原子力显微镜成像和支持的脂质双层力谱

Bioengineering

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Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (101), e52867, doi:10.3791/52867 (2015).

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Abstract

Introduction

原子力显微镜(AFM)由扫描用悬臂具有非常尖锐的端部1产生在样品的一个区域的表面的图像。悬臂的运动探测样品的表面拓扑结构。 AFM已经广泛应用于生物分子-包括蛋白质,DNA,和膜,由于它的多功能性在分析中液体2-5在空气中或接近天然状态固定的样品。

除了 ​​其在纳米范围内的高分辨率成像能力,原子力显微镜悬臂充当弹簧探测的相互作用力(粘附力和斥力)和样品5,6的机械性能。这就是所谓的力谱。在这种模式下,探针先靠近样品和施加在其上的力,然后缩回,直到它失去接触与样品( 图1A)。所产生的曲线显示力作为距离悬臂的两个应用程序的函数蟑螂和回缩。几个属性,包括弹性模量测量材料的硬度和粘合力可以得到。

支持的脂质双层的生物模型膜躺在了坚实的支撑顶部-通常是云母,硼硅玻璃,熔融石英,或氧化硅7。他们使用的是一样的囊泡沉积的各种技术制备,朗缪尔-布洛杰特法和旋涂8,9。原子力显微镜成像已被用来按照下列支持双层10的形成,并探测由不同的组合物11-15的膜形成不同的结构。

执行力谱上支持双层结果的方法曲线的峰值。这表明峰值刺穿双层所需的力,被称为突破力。该双层厚度,也可以使用力曲线6测量。双层典型的突破力1-50之间范围NN 6。这些特性取决于脂质填料(液体或凝胶相)和结构(酰基链长和不饱和度),并通过膜活性剂16改变。破裂背后的理论已经解释17等实验参数,如悬臂柔软度,刀尖半径和进近速度也影响了突破力15,16,18。力光谱已被用来分析不同的脂质相11,19,组成依赖变化12,20,以及其它生物分子的效果,例如,肽的性质,在膜21的稳定性。

支持双层的平面取向是有利的原子力显微镜和其他方法,例如表面等离子共振22和荧光显微镜11,19组合以更好地表征结构和膜的特性。

这种详细的原始视频COL旨在利用囊泡沉积制备支持的脂质双层和他们AFM和力谱分析。虽然可以使用各种尺寸的囊泡以制备双层,该协议的重点是小的和大单层囊泡。支持双层相分离成液体下令(L O)和液体紊乱(L D)阶段即进行了表征11,15。 2:1的比例将膜在2由二油酰 - 磷脂酰胆碱(DOPC),鞘磷脂(SM)和胆固醇(CHOL)的。该组合物车型脂筏,这是建议的行为作为平台蛋白质运输和分拣,细胞信号和其他细胞的过程23,24重要。

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Protocol

1.准备支持的脂质双层(SLB)11,12,21

  1. 脂质混合物和多层囊泡悬浮液的制备
    1. 事先准备以下的缓冲区。
      1. 制备PBS缓冲液以2.7毫米氯化钾,浓度为1.5mM KH 2 PO 4,8毫的Na 2 HPO 4,和137 mM氯化钠,pH值7.2。
      2. 制备SLB(支持的脂质双层)缓冲液,在150 mM氯化钠,的10mM HEPES,pH 7.4中的浓度。
      3. 制备的1M的CaCl 2的溶液中。
    2. 溶解在氯仿以下脂质在期望的浓度:例如,二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC),在25毫克/毫升,鞘磷脂(SM)在25毫克/毫升和胆固醇(CHOL)以10毫克/毫升。
    3. 取18.38微升DOPC的,17.10微升的SM和11.30微升澈的,使用1mg总脂质中一个2的溶液:2:1 DOPC:缅澈的摩尔比。改变卷基础上相应的conce1.1.2制备的脂质ntrations。但是,保持的摩尔比为2:2:1 DOPC:缅澈,如改变的摩尔比将改变膜25的相位特性。
    4. 通过涡旋彻底混合溶液。添加荧光染料脂质在0.05%(摩尔)如果希望通过荧光显微镜可视化的双层。
      注意:长链dialkylcarbocyanines家庭,像那样,的DiI和DIO跨越大范围的波长的,并且可以理想地用于标记脂质膜。替代地,荧光标记的脂质,如若丹明 - 磷脂或BODIPY胆固醇都可以使用。在任何情况下,染料的浓度应根据显微镜的设置被优化,同时考虑到高浓度结合到脂质的荧光团可以改变脂质的行为19。
    5. 擦干采用N 2气的氯仿(或任何可用的惰性气体,如Ar和He)。
    6. 此外牛逼干他的脂质混合物在真空下至少1小时。
      注意:如果存储该脂质混合物,净化空气用惰性气体(N 2,Ar或He),并在-20℃存储。分装多余的脂肪,在氯仿成小棕瓶。干燥它们以类似的方式为所述脂质混合物,置换空气用惰性气体(N 2,Ar或He),并储存在-20℃。
    7. 溶解在PBS缓冲液中的干燥脂质的10毫克/毫升的浓度。
    8. 涡大力为1分钟的混合物约20秒,以得到浑浊悬浮液,含有多层囊泡。确保没有脂质膜粘到闪烁小瓶的侧面。
    9. 发布这一悬挂成10等份微升(1毫克脂质,使10等分)。
    10. 储存在-20°C,直到进一步使用。
  2. 单层囊泡的制备
    注意:各种尺寸单层囊泡的可使用超声处理法或挤压法来制备。超声使用sound能量搅拌该混合物中,并分离出多层悬浮的层。这是通过清理朦胧暂停指示。挤压迫使多层囊泡穿过膜过滤器具有确定孔径。
    1. 超声法
      1. 取10微升的多层脂质悬浮液,加入150微升SLB缓冲区。
      2. 转移混合物成小(2ml)中加帽的玻璃小瓶中并密封用Parafilm。
      3. 超声处理在室温下将混合物在水浴超声10分钟,或直至它变得清晰,得到小单层囊泡(SUV的,低于50纳米的直径)。
    2. 挤压法
      1. 取10微升的多层脂质悬浮液,加入150微升SLB缓冲区。
      2. 转移悬浮液送入低温管中。
      3. 通过浸没在低温管在液氮几秒冻结的脂质悬浮液。
      4. 解冻通过浸没在低温管在水浴中在室温下或37℃下进行数分钟的脂质悬浮液。重复冻融步骤的至少10倍。
      5. 为了挤出脂质悬浮液,使用聚碳酸酯膜具有200nm的孔的尺寸(其他孔径可用等,100纳米或400纳米)和市售挤出装置26。
        注意:目前,有两个挤出机的设备可商购的:一个手动挤出机可用于小体积(200μl到几毫升)。在这种情况下,将样品通过膜通过手动推悬浮来回两个注射器之间挤出。根据制造商,脂质等份将需要被组合以达到设定的最高最小体积。对于更大的体积(最多50毫升)更复杂的设备用于在其中悬浮液是通过聚碳酸酯膜通过使用压缩气体被迫。设置和挤出条件可以根据国防部改变埃尔。在使用前从制造商参考说明书。这个协议是指手动挤出机为小体积。
      6. 通过在挤出机中通过水平衡的挤出机中的水。浸泡在水中的膜。
      7. 放置在膜的两个活塞之间,组装设备和平衡缓冲液中,通过使缓冲器通过挤出机,从一个针筒到另一。这个步骤允许额外地测试系统的泄漏。如果泄漏,拆卸和重新组装一遍改变膜。
      8. 取使用挤出机中的一个注射器(“脏侧”)的脂质悬浮液。
      9. 附加一个包含在一腔室中的脂质悬浮液并在相对腔室中的空的注射器的注射器。
      10. 推动注射器的一端。穿过膜并进入对置注射器的解决方案。这是第1次传球。
      11. 通过膜传递,共计31次这样的该溶液最终的对置注射器('干净侧“)。
        注意:检查膜挤出后。如果它被打破,则挤出过程不成功并且需要重复。
      12. 空注射器插入小管。大单层囊泡(的LUV)是稳定的1-2天,如果保存在4℃。
  3. 云母和盖玻片的制备
    1. 洗涤先在水中,然后盖玻片乙醇。空气干燥。
    2. 取云母光盘和使用胶带剥离外层。
    3. 附加云母盘上盖玻片。透明的光学胶粘剂是最优这样一方面可以检查双层用荧光显微镜。
    4. 附加使用光学胶水/润滑脂塑料圆筒(2.5厘米外径,2厘米内径和0.5厘米高)。确保一切是密封的,而且没有泄漏。希望当重新使用气缸,因为它们可容易地从第超脱使用油脂Ë盖玻片和洗涤。该塑料缸的尺寸取决于AFM悬臂支架的尺寸,应作相应的调整。
  4. 单层囊泡的固体沉积支持
    1. 吸管直接整个脂质体溶液涂布的云母。添加更多的SLB缓冲器达到300微升的体积。
    2. 加入0.9微升的1M氯化钙溶液,以达到3毫米的Ca 2+的最终浓度。
    3. 在37℃进行2分钟,然后在65℃下至少10分钟。总是覆盖缓冲区的双层。与空气和气泡接触会破坏它。如果必要的话在孵育,添加更多的缓冲液,尤其是当孵育温度较高。
      注意:孵化温度根据所需的脂质混合物和相变化。至少10分钟温育时间是必要的,以形成支承双层,但它可能是更长的时间,这取决于温度和组成。
    4. 洗用热(65℃)该双层SLB缓冲器15-20次,以去除钙和未融合的囊泡。在洗涤步骤格外小心,不断缓冲的双层轻轻吸管的清洗液,以免破坏双层。
    5. 凉爽支承双层至室温AFM测量之前。这是必要的,以形成膜的不同的阶段,以及在仪器减少热漂移。

2.原子力显微镜测量11,12

  1. 成像
    注:在接触模式或轻敲模式进行原子力显微镜成像。在溶液中的图像支持双层;不要让解决方案完全蒸发,因为这会破坏双层。作为一个将与缓冲区的工作,请遵守确保任何AFM部分由液体溢出保护的安全防范措施。
    1. 选择一个软悬臂(低于0.2牛顿/米弹簧常数决定),并安装它到t他AFM。悬臂刚度的选择是对力谱更关键(这将在后面讨论)。
    2. 安装在原子力显微镜阶段的样品,并确保所有隔振模块被接通。等待至少15分钟以达到平衡,并降低了系统的热漂移。根据AFM的设置,调整和成像规格可能不同。咨询制造商的手册。
    3. 接近与针尖接触,直到样品。
    4. 由于脂质双层通常是高度4纳米,使用Z系列的仪器,将给予最高的Z分辨率(例如1.5微米)。
    5. 选择一个地区的形象。为了获得脂质双层的概述,一个50微米×50微米或25微米×25微米的区域将是一个很好的起点,以形象。如果更小的特征出现,在较小的领域之一即可图像(10微米×10微米,或2微米×2微米)。成像区域的选择还取决于工作ř安格压电扫描器。请参考仪器手册此。
    6. 作为双层是很脆弱的,在成像过程中调整针尖的设定点,以保持在最低限度的力和正确热漂移,同时保持与样品接触。在接触模式下,最小化的设定点。在轻敲模式,最大限度的设定点。
    7. 处理图像拟合每个扫描线的多项式函数练级。对于失去与使用原子力显微镜制造公司的专有软件膜接触扫描线进行清除。
  2. 力谱
    1. 校准根据制造商的协议以下的说明悬臂。校准允许光电二极管到力( 图1B)的电信号的转换。
      1. 校准尖的灵敏度来测量偏转z-压电运动(长度单位),而不是电信号伏特。
      2. 计算使用的热噪声频率的方法,通常在AFM软件中包含的悬臂弹簧常数。在该方法中,标绘出由噪音振动的振幅相对于振荡频率,产生一个功率谱密度图。该曲线将显示谐振频率附近具有峰值。该频率上的幅度我S中最大的是共振频率。适应周围的峰的洛伦兹函数由软件自动计算弹簧常数。对于热噪声方法的理论一些有用的资源列在参考文献27-30。
    2. 成像双层的面积后,在双层选择一个5微米×5微米区域来执行力谱。
    3. 设置了原子力显微镜,以使它能力曲线在一个16×16网格区域。这将导致在每个区域256的力曲线。两个相邻点之间的间距应足够,以避免膜面积被探测由一点会与下一个点相一致。这取决于尖端半径。两点之间的100nm的距离将是理想的。除以5微米×5微米区域分为16×16格。取决于相的大小,可以选择较小的或较大的区域,然后相应地调整网格大小。
    4. 设置z-压电位移400纳米。这就决定了z-压电的运动的最大范围。它应当足够大,以确保该悬臂完全缩回远离样品在测量之间。
    5. 设置方法速度800海里/秒的速度缩回到200nm /秒。使用400之间的接近速度到6000纳米/秒取决于双层成分和脂质阶段进行研究6,16。
    6. 设置所有参数后,收购力曲线,按AFM软件的“运行”按钮。
    7. 保存力曲线为力与高度曲线(z-压电运动的度量)。这并没有考虑到在悬臂的弯曲在与样品接触时。在数据处理步骤,在AFM软件允许校正悬臂弯曲得到力与针尖样品分离曲线( 图1C),这将给予适当的值双层厚度。修正值在CALIBR通常掺入通货膨胀,这是保存与每个力曲线。通过在给定的点减去压电运动垂直偏转计算针尖 - 样品的分离。
      注意:在该方法的力曲线的峰值(该力值下降,即使悬臂运动仍然在方法循环)是膜的突破力,而该峰的位置和点的位置之间的差其中力开始上升再次提供了膜的厚度。
    8. 获得至少500力曲线每个条件以获得良好的统计数据。积使用像母或MatLab的方案的值的直方图,以及适合直方图高斯分布,以获得分布的峰值和宽度。

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Representative Results

DOPC构成支持的脂质双层:缅澈(2:2:1)进行成像的原子力显微镜( 图2的AC)。由于脂质成分,SM /澈丰富1。·和DOPC丰富l D同时相观察。从原子力显​​微镜成像高度轮廓可以提供在膜结构的重要信息。通过查看高度轮廓,该双层厚度可在缺陷在膜中( 图2B),或的Lø/ L D-相之间的高度差存在待测量可以提供。此外,AFM允许代表这些阶段具体选择区域和分析使用武力谱( 图2 D - F)的力学性能。从力谱模式得到的力曲线用于通过找出在力曲线( 图2DE)的峰力值来测量突破力,并且membrANE厚度减去力曲线的距离值的峰值的距离值时,力曲线开始回升( 图2DF)。

AFM测量的灵敏度取决于压电材料和电子反馈环路。因此,在做实验之前,重要的是要熟悉的AFM成立。有两种常用的仪器设置为压电材料:(1)管扫描器,其中,将样品放置在压电材料的顶部和样品上扫描一个静止的前端部;或(2),其中所述前端被安装在压电材料代替样品挠曲阶段。在后一种情况下,压电材料和其它电子被保护免受泄漏。很多AFM模式的生物应用有此配置。

在成像过程中,针尖可能会失去与样品接触,并导致错误的我asurements。取决于有多少扫描丢失时,图像可以通过删除扫描线,并用平均强度滤波器以导出来自周围区域( 图3)的新值被校正。然而,在大多数情况下,这不会产生良好的图像,并建议简单地丢弃该图像。有迹象表明,需要监控等文物。这些源于钝/损坏/弄脏技巧以及悬臂31背后的激光光斑的衍射。在这些情况下,图像应当被丢弃,针尖应更换。

在部队光谱测量,几个挑战可能会出现:(1)无峰( 图4A),(2)存在的肩膀,而不是定义良好的峰( 图4B),(3)小幅度上涨以及随后plateauing在非常低的力( 图4C - D)。不存在的峰可以归因于测量的区域中没有胆红素艾耶尔或收购的条件没有被优化。建议在AFM图像是做力谱,以确保该双层确实被测量之前获得的。采集条件以及塞尖/悬臂规格影响突破事件17的概率。甲锐利尖端可轻易刺穿的双层,因此,穿透力,可能会出现低或根本不显示,因为它是下面的噪音水平。 。提高进场速度也增加了突破力16。由于双层是由尖端按压时,脂质分子也发生反应来消除这个力。在一个较低的进场速度,脂质双层有足够的时间生效的下一步骤之前达到平衡,这增加了一个突破事件可能发生的概率。在更高的接近速度,力斜面比脂质的反应更快,因此,一个突破事件的概率是低的相同的力。这是POSSIBLE,通过使用高接近速度,从而导致在没有可观察到的峰的双层破裂之前达到设定点。没有报告来解释曲线上肩的外观,但我们推测,这可能是由于漏出之前,材料的压缩。此外,在非常低的力高原或宽峰可指示的污垢或松散的脂类物质的尖的存在。提示可能在多次测量的跨度积累污垢和油脂的材料。附着到尖端污垢和材料使其钝,从而增加了突破力。

建议在力曲线在不同的领域,如果这些挑战出现获得的。第二个建议是要改变提示(这将需要重新校准)。最后,该方法的速度,可能需要进行调整,或使用具有不同规格(尖端半径和刚度)的前端的可被考虑。 0-50 NN 6之间的突破力而变化,因此,叔他弹簧常数悬臂可以是在0.05〜0.7牛顿/米的范围内。大多数商业悬臂有大约20-40纳米的标称尖端半径。代替使用常规的提示的,无针尖悬臂也可以购买和已知半径(其通常是单分散的尺寸分布)的球体可以连接到它们。为了获得可重复的数据,始终使用相同的收购条件和悬臂规格为同一组实验。

图1
图1:强制光谱的原理方法回缩从样品悬臂的(A)序列红线表示从它的平衡位置(黑线)的悬臂偏转。 ( 二)悬臂式校准转换的电信号(伏特)强制(牛顿)。通过收购悬臂的森西拉了一和弹簧常数的垂直偏转(用伏特)被换算为距离,并使用胡克定律的距离生效。 (C)在中力光谱测量接触,z-压电扫描运动不会考虑到悬臂弯曲。的校正此可以通过从z-压电运动中减去在垂直偏转中,x(以距离单位)来完成,Z(也以距离单位)。以这种方式,实际的针尖 - 样品的分离,而不是简单地z-压电运动,可以报告,它是距离的更精确的度量,以测量样品的厚度很重要。

图2
SM: 图2:SLBs的DOPC组成的SLBs中的AFM(A)计划澈(2:2:1)分离成液体紊乱(L d)和液体下令(L O)阶段。 (B (C)的对应于B中的黄色正方形(10微米×10微米)。 1。·阶段标记。线轮廓下面对应于图像中的黄线。第期出现1-2纳米比l D同时相高。 (D)的样品力曲线示出如何突破力和膜厚度的表达式。 (E)突破力(F)膜与高斯拟合定量l D同时和阶段厚度分布。

图3
图3:接触成像过程中的损失导致。扫描不对应于该图像的其余部分线支持的双层DOPC组成:缅澈(2:2:1)接触的部分行扫描丢失。比例尺2微米。

图4
图4:在部队光谱挑战 )有些力曲线不会有任何峰。 (B)中的曲线可以具有肩代替良好定义的峰值。 (C)的后一个小的增加高原可能发生在不存在峰。 (D)外观高原连同一个良好定义的峰值。

膜区 突破力(NN) 膜厚度(纳米)
l D同时相 6±1 4.7± 0.5
1。·阶段 8±1 6±1

表1:DOPC的膜性能:SM:澈(2:2:1)。SLBs中l D同时相具有6±1 NN的突破力,厚度为4.7±0.5纳米。第l O具有8±1 NN,厚度为6±1纳米。在两相之间的高度差为2±1.4纳米。

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Discussion

的SLBs DOPC组成:缅澈(2:2:1)中诱导氯化钙囊泡吸附和破裂后形成在云母。这种脂质成分分离为L- D阶段。的1。·相位富含鞘磷脂和胆固醇,小于流体/更粘( 图1A)l D同时相11。 1。·了由L D相分离的表现高于周围( 图1B,C)升高为圆形结构。该平台是由l D同时相包围1。·阶段。膜缺陷(或在膜孔)也可见( 图1B,蓝色箭头)和横跨该缺陷的高度轮廓示出了双层的厚度。第l D / L O身高差异也可以通过观察的AFM高度轮廓( 图1C)检查。

脂的制备方法混合物是很重要的,因为该组合物决定了双层属性。在支持双层的制备中,重要的是工作在所示温度下进行适当的形成脂质相(步骤1.4.5)的。在成像过程中,保持低的力是非常重要的,以便不破坏双层也不到刀尖上积累污垢。

经过原子力显微镜成像,在SLB的区域选择和使用武力光谱探测。力光谱允许我们探讨该膜的其它性能,特别是突破力( 图1D)。第l D阶段表现出不同的突破力和厚度( 图1E,F)。的性能总结于表1中 。我们注意到,相比Chiantia 等人 11,分别获得突破力的L D四相类似的值,但是用于相较低的值。这可能是由于较低量的在我们的膜中使用的胆固醇(我们使用DOPC:缅澈比2:2:1,而他们使用1.5:1.5:1)。这也表明混合的权利脂类比率的重要性 - 在结果的可重复性的一个关键因素。此外,使用不同的脂质(链长,和不饱和度)也改变了双层属性6,15,18。

而绘制的突破力的分布是很有用的,并且可以已经显示在双层性质的差异,穿透力的分布的进一步分析可以用来推断其他机械性能,包括线张力和铺展压力11,17,21。简单地说,概率P(F)的测量有一定的突破力F,描述由连续成核模型11,15,17:

式(1)

其中A是索纳悬臂的NCE频率,K是悬臂梁的弹簧常数,v是该方法的速度,Γ是线张力(保持孔在膜中开所需的边缘能量),R为原子力显微镜的半径尖中,k B是玻尔兹曼常数,T是温度,S是扩散压力或相关联的关闭空穴的能量(膜张力相反-需要通过膜被施加以打开孔32的能量)。这个方程可以集成并且dp / DF可以计算为:

公式(2)

A,K,R 3是可通过悬臂校准来获得的AFM悬臂/针尖的性质。 T和v分别是应保持恒定在整个实验的实验参数。上升/ DF是再装到直方图获取线张力和铺展压力。由于几个参数影响P(F),experi主义者则宜选用类似的提示和收购条件有可比值线的张力和蔓延的压力。针尖(包括成像期间获得的尖端污垢和未融合的囊泡)的污染导致的非可重复的结果。此外,支持的选择会影响隔膜20的机械性能。

这可以表征脂质双层机械性能的另一项技术是巨大单层囊泡(GUVs)33微吸管。在该技术中,膜张力从GUVs抽吸在变形计算。此外,通过增加吸力,可以计算的张力在该GUV破裂(或裂解张力)34,其可能与在连续成核模型的线张力。这种技术的一个缺点是计算膜张力相分离膜的复杂性,因为不同的帕SES具有不同的机械特性35。这是相对于AFM力光谱,其中,各相可单独特征。此外,尽管还需要很多GUVs生产相关的统计结果,原子力显微镜可以产生每SLB一个分发。然而,膜重塑的效果(例如,的小管和内陷)更容易显现与GUVs,使它们更好的系统的具有机械性能表征这些形状相关的影响在一起。

在进一步的应用,研究膜蛋白对双层性能的影响,纯化的蛋白质可在这些囊泡被结合使蛋白脂质体。一个技术这样使用清洁剂来帮助蛋白质稳定,并插入到细胞膜。通过透析或大小排阻层析随后的纯化除去游离的蛋白质和洗涤剂溶液中36。另一种方法中,需要的标记纯化的蛋白质(例如,组氨酸或链霉标签)和将亲和伙伴在脂质体中该标签(与镍 - 次氮基乙酸(的Ni-NTA)或生物素化的脂质)。

总之,我们描述的方法来分析脂质双层。由于它的高清晰度,原子力显微镜可以揭示亚微米结构中的膜,其中包括除其他脂质相。力光谱,这里用于表征脂质膜,也可以使用对膜蛋白和在该膜的其他生物分子。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。

Acknowledgements

这项工作是由马普学会,图宾根大学的德国癌症研究中心,以及德国联邦联邦教育与研究部(批准号:0312040)的支持。

我们感谢爱德华·赫尔曼帮助我们自动力曲线数据和雅各布Suckale博士仔细阅读本手稿的分析。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850375P Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids, Inc. 860062P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8% Carl Roth GmbH + Co. KG 9265.1
Potassium chloride (KCl), 88% Sigma P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% AppliChem GmbH A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% Carl Roth GmbH + Co. KG 3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade AppliChem GmbH A4689
HEPES, molecular biology grade AppliChem GmbH A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness Duran Group 2355036
Punch and Die Set Precision Brand Products, Inc 40105
Optical Adhesive Norland Products, Inc. NOA 88 Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. 
Name Company Catalog Number Comments
Mica blocks NSC Mica Exports Ltd. These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease Borer Chemie AG Glisseal N
Liposome Extruder Avestin LiposoFast-Basic As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape 3M Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator Bandelin Sonorex Digitec DT-31 No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever  Bruker AFM Probes DNP-10 Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM JPK JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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