN910:1.8kbpの、COL-IV:696塩基対、LN-5:699塩基対)と使用したベクターをpET22b(+)の大きさが5.5 kbpのです。

図2
AECMタンパク質のタンパク質発現、溶解および精製の ​​ために図2の回路図の流れ。組換えタンパク質発現のための基本的なガイド、小さな文化に単一コロニーを接種から開始して1 Lに細胞の培養、収穫と再懸濁をスケールアップ、タンパク質溶解が続きます。タンパク質の精製は、人工的なECMタンパク質中に存在するエラスチン様ドメインのLCST挙動を用いて行きました。 AECMタンパク質は、ITCにより精製されます。複数の寒暖のサイクルは、標的タンパク質の高純度を達成するために行われました。最後に、標的タンパク質を水で透析し、さらに使用するまで凍結乾燥しました。 「O / N」=一晩。 「S / N」=上清。


逆転移サイクリングにより精製し、凍結乾燥AECMタンパク質の図3.イメージ。凍結乾燥LN5-AECMは、ウールのような外観を持っています。

図4
AECMタンパク質(LN-5 AECM)の図4 SDS-PAGEゲル電気泳動。レーン1及び2に示す培養タンパク質誘導前後。 22 kDaの近くに太いバンドの存在は、LN-5 AECMが正常に発現していることを示しています。レーン4は、ITCの3サイクル後に精製されたLN-5 AECMタンパク質を示しているレーン3は、完全な細胞溶解物を示しています。

図5
AECMタンパク質の図5(A)SDS-PAGEゲル。コルのためにHisタグを6倍速についてプローブ(B)ウェスタンブロット-IVとLN-5 AECMタンパク質。 COL-IVおよびLN-5 AECMタンパク質の両方は、C末端の​​6xHisタグが含まれています。精製されたタンパク質中に存在する6×Hisタグを表すサンプルCOL-IV AECMための試料LN-5 AECMおよび24 kDaのために22キロダルトンで予測分子量で観測された正の化学発光。

<TDのROWSPAN = "9">の2×YT培地
メディア/ L コンポーネントと指示
SOC培地 20gのトリプトン
5gの酵母エキス
0.6グラムのNaCl
0.2グラムのKCl
940ミリリットルの水に添加し、オートクレーブ、
その後、滅菌(フィルター滅菌)を追加
10ミリリットル1 MのMgCl 2
10ミリリットルの1M 硫酸マグネシウム
40ミリリットルの20%グルコース
16グラムトリプトン
10gの酵母エキス
5グラムのNaCl
15グラムのバクト寒天(のみ寒天プレートのための追加)
水に溶解し、1 L、オートクレーブまでトップ。
55クール寒天プレートを調製するために、 抗生物質の添加前にCを°。
前ペトリ皿に注ぐまでよく混ぜます。
寒天が固化するまで、プレートを冷却します。
パラフィルムでプレートをラップし、4で上下逆さまに保存 °C。
テリフィックブロス(TB) 12グラムトリプトン
24グラムの酵母エキス
4ミリリットルグリセロール
700ミリリットルの水およびオートクレーブに溶解します。
16.42グラムのK 2 HPO 4(メルク)
2.31グラムのKH 2 PO 4(メルク)
300ミリリットルの水に溶解し、別々にオートクレーブ、塩が完全に溶解されることを保証します。
冷却後の媒体と塩の両方を兼ね備えています。

表SOCメディア、の2×YT培地/寒天およびテリフィックブロス1.レシピ。E.のためのメディア大腸菌の培養は、分子クローニングおよびタンパク質発現に使用されます。

ソリューション/ L コンポーネントと指示
クマシーブリリアントブルー染色 0.25グラムクマシーblueR250
100ミリリットル氷酢酸
450ミリリットルのメチルアルコール
450ミリリットルの水
100ミリリットル氷酢酸
400ミリリットルのメチルアルコール
500ミリリットルの水

表染色するソリューションと脱色SDS-PAGEゲル2.レシピ 。染色し、SDS-PAGEを用いて特徴付けのための脱色液用のクマシーブリリアントブルーR250。

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Discussion

組換えタンパク質工学は、ボトムアップアプローチを用いた新規タンパク質材料を作成するための汎用的な技術です。タンパク質ベースの材料は、目的の用途に応じて調整、複数の機能を有するように設計することができます。によるクローニングおよびタンパク質発現技術の増加発展には、再現性があり、スケーラブルな方法で人工タンパク質の様々なを作成するために、比較的簡単な(かつ費用対効果の高い)となっています。エラスチン様ドメインが精製タグとして機能するだけでなく、機械的特性を付与するために、人工タンパク質の数に組み込まれています。エラスチン様配列を含む人工タンパク質が容易に高価な精製カラムおよび抗体の必要性を排除するITCを用いて精製することができます。

このプロトコルは、AECMタンパク質をコードする組換えプラスミドを構築する手順について説明します。エラスチン様反復をコードする遺伝子は、購入しました。のためにポリペプチドのようなエラスチンのような反復性の高いペプチド配列は、再帰的な方向性ライゲーション(RDL)戦略は22を使用することができるようなクローニング戦略を設計することをお勧めします。 RDLを使用することにより、特定の鎖長を有する反復的なポリペプチドを合成することができ、したがって、目的の遺伝子は、短いモノマーとして購入することができます。

我々の研究では、細胞結合ドメインが結合ドメイン、中央セルのモジュラー交換を可能にするために、両端にフランキングNheI制限部位を含むように設計しました。それはユニークであり、機能的ドメイン中に存在するかまたは他の場所宿主ベクターの多重クローニング部位(MCS)の外側でない制限部位を選択することが重要です。これは意図したサイトへの挿入またはベクターの消化を閉じ込めることです。場合によっては、前の機能性ドメインの挿入変異誘発を用いて宿主ベクターに新しい制限部位を導入する必要があるかもしれません。

私たちのクローニング戦略は、私たちは容易にAECMタンパク質の3つの変形を得るために、中央細胞結合ドメインを変更することができました。また、10倍以上により開始メチオニン増加したタンパク質収量後のリジン残基を挿入することを指摘しました。タンパク質収量におけるこの劇的な増加は、最終的なタンパク質収量は60 mg / Lで、5 mg / Lでから増加LN-5 AECMタンパク質、最も明らかでした。

様々なE.大腸菌ホストを比較した発現、およびBL21(DE3)pLysSをE.大腸菌株は最高タンパク質収量を与えました。タンパク質の発現は4時間よりも長いために、IPTGで誘導したとき、タンパク質収量の向上が最小でした。 1mMのIPTGより高い濃度でタンパク質の発現に有意差はなかったです。近い0.6のODで誘導しかし、タンパク質の発現が最も高かったです。

ITCを使用してAECMタンパク質の効果的な回復のためには、遠心分離装置の温度に注意することが重要です。試験を受験しますPLE、精製工程のほとんどがAECMタンパク質の最大の溶解性を確保するために、低温室(4℃)で行いました。また、(4°C)の前に冷サイクル遠心ロータO / Nをチルを事前に必要であり得ます。同様に、遠心ロータは、タンパク質溶液の温度は、そのT tの上に維持されたことを確実にするために前加温サイクルの(37℃)に予備加熱しました。

要約すると、人工的なECMタンパク質をコードする組換えプラスミドを設計し、クローニングする手順が記載されています。具体的には、ITCを用いAECMタンパク質の発現及び精製は、概説されています。最後に、SDS-PAGE電気泳動およびウエスタンブロッティングを用いAECMタンパク質の特徴付けについて説明しました。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。

Acknowledgments

著者らは、文部省のACRFティア1(RG41)からの資金を確認し、南洋理工大学から助成金を起動したいと思います。低く、Tjinは南洋工科大学、シンガポールから研究生奨学金(RSS)によって賄われています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET22b (+) Novagen 69744 T7 expression vectors with resistance to ampicillin 
BL21(DE3)pLysS  Invitrogen C6060-03 additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 plasmid isolation kit
T4 ligase New England Biolabs M0202S
Ampicillin Affymetrix 11259
Chloramphenicol Affymetrix 23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit Zymo Research D4001
XL10-gold strain Agilent Technologies 200315

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