Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Bioengineering

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Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (101), e52867, doi:10.3791/52867 (2015).

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Abstract

Introduction

Rasterkraftmikroskopie (AFM) erzeugt ein Bild einer Oberfläche durch Abtasten über einen Bereich der Probe unter Verwendung eines Auslegers mit einer sehr scharfen Spitze 1. Die Bewegung des Auslegers tastet die Oberflächentopologie der Probe. AFM wurde weithin an biologische Moleküle aufgebracht - einschließlich Proteinen, DNA und Membranen, die aufgrund ihrer Flexibilität bei der Analyse von festen Proben in Luft oder nahezu native Zustand in flüssiger 2-5.

Abgesehen von seiner hochauflösenden Imaging-Fähigkeit im Nanometerbereich, wirkt der AFM Cantilever als Feder, um Wechselwirkungskräfte (Adhäsion und Repulsion) und mechanischen Eigenschaften der Probe 5,6 sondieren. Dies wird als Kraftspektroskopie bekannt. In diesem Modus wird zuerst nähert die Sonde die Probe und übt eine Kraft auf, dann zurückgezogen wird, bis er den Kontakt verliert mit der Probe (1A). Die erzeugten Kurven zeigen Kraft als Funktion der Entfernung des Auslegers sowohl für den AppRotauge und Einfahren. Mehrere Objekte einschließlich des Elastizitätsmoduls, die Steifigkeit eines Materials zu messen, und Adhäsionskräfte ableiten.

Unterstützte Lipid-Doppelschichten sind biologische Modellmembranen auf einem festen Träger liegend - in der Regel Glimmer, Borosilikatglas, Quarzglas, oder oxidierten Silizium 7. Sie werden mit verschiedenen Techniken wie Vesikel Abscheidung hergestellt, Langmuir-Blodgett-Verfahren und Spin-Coating 8,9. AFM verwendet wurde, um die Bildung dieser abgestützt Doppelschichten 10 zu folgen, und der Sonde unterschiedliche Strukturen von Membranen unterschiedlicher Zusammensetzungen 11-15 gebildet.

Darstellende Kraftspektroskopie auf unterstützten Doppelschichten führt zu einer Spitze in der Ansatz-Kurve. Dieser Peak zeigt die Kraft, die benötigt, um die Doppelschicht zu durchdringen, und heißt Durchbruch Kraft. Die Doppelschichtdicke kann auch über die Kraftkurve 6 gemessen werden. Die typische Durchbruchkraft von DoppelschichtenBereich zwischen 1-50 nN 6. Diese Eigenschaften hängen von Lipidpackung (flüssig oder Gelphase) und Struktur (Acylkettenlänge und Grad der Ungesättigtheit) von membranaktiven Mittel 16 verändert. Die Theorie hinter dem Bruch wurde erläutert, 17 und andere experimentelle Parameter wie Cantilever Weichheit, Spitzenradius und Annäherungsgeschwindigkeit auch die bahnbrechende Kraft 15,16,18 beeinflussen. Kraftspektroskopie wurde verwendet, um die Eigenschaften der verschiedenen Lipidphasen 11,19, Zusammensetzung abhängigen Änderungen 12,20 sowie Wirkungen anderer Biomoleküle wie Peptide zu analysieren, auf die Stabilität der Membran 21.

Die flache Orientierung unterstützt Doppelschichten ist für die Kombination von AFM mit anderen Verfahren wie Oberflächenplasmonresonanz 22 und der Fluoreszenzmikroskopie 11,19 eine bessere Charakterisierung Struktur und die Eigenschaften von Membranen vorteilhaft.

Diese ausführliche Video protocol soll unterstützten Lipiddoppelschichten bereiten Vesikel mit Abscheidung und mit AFM und Kraftspektroskopie zu analysieren. Während Vesikel in verschiedenen Größen verwendet werden, um Doppelschichten herzustellen, konzentriert sich dieses Protokoll auf kleinen und großen unilamellaren Vesikeln. Unterstützte Doppelschichten, die in flüssige Phase bestellt (L o) und flüssige ungeordneten (L d) Phasentrennung wurden 11,15 aus. 2: 1-Verhältnis die Membran aus Di-oleoyl-phosphatidylcholin (DOPC), Sphingomyelin (SM) und Cholesterin (Chol) bei 2 besteht. Diese Zusammensetzung Modelle die Lipid Rafts, die vorgeschlagen werden, um als Plattform für wichtige Proteintransport und Sortierung, Zellsignalisierung und andere zelluläre Prozesse 23,24 verhalten.

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Protocol

1. Vorbereitung der unterstützten Lipiddoppelschichten (SLB) 11,12,21

  1. Herstellung von Lipid-Mischung und Multilamellare Vesikelsuspensionen
    1. Bereiten Sie die folgenden Puffer vorher.
      1. Vorbereitung PBS-Puffer bei Konzentrationen von 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4 und 137 mM NaCl, pH 7,2.
      2. Vorbereitung SLB (unterstützte Lipiddoppelschicht) Puffer bei Konzentrationen von 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4.
      3. Es wird eine Lösung von 1 M CaCl 2.
    2. Man löst die folgenden Lipide in Chloroform in einer gewünschten Konzentration: beispielsweise Di-oleoyl-phosphatidylcholin (DOPC) bei 25 mg / ml, Sphingomyelin (SM) bei 25 mg / ml und Cholesterin (Chol) bei 10 mg / ml.
    3. Nehmen 18,38 ul DOPC 17,10 ul SM und 11,30 ul Chol, um eine Lösung mit 1 mg Gesamtlipiden in einem 2 zu machen: 2: 1 DOPC: Molverhältnis Chol: SM. Variieren die Volumina entsprechend auf der Grundlage der concentrations der in 1.1.2 hergestellten Lipide. Behält jedoch das Molverhältnis von 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol als Änderung des Molverhältnisses wird die Phaseneigenschaften der Membran 25 zu ändern.
    4. Mischen Sie die Lösung vollständig durch Vortexen. Hinzufügen eines fluoreszierenden lipidischen Farbstoff bei 0,05 Mol-%, wenn man die Doppelschicht mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen wünscht.
      Hinweis: Die Familie von langkettigen dialkylcarbocyanines, mochte, DiI und DiO umfassen einen weiten Bereich von Wellenlängen und können idealerweise verwendet werden, um Lipidmembranen zu markieren. Alternativ können fluoreszenzmarkierten Lipiden, wie Rhodamin- Phosphatidylethanolamin oder BODIPY-Cholesterin verwendet werden. In jedem Fall sollte die Konzentration des Farbstoffs gemäß der Mikroskopie Einstellung optimiert werden, wenn man bedenkt, dass hohe Konzentrationen des Fluorophors an das Lipid gebunden ist, kann die Lipid Verhalten 19 zu ändern.
    5. Trocknen Sie das Chloroform unter Verwendung von N2-Gas (oder einen beliebigen verfügbaren Inertgas wie Ar und He).
    6. Weitere dry-Ter Lipidgemisch unter Vakuum für mindestens 1 Std.
      Hinweis: Wenn das Speichern dieser Lipidmischung, Spülluft mit Inertgas (N 2, Ar oder He) und bei -20 ° C. Aliquot überschüssige Lipide-in-Chloroform in kleine braune Fläschchen. Trocknen Sie sie in einer ähnlichen Weise wie die Lipid-Mischung, verdrängen Luft mit Inertgas (N 2, Ar oder He) und bei -20 ° C.
    7. Auflösung der getrockneten Lipide in einem PBS-Puffer auf eine Konzentration von 10 mg / ml.
    8. Wirbel die Mischung kräftig für etwa 20 sec bis 1 min, um eine trübe Suspension zu erhalten, mit einem multilamellaren Vesikeln. Stellen Sie sicher, dass die keine Lipidfilmen Festhalten an den Seiten des Fläschchens.
    9. Verteilen Sie diese Suspension in 10 ul Aliquots (1 mg Lipid macht 10 Teilmengen).
    10. Lagerung bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung.
  2. Herstellung unilamellare Vesikel
    Anmerkung: Verschiedene Größen von unilamellare Vesikel können mit dem Beschallungsverfahren oder dem Extrusionsverfahren hergestellt werden. Beschallung verwendet sound Energie, um das Gemisch zu rühren und trenne die Schichten des multilamellaren Suspension. Dies wird durch Bereinigung der trübe Suspension angezeigt. Extrusion zwingt die multilamellaren Vesikeln, um durch einen Membranfilter mit einer bestimmten Porengröße bestehen.
    1. Beschallungsverfahren
      1. Nehmen Sie die 10 ul multilamellaren Lipidsuspensionen und fügen Sie 150 ul SLB-Puffer.
      2. Übertragen Sie die Mischung in kleine (2 ml) bedeckten Glasfläschchen und Dichtung mit Parafilm.
      3. Beschallen des Gemisches bei Raumtemperatur in einem Ultraschallbad für 10 min oder bis sie klar wird, kleine unilamellare Vesikel (SUVs mit einem Durchmesser unter 50 nm) zu erhalten.
    2. Extrusionsverfahren
      1. Nehmen Sie die 10 ul multilamellaren Lipidsuspensionen und fügen Sie 150 ul SLB-Puffer.
      2. Übertragung der Suspension in einen kryogenen Röhre.
      3. Einfrieren der Lipidsuspension durch Eintauchen des kryogenen Schlauch für ein paar Sekunden in flüssigen Stickstoff.
      4. AuftauenLipidsuspension durch Eintauchen des kryogenen Rohr in einem Wasserbad bei Raumtemperatur oder 37 ° C für ein paar Minuten. Wiederholen Sie die Frost-Tau-Stufen mindestens 10-mal.
      5. Um die Lipidsuspension zu extrudieren, mit einem Polycarbonatmembran mit 200 nm Porengrße (andere Porengrößen sind verfügbar, wie 100 nm oder 400 nm) und einem kommerziellen Extrusionsvorrichtung 26.
        Hinweis: Zur Zeit gibt es zwei Extruder Geräte im Handel erhältlich: ein Handbuch Extruder ist für kleine Volumen (200 ul auf wenige ml) erhältlich. In diesem Fall wird die Probe durch die Membran durch manuelles Schieben der Suspension hin und her zwischen zwei Spritzen extrudiert. Je nach Hersteller, würde Lipid Aliquots müssen kombiniert werden, um Mindestvolumen von der Einrichtung zu erreichen. Für größere Mengen (bis zu 50 ml) ausgefeiltere Vorrichtungen verwendet werden, in dem die Suspension durch die Polycarbonat-Membran mit Hilfe von Druckgas gepresst. Aufbau und Extrusionsbedingungen können entsprechend der mod ändernel. Beachten Sie die Hinweise des Herstellers beachten. Dieses Protokoll bezieht sich auf die manuell bedienbarer Extruder für kleine Volumina.
      6. Ins Gleichgewicht des Extruders in Wasser, indem Wasser durch den Extruder. Tauchen Sie die Membran in Wasser.
      7. Platzieren der Membran zwischen den beiden Kolben, montieren die Vorrichtung und im Gleichgewicht belassen, Puffer, indem man den Puffer durch den Extruder von einer Spritze zur anderen. Zusätzlich ermöglicht dieser Schritt die Prüfung der Undichtheit des Systems. Wenn sie undicht ist, zerlegen und wieder zusammenbauen es wieder Veränderung der Membran.
      8. Nehmen Sie die Lipidsuspension mit Hilfe einer Spritze des Extruders ("Schmutzseite").
      9. Befestigen Sie die Spritze mit der Lipidsuspension auf einen Kammer und die leere Spritze auf der gegenüberliegenden Kammer.
      10. Schieben Sie die Spritze an einem Ende. Übergeben Sie die Lösung durch die Membran und in das gegenüberliegende Spritze. Dies ist der 1. Pass ab.
      11. Führt es durch die Membran für eine Gesamtzahl von 31 mal solchendaß die Lösung endet an der gegenüberliegenden Spritze ("saubere Seite").
        Hinweis: Prüfen Sie die Membran nach dem Extrudieren. Wenn es war gebrochen, dann Extrusionsverfahren war nicht erfolgreich und muss wiederholt werden.
      12. Leeren Sie die Spritze in einem Röhrchen. Große unilamellare Vesikel (LUVs) sind für 1-2 Tage stabil, wenn sie bei 4 ° C gehalten.
  3. Herstellung von Mica und Deckgläser
    1. Waschdeckgläschen erst in Wasser und dann in Ethanol. Luftgetrocknet.
    2. Nehmen Glimmerscheiben und ziehen Sie die äußere Schicht mit Klebeband.
    3. Befestigen Sie die Glimmerscheibe auf dem Deckglas. Transparente optische Klebstoffe sind optimal, so dass man die Doppelschichten mit einem Fluoreszenzmikroskop überprüfen.
    4. Bringen Kunststoffzylinder (2,5 cm Außendurchmesser, 2 cm Innendurchmesser und 0,5 cm Höhe) mit optischen Kleber / Fett. Stellen Sie sicher, dass alles dicht ist und keine Lecks vorhanden sind. Verwenden Sie Fett zu wollen, wenn Wiederverwendung der Zylinder, da sie leicht von th abgelöst werdene Deck und gewaschen. Wobei die Abmessungen der Kunststoffzylinder, abhängig von der Größe des AFM Cantileverhalter und sollte entsprechend eingestellt werden.
  4. Ablagerung von unilamellare Vesikel auf einem festen Träger
    1. Pipette das gesamte Liposomenlösung direkt auf den Glimmer. Noch ein SLB Puffer auf ein Volumen von 300 & mgr; l zu erreichen.
    2. Add 0,9 ul 1 M Calciumchlorid-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 3 mM Ca 2+ erreichen.
    3. Inkubieren bei 37 ° C für 2 min und dann bei 65 ° C für mindestens 10 min. Immer decken die Doppelschichten mit Puffer. Kontakt mit Luft und Luftblasen zu zerstören. Während der Inkubation fügen weitere Puffer, wenn notwendig, insbesondere, wenn die Inkubation bei höheren Temperaturen.
      Anmerkung: Die Inkubationstemperaturen je nach den Lipidmischungen und Phasen erforderlich. Inkubationszeit von mindestens 10 min erforderlich ist, um getragen Doppelschichten zu bilden, aber es länger sein könnte, abhängig von der Temperatur und Zusammensetzung.
    4. Wäschedie Doppelschicht mit heißem (65 ° C) SLB Puffer 15-20 mal Calcium und nichtkondensierten Vesikeln zu entfernen. Seien Sie besonders vorsichtig während der Waschschritte, um die Doppelschicht unter Puffer zu halten und vorsichtig pipettieren der Waschlösung zu verhindern die Zerstörung der Doppelschicht.
    5. Coole unterstützt Doppelschichten auf Raumtemperatur vor AFM-Messungen. Dies ist erforderlich, um die unterschiedlichen Phasen der Membran sowie bilden Minimierung thermischer Drift im Gerät.

2. Rasterkraftmikroskopie-Messungen 11,12

  1. Imaging
    Hinweis: Führen Sie die Rasterkraftmikroskopie-Bildgebung im Kontaktmodus oder Tapping-Modus. Bild unterstützt Doppelschichten in Lösung; erlauben keine Lösung vollständig verdampfen, da dies die Doppelschichten zu zerstören. Wie man es mit einem Puffer zu arbeiten, beachten Sie bitte Vorsichtsmaßnahmen, dafür zu sorgen, dass jeder AFM Teil von Flüssigkeiten geschützt.
    1. Wählen Sie ein weiches Ausleger (unter 0,2 N / m Federkonstante wird empfohlen) und montieren Sie ihn auf ter AFM. Die Wahl des Auslegersteifigkeit für die Kraftspektroskopie kritischer (und dies wird später diskutiert werden).
    2. Montieren Sie die Probe auf der Bühne AFM und stellen Sie sicher, dass alle Schwingungsisolationsmodule eingeschaltet sind. Wartezeit von mindestens 15 min äquilibrieren und verringern die thermische Drift des Systems. In Abhängigkeit von der AFM-Set-up kann Tuning und Imaging-Spezifikationen variieren. Wenden Handbuch des Herstellers.
    3. Nähern Sie sich der Probe mit der AFM-Spitze bis zum Kontakt.
    4. Da Lipiddoppelschichten sind in der Regel 4 nm in der Höhe, verwenden die Z-Bereich des Instruments, die den höchsten z-Auflösung (beispielsweise 1,5 um) erhalten wird.
    5. Wählen Sie eine Region, die dem Bild. Um einen Überblick über die Lipiddoppelschicht, eine 50 & mgr; m × 50 & mgr; m oder 25 & mgr; m × 25 & mgr; m-Region wird ein guter Ausgangspunkt, um sein Bild zu bekommen. Wenn kleinere Features erscheinen, kann man Bild in kleinere Bereiche (10 & mgr; m × 10 & mgr; m oder 2 um x 2 um). Die Wahl der Abbildungsbereich hängt auch von der Arbeits range des piezoelektrischen Scanner. Bitte konsultieren Sie die Instrumentenhand dafür.
    6. Als Doppelschichten sind sehr zerbrechlich, den Sollwert der AFM-Spitze einstellen während der Bilderzeugung, die Kraft bei minimalem und richtig für thermische Drift zu halten, dabei ständig in Kontakt mit der Probe. Im Kontaktmodus, den Sollwert zu minimieren. Im Tipp-Betrieb, den Sollwert zu maximieren.
    7. Prozessbilder durch Anbringen jeder Scanlinie zu Polynom Ausgleichsfunktionen. Führen Linienentfernung für Scans, die Kontakt mit der Membran unter Verwendung der proprietären Software der AFM-Produktionsunternehmen zu verlieren.
  2. Kraftspektroskopie
    1. Kalibrieren des Auslegers entsprechend den Anweisungen nach dem Protokoll des Herstellers. Kalibrierung ermöglicht die Umwandlung des elektrischen Signals der Photodioden, um eine Kraft (1B).
      1. Kalibrieren Sie die Empfindlichkeit der Spitze zur Ablenkung als z-Piezo-Bewegung (in Längeneinheiten) zu messen, anstatt elektrische Signal in Volt.
      2. Berechnung des Auslegerfederkonstante mit dem thermischen Rauschfrequenzverfahren, in der Regel in der AFM-Software integriert. Bei diesem Verfahren zeigen die Amplitude der Schwingung von Rauschen mit Bezug auf die Frequenz der Schwingung, wodurch eine spektrale Leistungsdichteverteilung. Dieses Grundstück wird eine Spitze um die Resonanzfrequenz zu zeigen. Die Frequenz, bei der die Amplitude idas Größte ist die Resonanzfrequenz. Setzen Sie eine Lorentz-Funktion rund um den Gipfel zu berechnen automatisch die Federkonstante durch die Software. Hier werden einige nützliche Ressourcen für die Theorie des thermischen Rauschens Verfahrens sind in den Artikeln 27 bis 30 angegeben.
    2. Nach der Bebilderung eine Fläche von der Doppelschicht, wählen Sie eine 5 um x 5 um-Bereich in der Doppelschicht auf Kraftspektroskopie durchzuführen.
    3. Einrichten des AFM so, dass es Kraftkurven in einem 16 x 16 Raster von der Region. Dies führt zu 256 Kraftkurven pro Region. Der Raum zwischen zwei benachbarten Punkten sollte ausreichen, um zu vermeiden, dass die Membranfläche von einem Punkt untersucht würde mit dem nächsten Punkt übereinstimmt. Dies ist abhängig von der Spitzenradius. A 100 nm Abstand zwischen zwei Punkten wäre ideal. Teilen Sie die 5 & mgr; m × 5 & mgr; m Bereich in 16 x 16 Gitter. Abhängig von der Größe der Phasen kann man einen kleineren oder größeren Bereich auszuwählen, und dann entsprechend an die Rastergröße.
    4. Stellen Sie z-Piezoverschiebung zu400 nm. Dies bestimmt die maximale Reichweite der Bewegung des z-piezo. Sie sollte groß genug sein, um sicherzustellen, dass der Ausleger vollständig weg von der Probe in zwischen den Messungen eingefahren werden.
    5. Stellen Annäherungsgeschwindigkeit bis 800 nm / sec und zurückzuziehen Geschwindigkeit bis 200 nm / sec. Verwenden Sie eine Annäherungsgeschwindigkeit von 400 bis 6000 nm / s in Abhängigkeit von der Doppelschichtzusammensetzung und Lipidphase zu unter 6,16 werden.
    6. Nach dem Einstellen aller Parameter, erwerben Kraftkurven, durch Drücken der Taste "RUN" der AFM-Software.
    7. Sparen Kraftkurven als Kraft-Höhenkurven (ein Maß der z-Piezo-Bewegung). Dies berücksichtigt nicht die Biegung des Auslegers in Kontakt mit der Probe zu nehmen. Während der Datenverarbeitungsschritt, kann der AFM-Software-Korrektur für Auslegerbiege zu Kraft-Spitze und Probe-Kurven (Abbildung 1c), die richtigen Werte für die Doppelschichtdicke zu geben erhalten. Die Korrekturwerte werden in der Regel im calibr eingeation, die mit jedem Kraftkurve gespeichert wird. Berechnen Spitze und Probe durch Subtrahieren der vertikalen Ablenkung vom piezoBewegung an einem gegebenen Punkt.
      Anmerkung: Der Peak in der Annäherungskraft-Kurve (der Kraftwert sinkt, auch wenn die Auslegerbewegung noch auf dem Ansatz-Zyklus) ist die Bruchkraft der Membran, während die Differenz zwischen der Position der Spitze und der Position des Punktes wo die Kraft zu steigen beginnt wieder stellt die Dicke der Membran.
    8. Erwerben Sie mindestens 500 Kraftkurven für jede Bedingung, um gute Statistiken zu erhalten. Zeichnen Sie ein Histogramm der Werte mit Programmen wie Origin oder MatLab, und passen Sie die Histogramme zu einer Gauß-Verteilung, um die Spitze und Breite der Verteilung zu erhalten.

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Representative Results

Unterstützte Lipid-Doppelschichten von DOPC zusammengesetzt: SM: Chol (2: 2: 1) wurden in AFM abgebildet (Abbildung 2 AC). Aufgrund der Lipidzusammensetzung wurden SM / Chol reiche L o und DOPC reiche L d Phasen beobachtet. Das Höhenprofil der AFM-Bildgebung kann wichtige Informationen über die Membranstruktur zu schaffen. Indem man die Höhenprofils kann die Dicke der Doppelschicht in Anwesenheit von Defekten in der Membran (2B), oder die Differenz in der Höhe zwischen den L o / L d-Phasen gemessen werden, bereitgestellt werden. Darüber hinaus ermöglicht AFM speziell ausgewählten Regionen, die diese Phasen und ihre mechanischen Eigenschaften unter Verwendung von Kraftspektroskopie (Abbildung 2 D - F) zu analysieren. Die Kraftkurven aus der Kraftspektroskopie-Modus abgeleitet werden verwendet, um die bahnbrechende Kraft, die von der Suche nach der Kraftwert auf dem Höhepunkt der Kraftkurve (2D und E) zu messen, und die membrane Dicke durch Subtrahieren der Abstandswert von dem Spitzenwert des Kraftverlaufes auf den Distanzwert, wenn der Kraftverlauf wieder zu steigen beginnt (2D und F).

Die Sensitivität der AFM-Messungen ist abhängig von piezoelektrischem Material und elektronische Rückkopplungsschleifen. Als solcher, bevor Sie Experimente, ist wichtig, um sich mit der AFM einrichten vertraut. Es gibt zwei übliche Instrument für die piezoelektrische Materialien ein: (1) Rollenscanner, bei dem die Probe auf die Oberseite des piezoelektrischen Materials auf einer unbeweglichen Spitze aufgesetzt und die Probe abgetastet wird; oder (2) Biegeabschnitt, in dem die Spitze auf dem piezoelektrischen Material anstelle der Probe angebracht ist. Im letzteren Fall werden die piezoelektrischen Material und andere Elektronik vor Verschmutzungen geschützt. Eine Menge von AFM Modelle für biologische Anwendungen haben diese Konfiguration.

Während der Bilderzeugung kann die AFM-Spitze mit der Probe zu verlieren und zu mir fehlerhaftasurements. Je nachdem wie viele Abtastungen verloren gegangen sind, kann das Bild durch Entfernen der Abtastzeilen und mit einem mittleren Intensitätsfilter, um die neuen Werte von Umgebung (3) abzuleiten korrigiert werden. Doch in den meisten Fällen bedeutet dies nicht, ergeben ein gutes Bild und es wird empfohlen, einfach zu verwerfen, das Bild. Es gibt andere Artefakte, die überwacht werden müssen. Diese ergeben sich aus stumpf / beschädigt / verschmutzt Tipps sowie die Beugung des Laserpunkt hinter dem Ausleger 31. In diesen Fällen sollten die Bilder entfernen, und die AFM-Spitze ersetzt werden sollte.

Während der Kraftspektroskopie-Messungen können mehrere Herausforderungen ergeben: (1) Fehlen von Peaks (4A), (2) Vorhandensein von Schultern statt wohldefinierte Peaks (4B), (3) ein kleiner Anstieg und anschließende Plateaubildung bei sehr niedrigen Kräfte (4C - D). Die Abwesenheit eines Peaks zum Messen in einem Bereich ohne bil zurückzuführenayer oder Aufnahmebedingungen nicht optimiert. Es wird empfohlen, ein AFM-Bild ist, bevor Sie Kraftspektroskopie, um sicherzustellen, dass der Doppelschicht ist in der Tat, die gemessen erworben. Erwerbsbedingungen sowie tip / Cantilever Spezifikationen Einfluss auf die Wahrscheinlichkeit, dass ein Durchbruch Ereignis 17. Eine schärfere Spitze kann leicht durchstechen eine Doppelschicht als solche kann die bahnbrechende Kraft erscheinen gering oder gar nicht angezeigt, da es unter den Rauschpegel ist. . Die Erhöhung der Annäherungsgeschwindigkeit erhöht auch die bahnbrechende Kraft 16. Da die Doppelschicht durch die Spitze gedrückt wird, die Lipidmoleküle reagieren auch auf diese Kraft zu zerstreuen. Bei einer niedrigeren Annäherungsgeschwindigkeit weist die Lipiddoppelschicht genügend Zeit, um vor dem nächsten Schritt in Kraft zu äquilibrieren, und dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass ein Durchbruch Falle passieren kann. Bei einer höheren Annäherungsgeschwindigkeit die Kraft Rampen schneller als die Reaktion der Lipide und als solche ist die Wahrscheinlichkeit eines Durchbruchs Falle niedriger bei der gleichen Kraft. Es ist possIVK, dass durch die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Ansatz, der Sollwert vor den Doppelschicht bricht, was zu keinen beobachtbaren Peaks erreicht wird. Es gibt keine Berichte, um das Auftreten von Schultern auf der Kurve zu erklären, aber wir postulieren, dass es aufgrund der Materialverdichtung vor dem Durchbruch sein könnte. Ferner kann ein Plateau oder breite Peaks bei sehr geringen Kräften auf das Vorhandensein von Schmutz oder lose Lipidmaterial in der Spitze. Spitzen können Schmutz und Lipidmaterial in der Spanne von mehreren Messungen akkumulieren. Schmutz und Material an der Spitze befestigt macht es stumpf, wodurch die Durchbruchkraft erhöht.

Es wird empfohlen, Kraftkurven sind in verschiedenen Bereichen erworben werden, wenn diese Herausforderungen entstehen. Eine zweite Empfehlung ist es, Tipps zu ändern (dies wird eine Neukalibrierung erforderlich). Schließlich muss die Anströmgeschwindigkeit auf eingestellt werden, oder die Verwendung einer Spitze mit unterschiedlichen Spezifikationen (Spitzenradius und Steifigkeit) in Betracht gezogen werden. Der Durchbruch Kraft variiert zwischen 0-50 nN 6, als solche, ter Federkonstante des Cantilevers in dem Bereich von 0,05-0,7 N / m sein. Die meisten kommerziellen Ausleger haben eine Nennspitzenradius um 20-40 nm. Anstelle der Verwendung von herkömmlichen Tipps, könnte spitzenlose Cantilever auch gekauft werden und Sphären bekanntem Radius (die in der Regel in monodisperse Größenverteilung) konnte mit ihnen verbunden werden. Um reproduzierbare Daten zu erhalten, verwenden Sie immer die gleichen Aufnahmebedingungen und Ausleger für den gleichen Satz von Experimenten.

Abbildung 1
Abbildung 1: Grundlagen der Kraftspektroskopie (A) Reihenfolge der Ansatz-Zurückziehen des Auslegers aus der Probe.. Die rote Linie zeigt den Cantilever Auslenkung aus der Gleichgewichtslage (schwarze Linie). (B) Cantilever Kalibrierung wandelt elektrische Signal (in Volt) bis (in Newton) zu erzwingen. Durch Aufnahme des Auslegers Sensivität und Federkonstante der Vertikalablenkung (in Volt) in Abstand und der Abstand in Kraft mit Hookeschen Gesetz umgewandelt. (C) Bei Kontakt in Kraftspektroskopie-Messungen, ist z-Piezo-Scanbewegung nicht berücksichtigt, den Cantilever zu verbiegen. Eine Korrektur kann durch Subtrahieren der vertikalen Ablenkung, x (in Längeneinheiten) von der z-Piezobewegung durchgeführt, z (auch in Längeneinheiten). Auf diese Weise bleibt der Spitze und Probe, anstatt einfach z-Piezobewegung kann gemeldet werden, was eine genauere Messung der Abstände ist und um die Dicke der Probe zu messen wichtig.

Figur 2
Abb. 2: AFM von SLBs (A) Schematische Darstellung SLBs von DOPC zusammengesetzt: SM: Chol (2: 2: 1) getrennt in Flüssigkeit ungeordnet (L d) und flüssige bestellt (L o) Phasen. (B (C) entspricht dem gelben Quadrat in B (10 & mgr; m × 10 & mgr; m). L o und L d Phasen sind gekennzeichnet. Das Linienprofil unten entspricht der gelben Linie im Bild. Die L o Phase erscheint 1-2 nm höher ist als die L d Phase. (D) Eine Probe Kraftkurve zeigt, wie die bahnbrechende Kraft und Membrandicke abgeleitet werden. (E) Bruchkraft und (F) Membrandicke Verteilung für L d und L O-Phasen mit Gaußschen Anpassung für die Quantifizierung.

Figur 3
Abbildung 3: Kontaktverlust während der Bilderzeugung führt zu. Scanlinien, die nicht zum Rest des Bildes entsprechen, ist ein unterstützter Doppelschicht aus DOPC zusammengesetzt: SM: Chol (2: 2: 1) mit Kontaktverlust in einigen Linien-Scans. Maßstabsleiste 2 um.

Figur 4
Abb. 4: Herausforderungen bei der Kraftspektroskopie (A) Einige Kraftkurven haben keine Spitzen. (B) Die Kurve kann Schultern statt wohldefinierte Peaks. (C) Nach einer geringen Zunahme ein Plateau kann in Abwesenheit des Peaks auftritt. (D) Aussehen eines Plateaus zusammen mit einem gut definierten Peaks.

Membranbereich Durchbruch Force (nN) Membrandicke (nm)
L d Phase 6 ± 1 4.7 &# 177; 0,5
L o Phase 8 ± 1 6 ± 1

Tabelle 1: Eigenschaften der Membran DOPC: SM: Chol (2: 2: 1). SLBs Die L d Phase eine bahnbrechende Kraft von 6 ± 1 nN und einer Dicke von 4,7 ± 0,5 nm. Die L o hat 8 ± 1 nN und eine Dicke von 6 ± 1 nm. Der Höhenunterschied zwischen den beiden Phasen 2 ± 1,4 nm.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850375P Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids, Inc. 860062P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8% Carl Roth GmbH + Co. KG 9265.1
Potassium chloride (KCl), 88% Sigma P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% AppliChem GmbH A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% Carl Roth GmbH + Co. KG 3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade AppliChem GmbH A4689
HEPES, molecular biology grade AppliChem GmbH A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness Duran Group 2355036
Punch and Die Set Precision Brand Products, Inc 40105
Optical Adhesive Norland Products, Inc. NOA 88 Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. 
Name Company Catalog Number Comments
Mica blocks NSC Mica Exports Ltd. These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease Borer Chemie AG Glisseal N
Liposome Extruder Avestin LiposoFast-Basic As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape 3M Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator Bandelin Sonorex Digitec DT-31 No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever  Bruker AFM Probes DNP-10 Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM JPK JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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