Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

Bioengineering

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Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (101), e52867, doi:10.3791/52867 (2015).

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Abstract

Introduction

Atomic Force Microscopy (AFM) genera un'immagine di una superficie di scansione attraverso l'area del campione utilizzando una mensola con una punta molto affilata 1. Il movimento del cantilever sonda la topologia superficiale del campione. AFM è stato ampiamente applicato alle molecole biologiche - come proteine, DNA e membrane, grazie alla sua versatilità nell'analisi campioni fissati in aria o stato quasi native nel liquido 2-5.

Oltre alla sua capacità di imaging ad alta risoluzione in nanometri, il cantilever AFM agisce come una molla per sondare forze di interazione (adesione e repulsione) e le proprietà meccaniche del campione di 5,6. Questo è noto come spettroscopia di forza. In questa modalità, la prima sonda si avvicina al campione e esercita una forza su di esso, allora viene retratto fino perde contatto con il campione (Figura 1A). Le curve generate mostrano forza in funzione della distanza del cantilever sia per l'applicazionescarafaggio e retrazione. Diversi proprietà incluso il modulo elastico per misurare la rigidità di un materiale, e le forze di adesione possono essere derivati.

Bistrati lipidici supportati sono membrane biologiche modello situata sulla sommità di un supporto solido - solitamente mica, vetro borosilicato, silice fusa, o ossidato silicio 7. Sono preparati utilizzando varie tecniche come vescicole deposizione, metodo Langmuir-Blodgett e spin-coating 8,9. L'imaging AFM è stato utilizzato per seguire la formazione di questi bistrati supportati 10, e sonda diverse strutture formate da membrane di diverse composizioni 11-15.

Esecuzione di spettroscopia di forza su bistrati risultati supportati in un picco nella curva approccio. Questo picco indica la forza necessaria per perforare il doppio strato, e si chiama forza rivoluzionaria. Lo spessore doppio strato può essere misurata utilizzando la curva della forza 6. La forza innovativa tipica di bistratirange compreso tra 1-50 nN 6. Queste proprietà dipendono imballaggio lipidi (liquido o gel fase) e la struttura (acil lunghezza della catena e il grado di insaturazione) e modificata da agenti membrana attiva 16. La teoria dietro la rottura è stato spiegato il 17 ed altri parametri sperimentali come cantilever morbidezza, il raggio e la velocità di punta approccio influenzare anche la forza rivoluzionaria 15,16,18. Spettroscopia di forza è stato utilizzato per analizzare le proprietà di diverse fasi lipidiche 11,19, composizione-dipendente cambiamenti 12,20, così come gli effetti di altre biomolecole, quali peptidi, sulla stabilità della membrana 21.

L'orientamento piatta di bistrati supportati è vantaggioso per combinare AFM con altri metodi come la risonanza plasmonica superficiale 22 e microscopia a fluorescenza 11,19 per meglio caratterizzare struttura e le proprietà delle membrane.

Questo video proto dettagliatacol lo scopo di preparare i doppi strati lipidici supportati con vescicole deposizione e analizzarli con AFM e spettroscopia di forza. Mentre vescicole di varie dimensioni possono essere usati per preparare bistrati, questo protocollo si concentra sulle piccole e grandi vescicole unilamellari. Bistrati supportati quella fase separano in liquido ordinato (L o) e disordinati (L d) fasi liquide sono state caratterizzate 11,15. La membrana è composta di-oleoyl-fosfatidilcolina (DOPC), sfingomielina (SM) e colesterolo (Chol) a 2: 2: 1 ratio. Questi modelli di composizione delle zattere lipidiche, che sono proposti a comportarsi come piattaforme importanti per il traffico di proteine ​​e di smistamento, segnalazione cellulare e altri processi cellulari 23,24.

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Protocol

1. Preparazione di doppi strati lipidici supportati (SLB) 11,12,21

  1. Preparazione di lipidi miscela e multilamellari vescicole Sospensioni
    1. Preparare i seguenti buffer in anticipo.
      1. Preparare tampone PBS a concentrazioni di 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4, e 137 mM NaCl, pH 7,2.
      2. Preparare SLB (bistrato lipidico supportato) tampone a concentrazioni di NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4.
      3. Preparare una soluzione di 1 M CaCl 2.
    2. Sciogliere le seguenti lipidi in cloroformio a una concentrazione desiderata: ad esempio, di-oleoyl-fosfatidilcolina (DOPC) a 25 mg / ml, sfingomielina (SM) a 25 mg / ml e colesterolo (Chol) a 10 mg / ml.
    3. Prendere 18,38 ml di DOPC, 17,10 ml di SM e 11.30 ml di Chol per ottenere una soluzione con 1 mg di lipidi totali in rapporto 2: 2: 1 DOPC: rapporto molare Chol: SM. Variare i volumi di conseguenza, basandosi sul concentrations dei lipidi preparate in 1.1.2. Tuttavia, mantenere il rapporto molare di 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, come cambiando il rapporto molare cambierà le caratteristiche di fase della membrana 25.
    4. Mescolare la soluzione completamente nel vortex. Aggiungere un colorante fluorescente lipidico a 0,05 moli% se si desidera visualizzare il doppio strato con un microscopio a fluorescenza.
      Nota: La famiglia di dialkylcarbocyanines a catena lunga, come ha fatto, DII e DiO abbracciano una vasta gamma di lunghezze d'onda e possono essere utilizzati in posizione ideale per etichettare membrane lipidiche. In alternativa, i lipidi fluorescente, come rodamina-fosfatidiletanolamina o BODIPY-colesterolo possono essere utilizzati. In ogni caso, la concentrazione del colorante deve essere ottimizzato in base all'impostazione microscopia, tenendo presente che alte concentrazioni di fluoroforo legato al lipide possono modificare il comportamento lipidica 19.
    5. Asciugare il cloroformio con N 2 gas (o qualsiasi gas inerte disponibili come Ar e He).
    6. Ulteriore t seccoegli lipidico miscela sotto vuoto per almeno 1 ora.
      Nota: Se si conserva questa miscela lipidica, eliminare l'aria con gas inerte (N 2, Ar o He) e conservare a -20 ° C. Aliquota lipidi-in-cloroformio in eccesso in piccole fiale marrone. Asciugarli in un modo simile come la miscela di lipidi, spostare l'aria con gas inerte (N 2, Ar o He) e conservare a -20 ° C.
    7. Sciogliere i lipidi essiccati in tampone PBS ad una concentrazione di 10 mg / ml.
    8. Vortex la miscela vigorosamente per circa 20 secondi a 1 minuto per ottenere una sospensione torbida, contenente vescicole multilamellari. Assicurarsi che il non ci sono film lipidici sporgenti ai lati del flacone.
    9. Distribuire la sospensione in 10 aliquote microlitri (1 mg di lipidi rende 10 aliquote).
    10. Conservare a -20 ° C fino all'utilizzo.
  2. Preparazione di unilamellari vescicole
    Nota: I vari formati di vescicole unilamellari possono essere preparate con il metodo sonicazione o il metodo di estrusione. Sonicazione utilizza sound energia per agitare la miscela e separare gli strati della sospensione multilamellare. Questo è indicato da ripulire della sospensione nebuloso. Estrusione costringe le vescicole multilamellari passare attraverso un filtro a membrana con dimensione dei pori definito.
    1. Metodo Sonicazione
      1. Prendete i 10 ml di sospensioni lipidiche multilamellari e aggiungere 150 ml di tampone SLB.
      2. Trasferire il composto in piccoli (2 ml) fiale di vetro ricoperti e sigillare con Parafilm.
      3. Sonicare la miscela a temperatura ambiente in un bagno sonicatore per 10 minuti o fino a quando diventa chiaro per produrre piccole vescicole unilamellari (SUV, inferiore a 50 nm di diametro).
    2. Metodo di estrusione
      1. Prendete i 10 ml di sospensioni lipidiche multilamellari e aggiungere 150 ml di tampone SLB.
      2. Trasferire la sospensione in un tubo criogenico.
      3. Congelare la sospensione lipidica immergendo il tubo criogenico per alcuni secondi in azoto liquido.
      4. Scongelare lasospensione lipidica immergendo il tubo criogenico in un bagno d'acqua a temperatura ambiente oa 37 ° C per alcuni minuti. Ripetere le fasi gelività almeno 10 volte.
      5. Per estrudere la sospensione lipidica, usare una membrana di policarbonato con dimensioni 200 nm pori (altre dimensioni dei pori sono disponibili come, 100 nm o 400 nm) e di un dispositivo di estrusione commerciale 26.
        Nota: Attualmente, ci sono due dispositivi estrusori disponibili in commercio: un estrusore manuale è disponibile per piccoli volumi (200 microlitri a pochi ml). In questo caso, il campione viene estruso attraverso la membrana spingendo manualmente la sospensione avanti e indietro tra due siringhe. A seconda del produttore, aliquote lipidi dovrebbero essere combinati per raggiungere volume minimo del set up. Per i volumi più grandi (fino a 50 ml) sono utilizzati dispositivi più sofisticati in cui la sospensione è forzato attraverso la membrana di policarbonato utilizzando gas compresso. Condizioni di impianto e di estrusione possono cambiare in base alla model. Consultare le istruzioni del produttore prima dell'uso. Questo protocollo si riferisce al estrusore manuale per piccoli volumi.
      6. Equilibrare l'estrusore in acqua facendo passare l'acqua attraverso l'estrusore. Immergere la membrana in acqua.
      7. Posizionare la membrana tra i due pistoni, montare il dispositivo ed equilibrare in tampone, facendo passare il buffer attraverso l'estrusore, da una siringa all'altra. Questa fase consente inoltre testare la permeabilità del sistema. Se perde, smontare e rimontare nuovamente cambiare la membrana.
      8. Prendere la sospensione lipidica utilizzando una siringa dell'estrusore ('lato sporco').
      9. Applicare la siringa contenente la sospensione lipidica su una camera e la siringa vuota sulla camera opposta.
      10. Premere la siringa su una estremità. Far passare la soluzione attraverso la membrana e nella siringa avversaria. Questo è il passo 1 °.
      11. Passare attraverso la membrana per un totale di 31 volte taliche la soluzione finisce sulla siringa opposta ('lato pulito').
        Nota: Controllare la membrana dopo l'estrusione. Se è stato rotto, allora il processo di estrusione, non ha avuto successo e deve essere ripetuto.
      12. Svuotare la siringa in un piccolo tubo. Grandi vescicole unilamellari (Luvs) sono stabili per 1-2 giorni se conservato a 4 ° C.
  3. Preparazione di Mica e vetrini
    1. Lavare coprioggetto prima in acqua e poi in etanolo. Aria secca.
    2. Prendete dischi mica e staccare lo strato esterno con del nastro adesivo.
    3. Fissare il disco mica sul vetrino. Colle ottici trasparenti sono ottimali in modo che si possa controllare i doppi strati con un microscopio a fluorescenza.
    4. Fissare cilindri di plastica (diametro 2,5 centimetri esterno, due centimetri di diametro interno, e 0,5 cm di altezza) con ottica colla / grasso. Assicurarsi che tutto sia sigillata e che non vi siano perdite. Usare grasso quando vogliono riutilizzare i cilindri in quanto possono essere facilmente smontato dal the vetrino e lavato. Le dimensioni dei cilindri di plastica dipendono dalle dimensioni del supporto cantilever AFM e devono essere regolati di conseguenza.
  4. Deposizione di unilamellari vescicole su un solido appoggio
    1. Pipettare l'intera soluzione liposomiale direttamente sulla mica. Aggiungere più di buffer SLB di raggiungere un volume di 300 ml.
    2. Aggiungere 0,9 ml di soluzione 1 M di cloruro di calcio per raggiungere una concentrazione finale di 3 mM Ca 2+.
    3. Incubare a 37 ° C per 2 minuti e poi a 65 ° C per almeno 10 min. Coprire sempre i doppi strati con tampone. Il contatto con le bolle d'aria e aria la distruggerà. Durante l'incubazione, aggiungere più tampone se necessario, soprattutto se incubando a temperature più elevate.
      Nota: le temperature di incubazione variano secondo le miscele di lipidi e le fasi necessarie. Occorre tempo di incubazione di almeno 10 minuti per formare bistrati supportati, ma potrebbe essere più lungo, a seconda della temperatura e della composizione.
    4. Lavaggioil doppio strato con calda (65 ° C) del buffer SLB 15-20 volte per rimuovere calcio e vescicole non fuse. Prestare particolare attenzione durante le fasi di lavaggio per mantenere il doppio strato sotto buffer e pipetta delicatamente la soluzione di lavaggio per evitare di distruggere il doppio strato.
    5. Raffreddare bistrati supportati a temperatura ambiente prima misure AFM. Ciò è necessario per formare le diverse fasi della membrana e ridurre la deriva termica dello strumento.

2. Forza Atomica Microscopia Misure 11,12

  1. Imaging
    Nota: eseguire a forza atomica immagini di microscopia in modalità contatto o in modalità tapping. Immagini supportati bistrati in soluzione; non consentono soluzione evapori completamente, come questo distruggerà i doppi strati. Come ci si potrebbe lavorare con tampone, osservare le precauzioni di sicurezza per fare in modo che ogni parte AFM è protetto da fuoriuscite di liquidi.
    1. Selezionare una mensola morbido (di seguito è consigliato di 0,2 N / m costante della molla) e montarlo in tegli AFM. La scelta di cantilever rigidità è più critica per la spettroscopia di forza (e se ne parlerà più avanti).
    2. Montare il campione sul palco AFM e fare in modo che tutti i moduli di vibrazione-isolamento sono attivate. Attendere almeno 15 minuti per equilibrare e ridurre la dispersione termica del sistema. A seconda della AFM set-up, messa a punto e di imaging specifiche possono variare. Consultare manuale del costruttore.
    3. Avvicinare il campione con la punta AFM fino contatto.
    4. Poiché doppi strati lipidici sono solitamente 4 nm in altezza, utilizzare la Z-gamma dello strumento che darà il più alto z-risoluzione (ad esempio 1,5 micron).
    5. Seleziona una regione per immagine. Per avere una panoramica del doppio strato lipidico, a 50 micron x 50 micron o 25 micron x 25 micron regione sarà un buon punto di partenza per l'immagine. Se appaiono le caratteristiche più piccole, immagine una lattina nelle aree più piccole (10 micron x 10 micron, o 2 micron x 2 micron). La scelta della zona di imaging dipende anche dalla r lavorareange dello scanner piezoelettrico. Si prega di consultare il manuale dello strumento per questo.
    6. Come bistrati sono molto fragili, regolare il set point della punta AFM durante l'imaging di mantenere la forza al minimo e corretta per deriva termica, restando a contatto con il campione. Nella modalità di contatto, ridurre al minimo il set point. In modalità toccando, massimizzare il set point.
    7. Le immagini del processo di montaggio ogni linea di scansione per le funzioni di livellamento polinomi. Eseguire la rimozione delle linee per le scansioni che perdono contatto con la membrana utilizzando il software proprietario della società di produzione AFM.
  2. Spettroscopia Forza
    1. Calibrare il cantilever seguendo le istruzioni in base al protocollo del produttore. La calibrazione consente la conversione del segnale elettrico di fotodiodi a forza (Figura 1B).
      1. Calibrare la sensibilità della punta per misurare deflessione come movimento z-piezo (in unità di lunghezza) invece del segnale elettrico in volt.
      2. Calcolare la costante della molla a sbalzo con il metodo frequenza del rumore termico, solitamente incorporato nel software AFM. In questo metodo, tracciare l'ampiezza di vibrazione dal rumore rispetto alla frequenza di oscillazione, creando una trama densità spettrale di potenza. Questo grafico mostra un picco intorno alla frequenza di risonanza. La frequenza dove l'i dell'ampiezzas il più grande è la frequenza di risonanza. Montare una funzione Lorentziana intorno al picco di calcolare automaticamente la costante della molla dal software. Alcune risorse utili per la teoria del metodo rumore termico sono riportati nei riferimenti 27-30.
    2. Dopo l'imaging un'area del doppio strato, selezionare una regione x 5 micron 5 micron nel doppio strato effettuare spettroscopia di forza.
    3. Impostare la AFM modo che ci vuole forza curve di una griglia di quella regione 16 x 16. Ciò si traduce in 256 curve di forza per regione. Lo spazio tra i due punti adiacenti dovrebbe essere sufficiente ad evitare che l'area membrana essendo controllato di un punto coinciderebbe con il punto successivo. Questo dipende dal raggio della punta. Una distanza 100 nm tra due punti sarebbe ideale. Dividere il 5 micron x 5 micron regione in 16 x 16 griglia. A seconda delle dimensioni della fase, si può selezionare una regione più piccolo o più grande, e quindi regolare la dimensione della griglia di conseguenza.
    4. Set spostamento z-piezo per400 nm. Questo determina la portata massima di movimento del z-piezo. Esso dovrebbe essere abbastanza grande per assicurarsi che il cantilever sia completamente ritirata dal campione tra le misurazioni.
    5. Impostare velocità di avvicinamento a 800 nm / sec e ritrarre la velocità a 200 nm / sec. Utilizzare una velocità di avvicinamento tra 400 a 6.000 nm / sec a seconda della composizione bistrato e fase lipidica da studiare 6,16.
    6. Dopo aver impostato tutti i parametri, acquisire forza curve, premendo il tasto "run" del software AFM.
    7. Salvare forza curve come forza contro le curve di altezza (una misura di movimento z-piezo). Ciò non tiene conto della curvatura del cantilever a contatto con il campione. Durante la fase di elaborazione dei dati, il software permette di AFM correzione per cantilever flessione per ottenere forza contro curve di separazione punta-campione (Figura 1C), che darà valori corretti per lo spessore doppio strato. I valori di correzione sono di solito incorporati nel CALIBRAZzione, che viene salvato ad ogni curva di forza. Calcolare separazione punta-campione sottraendo la deflessione verticale dal movimento piezo in un determinato punto.
      Nota: Il picco nella curva forza approccio (il valore della forza scende anche se il movimento cantilever è ancora sul ciclo di accostamento) è la forza innovativa della membrana, mentre la differenza tra la posizione di questo picco e la posizione del punto dove la forza comincia a sollevarsi fornisce nuovamente lo spessore della membrana.
    8. Acquisire almeno 500 curve di forza per ogni condizione di ottenere buone statistiche. Tracciare un istogramma dei valori utilizzando programmi come origine o MatLab, e montare gli istogrammi di una distribuzione gaussiana per ottenere il picco e la larghezza della distribuzione.

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Representative Results

Doppi strati lipidici supportati composto da DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) sono state visualizzate con AFM (Figura 2 AC). A causa della composizione lipidica, sono stati osservati SM / Chol-ricchi L DOPC ricchi fasi L d oe. Il profilo altezza da immagini AFM può fornire importanti informazioni sulla struttura della membrana. Osservando il profilo altezza, lo spessore doppio strato può essere misurato in presenza di difetti nella membrana (Figura 2B), ovvero la differenza di altezza tra i L O / L d fasi può essere fornita. Inoltre, AFM permette di selezionare in modo specifico le regioni che rappresentano queste fasi e analizzare le loro proprietà meccaniche mediante spettroscopia di forza (Figura 2 D - F). Le curve forza derivati ​​dalla modalità spettroscopia di forza sono utilizzati per misurare la forza svolta trovando il valore di forza al picco della curva di forza (Figura 2D e E), e il membrspessore ane sottraendo il valore di distanza dal picco della curva di forza sul valore della distanza quando la curva della forza comincia a salire (Figura 2D e F).

La sensibilità di misure AFM dipende materiale piezoelettrico e anelli di retroazione elettroniche. In quanto tale, prima degli esperimenti che fanno, è importante per acquisire familiarità con l'AFM istituito. Ci sono due strumento comune istituito per i materiali piezoelettrici: (1) scanner tubo in cui il campione è posto sulla parte superiore del materiale piezoelettrico e il campione viene acquisito su una punta immobile; o (2) di flessione-fase in cui la punta viene montata sul materiale piezoelettrico posto del campione. In quest'ultimo caso, il materiale piezoelettrico e altri dispositivi elettronici sono protetti dalle cadute. Un sacco di modelli AFM per applicazioni biologiche hanno questa configurazione.

Durante l'imaging, la punta AFM può perdere il contatto con il campione e ad una falsa measurements. A seconda di quanti scansioni vengono persi, l'immagine può essere corretto rimuovendo le linee di scansione e utilizzando un filtro di intensità media per derivare i nuovi valori dalla zona circostante (Figura 3). Tuttavia, in molti casi, questo non produce una buona immagine e si raccomanda di scartare semplicemente l'immagine. Ci sono altri artefatti che devono essere monitorati. Questi derivano da contundenti danneggiati / punte / sporchi nonché la diffrazione del punto laser dietro cantilever 31. In questi casi, le immagini devono essere eliminati e la punta AFM devono essere sostituiti.

Durante forza misure di spettroscopia, possono sorgere diversi problemi: (1) assenza di picchi (Figura 4A), (2) presenza di spalle invece picchi di ben definiti (Figura 4B), (3) un piccolo aumento e successiva plateauing a bassissima forze (Figura 4C - D). L'assenza di un picco può essere attribuito alla misura in una regione senza bilcondizioni ayer o ad acquisizioni non vengono ottimizzati. Si raccomanda che un'immagine AFM viene acquisita prima di fare spettroscopia di forza per assicurarsi che il doppio strato è infatti misurato. Condizioni di acquisizione così come punta specifiche / cantilever influenzano la probabilità di un evento di svolta 17. Una punta tagliente può facilmente perforare un doppio strato, in quanto tale, la forza rivoluzionaria può apparire basso o non appare affatto, perché è al di sotto dei livelli di rumore. . Aumentando la velocità di avvicinamento aumenta anche la forza rivoluzionaria 16. Poiché il doppio strato è premuto dalla punta, le molecole lipidiche anche reagiscono per dissipare questa forza. Ad una velocità di avvicinamento inferiore, il doppio strato lipidico ha abbastanza tempo per equilibrare prima del passaggio successivo in vigore, e questo aumenta la probabilità che un evento svolta può accadere. Ad una velocità di avvicinamento più elevata, le rampe forza più veloce rispetto alla reazione dei lipidi e, come tale, la probabilità di un evento di svolta è inferiore alla stessa forza. È possbile che, utilizzando ad alta velocità di avvicinamento, il set point viene raggiunto prima le interruzioni doppio strato con conseguente senza picchi osservabili. Non ci sono rapporti per spiegare la comparsa delle spalle della curva, ma abbiamo postulato che potrebbe essere a causa della compressione del materiale prima svolta. Inoltre, un plateau o picchi larghi a forze molto basse possono indicare la presenza di sporco o materiale lipidico sciolto nella punta. Suggerimenti possono accumularsi sporcizia e materiale lipidico nel giro di diverse misurazioni. Sporcizia e materiale attaccato alla punta rende smussato, aumentando così la forza di svolta.

Si raccomanda che le curve di forza sono acquisite in settori diversi se queste sfide si presentano. Una seconda raccomandazione è quello di cambiare punte (questo richiede ricalibrazione). Infine, la velocità di approccio può essere necessario regolare o l'uso di una punta con caratteristiche diverse (raggio punta e rigidità) possono essere considerati. La forza svolta varia tra 0-50 nN 6, in quanto tale, tegli costante della molla del cantilever può essere nell'intervallo di 0,05-0,7 N / m. La maggior parte dei cantilever commerciali hanno un raggio di punta nominale intorno 20-40 nm. Invece di usare punte convenzionali, cantilever tipless potrebbero anche essere acquistati e sfere di raggio noto (che di solito sono monodispersa in distribuzione delle dimensioni) potrebbero essere collegati a loro. Per ottenere dati riproducibili, utilizzare sempre le stesse condizioni di acquisto e le specifiche a sbalzo per la stessa serie di esperimenti.

Figura 1
Figura 1: Principi di spettroscopia di forza (A) Sequenza di approccio retrazione del cantilever dal campione.. La linea rossa indica la deviazione a sbalzo dalla sua posizione di equilibrio (linea nera). (B) calibrazione sbalzo converte il segnale elettrico (in Volt) per forzare (in Newton). Con l'acquisizione della Sensi cantilevervità e la primavera costante la deflessione verticale (in volt) viene convertito in distanza e la distanza in vigore con la legge di Hooke. (C) In contatto in spettroscopia forza, il movimento di scansione z-piezo non prende in considerazione il cantilever piegatura. Una correzione per questo può essere fatto sottraendo la deflessione verticale, x (in unità di distanza) dal movimento z-piezo, z (anche in unità di distanza). In questo modo, la separazione punta-campione attuale, invece di movimento z-piezo, può essere riferito, che è una misura più accurata delle distanze ed è importante per misurare lo spessore del campione.

Figura 2
Figura 2:. AFM di SLB (A) Schema di SLB composta DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) si separano in liquido disordinata (L d), e liquido ordinato (L o) fasi. (B (C) corrisponde al quadrato giallo in B (10 micron x 10 micron). Fasi L O e L d sono etichettati. Il profilo riga sotto corrisponde alla linea gialla nell'immagine. La fase L o appare 1-2 nm superiore alla fase L d. (D) Una curva forza di esempio che mostra come la forza innovativa e lo spessore della membrana sono derivati. (E) la forza di penetrazione e (F) membrana distribuzione di spessore per L d e L o fasi con raccordo gaussiana per la quantificazione.

Figura 3
Figura 3: La perdita di contatto durante l'imaging comporta. SM:: Chol scansione linee che non corrispondono al resto dell'immagine Un doppio strato composta DOPC supportati (2: 2: 1) con perdita di contatto in alcune scansioni linea. Scala bar 2 micron.

Figura 4
Figura 4:. Le sfide di spettroscopia di forza (A) Alcune curve di forza non avrà picchi. (B) La curva può avere spalle invece di picchi ben definiti. (C) Dopo un piccolo aumento un plateau può verificarsi in assenza del picco. (D) Aspetto di un plateau insieme con un picco ben definito.

Regione membrana Breakthrough Force (NN) Membrana Spessore (nm)
Fase L d 6 ± 1 4.7 &# 177; 0.5
Fase L o 8 ± 1 6 ± 1

Tabella 1: proprietà membrana DOPC: SM: Chol (2: 2: 1). SLB La fase L d ha una forza svolta di 6 ± 1 nN e uno spessore di 4,7 ± 0,5 nm. La L o ha 8 ± 1 NN e uno spessore di 6 ± 1 nm. La differenza di altezza tra le due fasi è 2 ± 1,4 nm.

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Discussion

SLB composti DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) sono formati sulla mica dopo vescicole adsorbimento e rottura indotta da cloruro di calcio. Questa composizione lipidica separato in L d e L o fasi. La fase L o si arricchisce in sfingomielina e colesterolo ed è meno fluido / più viscoso (Figura 1A) che l'L d di fase 11. La separazione di L o di fase L d manifesta come strutture circolari elevata sopra la circostante (Figura 1B, C). Le piattaforme sono gli o fasi L circondati dalle fasi L d. Difetti di membrana (o fori nella membrana) sono anche visto (Figura 1B, freccia blu) e un profilo altezza attraverso questo difetto mostra lo spessore del doppio strato. La L d / L o differenza di altezza può essere esaminata anche cercando in un profilo un'altezza AFM (Figura 1C).

La preparazione dei lipidimiscela è molto importante in quanto la composizione determina le proprietà doppio strato. Durante la preparazione del doppio strato supportato, è importante lavorare alle temperature indicate per la corretta formazione di fasi lipidiche (passo 1.4.5). Durante l'imaging, mantenendo una bassa forza è molto importante in modo da non distruggere bistrato non accumulare sporcizia sulla punta.

Dopo l'imaging AFM, regioni del SLB sono selezionati e sondate con spettroscopia di forza. Spettroscopia di forza ci permette di sondare altre proprietà della membrana, in particolare la forza rivoluzionaria (Figura 1D). The L d e L o fasi mostrano diverso forza rivoluzionaria e spessore (Figura 1E, F). Le proprietà sono riassunte in Tabella 1. Notiamo che rispetto al Chiantia et al. 11, sono stati ottenuti valori simili per forza svolta nel L d fase, ma un valore inferiore per la fase L o. Questo potrebbe essereper effetto delle minori quantità di colesterolo usato nelle nostre membrane (abbiamo usato DOPC: SM: rapporto Chol 2: 2: 1, mentre hanno usato di 1.5: 1.5: 1). Questo dimostra anche l'importanza della miscelazione giusto rapporto lipidi - un fattore critico nella riproducibilità dei risultati. Inoltre, utilizzando diversi lipidi (lunghezza della catena, e il grado di insaturazione) cambia anche le proprietà doppio strato 6,15,18.

Mentre tracciare la distribuzione delle forze rivoluzionarie è utile e può mostrare già differenze nelle proprietà doppio strato, un'ulteriore analisi della distribuzione della forza innovativa può essere utilizzata per dedurre altre proprietà meccaniche, tra cui la tensione di linea e diffusione pressione 11,17,21. Brevemente, la probabilità P (F) di misurare una certa forza svolta, F, è descritto dal modello di nucleazione continuo 11,15,17:

Equazione 1

dove A è la Resonafrequenza SNO del cantilever, K è la costante elastica del cantilever, v è la velocità di avvicinamento, Γ è la tensione di linea (l'energia bordo necessaria per mantenere un foro nella membrana aperta), R è il raggio del AFM punta, k B è la costante di Boltzmann, T è la temperatura, e S è la pressione diffusione o l'energia associata a chiudere il foro (opposto di tensione della membrana - l'energia necessaria per essere esercitata dalla membrana di aprire un foro 32). Questa equazione può essere integrata e dP / dF può essere calcolata come:

Equazione 2

A, K, R sono proprietà della AFM cantilever / suggerimento che può essere acquisita attraverso la calibrazione a sbalzo. T e v sono parametri sperimentali che deve essere mantenuta costante durante gli esperimenti. dP / dF viene poi fissata alla istogramma di acquisire la tensione di linea e la pressione diffusione. Come diversi parametri influenzano P (F), esperimentiambientalisti si consiglia di utilizzare punte simili e condizioni di acquisizione di avere valori comparabili per tensione di linea e la pressione diffusione. La contaminazione della punta AFM (i corpi estranei e non fuse vescicole sulla punta acquisita durante l'imaging) porta a risultati non riproducibili. Inoltre, la scelta del supporto influisce sulle proprietà meccaniche della membrana 20.

Un'altra tecnica che può caratterizzare le proprietà meccaniche del doppio strato lipidico è l'aspirazione micropipetta di vescicole unilamellari giganti (GUVs) 33. In questa tecnica, tensione della membrana viene calcolato dalla deformazione del GUVs durante l'aspirazione. Inoltre, aumentando l'aspirazione, si può calcolare la tensione alla quale si fessura GUV (o tensione lisi) 34, che potrebbe essere connesso alla tensione di linea nel modello continuo nucleazione. Uno svantaggio di questa tecnica è la complessità di calcolo tensione della membrana di separazione di fase membrane, come diverso phases hanno diverse caratteristiche meccaniche 35. Questo è in contrasto con spettroscopia di forza AFM, dove le singole fasi possono essere caratterizzati separatamente. Inoltre, considerando che sono necessari molti GUVs per produrre risultati statisticamente rilevanti, l'AFM può produrre una distribuzione per SLB. Tuttavia, membrana rimodellamento effetti (per esempio, tubulazione e invaginations) sono più facilmente visualizzate con GUVs, rendendoli sistemi migliori per la caratterizzazione di questi effetti forma connesse, nonché proprietà meccaniche.

In ulteriori applicazioni per studiare gli effetti delle proteine ​​di membrana sulle proprietà doppio strato, proteine ​​purificate possono essere incorporati in queste vescicole per fare proteoliposomi. Una tecnica per fare questo utilizza detergenti per aiutare le proteine ​​a stabilizzare e inserire nella membrana. Purificazione successiva tramite dialisi o formato esclusione cromatografia rimuove le proteine ​​gratuiti e detergente in soluzione 36. Un altro approccio richiede la codifica dile proteine ​​purificate (per esempio, istidina o streptavidina tag) e incorporano partner affinità per questo tag in liposomi (con acido nickel-nitriloacetic (Ni-NTA) o lipidi biotinilati).

In sintesi, abbiamo descritto un metodo per analizzare bistrati lipidici. Grazie alla sua alta risoluzione, AFM può rivelare strutture sub-micrometriche nella membrana, che comprendono le fasi di lipidi tra gli altri. Spettroscopia di forza, qui utilizzato per caratterizzare membrane lipidiche, può essere utilizzato anche su proteine ​​di membrana e altre biomolecole sulla membrana.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Max Planck Society, il tedesco Cancer Research Center, l'Università di Tubinga, e il Bundesministerium für Bildung und Forschung (concessione n. 0.312.040).

Ringraziamo Eduard Hermann per averci aiutato ad automatizzare l'analisi dei dati curva forza e il Dr. Jakob Suckale un'attenta lettura di questo manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850375P Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids, Inc. 860062P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8% Carl Roth GmbH + Co. KG 9265.1
Potassium chloride (KCl), 88% Sigma P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% AppliChem GmbH A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% Carl Roth GmbH + Co. KG 3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade AppliChem GmbH A4689
HEPES, molecular biology grade AppliChem GmbH A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness Duran Group 2355036
Punch and Die Set Precision Brand Products, Inc 40105
Optical Adhesive Norland Products, Inc. NOA 88 Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. 
Name Company Catalog Number Comments
Mica blocks NSC Mica Exports Ltd. These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease Borer Chemie AG Glisseal N
Liposome Extruder Avestin LiposoFast-Basic As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape 3M Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator Bandelin Sonorex Digitec DT-31 No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever  Bruker AFM Probes DNP-10 Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM JPK JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200

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