قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (101), e52867, doi:10.3791/52867 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

قوة الذرية المجهر (AFM) يولد صورة لسطح عن طريق المسح الضوئي عبر منطقة من العينة باستخدام ناتئ مع طرف حاد جدا 1. حركة ناتئ المسابير طوبولوجيا سطح العينة. وقد تم تطبيق AFM على نطاق واسع لجزيئات البيولوجية - بما في ذلك البروتينات والحمض النووي، والأغشية، نظرا لتنوعها في تحليل عينات الثابتة في الهواء أو دولة شبه الأم في السائل 2-5.

وبصرف النظر عن قدرتها التصوير عالية الدقة في نطاق نانومتر، يعمل ناتئ AFM بمثابة ربيع للتحقيق القوات التفاعل (التصاق والتنافر) والخواص الميكانيكية للعينة 5،6. هذا هو المعروف باسم قوة التحليل الطيفي. في هذا الوضع، وتحقيق نهج أول العينة ويمارس قوة على ذلك، ومن ثم تراجع حتى أنه يفقد الاتصال مع العينة (الشكل 1A). تظهر منحنيات ولدت القوة كدالة للمسافة ناتئ لكل من التطبيقصرصور وتراجع. العديد من الخصائص بما في ذلك معامل المرونة لقياس صلابة من المواد، وقوات التصاق يمكن أن تستمد.

طبقات ثنائية الدهون المعتمدة هي الأغشية البيولوجية نموذج الكذب على رأس دعم قوي - عادة الميكا، والزجاج البورسليكات، السيليكا تنصهر فيها، أو المؤكسد السيليكون 7. انهم مستعدون باستخدام تقنيات مختلفة مثل ترسب حويصلة، طريقة انجميور-بلودجيت وتدور طلاء 8،9. وقد استخدم التصوير AFM لمتابعة تشكيل هذه طبقات ثنائية بدعم 10، وتحقيق مختلف الهياكل التي شكلتها أغشية تركيبات مختلفة 11-15.

أداء قوة التحليل الطيفي على النتائج طبقات ثنائية المعتمدة في قمة في منحنى النهج. هذه الذروة تشير إلى القوة اللازمة لاختراق طبقة ثنائية، ويسمى القوة الخارقة. كما يمكن قياس سمك طبقة ثنائية باستخدام منحنى القوة 6. قوة اختراق نموذجية من طبقات ثنائيةتتراوح ما بين 1-50 ن ن 6. هذه الخصائص تعتمد على التعبئة الدهون (المرحلة سائل أو هلام) وهيكل (أسيل طول السلسلة ودرجة التشبع) وتعديلها من قبل غشاء نشط وكلاء 16. وقد شرحت النظرية وراء القطيعة 17 والمعلمات تجريبية أخرى مثل النعومة ناتئ، دائرة نصف قطرها طرف وسرعة نهج تؤثر أيضا على قوة اختراق 15،16،18. وقد استخدمت القوة الطيفي لتحليل خصائص مراحل مختلفة الدهون 11،19، والتغيرات التي تعتمد على تكوين 12،20، فضلا عن آثار الجزيئات الحيوية الأخرى، مثل الببتيدات، على استقرار الغشاء 21.

التوجه شقة من طبقات ثنائية معتمد من المفيد للجمع بين AFM مع وسائل أخرى مثل مأكل سطح الرنين 22 ومضان المجهر 11،19 لتوصيف هيكل وخصائص الأغشية بشكل أفضل.

هذا بروتو فيديو تفصيليوالمقصود العقيد لإعداد طبقات ثنائية الدهون تدعم استغلال ترسب الحويصلة وتحليلها مع AFM وقوة التحليل الطيفي. في حين الحويصلات من مختلف الأحجام يمكن استخدامها لإعداد طبقات ثنائية، ويركز هذا البروتوكول على الحويصلات unilamellar الصغيرة والكبيرة. وتميزت بدعم طبقات ثنائية تلك المرحلة تفصل في أمر السائل (L س) والسائلة المختلين (L د) مراحل 11،15. ويتكون الغشاء من دى oleoyl-فسفاتيديل (DOPC)، سفينغوميالين (SM)، والكولسترول (شول) في 2: 2: 1 النسبة. هذه نماذج تكوين الطوافات الدهنية، والتي من المقترح أن تتصرف كما منابر هامة للاتجار البروتين والفرز، مما يشير الى الخلايا والعمليات الخلوية الأخرى 23،24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المعتمدة الدهن طبقات ثنائية (SLB) 11،12،21

  1. إعداد خليط الدهن وعديد الصفاحات الحويصلة معلقات
    1. إعداد المخازن التالية مسبقا.
      1. إعداد العازلة PBS بتركيزات 2.7 ملي بوكل، 1.5 ملي KH 2 PO 8 ملي نا 2 هبو و 137 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.2.
      2. إعداد SLB (بدعم طبقة ثنائية الدهن) عازلة في تركيزات 150 ملي كلوريد الصوديوم، و 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4.
      3. تحضير محلول 1 M CaCl 2.
    2. حل الدهون التالية في الكلوروفورم في التركيز المطلوب: على سبيل المثال، دى oleoyl-فسفاتيديل (DOPC) في 25 ملغ / مل، سفينغوميالين (SM) في 25 ملغ / مل والكولسترول (شول) في 10 ملغ / مل.
    3. خذ 18.38 ميكرولتر من DOPC، 17.10 ميكرولتر من SM و11،30 ميكرولتر من تشول لجعل حل مع 1 ملغ من الدهون الكلية في 2: 2: 1 DOPC: نسبة المولي تشول: SM. تختلف أحجام وفقا لذلك على أساس بغية دراسته واقرارهntrations من نسبة الدهون في المعدة و1.1.2. ومع ذلك، والحفاظ على نسبة المولي في 2: 2: 1 DOPC: SM: تشول، وتغيير نسبة المولي وتغيير خصائص المرحلة من غشاء 25.
    4. مزيج الحل تماما من قبل vortexing. إضافة صبغة الفلورسنت شحمي في 0.05 مول٪ إذا كان أحد يرغب في رؤية طبقة ثنائية بواسطة المجهر مضان.
      ملاحظة: عائلة dialkylcarbocyanines سلسلة طويلة، كما فعلت، الجاذبة وديو تمتد مجموعة واسعة من الأطوال الموجية، ويمكن استخدامها بشكل مثالي لتسمية الأغشية الدهنية. بدلا من ذلك، والدهون fluorescently المسمى، مثل رودامين-فسفاتيديل إيثانولامين أو BODIPY الكولسترول يمكن استخدامها. في أي حال، يجب أن يكون الأمثل للتركيز الصبغة وفقا لإعداد المجهر، مع الأخذ في الاعتبار أن تركيزات عالية من fluorophore بد أن الدهون يمكن تغيير سلوك الدهون 19.
    5. تجفيف قبالة الكلوروفورم باستخدام N 2 الغاز (أو أي غاز خامل المتاحة مثل هارون وقال).
    6. مزيد تي الجافانه خليط الدهن تحت فراغ لا يقل عن 1 ساعة.
      ملاحظة: إذا تخزين هذا الخليط الدهون، تطهير الهواء مع غاز خامل (N AR أو و) وتخزينها في -20 ° C. قسامة الدهون في والكلوروفورم الزائدة في قوارير صغيرة بنية اللون. تجفيفها بطريقة مماثلة لخليط الدهن، محل الهواء مع غاز خامل (N AR أو و) وتخزينها في -20 ° C.
    7. حل الدهون المجففة في المخزن برنامج تلفزيوني إلى تركيز من 10 ملغ / مل.
    8. دوامة الخليط بقوة لمدة 20 ثانية إلى 1 دقيقة للحصول على تعليق غائم، التي تحتوي على حويصلات عديد الصفاحات. تأكد من أن ليست هناك أفلام الدهون العالقة على جانبي القارورة.
    9. توزيع هذا التعليق في 10 مكل (1 ملغ من الدهون يجعل 10 قسامات).
    10. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  2. إعداد Unilamellar الحويصلات
    ملاحظة: أحجام مختلفة من الحويصلات unilamellar يمكن إعداد باستخدام طريقة صوتنة أو طريقة قذف. يستخدم صوتنة الصورةاوند الطاقة للتحريض على الخليط وفصل طبقات تعليق عديد الصفاحات. ويدل على ذلك توضيح لتعليق ضبابي. القوات قذف الحويصلات عديد الصفاحات لتمرير من خلال مرشح غشاء مع حجم المسام واضح.
    1. الطريقة صوتنة
      1. أخذ 10 ميكرولتر من تعليق الدهون عديد الصفاحات وإضافة 150 ميكرولتر من العازلة SLB.
      2. نقل الخليط الصغيرة (2 مل) قوارير زجاجية توج وختم مع parafilm.
      3. يصوتن الخليط في درجة حرارة الغرفة في sonicator الحمام لمدة 10 دقيقة أو حتى يصبح من الواضح أن تسفر الحويصلات unilamellar الصغيرة (سيارات الدفع الرباعي، أقل من 50 نانومتر في القطر).
    2. قذف الطريقة
      1. أخذ 10 ميكرولتر من تعليق الدهون عديد الصفاحات وإضافة 150 ميكرولتر من العازلة SLB.
      2. نقل تعليق في أنبوب المبردة.
      3. تجميد تعليق الدهون التي غمرت أنبوب المبردة لبضع ثوان في النيتروجين السائل.
      4. ذوبان الجليدالدهون التعليق من غمر أنبوب المبردة في حمام مائي عند درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية لمدة بضع دقائق. كرر الخطوات تجميد أذاب 10 مرات على الأقل.
      5. من أجل قذف تعليق الدهون، واستخدام غشاء البولي مع 200 نانومتر حجم المسام (أحجام المسام الأخرى المتاحة مثل، 100 نانومتر أو 400 نانومتر) وقذف التجاري الجهاز 26.
        ملاحظة: في الوقت الراهن، هناك نوعان من الأجهزة الطارد متاحة تجاريا: الطارد يدوي متوفر للكميات صغيرة (200 ميكرولتر لبضع مل). في هذه الحالة، هو مقذوف العينة من خلال الغشاء عن طريق دفع يدويا تعليق ذهابا وإيابا بين اثنين من الحقن. اعتمادا على الشركة المصنعة، سيحتاج قسامات الدهون لتكون جنبا إلى جنب للوصول إلى الحد الأدنى من حجم المجموعة لأعلى. لكميات أكبر (يصل إلى 50 مل) وتستخدم أجهزة أكثر تطورا في الذي أجبر على تعليق من خلال الغشاء البولي باستخدام الغاز المضغوط. انشاء وقذف الظروف يمكن أن تتغير وفقا لوزارة الدفاعايل. الرجوع إلى تعليمات من الشركة المصنعة قبل الاستخدام. يشير هذا البروتوكول إلى الطارد اليدوي لأحجام صغيرة.
      6. تتوازن الطارد في الماء عن طريق تمرير الماء من خلال الطارد. تزج الغشاء في الماء.
      7. وضع الغشاء بين المكابس اثنين وتجميع الجهاز وتتوازن في المخزن، عن طريق تمرير المخزن المؤقت من خلال الطارد، من حقنة واحدة إلى أخرى. هذه الخطوة يسمح يختبر وبالإضافة إلى ذلك التسرب من النظام. إذا كان تسرب، تفكيك وإعادة تجميع ذلك تغيير مرة أخرى الغشاء.
      8. خذ تعليق الدهون باستخدام حقنة واحدة من الطارد ('الجانب القذر').
      9. نعلق حقنة تحتوي على تعليق الدهون في غرفة واحدة وحقنة فارغة على غرفة المتعارضة.
      10. دفع حقنة واحدة على نهاية. تمرير حل من خلال الغشاء وإلى حقنة المعارضة. هذا هو تمرير 1 الحادي والعشرين.
      11. تمريرها عبر الغشاء ليصبح المجموع 31 مرات هذهأن الحل ينتهي على حقنة المعارضة ('الجانب نظيفة').
        ملاحظة: التحقق من الغشاء بعد البثق. إذا تم كسرها، ثم كانت عملية قذف لم تكن ناجحة وتحتاج إلى أن يتكرر.
      12. إفراغ الحقنة في أنبوب صغير. الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs) مستقرة لمدة 1-2 أيام إذا كان يحتفظ بها في 4 درجات مئوية.
  3. إعداد ميكا وCoverslips
    1. غسل coverslips أولا في الماء ثم في الإيثانول. الهواء الجاف.
    2. أخذ أقراص الميكا وتقشر الطبقة الخارجية باستخدام شريط لاصق.
    3. إرفاق القرص الميكا على ساترة. المواد اللاصقة البصرية الشفافة هي الأمثل بحيث يمكن للمرء أن تحقق من طبقات ثنائية مع المجهر مضان.
    4. إرفاق اسطوانات البلاستيك (2.5 سم القطر الخارجي، 2 سم القطر الداخلي، و 0.5 سم ارتفاع) باستخدام البصرية الغراء / الشحوم. تأكد من أن كل شيء مختومة وأن هناك أي تسرب. استخدام الشحوم عند الرغبة في إعادة استخدام اسطوانات لأنها يمكن أن تكون منفصلة بسهولة من عشرالبريد ساترة وغسلها. أبعاد اسطوانات البلاستيكية تعتمد على حجم حامل ناتئ AFM ولابد من تعديل وفقا لذلك.
  4. ترسب Unilamellar الحويصلات على دعم قوي
    1. الماصة الحل الحويصلية كله مباشرة على الميكا. إضافة المزيد من عازلة SLB للوصول إلى حجم 300 ميكرولتر.
    2. إضافة 0.9 ميكرولتر من 1 M محلول كلوريد الكالسيوم للوصول إلى تركيز النهائي من 3 ملي كا 2+.
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل. تغطية دائما طبقات ثنائية مع العازلة. سوف نتصل مع فقاعات الهواء، والهواء تدميره. خلال فترة الحضانة، وإضافة المزيد من العازلة إذا لزم الأمر، خصوصا إذا يحتضنها عند ارتفاع درجات الحرارة.
      ملاحظة: تختلف درجات حرارة الحضانة وفقا لخليط من الدهون والمراحل المطلوبة. هناك حاجة إلى فترة حضانة من 10 دقيقة على الأقل لتشكيل طبقات ثنائية المعتمدة، ولكنها قد تكون أطول، اعتمادا على درجة الحرارة والتكوين.
    4. غسلطبقة ثنائية مع الساخن (65 درجة مئوية) العازلة SLB 15-20 مرات لإزالة الكالسيوم والحويصلات غير مدمجة. اتخاذ مزيد من الحذر خلال خطوات الغسيل للحفاظ على طبقة ثنائية تحت العازلة والماصة بلطف حل الغسيل لتجنب تدمير طبقة ثنائية.
    5. طبقات ثنائية باردة معتمدة لدرجة حرارة الغرفة قبل قياسات AFM. وهذا مطلوب لتشكيل مراحل مختلفة من الغشاء وكذلك تقليل الانجراف الحراري في الصك.

2. قياسات القوة الذرية المجهر 11،12

  1. التصوير
    ملاحظة: إجراء القوة الذرية التصوير المجهري في وضع الاتصال أو التنصت واسطة. الصور المدعومة طبقات ثنائية في حل؛ لا تسمح حل لتتبخر تماما حيث سيؤدي ذلك إلى تدمير طبقات ثنائية. باعتبارها واحدة سوف تعمل مع العازلة، يرجى مراعاة احتياطات السلامة في التأكد من أن أي جزء AFM محمي من انسكاب السوائل.
    1. حدد تعزية لينة (أقل من ينصح 0.2 N / م ربيع ثابت) وتركيبها لرانه AFM. اختيار ناتئ صلابة أكثر خطورة لقوة التحليل الطيفي (وسيتم هذا مناقشته لاحقا).
    2. جبل العينة على المسرح AFM وتأكد من أن يتم تشغيل جميع وحدات الاهتزاز والعزل جرا. انتظر لمدة 15 دقيقة على الأقل لكي تتوازن والحد من الانجراف الحراري للنظام. اعتمادا على AFM مجموعة المتابعة، قد تختلف ضبط والتصوير المواصفات. الرجوع إلى دليل الشركة المصنعة.
    3. الاقتراب من العينة مع طرف AFM حتى للإتصال به.
    4. منذ طبقات ثنائية الدهون وعادة ما تكون 4 نانومتر في الطول، واستخدام Z-مجموعة من الصك من شأنها أن تعطي أعلى ض القرار (على سبيل المثال 1،5 ميكرون).
    5. حدد منطقة إلى الصورة. للحصول على لمحة عامة عن طبقة ثنائية الدهون، 50 ميكرون × 50 ميكرون أو 25 ميكرون و× 25 ميكرون المنطقة ستكون نقطة انطلاق جيدة لصورة. إذا ظهرت معالم أصغر، يمكن للمرء الصورة في مساحات أصغر (10 ميكرون × 10 ميكرون، أو 2 × 2 ميكرون ميكرون). اختيار منطقة التصوير يعتمد أيضا على ص العملانجى من الماسح الضوئي كهرضغطية. يرجى الرجوع إلى دليل أداة لهذا الغرض.
    6. كما طبقات ثنائية هشة للغاية، وضبط نقطة مجموعة من غيض AFM أثناء التصوير للحفاظ على القوة في الحد الأدنى وتصحيح الانحراف الحراري، مع الحفاظ على اتصال مع العينة. في وضع الاتصال، والتقليل من نقطة التحديد. في التنصت واسطة، وتحقيق أقصى قدر من نقطة التحديد.
    7. صور عملية من المناسب لكل خط مسح لوظائف التسوية متعدد الحدود. إجراء عملية إزالة خط لاجراء الفحوصات التي تفقد الاتصال مع غشاء باستخدام البرمجيات المملوكة للشركة التصنيع AFM.
  2. قوة التحليل الطيفي
    1. معايرة ناتئ اتباع التعليمات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. معايرة تتيح تحويل الإشارة الكهربائية من ثنائيات ضوئية لقوة (الشكل 1B).
      1. معايرة حساسية طرف لقياس انحراف كحركة ض بيزو (في وحدات الطول) بدلا من إشارة كهربائية في فولت.
      2. حساب ثابت ناتئ الربيع باستخدام طريقة تردد الضوضاء الحرارية، التي تأسست عادة في البرنامج AFM. في هذه الطريقة، رسم سعة الاهتزاز من الضوضاء فيما يتعلق تيرة التذبذب، وخلق الكثافة الطيفية مؤامرة السلطة. سوف تظهر هذه المؤامرة ذروته حول تردد الرنين. تردد حيث ط السعةق أعظم هو تردد الرنين. تناسب وظيفة Lorentzian حول الذروة لحساب تلقائيا ثابت الربيع من قبل البرنامج. يتم إعطاء بعض الموارد المفيدة لنظرية أسلوب الضوضاء الحرارية في المراجع 27-30.
    2. بعد التصوير مساحة طبقة ثنائية، حدد 5 ميكرون المنطقة × 5 ميكرون في طبقة ثنائية لأداء قوة التحليل الطيفي.
    3. إعداد AFM بحيث يأخذ منحنيات القوة في 16 × 16 شبكة من تلك المنطقة. هذه النتائج في 256 منحنيات القوة في المنطقة. يجب أن تكون المسافة بين نقطتين المجاورة بما فيه الكفاية لتجنب أن المنطقة غشاء يجري سبر بفارق نقطة واحدة سوف يتزامن مع النقطة التالية. هذا يعتمد على دائرة نصف قطرها طرف. ومن شأن مسافة 100 نانومتر بين نقطتين يكون مثاليا. تقسيم 5 × 5 ميكرون المنطقة ميكرون إلى 16 × 16 شبكة. اعتمادا على حجم المرحلة، يمكن للمرء تحديد منطقة أصغر أو أكبر، ومن ثم ضبط حجم الشبكة وفقا لذلك.
    4. تعيين النزوح ض بيزو ل400 نانومتر. هذا يحدد أقصى مدى من حركة ض بيزو. يجب أن تكون كبيرة بما يكفي للتأكد من أن ناتئ قد تراجع تماما بعيدا عن عينة بين القياسات.
    5. ضبط سرعة النهج إلى 800 نانومتر / ثانية وسحب السرعة إلى 200 نانومتر / ثانية. استخدام سرعة مقاربة بين 400 إلى 6000 نانومتر / ثانية اعتمادا على تكوين طبقة ثنائية ومرحلة الدهون التي يتعين دراستها 6،16.
    6. بعد إعداد جميع المعلمات، والحصول على منحنيات القوة، عن طريق الضغط على زر "تشغيل" من البرنامج AFM.
    7. حفظ منحنيات قوة كقوة مقابل منحنيات الطول (مقياس حركة ض بيزو). هذا لا يأخذ بعين الاعتبار الانحناء للناتئ عندما تكون في اتصال مع العينة. خلال خطوة لمعالجة البيانات، والبرمجيات AFM يسمح تصحيح ناتئ الانحناء للحصول على القوة مقابل منحنيات الفصل طرف عينة (الشكل 1C)، والتي سوف تعطي القيم المناسبة لسمك طبقة ثنائية. وعادة ما يتم دمج قيم التصحيح في calibrأوجه، والتي يتم حفظها مع كل منحنى القوة. حساب الفصل طرف عينة عن طريق طرح انحراف الرأسي من حركة بيزو عند نقطة معينة.
      ملاحظة: قمة في منحنى القوة نهج (قيمة القوة وتنخفض حتى إذا كانت الحركة ناتئ لا تزال على اتباع منهج دورة) هي القوة اختراق الغشاء، في حين أن الفرق بين موقف هذه الذروة وموضع نقطة حيث تبدأ القوة لترتفع مرة أخرى يقدم سمك الغشاء.
    8. الحصول على ما لا يقل عن 500 منحنيات القوة لكل حالة للحصول على إحصاءات جيدة. رسم بياني لقيم باستخدام برامج مثل المنشأ أو مطلب، وتناسب رسوم بيانية لتوزيع جاوس للحصول على الذروة وعرض للتوزيع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

طبقات ثنائية بدعم الدهون تتكون من DOPC: SM: تشول (2: 2: 1) تم تصويره في AFM (الشكل 2 AC). بسبب تركيبة الدهون، لوحظت SM / تشول الغنية L O و DOPC الغنية L د مراحل. يمكن الشخصى ارتفاع من التصوير AFM توفر معلومات هامة عن هيكل الغشاء. من خلال النظر في ملف الارتفاع، ويمكن قياس سمك طبقة ثنائية في وجود عيوب في الغشاء (الشكل 2B)، أو الفرق في الارتفاع بين L س / L د مراحل يمكن تقديمها. بالإضافة إلى ذلك، AFM يسمح لوجه التحديد حدد المناطق التي تمثل هذه المراحل وتحليل الخصائص الميكانيكية الخاصة بهم باستخدام القوة الطيفي (الشكل 2 D - F). يتم استخدام منحنيات القوة المستمدة من وضع قوة التحليل الطيفي لقياس قوة اختراق من خلال إيجاد قيمة القوة في ذروة منحنى القوة (الشكل 2D و E)، وmembrسمك انو بطرح قيمة المسافة من ذروة منحنى القوة لقيمة المسافة عندما يبدأ منحنى القوة في الارتفاع مرة أخرى (الشكل 2D و F).

حساسية قياسات AFM تعتمد على المواد كهرضغطية والحلقات ردود الفعل الإلكترونية. على هذا النحو، قبل التجارب به، من المهم أن تحصل على دراية AFM اقامة. هناك نوعان من أداة مشتركة إعداد للمواد كهرضغطية: (1) أنبوب الماسح الضوئي التي وضعت العينة على رأس المواد كهرضغطية ويتم فحص العينة بناء على بلاغ قادرة على الحركة. أو (2) المرحلة الثنية حيث يتم تركيب طرف على المواد كهرضغطية بدلا من العينة. في الحالة الأخيرة، والمواد كهرضغطية والالكترونيات وغيرها محمية من تسرب. وهناك الكثير من النماذج AFM للتطبيقات البيولوجية يكون هذا التكوين.

أثناء التصوير، وغيض AFM قد تفقد الاتصال مع العينة ويؤدي إلى الخاطئة ليasurements. اعتمادا على عدد بمسح تضيع، الصورة يمكن تصحيح عن طريق إزالة خطوط المسح وباستخدام فلتر كثافة يعني لاستخلاص القيم الجديدة من المنطقة المحيطة بها (الشكل 3). ولكن في معظم الحالات، وهذا لا تسفر عن صورة جيدة وينصح ببساطة تجاهل الصورة. وهناك غيرها من الأعمال الفنية التي تحتاج إلى مراقبة. هذه تنشأ من كليلة / التالفة / نصائح القذرة فضلا عن حيود بقعة الليزر وراء ناتئ 31. في هذه الحالات، يجب التخلص من الصور ويجب استبداله طرف AFM.

خلال قياسات التحليل الطيفي القوة، قد تنشأ العديد من التحديات: (1) عدم وجود قمم (الشكل 4A)، (2) وجود أكتاف بدلا قمم واضحة المعالم (الشكل 4B)، (3) زيادة صغيرة وplateauing لاحقا بأسعار منخفضة جدا قوات (الشكل 4C - D). ويمكن أن يعزى غياب الذروة إلى قياس في المنطقة دون BILشروط آير أو لاكتساب عدم الأمثل. فمن المستحسن أن يتم الحصول على صورة AFM قبل القيام قوة التحليل الطيفي للتأكد من أن طبقة ثنائية هو في الواقع الذي يتم قياسه. شروط اكتساب فضلا عن معلومات سرية المواصفات / ناتئ تؤثر على احتمال حدوث حدث اختراق 17. وهناك معلومات أكثر وضوحا يمكن أن تثقب بسهولة طبقة ثنائية، على هذا النحو، قد تظهر قوة اختراق منخفضة أو لا تظهر على الإطلاق لأنه أقل من مستويات الضوضاء. . زيادة سرعة النهج أيضا يزيد من قوة اختراق 16. كما هو الضغط على طبقة ثنائية من قبل طرف وجزيئات الدهون تتفاعل أيضا لتبديد هذه القوة. بسرعة أقل النهج، طبقة ثنائية المادة الدهنية لديها ما يكفي من الوقت لكي تتوازن قبل الخطوة التالية في القوة، وهذا يزيد من احتمال أن حدث اختراق يمكن أن يحدث. في أعلى سرعة النهج، سلالم قوة أسرع من رد فعل من الدهون، وعلى هذا النحو، فإن احتمال حدث اختراق أقل في نفس القوة. فمن POSSible أنه باستخدام عالية السرعة النهج، يتم الوصول إلى نقطة مجموعة قبل فواصل طبقة ثنائية مما أدى إلى عدم قمم يمكن ملاحظتها. لا توجد تقارير لشرح ظهور الكتفين على منحنى لكننا نفترض أنه يمكن أن يكون نتيجة لضغط مادي قبل انفراجة. وعلاوة على ذلك، هضبة أو قمم واسعة في القوات منخفضة جدا قد تشير إلى وجود أوساخ أو المواد الدهنية فضفاضة في الطرف. نصائح قد تتراكم الأوساخ والمواد شحمي في غضون عدة القياسات. الأوساخ والمواد التي تعلق على طرف يجعلها حادة، وبالتالي زيادة قوة اختراق.

فمن المستحسن أن منحنيات القوة يتم الحصول عليها في المناطق المختلفة إذا تنشأ هذه التحديات. والتوصية الثانية هي تغيير نصائح (وهذا سوف يتطلب إعادة تقويم). وأخيرا، قد تحتاج سرعة النهج إلى تعديل أو استخدام معلومات سرية مع مواصفات مختلفة (نصف قطرها طرف وصلابة) ويمكن اعتبار. قوة اختراق تتراوح ما بين 0-50 ن ن على هذا النحو، رانه الربيع الدائم للناتئ يمكن أن يكون في حدود 0،05 حتي 0،7 N / م. معظم الكابولي التجارية لديها دائرة نصف قطرها طرف الاسمي حوالي 20-40 نانومتر. بدلا من استخدام النصائح التقليدية، ويمكن أيضا أن يكون اشترى الكابولي tipless ويمكن أن تعلق مجالات دائرة نصف قطرها المعروفة (والتي عادة ما تكون monodisperse في حجم التوزيع) لهم. للحصول على بيانات قابلة للتكرار، استخدم دائما شروط اكتساب نفس والمواصفات تعزية لنفس مجموعة من التجارب.

الشكل 1
الشكل 1: مبادئ قوة التحليل الطيفي (A) تسلسل نهج التراجع للناتئ من العينة. يظهر خط أحمر انحراف ناتئ من موقف توازنها (خط أسود). (B) الكابولي معايرة تحويل الإشارة الكهربائية (في فولت) لفرض (في نيوتن). من خلال الاستحواذ على سينسي ناتئيتم تحويل الناقلية والربيع ثابت انحراف الرأسي (فولت) في المسافة والمسافة حيز التنفيذ باستخدام قانون هوك. (C) عند الاتصال في قياسات قوة التحليل الطيفي، حركة المسح الضوئي Z-بيزو لا يأخذ بعين الاعتبار ناتئ الانحناء. ويمكن أن يتم تصحيح هذا عن طريق طرح انحراف العمودي، العاشر (في وحدات المسافة) من حركة ض بيزو، ض (كما في وحدات المسافة). في هذه الطريقة، الفعلي فصل طرف عينة، بدلا من مجرد حركة ض بيزو، يمكن الإبلاغ، الذي يعد مقياسا أكثر دقة من المسافات ومهم من أجل قياس سمك العينة.

الرقم 2
الشكل 2: AFM من SLBs (A) مخطط SLBs تتألف من DOPC: SM: تشول (2: 2: 1) فصل في السائل المختلين (L د) وسائل أمر (L س) مراحل. (B (C) يناظر المربع الأصفر في B (10 ميكرون × 10 ميكرون). وصفت L O و L د مراحل. يتوافق ملف خط أدناه إلى الخط الأصفر في الصورة. تظهر مرحلة L س 1-2 نانومتر أعلى من المرحلة L د. (D) منحنى القوة عينة تبين كيف تستمد قوة اختراق وسمك الغشاء. (E) قوة الاختراق و(F) غشاء توزيع سمك لL د وL س مراحل مع تركيب الضبابي لتقدير.

الشكل (3)
الرقم 3: فقدان الاتصال أثناء التصوير يؤدي إلى. مسح الخطوط التي لا تتوافق مع ما تبقى من صورة معتمدة طبقة ثنائية مكونة من DOPC: SM: تشول (2: 2: 1) مع فقدان الاتصال في بعض بمسح الخط. شريط النطاق 2 ميكرون.

الرقم 4
الرقم 4: التحديات في قوة التحليل الطيفي (A) وبعض المنحنيات قوة ليس لديهم القمم. قد يكون (B) ومنحنى الكتفين بدلا من قمم واضحة المعالم. (C) بعد زيادة طفيفة قد تحدث هضبة في غياب الذروة. (D) المظهر من هضبة مع ذروة واضحة المعالم.

منطقة الغشاء اختراق قوة (ن ن) غشاء سمك (نانومتر)
L د المرحلة 6 ± 1 4.7 &# 177؛ 0.5
المرحلة L س 8 ± 1 6 ± 1

الجدول 1: خصائص غشاء DOPC: SM: تشول (2: 2: 1). SLBs المرحلة L د ديها قوة اختراق من 6 ± 1 ن ن وبسمك 4.7 ± 0.5 نانومتر. وL س يحتوي على 8 ± 1 ن ن وسمك 6 ± 1 نانومتر. الفرق في الارتفاع بين المرحلتين هو 2 ± 1.4 نانومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SLBs تتألف من DOPC: SM: تشول (2: 2: 1) تشكلت على الميكا بعد الامتزاز الحويصلة وتمزق الناجمة عن كلوريد الكالسيوم. هذه التركيبة الدهنية فصل إلى L د وL س مراحل. وأثرى مرحلة L س في سفينغوميالين والكوليسترول وأقل السائل / أكثر لزوجة (الشكل 1A) من د مرحلة L 11. فصل L س من L د المرحلة يظهر هياكل دائرية كما ارتقى فوق المحيطة بها (الشكل 1B، C). منصات هي س مراحل L محاطة L د مراحل. وينظر إلى عيوب غشاء (أو ثقوب في غشاء) أيضا (الشكل 1B، السهم الأزرق) ونبذة ارتفاع عبر هذا العيب يظهر سمك طبقة ثنائية. ويمكن أيضا أن يتم فحص L د / L س فرق الارتفاع من خلال النظر في ملف تعريف ارتفاع AFM (الشكل 1C).

إعداد الدهونخليط مهم جدا كما يحدد تكوين خصائص طبقة ثنائية. أثناء إعداد طبقة ثنائية المعتمدة، فمن المهم للعمل في درجات الحرارة وأشار إلى تشكيل السليم للمراحل الدهون (الخطوة 1.4.5). أثناء التصوير، والحفاظ على قوة منخفضة مهم جدا حتى لا تدمر طبقة ثنائية ولا تتراكم الأوساخ على معلومات سرية.

بعد AFM التصوير، ويتم اختيار مناطق SLB وسبر استخدام القوة الطيفي. التحليل الطيفي قوة يسمح لنا للتحقيق خصائص أخرى للغشاء، وتحديدا قوة اختراق (1D الشكل). وL د وL س مراحل تظهر قوة اختراق مختلفة وسمك (الشكل 1E، F). وتتلخص الخصائص في الجدول 1. ونلاحظ أنه بالمقارنة مع Chiantia وآخرون 11، تم الحصول على قيم مماثلة لقوة اختراق في د مرحلة L لكن انخفاض قيمة للمرحلة L س. هذا يمكن أن يكوننظرا لكميات أقل من الكولسترول المستخدمة في الأغشية لدينا (كنا DOPC: SM: نسبة تشول 2: 2: 1، في حين أنها تستخدم من 1.5: 1.5: 1). وهذا يدل أيضا على أهمية خلط نسبة الدهون الصحيحة - عاملا حاسما في استنساخ النتائج. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام الدهون المختلفة (طول السلسلة، ودرجة التشبع) أيضا إلى تغيير خصائص طبقة ثنائية 6،15،18.

بينما بالتآمر توزيع القوات اختراق مفيد ويمكن أن تظهر بالفعل اختلافات في خصائص طبقة ثنائية، مزيدا من التحليل لتوزيع قوة اختراق يمكن استخدامها لاستخلاص الخواص الميكانيكية الأخرى بما في ذلك خط التوتر ونشر ضغط 11،17،21. لفترة وجيزة، وصفت الاحتمالات، P (F) لقياس قوة اختراق معينة، F، من خلال التواصل التنوي نموذج 11،15،17:

المعادلة 1

حيث A هو ريسوناتردد الامتحانات التنافسية الوطنية للتعزية، K هو ثابت ربيع ناتئ، والخامس هو سرعة هذا النهج، Γ هو التوتر خط (الطاقة حافة المطلوبة للحفاظ على ثقب في غشاء مفتوح)، R هو نصف قطر AFM تلميح، ك B هو ثابت بولتزمان، T هو درجة الحرارة، وS هو الضغط نشر أو الطاقة المصاحبة لإغلاق ثقب (عكس التوتر الغشاء - الطاقة اللازمة لأن تمارسها الغشاء لفتح ثقب 32). هذه المعادلة يمكن أن تكون متكاملة ويمكن حساب موانئ دبي / DF على النحو التالي:

المعادلة 2

A، K، R هي خصائص AFM ناتئ / غيض التي يمكن الحصول عليها من خلال ناتئ المعايرة. T والخامس معلمات التجريبية التي يجب أن تبقى ثابتة طوال التجارب. موانئ دبي / DF ثم يتم تركيبها على الرسم البياني للحصول على خط التوتر والضغط الانتشار. كما تؤثر على العديد من المعلمات P (F)، من experiوينصح mentalists استخدام نصائح مماثلة وشروط اكتساب لقيم قابلة للمقارنة لخط التوتر والضغط الانتشار. التلوث من طرف AFM (بما في ذلك التراب والحويصلات غير مدمجة على طرف المكتسبة أثناء التصوير) يؤدي إلى نتائج غير قابلة للتكرار. وعلاوة على ذلك، واختيار من الدعم يؤثر على الخواص الميكانيكية للغشاء 20.

أسلوب آخر يمكن أن تميز الخواص الميكانيكية للدهن طبقة ثنائية هي تطلع micropipette حويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) 33. في هذه التقنية، يتم احتساب التوتر غشاء من تشوه GUVs خلال الطموح. وعلاوة على ذلك، من خلال زيادة شفط، يمكن للمرء حساب التوتر الذي تصدعات GUV (أو تحلل التوتر) 34، والتي يمكن أن تكون ذات صلة خط التوتر في نموذج التواصل التنوي. عيب واحد من هذه التقنيات هو تعقيد حساب التوتر غشاء للتخلص فصل الأغشية، كما فا مختلفةسيس لها خصائص ميكانيكية مختلفة 35. هذا هو على النقيض من AFM قوة التحليل الطيفي، حيث يمكن وصفها مراحل على حدة. وعلاوة على ذلك، في حين أن هناك حاجة إلى العديد من GUVs لتحقيق نتائج ذات الصلة إحصائيا، يمكن للAFM إنتاج توزيع واحد في SLB. ومع ذلك، غشاء إعادة عرض الآثار (على سبيل المثال، tubulation والانغلافات) وتصور بسهولة أكبر مع GUVs، مما يجعلها نظم أفضل لوصف هذه الآثار المتعلقة الشكل جنبا إلى جنب مع الخواص الميكانيكية.

في تطبيقات أخرى لدراسة آثار بروتينات الغشاء على خصائص طبقة ثنائية، فمن الممكن ادراج تنقية البروتينات في هذه الحويصلات لجعل proteoliposomes. أسلوب واحد للقيام بذلك تستخدم المنظفات لمساعدة البروتينات لتحقيق الاستقرار وإدراجها في الغشاء. تنقية اللاحقة عن طريق الغسيل الكلوي أو حجم الاستبعاد اللوني يزيل البروتينات حرة والمنظفات في حل 36. نهج آخر يتطلب وضع علامات علىفي تنقية البروتينات (على سبيل المثال، الحامض الأميني أو ستربتافيدين العلامات) وتتضمن شركاء تقارب لهذه العلامة في الجسيمات الشحمية (مع حامض والنيكل nitriloacetic (ني NTA) أو الدهون المعقدة البيروكسيديز).

باختصار، وصفنا أسلوبا لتحليل طبقات ثنائية الدهون. بسبب عالية الدقة، ويمكن AFM تكشف عن هياكل ميكرومتر الفرعي في الغشاء، والتي تشمل مراحل الدهون وغيرها. التحليل الطيفي القوة، وهنا يستخدم لوصف الأغشية الدهنية، ويمكن أن تستخدم أيضا على بروتينات الغشاء والجزيئات الحيوية الأخرى على الغشاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك، والمركز الألماني لأبحاث السرطان، وجامعة توبنغن، وBundesministerium FÜR Bildung اوند Forschung (منح رقم 0312040).

نشكر ادوارد هيرمان لمساعدتنا أتمتة تحليل البيانات منحنى القوة والدكتور جاكوب Suckale للقراءة متأنية لهذه المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850375P Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids, Inc. 860062P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8% Carl Roth GmbH + Co. KG 9265.1
Potassium chloride (KCl), 88% Sigma P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% AppliChem GmbH A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% Carl Roth GmbH + Co. KG 3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade AppliChem GmbH A4689
HEPES, molecular biology grade AppliChem GmbH A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness Duran Group 2355036
Punch and Die Set Precision Brand Products, Inc 40105
Optical Adhesive Norland Products, Inc. NOA 88 Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. 
Name Company Catalog Number Comments
Mica blocks NSC Mica Exports Ltd. These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease Borer Chemie AG Glisseal N
Liposome Extruder Avestin LiposoFast-Basic As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape 3M Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator Bandelin Sonorex Digitec DT-31 No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever  Bruker AFM Probes DNP-10 Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM JPK JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
  2. Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 209-216 (1988).
  3. Gaczynska, M., Osmulski, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn. Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).
  4. Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -C., Longo, M. L. AFM for structure and dynamics of biomembranes. BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).
  5. Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).
  6. Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F. Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
  7. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
  8. Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. Atomic Force Microscopy of Biological Membranes. Biophys. J. 96, 329-338 (2009).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Raviakine, I., Brisson, A. R. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy. Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).
  11. Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).
  12. Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics. Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).
  13. Domènech, Ò, Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane. BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).
  14. Domènech, Ò, Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. Supported planar bilayers from hexagonal phases. BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).
  15. Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes. J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).
  16. Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation. Biophys. J. 103, 38-47 (2012).
  17. Butt, H. -J., Franz, V. Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory. Physical Review E. 66, 031601 (2002).
  18. Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy. Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).
  19. Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study. Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).
  20. Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes. Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).
  21. García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM. Biophys. J. 93, 103-112 (2007).
  22. Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques. Nanoscale. 1, 40-49 (2009).
  23. Simons, K., Vaz, W. L. C. Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1. Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).
  24. Pike, L. J. Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function. The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).
  25. Kahya, N. Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
  26. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation and applications. Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).
  27. Butt, H. -J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
  28. Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids. Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).
  29. Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).
  30. Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).
  31. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).
  32. Lee, M. -T., Chen, F. -Y., Huang, H. W. Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides. Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).
  33. Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).
  34. Nichols-Smith, S., Teh, S. -Y., Kuhl, T. L. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes. BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).
  35. Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration. Phys. Rev. Lett. 98, (2007).
  36. Rigaud, J. -L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics