الاستنساخ واسع النطاق إنتاج ذات قدرة عالية ناقلات الفيروسة الغدانية استنادا إلى نوع اتش 5 الإنسان

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ehrke-Schulz, E., Zhang, W., Schiwon, M., Bergmann, T., Solanki, M., Liu, J., Boehme, P., Leitner, T., Ehrhardt, A. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (107), e52894, doi:10.3791/52894 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

للتطبيقات العلاجية الجين هو من أهمية كبيرة لتجنب الآثار الجانبية السامة للخلايا المناعية والناجمة عن التعبير عن البروتينات الفيروسية، والتحوير نفسه أو من البروتينات الفيروسية واردة. وتستخدم على نطاق واسع ناقلات اتش (ADV) لإدخال DNA الأجانب إلى مجموعة واسعة من الخلايا للتحقيق في تأثير التعبير التحوير 1،2. ويمثل النسخة الأكثر تقدما من ADV بواسطة ناقلات اتش قدرة عالية (HCAdV) تفتقر إلى كل تسلسل الترميز الفيروسية 3،4 وبالتالي يوفر سعة التعبئة والتغليف تصل إلى 35 كيلو بايت جنبا إلى جنب مع انخفاض المناعة وانخفاض السمية 5-8. ونظرا لقدرة عالية عبواتها أنها تسمح إيصال الجينات المحورة كبيرة أو متعددة باستخدام جرعة ناقلات واحدة. وبالتالي، فإنها تمثل أداة قيمة لمجتمع البحث.

وعلى النقيض من الأولى أو الجيل الثاني من ADV تفتقر إلى الجينات الأولى E1 و / أو E3 التي يمكن إنتاجها بسهولة باستخدام مجموعات تجارية، مركزناتور بناء جينوم الفيروس وإنتاج HCAdV أكثر تعقيدا. ويستند هذا النظام لبناء الجينوم HCAdV على pAdFTC البلازميد يحمل الجينوم HCAdV خال من كل تسلسل الترميز الفيروسية والبلازميد المكوك pHM5 12/09. يمكن استنساخ أي جين من فائدة تصل إلى 14 كيلو قواعد (كيلوبايت) في pHM5 ناقلات المكوك الذي يحيط موقع استنساخ متعددة من خلال الاعتراف / الشق المواقع من endonucleases صاروخ موجه PI- SCE الأول وI- سيو I. ولذلك، فإن الجينات المستنسخة من الفائدة يمكن أن تنطلق من PI- التوالي SCE الأول وI- سيو I يساعد على هضم للالإدراج الموجهة لاحق في نفس المواقع قيود الموجودة في الجينوم HCAdV الواردة في pAdFTC البلازميد. في pAdFTC ويحيط الموقع التحوير الإدراج تقع بين PI- SCE الأول وI- سيو I انشقاق المواقع عن طريق ستوفير DNA وتسلسل الفيروسة الغدانية غير المكودة اللازمة لتغليف الجينوم تلك يكرر الطرفية كما 5 'و 3' مقلوب (وائح الاتصالات الدولية)عند كلا الطرفين وإشارة التعبئة والتغليف المصب من 5'ITR. يوفر DNA ستوفير إضافي الحجم الأمثل للجينوم HCAdV النهائي تتراوح 27-36 كيلوبايت التعبئة والتغليف لضمان كفاءة خلال إنتاج الفيروس. منذ pAdFTC هو البلازميد كبير مع ما يصل إلى 45 كيلو بايت (تعتمد على حجم التحوير إدخالها) واستخدام endonucleases صاروخ موجه مع المواقع الاعتراف DNA طويلة مماثل في المعارض DNA قوية ملزمة، هي عدة خطوات تنظيف اللازمة أثناء نقل التحوير من pHM5 لpAdFTC. ويوصى معالجة متأنية تجنب قوى القص.

ويحيط وائح الاتصالات الدولية من الجينوم HCAdV بواسطة Not I انزيم تقييد المواقع الاعتراف يقع مباشرة من المنبع والمصب 5'ITR من 3'ITR 12. ولذلك، HCAdV يمكن أن تنطلق من ليس أنا هضم لترنسفكأيشن لاحق من الجينوم الفيروسي في خط الخلية المنتجة HCAdV. لاحظ أن استخدام انزيم التقييد ليس أنا ليختلطسهولة الجينوم الفيروسي من pAdFTC البلازميد يعني أن التحوير إدراج يخلو من المواقع الاعتراف ليس أنا DNA. الخلايا المنتجة خلية HEK293 أساس (116 الخلايا) التعبير عن مستقر لجنة المساواة العرقية recombinase. لتضخيم فيروس يشترك في إصابة-116 الخلايا مع فيروس المساعد (HV) توفير جميع الجينات ADV حاجة لتكرارها والتعبئة والتغليف في غير المشبعة 3،4. وHV هو الجيل الأول ADV مع إشارة التعبئة floxed التي يتم إزالتها خلال تضخيم الفيروس عن طريق لجنة المساواة العرقية recombinase أعرب في 116 الخلايا 4. هذا يضمن أن الجينوم في الغالب HCAdV تحتوي على إشارة التعبئة والتغليف سليمة وencapsidated.

يتم تنفيذ ما قبل التضخيم للHCAdV عن طريق إجراء الخطوات الركض المسلسل في 116 الخلايا المزروعة على الأسطح في أطباق زراعة الأنسجة. بعد كل مرور يتم الافراج الجسيمات الفيروسية من الخلايا المصابة عن طريق إجراء ثلاث خطوات تجميد أذاب متتالية. مع كل مرور أعداد متزايدة من الخلايا المصابة1/3 من المحللة خلية من مرور السابق. أخيرا المحللة من يستخدم الخطوة ما قبل الأخيرة لتضخيم تصيب الخلايا المنتجة تزرع في تعليق في قارورة الدوار لتضخيم نطاق واسع. يتم تنقيته Virions من الخلايا التعليق من أداء تنبيذ فائق في السيزيوم كلوريد التدرج الكثافة 4،12. مع هذا الإجراء يتم فصل الجزيئات والجسيمات فارغة تجميعها بشكل كامل إلى شريطين متميزة. لزيادة تركيز الجسيمات HCAdV يتم تنفيذ خطوة تنبيذ فائق غير تدريجية الثانية. وفي وقت لاحق مما أدى الفرقة التي تحتوي على HCAdV يتم جمعها ومدال ضد عازلة الفسيولوجية. تتميز الاستعدادات ناقلات النهائية فيما يتعلق أعداد الجسيمات الفيروسية المطلقة، والجسيمات المعدية ومستويات التلوث HV. يمكن تحديد الجزيئات الفيروسية المطلقة من قبل الناشر الجسيمات الفيروسية وقياس الامتصاصية في 260 نانومتر أو عن طريق أداء الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR) 12. العدوى من بوريمكن تحديد ified جزيئات الفيروس عن طريق QPCR قياس الجينوم HCAdV موجودة داخل الخلايا المصابة 3 ساعة بعد العدوى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. البناء المؤتلف HCAdV خريطة جينوم بناء على البلازميد pAdFTC

ملاحظة: تم وصف جميع البلازميدات سابقا 11،12 ومتاحة عند الطلب. يظهر الإجراء الاستنساخ تخطيطي في الشكل 1.

  1. استنساخ الجينات في المصالح (الحكومة الإسرائيلية) بما في ذلك المروج وتذييل بعديد الأدينيلات إشارة (PA) في المكوك البلازميد pHM5، وذلك باستخدام استراتيجية استنساخ الاختيار، لتوليد pHM5-العراقية.
    ملاحظة: منذ pAdFTC هو البلازميد كبير نسبيا، ينصح بروتوكولات إعداد البلازميد الكلاسيكية لتجنب ثائقية من DNA البلازميد باستخدام مجموعات تنقية البلازميد التجارية التي تعتمد على الأغشية السيليكا. I- سيو الأول وPI -Sce I تربط بقوة على الحمض النووي وتغيير التنقل الكهربي من الحمض النووي هضمها. لذلك، لا بد من استخراج الفينول كلوروفورم وETOH هطول الأمطار (الخطوة 1.3) قبل الاغاروز الكهربائي للهلام.
  2. ملخص 20 ميكروغرام من حركة صحة الشعوب5-العراقية و 10 ميكروغرام من pAdFTC التي كتبها I-CeuI (10 U) لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية في إجمالي حجم 100 ميكرولتر لخطي البلازميدات (~ 2.8 كيلوبايت + تسلسل الحكومة الإسرائيلية ORF و ~ 31KB، على التوالي).
  3. تنقية البلازميدات خطي باستخدام استخراج الفينول كلوروفورم تليها الإيثانول (ETOH) هطول الأمطار 13.
    1. إضافة 100 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي وتخلط بلطف بواسطة قلب الأنبوب عدة مرات. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 15000 ز س.
    2. طاف لنقل أنبوب جديد، إضافة 20 ميكرولتر من خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5، 3 M) و 400 ميكرولتر من الجليد الباردة ETOH (99.8٪) وتخلط تعليق بقوة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 15000 ز س.
    3. إزالة طاف، إضافة 300 ميكرولتر من 70٪ ETOH وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 15000 ز س. ثم إزالة طاف وDNA بيليه الهواء الجاف. حل بيليه في 10- 20 ميكرولتر من 2 درهم O. هل بيليه DNA يست جافة فترة طويلة جدا، كما أنه سيكون من الصعب للحصول على الحمض النووي في حل.
  4. ملخص I-سيو I -digested pHM5-العراقية وpAdFTC البلازميد من الخطوة 1.3) لا يقل عن 3 ساعة أو O / N مع انزيم التقييد PI -Sce I (10 U) عند 37 درجة مئوية في إجمالي حجم 50 ميكرولتر وبعد ذلك تنقية I -CeuI وPI -Sce I هضمها البلازميدات استخدام استخراج الفينول كلوروفورم تليها ETOH هطول الأمطار (راجع الخطوة 1.3). حل الحمض النووي في 20 ميكرولتر من نوكلياز درهم مجانا 2 O.
  5. منفصل pHM5 البلازميد العمود الفقري (2.8 كيلوبايت) والحكومة العراقية (من الخطوة 1.4) على هلام الاغاروز إعدادي وهلام تنقية الحكومة العراقية باستخدام gel- التجارية وPCR- عدة التنظيف. ويرد جل الاغاروز التمثيلي للهضم في الشكل 2A.
  6. Dephosphorylate I- سيو I وPI -Sce I-هضمها pAdFTC (من الخطوة 1.4) مع العجل المعوية الفوسفاتيز القلوية CIP (10 U) لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية في إجمالي حجم 25 ميكرولتر وتنقية dephosphorylated البلازميد pAdFTC عن طريق استخراج الفينول كلوروفورم وETOH لاحقا العلاقات العامةecipitation (الخطوة 1.3). أزل الحمض النووي في 20 ميكرولتر من نوكلياز درهم مجانا 2 O.
  7. أداء التحليل الكهربائي للهلام من قسامة من البلازميد dephosphorylated pAdFTC (من الخطوة 1.6) والمطهرون الحكومة الإسرائيلية-جزء (من الخطوة 1.5) لتحليل ما إذا كان هضم كاملة وأحجام شظايا المتوقع صحيحة (~ 31 كيلو بايت لpAdFTC خطي ).
    ملاحظة: حجم الحكومة العراقية هو متغير تبعا لحجم الكاسيت التعبير التحوير. تقدير تركيزات النسبية لأجزاء منها لربط لاحقة. ويرد جل الاغاروز تمثيلية من شظايا تنقيته في الشكل 2B.
  8. إعداد رد فعل ربط في الحجم الكلي لل20 ميكرولتر باستخدام 400 U من T4 DNA يغاز ونسبة المولي من ناقلات لادخال من 1: 3.
    ملاحظة: في التوافق مع هلام الاغاروز هو مبين في الشكل 2B نحن ligate عادة في الحجم الكلي لل20 ميكرولتر مع 2- لناقلات 6 ميكرولتر، 8- 12 ميكرولترإدراج و 400 U من T4 DNA يغاز. كما تركيز الحمض النووي هو المنخفض عادة بعد عدة خطوات المعاملة بالفينول، واستخدام الكثير من DNA ممكن بحيث لا إضافي H 2 O المراد إضافتها للوصول إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر. Ligate في 16 ° CO / N وبعد إجراء استخراج الفينول كلوروفورم تليها ETOH هطول الأمطار (الخطوة 1.3).
    1. أزل الحمض النووي في 15 ميكرولتر من نوكلياز درهم مجانا 2 O واستيعاب رد فعل ربط النقي مع انزيم التقييد صوي (10 U) لمدة 2 ساعة على 25 درجة مئوية في إجمالي حجم 20 ميكرولتر. ثم التركيز وتنقية الحمض النووي، عن طريق إجراء استخراج الفينول كلوروفورم تليها ETOH هطول الأمطار (الخطوة 1.3). أزل الحمض النووي في 10 ميكرولتر من نوكلياز درهم مجانا 2 O.
  9. تحويل 2 ميكرولتر من سوا النقي I هضم المنتج ربط بواسطة الصعق الكهربائي في DH10B أو DH5α electrocompetent E. القولونية وحدد الحيوانات المستنسخة من 16 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية على اساس تحتوي على الأمبيسلين LBلوحات (50 ملغ / مل الأمبيسلين). حدد 5- 10 الحيوانات المستنسخة وإعداد DNA البلازميد مصغرة الاستعدادات باستخدام تحلل القلوية تليها استخراج الفينول كلوروفورم وهطول الأمطار ETOH لاحق (الخطوة 1.3) 13.
  10. إجراء خلاصة تحليلية البلازميد مصغرة الاستعدادات تليها الاغاروز الكهربائي للهلام للتحقق من حجم شظايا الحمض النووي. الانزيمات تقييد المقترحة هي على سبيل المثال I- سيو الأول وPI- SCE I الإفراج عن إدراج، جمعية مهندسي البترول I أو II Hinc (الشكل 2C).
  11. تضخيم استنساخ الصحيح في المحتوية على الأمبيسلين LB المتوسطة (50 ملغ / مل الأمبيسلين) وإجراء إعداد midi- أو ماكسي البلازميد استخدام أي أدوات تنقية البلازميد المتاحة تجاريا.

2. الإفراج عن HCAdV-الجينوم من pAdFTC البلازميد وPreamplification من HCAdV المتجهات في خط منتج خلية 116

  1. هضمها 20 ميكروغرام من إنتاج الفيروسة الغدانية البلازميد القائم على pAdFTC تحتوي على الحكومة العراقية المستنسخة من الخطوة 1.11) فيوبلغ حجم التداول الإجمالي ل100 ميكرولتر باستخدام ليس أنا (20 U) عند 37 درجة مئوية لمدة> 2 ساعة وأداء استخراج الفينول كلوروفورم تليها مرتين من قبل ETOH هطول الأمطار. تذوب في 20- 30 ميكرولتر درهم العقيمة 2 O.
  2. تحقق قسامة من 1:10 المخفف هضمها pAdFTC-العراقية-DNA من قبل الكهربائي للهلام. A جزء 9 كيلو بايت لالعمود الفقري البلازميد، واعتمادا على حجم الحكومة العراقية، وهو جزء DNA الثاني للجينوم HCAdV (الحجم: 28- 36 كيلوبايت) قابلا للاكتشاف.
    يتم عرض مثال ممثل من غير I ملخص في الشكل 2D: ملاحظة. ويمكن تخزين DNA خطي لعدة أيام في 4 درجات مئوية أو في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  3. قبل الشروع في البروتوكول، تأكد من أن الفيروس المساعد AdNG163R-2 تم تضخيمه 4.
    ملاحظة: الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع pAdFTC المستمدة ناقلات HCAdV هي كائنات المعدلة وراثيا المصنفة السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL-2)، يرجى استخدام الاحتواء السليم ومعالجة النفاياتالتدابير، بما في ذلك معدات الوقاية الشخصية، والعمل تحت BSL-2 اغطية تدفق الصفحي.
  4. الثقافة 116 الخلايا في MEM المتوسطة النسر تستكمل مع 10٪ FBS وهيغروميسين B (100 ميكروغرام / مل). البذور مرور منخفض (أقل من مرور 10) 116 الخلايا (~ 0.4x 10 6 خلايا) في 60 ملم صحن زراعة الأنسجة قبل يوم واحد ترنسفكأيشن بحيث تصل 50- 80٪ confluency في اليوم التالي.
  5. Transfect خطي الجينوم HCAdV من الخطوة (2،1) إلى 116 الخلايا باستخدام أساليب مثل ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم أو غيرها من الكواشف ترنسفكأيشن المتاحة تجاريا (الشكل 3A). 16- 18 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وإزالة بعناية المتوسط، إضافة 3 مل متوسطة جديدة (MEM، 5٪ FBS) وتصيب الخلايا مع HV AdNG163R-2 4 تطبيق 5 وحدات transducing (TU) في الخلية (منذ متموجة 60 مم يحتوي طبق زراعة الأنسجة ~ 3.2x 10 6 خلايا، إضافة ~ 1.6x 10 7 TU من HV).
    1. بلطف تحريك الطبق كل 20 دقيقة خلال الساعة الأولى بعد العدوى إلىضمان توزيع HV المساواة. زراعة الخلايا المصابة عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. في حالة كفاءة تأثير التضخيم فيروس الاعتلال الخلوي (CPE) بسبب تكاثر الفيروس (يتم تقريب الخلايا صعودا وفضفاضة يعلق أو فصل من صحن زراعة الأنسجة) ويمكن ملاحظتها 48 ساعة لوحظ بعد infection.If CPE في وقت سابق مبلغ HV أن يتم تخفيض. في حالة بدء تشغيل CPE في وقت لاحق، والمزيد من فيروس المساعد لابد من استخدامها.
  6. حصاد الخلايا بما في ذلك طاف 48 ساعة بعد العدوى عن طريق تنظيف قبالة الخلايا من الطبق الثقافة باستخدام مستنبت. وتسمى الخلايا التي يتم تعليقها في المتوسط ​​ثقافتهم مرور 0 (P0). انقسام P0 إلى تيارين،
    1. من 0.5 مل من خلايا منفصلة تدور أسفل الخلايا لمدة 3 دقائق في 2000 x ج وإزالة المتوسطة من بيليه الخلية، التي يتم استخدامها في وقت لاحق لعزل الحمض النووي الجيني (gDNA) للتحليل QPCR تستند عملية التضخيم. الكريات تخزين الخلايا عند -20 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
    2. من 2.5مل من خلايا منفصلة الافراج عن الجسيمات الفيروسية من خلال تجميد (-80 ° C أو في النيتروجين السائل) والذوبان (في RT أو 37 درجة مئوية حمام مائي) في الخلايا التي يتم resupended في حياتهم المتوسطة 3-4 مرات. هذا الكسر هو من دعا المحللة من P0.
  7. ضمان أطباق زراعة الأنسجة مع 116 الخلايا التي تزرع على 90- 95٪ confluency باستخدام MEM المتوسطة تستكمل مع FBS (10٪) وهيغروميسين B (100 ميكروغرام / مل)، وHV المتوفرة للخطوات التالية الركض.
  8. مزيج 1 مل من وسائل الإعلام الجديدة (MEM، 5٪ FBS) مع 2.5 مل من المحللة من مرور السابقة (الخطوة 2.6.2) إلى الحجم النهائي من 3.5 مل، إضافة HV تطبيق 2 TU لكل خلية (منذ الأنسجة 60 مم صحن الثقافة في confluency من 90- 95٪ يحتوي ~ 3.2x 10 6 خلايا، إضافة ~ 6.4x 10 6 TU من HV). (الشكل 3B). إزالة بعناية متوسطة من صحن 60 ملم من 116 الخلايا وإضافة الخليط الفيروسي لخلايا. كرر الخطوة 2.6) - 2،8) مرتين للحصول لست] من تمريرةالأعمار P1 و P2.
  9. خلط 17.5 مل وسائل الإعلام الجديدة (MEM، 5٪ FBS) مع 2.5 مل من المحللة من P2 وإضافة HV تطبيق 2 TU لكل خلية (منذ 150 ملم الأنسجة صحن الثقافة في confluency من 80- 100٪ يحتوي ~ 2X 10 7 الخلايا، إضافة ~ 4X 10 7 TU من HV). إزالة المتوسطة من طبق 150 ملم من 116 الخلايا وتصيب الخلايا مع الخليط الفيروسي. زراعة الخلايا المصابة عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
  10. 48H بعد إصابة خلايا الحصاد كما هو موضح في الخطوة 2.6) للحصول على مرور P3 (الشكل 3B).
    1. كرر الخطوة 2.6) 1.
    2. من 19.5 مل المتبقية من الإفراج P3 الجسيمات الفيروسية من الخلايا resupended من خلال تجميد والذوبان 3-4 مرات. هذا الكسر هو من دعا المحللة من P3.
      ملاحظة: بعض النواقل في نهاية المطاف قد يتطلب مقاطع إضافية في 150 ملم الأطباق حتى يتم تضخيمها أنها بما فيه الكفاية. لذا الفعاليه لعملية ما قبل التضخيم بد من رصدها خلال تمرير المسلسلشيخوخة. لا يمكن أن يؤديها QPCR التحليل القائم على عملية التضخيم كما هو موضح في القسم 3 (انظر أيضا الشكل 4A). قبل التضخيم من HCAdV يحمل كاسيت التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) يمكن بسهولة أن يتم تقييم بملاحظة إشارة GFP flourecscent باستخدام مجهر فلوري (الشكل 4B).

3. مراقبة عملية التضخيم باستخدام الكمي، في الوقت الحقيقي PCR (QPCR) (انظر أيضا الشكل 4A).

  1. عزل gDNA من الكريات خلية من كل مرور preamplifaction (الخطوات 2،6) - 2.10) باستخدام أي مجموعة عزل الحمض النووي التجارية لعزل gDNA من الخلايا المستنبتة أو أسلوب آخر للاختيار. للحصول على نتائج PCR المثلى استخدام gDNA طازجة ممكن. خلاف ذلك gDNA يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  2. لتحديد عدد من العوامل الوراثية HCAdV موجودة في خلايا مرور منها عن طريق التحليل QPCR توليد منحنى قياسي باستخدام 10 1 </ سوب> - 10 9 نسخ من البلازميد تحمل الحكومة العراقية الواردة في الجينوم HCAdV.
  3. تحليل نفس الكمية من gDNA من P0- P3 (الخطوة 2.6- 2.10) تطبيق QPCR باستخدام 400 نيوتن متر من الاشعال محددة للحكومة العراقية الواردة في الجينوم HCAdV. لإجراء تعليمات الشركة المصنعة QPCR متابعة للمواد الكيميائية QPCR منها. وضع برنامج QPCR على النحو التالي: مرحلة ما قبل الحضانة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، والتضخيم في 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 55- 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية. على أساس منحنى قياسي يمكن محرف عدد الجينوم HCAdV في رد الفعل.

4. كبير التضخيم جدول HCAdV المتجهات في 116 خلايا المتزايد في تعليق

  1. إضافة 900 مل من prewarmed (37 درجة مئوية) MEM جديدة تستكمل مع 10٪ FBS وهيغروميسين B (100 ميكروغرام / مل) في قارورة الثقافة الدوار 3 لتر (الشكل 3B).
  2. إزالة المتوسطة من 10 على الأقل الفردية 150 مم أطباق زراعة الأنسجة مع 116 الخلايا المزروعة في confluency من 90- 100٪ وطرد خارج الخلايا مع 10 مل من جديد قبل حرارة (37 درجة مئوية) MEM تستكمل مع FBS (10٪) وهيغروميسين B (100 ميكروغرام / مل) باستخدام ماصة المصلية. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات للحصول على تعليق خلية متجانسة. نقل الخلايا مباشرة في قارورة تحتوي على الدوار بالفعل 900 مل من الخطوة 4.1).
    ملاحظة: لا تستخدم التربسين / EDTA لأنها قد تؤثر سلبا على نمو الخلايا تعليق. بعد إزالة متوسطة نقل على الفور الخلايا في قارورة الدوار. لا تتعامل مع أكثر من عقدين من أطباق زراعة الأنسجة في وقت واحد. في الوقت أطول الانتظار بعد إضافة وسائل الإعلام الجديدة وأكثر صعوبة وسيكون لفصل الخلايا من صحن زراعة الأنسجة.
  3. لضمان أفضل نمو الخلايا احتضان الدوار قارورة على محرك مغناطيسي في ثقافة حاضنة الأنسجة لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية و CO 2 5٪. ضبط محرك مغناطيسي إلى 70 دورة في الدقيقة لتجنب إلحاق الخلايا إلى الواجهات الزجاجية. مراقبة نمو الخلايا في الدوار قارورة الثقافة لدراسة ما إذا كانت الخلايا المزروعة في قارورة الثقافة الدوار قابلة للبقاء، وما إذا كانت تنمو على كميات كافية. في كل مرة قبل إضافة نقل متوسطة جديدة 2 مل من مفاعل حيوي إلى 60 مم طبق زراعة الأنسجة. مراقبة مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر.
    ملاحظة: خلايا تشكيل كتل عائمة في مستنبت تشير إلى النمو الأمثل والجدوى (انظر أيضا الشكل 4C). بعد 24 ساعة أنها تشكل مستعمرات على سطح الطبق زراعة الأنسجة. 30- 50٪ التقاء يشير الكثافة المثلى.
  4. 24 ساعة بعد وضع القارورة ثقافة الدوار إضافة 500 مل من وسائل الإعلام الجديدة (MEM 10٪ FBS) تستكمل مع هيغروميسين B (100 ميكروغرام / مل). بعد 24 ساعة كرر هذه الخطوة.
  5. 72 ساعة بعد وضع ثقافة الدوار، إضافة 1000 مل من وسائل الإعلام MEM الطازجة (10٪ FBS) مع هيغروميسين B (100 ميكروغرام / مل) مما أدى إلى الحجم الكلي لل3 L من التعليق الخلية.
  6. 24 ساعة بعد وصوله للمركباتolume من ثلاثة لترات، والحصاد 116 خلايا تعليق بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 500 x ج في RT. تجاهل طاف. الحفاظ على أفرغت قارورة الثقافة الدوار تحت غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة.
  7. الكريات الخلايا resuspend في MEM جديدة تستكمل مع 5٪ FBS بواسطة pipetting صعودا وهبوطا حول 8- 10 مرات للحصول على تعليق خلية متجانسة. حجم المتوسطة يعتمد على ما إذا المحللة من الخطوة 2.10) 2. (19.5 مل، راجع الخطوة 4.8) 1. خيار) أو الأسهم الفيروسية تنقيته من HCAdV من الخطوة 5.9) 2. (عدة ميكرولتر depanding على عيار الفيروسية، راجع الخطوة 4.8) 2.، والخيار ب) يستخدم لإصابة الخلايا. استخدام إجمالي حجم 150 مل.
    1. الخيار: لإصابة 116 خلايا تعليق مع المحللة من P3 (التضخيم الرئيسي) نقل الخلايا من الخطوة 4.8) إلى زجاجة تخزين 250 مل مجهزة بار العقيمة المغناطيسي ضجة أو 250ml الاتحاد الدوار قارورة صغيرة الحجم والخلايا مع الرئيسين تصيب فيروس داخل المحللة من P3 (الخطوة 2.10.2) و 2 TU من HV لكل خلية. وإذا افترضنا أن كثافة 3X10 5 خلايا لكل مل، وعدد الخلايا الإجمالي 9X 10 8 خلايا. وبالتالي إضافة 1.8X 10 9 TU من HV.
    2. الخيار ب: لإصابة 116 خلايا تعليق مع الأوراق المالية الفيروسي النقى نقل الخلايا من الخطوة 4.8) إلى زجاجة تخزين 250 مل مجهزة بار العقيمة المغناطيسي ضجة أو 250ml الاتحاد الدوار قارورة صغيرة الحجم وزملاء تصيب الخلايا مع 100 جسيمات فيروسية في كل خلية من HCAdV تنقيته سابقا (من الخطوة 5.9) 2). وبالتالي إضافة 9X 10 10 VP وفقا لعيار البدني (تقاس الامتصاصية في 260nm؛ الخطوة 6) من HCAdV تنقيته و1.8X 10 9 TU من HV.
  8. يحرك الخليط خلية الفيروس من سبتمبر 4.8.1) أو 4.8.2) في على محرك مغناطيسي في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 2 ساعة على 60 دورة في الدقيقة. تأكد من أن زجاجة التخزين غير مغلق تماما للسماح للدوران الهواء.
  9. 2 ساعة بعد العدوى بنقل إجمالي حجم الخليط خلية الفيروس مرة أخرى في 3 لتر الدوار عبادةقارورة لدى عودتهم وإضافة 1850 مل من قبل تحسنت (37 ° C) MEM وسائل الإعلام الجديدة تستكمل مع 5٪ FBS إلى الحجم الكلي لل2 L واحتضان في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة على 70 دورة في الدقيقة.
  10. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 890x ز في RT في 500 مل أنابيب الطرد المركزي. إزالة المتوسطة و resuspend الخلايا مكعبات في إجمالي حجم 28 مل من DPBS. ماصة صعودا وهبوطا للحصول على تعليق خلية متجانسة. تجميد تعليق خلية للفيروسات في النيتروجين السائل أو في -80 ° C التأكد من أن تعليق يتم تجميد تماما. تخزين تعليق خلية للفيروسات في -80 درجة مئوية حتى البدء في تنقية الفيروس.

5. تنظيف و غسيل الكلى من HCAdV

  1. لإعداد المحللة الفيروسي كلوريد السيزيوم (CSCL) التدرجات، وتجميد تعليق خلية للفيروسات من الخطوة 4.11) في النتروجين السائل وذوبان الجليد في حمام مائي عند 37 ° C أربع مرات.
  2. الطرد المركزي المحللة الفيروسي في 500 x ج لمدة 8 دقائق في RT وجمع طاف تحتوي على HCAdV.
  3. لإعداد تنبيذ فائق حلول CSCL كما follows.Weigh 37.5 غرام (1.5 جم / سم 3)، 33.5 غ (مقابل 1.35 جم / سم 3)، و31،25 غ (مقابل 1.25 جم / سم 3) من مسحوق CSCL على التوالي وملء حتى مع DH 2 O إلى 25 مل.
    1. Stirr حتى حل يصبح مرشح واضح والعقيمة الحلول. وأخيرا إزالة 1 مل من كل حل وتزن على نطاق جيد للتحقق الطقس كثافة صحيحة. 1ML أن الوزن 1.5 غرام، 1.35 و 1.25 غرام على التوالي.
    2. إذا كانت كثافة عالية جدا تعديله بإضافة متدرجة الأحجام الصغيرة (ميكرولتر) من درهم العقيمة 2 O. بعد إضافة درهم 2 O قياس densitiy مرة أخرى. إذا لزم الأمر إضافة المزيد درهم 2 O.
    3. كرر الإجراء حتى كثافة صحيحة. إذا كانت كثافة منخفضة جدا تعديله بإضافة كمية صغيرة من مسحوق CSCL. تصفية العقيمة مرة أخرى والتحقق من الكثافة. إذا كانت كثافة عالية جدا ضبط من قبل الدينز درهم 2 O كما هو موضح من قبل. إذا كانت كثافة لا تزال منخفضة جدا إضافة مور CSCL، تصفية العقيمة مرة أخرى والتحقق من الكثافة. كرر الإجراء حتى كثافة صحيحة.
  4. إعداد CSCL خطوة التدرجات في ستة أنابيب نابذة فائقة السرعة واضحة. بعناية وماصة ببطء حلول CSCL في أنابيب باستخدام الترتيب التالي: 0.5 مل من 1.5 جم / سم 3 CSCL حل، 3 مل من 1.35 جم / سم 3 CSCL حل و 3.5 مل من 1.25 جم / سم 3 CSCL حل (الشكل 2C) .
  5. تراكب ~ 4.5 مل من مسح طاف ناقلات من الخطوة 5.2) على رأس جم / سم 3 CSCL طبقة 1.25. الطرد المركزي التدرجات في نابذة فائقة السرعة باستخدام أرجوحة خارج الدوار (SW-41) في 12 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة على 226،000 x ج (35،000 دورة في الدقيقة) مع تسارع بطيء والتباطؤ إلى منفصل HCAdV الجينوم تحتوي على جزيئات فيروسية من الجسيمات الفارغة والخلايا الحطام.
    ملاحظة: في ظل الظروف المثلى الفرقة المنتشرة FORMES الحطام الخلية على رأسالأنابيب. أدناه شريطين بيضاء يمكن ملاحظتها. الشريط العلوي يحتوي على جزيئات فارغة في حين أن أقل الفرقة تساوي HCAdV (أرقام 2C و5A).
  6. إزالة بعناية طبقات من الحطام الخلية والجزيئات فارغة وجمع 1 مل من أقل فرق من كل أنبوب وفيروس نقل مع طرف ماصة نظيفة في أنبوب معقم 50 مل. تضيف ما يصل الى 24 مل من 1.35 جم / سم 3 CSCL حل للجزيئات الفيروس التي تم جمعها وتخلط بعناية.
  7. ملء أنابيب الطرد المركزي مع 1.35 جم / سم 3 حل CSCL الفيروسات إلى الأعلى وأجهزة الطرد المركزي O / N (18- 20 ساعة) في 226،000 x ج (35،000 دورة في الدقيقة) في 12 ° C في نابذة فائقة السرعة باستخدام أرجوحة خارج الدوار (SW-41 ) مع تسارع بطيء والتباطؤ.
  8. جمع HCAdV موجودة في الشريط السفلي بارزة. والفرقة العليا المحتملة يحتوي على جزيئات فارغة إزالة الطبقات العليا من أعلى باستخدام ماصة (انظر الأرقام 2C و5B) ثم يسلب أقل الفرقة باليودنانوغرام ماصة.
  9. Dialyze جسيمات الفيروس التي تم جمعها لتبادل العازلة.
    1. قطع شريط من أنابيب غسيل الكلى (MWCO: 50000) حوالي 8 سم في الطول، وغسله مع DH العقيمة 2 O ثلاث مرات. ثم أغلق جانب واحد من أنابيب غسيل الكلى مع المشبك البلاستيك ونقل الفيروس التي تم جمعها من الخطوة 5.8) إلى أنابيب باستخدام ماصة 1 مل. تجنب فقاعات الهواء داخل الأنبوب وإغلاقه على الجانب الآخر مع البلاستيك إغلاق المشبك غسيل الكلى.
    2. Dialyze في 1 لتر من العازلة غسيل الكلى (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، و 10٪ الجلسرين و1 ملم MgCl 2 في منزوع الأيونات H 2 O) لمدة 2 ساعة في 4 درجات Cwith التحريك البطيء. صرف غسيل الكلى العازلة مع 2 لتر من العازلة غسيل الكلى وdialyze O / N عند 4 درجات مئوية مع التحريك البطيء. وبدلا من استخدام sucrosebuffer (140 ملي كلوريد الصوديوم، 5 ملي نا 2 هبو 4 x2H 2 O، و 1.5 مم KH 2 PO 4 و 730 ملي السكروز، ودرجة الحموضة 7.8).
    3. جمع جزيئات الفيروس مدال من الخطوة 5.9) 2. باستخدام 1 مل صipette. إعداد قسامات متعددة من أحجام صغيرة المطلوب (25- 100 ميكرولتر) وتخزينها فيروس النقي في -80 ° C.

6. قياس عيار المادية للالاستعدادات HCAdV النهائية التي كتبها الكثافة الضوئية (OD)

  1. تمييع 25 ميكرولتر من إعداد ناقلات النهائي من الخطوة 5.9) 2 مع 475 ميكرولتر من تحلل العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 10 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة)، 0.5٪ SDS))، ويهز بلطف لمدة 20 دقيقة في RT وأجهزة الطرد المركزي أخيرا لمدة 2 دقيقة في RT في 15000 ز س.
  2. منذ القيم الامتصاصية في 260 نانومتر (A260) هي عادة ما تكون منخفضة، وقياس الامتصاصية أربع مرات باستخدام 100 ميكرولتر من طاف وحساب قيمة متوسط ​​القياسات الأربعة. حساب عدد الجسيمات الفيروسية لكل مل (نائب الرئيس / مل -1) باستخدام الصيغة التالية: نائب الرئيس / مل -1 = (يعني A260) س (20) س (1.1 × 10 12) س (36 كيلو بايت حجم / HCAdV في كيلوبايت ).
    وتظهر نتائج العائد نموذجي من الجسيمات الفيروسية المطلقة (OD عيار) في الشكل 7A ملاحظة:

7. قياس إجمالي الجسيمات، وحدات المعدية من HCAdV ومستويات HV تلوث في ناقلات التحضير النهائي من قبل QPCR. ويرد مخطط إجراء المعايرة في الشكل (6)

  1. البذور خلايا HEK293 في 6 أو 12 جيدا لوحات زراعة الأنسجة بحيث خلايا تصل إلى 90٪ confluency في اليوم التالي. لتحديد عدد من الجزيئات الفيروسية المعدية (عيار المعدية)، ويصيب خلايا بئر واحدة في لوحة متعددة جيدا مع 1 ميكرولتر وكذلك الثاني مع 10 ميكرولتر من فيروس تنقيته من الخطوة 5.9) 3.
  2. حصاد الخلايا العدوى بعد 3 ساعات. إزالة المتوسطة وإضافة التربسين لتغطية البئر كله واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 5 دقائق. طرد خارج الخلايا مع التربسين باستخدام ماصة وتدور أسفل الخلايا في 890 x ج لمدة 3 دقائق على RT.
  3. resuspend الخلايا مكعبات في 200 ميكرولتر من DPBS وغسلها جيدا لإزالة مجانية (غير المعدية) جزيئات النواقل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 890 x ج في RT. تجاهل طاف و resuspend الكريات الخلايا في 200 ميكرولتر من DPBS الطازجة.
    ملاحظة: للحصول على تحديد دقيق لعيار المعدية، لا بد من إزالة جميع الجزيئات الفيروسية غير المعدية من أسطح الخلية التربسين العلاج والغسل الكامل.
  4. لتحديد إجمالي عدد الجسيمات الفيروسية (الجسيمات المعدية والجزيئات غير المعدية = عيار البدني)، والحصاد غير المصابة الخلايا HEK293 من بئرين دون التربسين عن طريق تنظيف قبالة الخلايا مع مستنبت الخاصة بهم باستخدام ماصة.
  5. تدور باستمرار الخلايا لمدة 3 دقائق في 890 x ج في RT. تجاهل المتوسطة و resuspend الخلايا مكعبات في 200 ميكرولتر من DPBS. سوbsequently إضافة 1 ميكرولتر و 10 ميكرولتر من إعداد HCAdV تنقيته مباشرة إلى الخلايا، على التوالي. استخدام الخلايا غير المصابة كخلفية، لضمان نفس الظروف للgDNA العزلة واللاحق Q-PCR.
  6. عزل gDNA من خلايا HEK293 المستمدة من الخطوات 7.3) و 7.5)
    1. خلايا دوامة معلق في 200 ميكرولتر من DPBS (الخطوة 7.3 و 7.4) لمدة 3 ثانية، إضافة 200 ميكرولتر من محلول SDS. (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 10 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة)، 0.5٪ SDS) و 20 ميكرولتر بروتين K (20 ملغ / مل)، ووقف دوامة لمدة 3 ثوان. احتضان 12- 16 ساعة على 55 درجة مئوية ويهز ببطء. ثم إضافة 2 ميكرولتر من ريبونوكلياز A (20 ملغ / مل)، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C.
    2. إضافة 350 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 15000 ز س. طاف لنقل أنبوب جديد وتكرار هذه الخطوة مرة واحدة
    3. طاف لنقل أنبوب جديد، إضافة 50 ميكرولتر من خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5، 3 M) و 1 مل من الجليد الباردة ETOH (99.8٪) وتخلط تعليق. Centriعينات fuge لمدة 10 دقيقة في 15000 x ج لتكوير الحمض النووي الجيني.
    4. ثم إزالة طاف، إضافة 500 ميكرولتر من 70٪ ETOH وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 15000 ز س. إزالة طاف، إضافة 500 ميكرولتر من 70٪ ETOH ويهز لمدة 30 دقيقة في RT. ثم الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 15000 ز س.
    5. إزالة طاف وDNA بيليه الهواء الجاف. هل الكريات DNA يست جافة لفترة طويلة، كما أنه سيكون من الصعب للحصول على gDNA في الحل. Resuspend وبيليه الحمض النووي في 120 ميكرولتر من درهم 2 O واحتضان ل~ 1 ساعة على 37 درجة مئوية في حين تهتز. إذا ظهر حل DNA لزج، التخلص منه لعدة ساعات في 37 ° C، أو احتضان عند 55 درجة مئوية لمدة ~ 1 ساعة.
  7. لتحديد المعدية HCAdV الجسيمات والمطلقة HCAdV الجسيمات، وتوليد منحنى مستوى 10 يناير - 10 أغسطس نسخ من البلازميد تحمل الحكومة العراقية الواردة في الجينوم HCAdV.
  8. تحديد مجموع الجسيمات والجسيمات المعدية عن طريق تحليل نفس الكميات من gDNA من المصابين HEK293 جتنطبق ملتعلمي اللغة اإلنكليزية من الخطوة 7.3) و 7.4) QPCR باستخدام 400 نيوتن متر من الاشعال محددة للحكومة العراقية الواردة في الجينوم HCAdV.
  9. ضبط البرنامج PCR على النحو التالي: مرحلة ما قبل الحضانة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، والتضخيم في 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية. على أساس المنحنى القياسي (الخطوة 7.7)، أقحم العدد الإجمالي للجينوم الفيروسة الغدانية في رد الفعل.
  10. حساب عدد من الجينوم الفيروسة الغدانية في إعداد ناقلات النهائي باستخدام الاستمارة التالية: (عدد HCAdV / الوزن في نانوغرام من gDNA في رد فعل) س (الوزن في نانوغرام من الحمض النووي لجميع الخلايا في الطبق المصاب / فيروس حجم في ميكرولتر) .
    ملاحظة: في مدى محدد للجسيمات فيروسية المطلقة والمعدية غلة حول 1X10 7 -1x10 8 جسيمات فيروسية / ميكرولتر. التتر التي هي عشرة أضعاف أعلى أو أقل من أظهر هنا يمكن اعتبار كالمعتاد. ان التتر أعلى يكون تحسنا. مع الاحترام لنسبة partic HCAdV المطلقليه لجسيمات HCAdV المعدية، تبين التجربة أن ما يقرب من 5- 10٪ من الجزيئات HCAdV المطلقة هي المعدية (الشكل 7A).
  11. لتحديد مستويات التلوث مع HV، نفذ QPCR عن طريق تضخيم جزء من أواخر الجينات الفيروسة الغدانية 3 (L3) موجودة في الجينوم HV. استخدام البلازميد تحمل أواخر الجينات الفيروسة الغدانية 3 (L3) لإنشاء منحنى قياسي (الخطوة 7.7).
  12. في هذا التفاعل تطبيق 400 نيوتن متر من L3 الاشعال إلى الأمام 5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT GTT ACT CGA GG-3 "و L3 عكس 5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3" جنبا إلى جنب مع 300 نيوتن متر لجنة التحقيق L3 محددة 5'-فام-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-طمرة-3 ".
  13. ضبط البرنامج PCR على النحو التالي: مرحلة ما قبل الحضانة / التنشيط في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، والتضخيم خلال 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. استخدام أي مسبار العالمي mastermix PCR للتفاعل QPCR. على أساس المنحنى القياسي (الخطوة 7.7)، وحساب عدد فيالجسيمات HV fectious في إعداد ناقلات النهائي. انظر (الشكل 7A) للغلة النموذجية للجسيمات HV.
  14. وأخيرا حساب نسبة الجسيمات المعدية المطلقة HCAdV إلى مستويات التلوث HV لتقييم جودة إعداد النواقل.
    ملاحظة: حتى الآن على جزء صغير من ما تبقى HV لا يمكن استبعاده. عادة ما تكون نسبة التلوث HV هي ~ 5٪ من الجسيمات المعدية أو أقل، وهو مقبول (7B الشكل). كما بالطبع أقل HV ممكن أمر مرغوب فيه، وخاصة إذا كان إعداد ناقلات تسير لاستخدامها في التجارب على الحيوانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم عرض نماذج تمثيلية هنا للاستنساخ، والتضخيم، وتنقية الاستعدادات HCAdV. وتقدم لمحة عامة عن استراتيجية استنساخ (الشكل 1) وأمثلة تمثيلية للاستنساخ والإفراج عن الجينوم HCAdV بواسطة تقييد هضم انزيم (الشكل 2). وثمة نمط تقييد نموذجي بعد الافراج عن كاسيت الحكومة الإسرائيلية-التعبير عن pHM5 التي كتبها PI- SCE الأول وI- سيو I الهضم واللاحق استخراج الفينول كلوروفورم وETOH هطول الأمطار (انظر الخطوات أيضا 1.2- 1.5) يظهر (الشكل 2A). عادة ~ 3 كيلوبايت الفرقة المقابلة لpHM5 البلازميد العمود الفقري والفرقة الثانية المقابلة للكاسيت التعبير من الحكومة العراقية ويمكن ملاحظة. ثم يتم تنقيته الفرقة التي تحتوي على كاسيت الحكومة الإسرائيلية-التعبير عن هلام الاغاروز. يتم تحليل النقي كاسيت الحكومة الإسرائيلية-التعبير على هلام الاغاروز جنبا إلى جنب مع تنقيته، pAdVFTC dephosphorylated أن ثكما يتفاعل مع PI- SCE الأول وI- سيو أنا على التوالي (الخطوة 1.7) للتحقق من الحجم الصحيح وتقدير القيمة النسبية للجزيئات لربط لاحقة (الشكل 2B). بعد ربط (راجع الخطوة 1.8)، يليه استخراج الفينول كلوروفورم وETOH هطول الأمطار وسوا I هضم للقضاء على pAdFTC تقطيعه واللاحق استخراج الفينول كلوروفورم وETOH هطول الأمطار (الخطوة 1.9)، يتم تحويلها منتجات ربط إلى البكتيريا واستنساخ يتم تحديدها على الأمبيسلين تحتوي على لوحات أجار LB-. عادة ما يتم الحصول على عشرات إلى مئات من الحيوانات المستنسخة، والتي يتم إعدادها 5- 10 استنساخ لDNA البلازميد مصغرة الاستعدادات. ويرد نمط تقييد تحليلية Hinc II ملخص من الحيوانات المستنسخة الإيجابية والسلبية معا مع pAdFTC فارغة كما سيطرة سلبية (انظر أيضا الخطوة 1.10) (الشكل 2C). هنا استنساخ الإيجابية لا تظهر الفرقة 5 كيلو بايت، وهذا هو الحاضر في pAdFTC فارغة واستنساخ السلبية ويظهر جزء 1.7 كيلوبايتهذا لم يكن موجودا في pAdFTC فارغة واستنساخ السلبية. لهذا GOI كل هذا يدل كان ثا استنساخ ناجحة. استنساخ الإيجابي الذي تم تنقيته عبر midiprep ثم هضمها مع أي منظمة الشفافية الدولية للافراج عن HCAdV الجينوم تحمل الحكومة العراقية من pAdVFTC-العراقية (الخطوة 2.2). أخيرا هضمها لا TI DNA تنقية الخاصة العراقية مرتين باستخدام استخراج الفينول كلوروفورم وETOH هطول الأمطار لضمان نقاء عالية من الحمض النووي لترنسفكأيشن لاحقا إلى 116 الخلايا. تحليل جزء صغير من منظمة الشفافية الدولية لا يهضم pAdVFTC-العراقية على هلام الاغاروز يظهر ~ 9 كيلو بايت الفرقة الموافق العمود الفقري pAdFTC البلازميد وفرقة كبيرة تصل إلى ~ 36 كيلو بايت (اعتمادا على حجم الكاسيت التعبير الحكومة الإسرائيلية) المقابلة لجينوم HCAdV (الشكل 2D). لمحة عامة عن خط أنابيب تضخيم وتنقية ويرد تخطيطي (الشكل 3). وتقدم الأمثلة النموذجية على رصد عملية ناقلات قبل التضخيم ( الشكل (4A). لاحظ أن عددا من الجينوم ناقلات descreases عادة خلال المقاطع الأولى ويزيد بقوة في الممرات في وقت لاحق. عدد نسخة متجه من 10 يونيو - 10 يوليو في 15000 خلايا كافية لتصيب 116 الخلايا لإنتاج على نطاق واسع في 3 لتر الدوار قارورة. إذا كانت الحكومة الإسرائيلية داخل الجينوم ناقلات HCAdV تحتوي على الكاسيت GFP التعبير، وعملية ما قبل التضخيم (القسم 2) ويمكن أيضا أن يتم رصدها بواسطة المجهر الفلورسنت. وتظهر الصور التمثيلية من كل ممر (الشكل 4B). لاحظ أن عدد الخلايا إيجابية GFP تنخفض عادة خلال المقاطع الأولى ويزيد بقوة في الممرات في وقت متأخر. وإذا كان عدد خلايا إيجابية GFP يصل ~ 100٪، تم تضخيمه ناقلات sufficiently لتصيب 116 الخلايا لإنتاج على نطاق واسع في 3 لتر الدوار قارورة. تم رصد عملية كبيرة التضخيم نطاق من HCAdV تحتوي على GFP التعبير كاسيت عن طريق التحليل المجهري للثقافة متوسطة والخلايا التي تم نقلها من القارورة الدوار إلى صحن زراعة الأنسجة. صور مجهرية من الخلايا المنتجة HCAdV في الثقافة تعليق (راجع الخطوة 4.4 و 4.11) وتقدم (الشكل 4C). لاحظ أن الخلايا تنمو في كتل مشيرا إلى أن نمو الخلايا الآنفة الذكر كان كافيا والخلايا يتمتعون بصحة جيدة. عند استخدام المجهر الفلورسنت ~ 100٪ من هذه الخلايا كانت GFP إيجابية، مشيرا إلى التنبيغ كفاءة الخلايا تعليق في إنتاج مفاعل حيوي وناقلات كفاءة. وتنقيته الجسيمات متجه من المتوسط ​​وخلايا الثقافة تعليق 3 لتر قبل CSCL تنبيذ فائق. وتظهر الصور التمثيلية للتنقية ناقلات HCAdV باستخدام CSCL كثافة التدرج تنبيذ فائق (الشكل 5). بعدن الطرد المركزي الأولي باستخدام CSCL خطوة الانحدار وعادة ما يلاحظ شريطين. الشريط العلوي يحتوي فارغة من capsids جزئية في حين يتكون الجزء الأسفل من عصابة من الحمض النووي التي تحتوي على جزيئات النواقل (الخطوة 5.4- 5.5) (الشكل 5A). DNA التي تحتوي على جزيئات ناقلات تحصد في وقت لاحق (الخطوة 5.6) وتجميع للخطوة تنبيذ فائق الثانية لتركيز جزيئات النواقل. هذه الخطوة عادة ما تكون النتائج في فرقة واحدة من الحمض النووي التي تحتوي على جزيئات النواقل التي يتم حصادها في نهاية المطاف لغسيل الكلى لاحق (الخطوة 5.7- 5.8) (الشكل 5B). وتميزت الاستعدادات ناقلات مدال عن طريق قياس عدد الجسيمات المطلقة، والجسيمات المعدية وتلوث HV. ويرد ملخص تخطيطي للإجراء المعايرة (القسم 6 و 7) (الشكل 6). وأظهرت نتائج ممثل لتوصيف إعداد ناقلات النهائي (الشكل 7). الرسم البياني شريط يبين أعداد ناقلات الجسيمات النموذجية التي هيالتي حصل عليها الإجراء الموضح في هذا البروتوكول. تم تحديد جزيئات الأعداد المطلقة للجسيمات ناقلات التي كتبها الكثافة الضوئية (المادة 6)، والجسيمات ناقلات المعدية وتلوث HV كانت تقاس QPCR (المادة 7) (الشكل 7A). وتبين التجربة أن عيار OD يغالي عدد جزيئات الفيروس. الجسيمات الفيروسية المطلقة يقاس OD يمكن أن يكون 20- 500 مرة أعلى من الجسيمات الفيروسية المعدية التي تقاس Q-PCR. الجسيمات المعدية ناقلات تتراوح أوسلي بين 5- 10٪ من الجسيمات المطلقة عندما تم قياس كل من Q-PCR (المادة 7). إذا كان إعداد الموجه لديه نوعية جيدة جدا، وأكثر من 20٪ من الجسيمات المطلقة معدية. نسبة نموذجية بين HV والجسيمات HCAdV المعدية (الخطوة 7.14) وعادة ما تتراوح بين 1-5٪ من الجسيمات المعدية (7B الشكل). هذا هو مقبول كما HV هو تكرار ناقصة. ومع ذلك كما تلوث HV أقل وقت ممكن (<1٪ من الجسيمات المعدية) سوفيفضل.

الشكل 1
الشكل 1. مخطط انسيابي لاستنساخ الحكومة العراقية إلى pAdFTC. يتم استنساخ الحكومة الإسرائيلية في MCS المكوك البلازميد pHM5. يتم هضمها البلازميدات pAdFTC وpHM5-العراقية مع I- سيو الأول وPI- SCE الأول وتنقيته عن طريق استخراج الفينول كلوروفورم وETOH هطول الأمطار. يتم تحميل pHM5 هضمها على هلام الاغاروز إعدادي لتنقية الجينات في المصالح (انظر أيضا الخطوة 1.5)، في حين أن dephosphorylated وpAdFTC البلازميد هضمها. وفي وقت لاحق تم تعيين رد فعل ربط مع CIP المعاملة pAdFTC والكاسيت التعبير التحوير حتى (راجع الخطوة 1.8) وبعد الانتهاء تنقيته عن طريق استخراج الفينول كلوروفورم وETOH هطول الأمطار. في وقت لاحق سوا I هضم المنتج ربط تليها استخراج الفينول كلوروفورم وETOH هطول الأمطار يمنع نمو الحيوانات المستنسخة تحمل pAdFTC دون إدراج. الأسود ثلاثيزوايا تشير تقييد المواقع الاعتراف الانزيم. مربعات رمادية تشير مقلوب AdV5 يكرر محطة (ITR)، المربعات البيضاء التي تحمل علامة Ψ تشير AdV5 إشارة التعبئة والتغليف، السهم الأحمر يشير المروج، صناديق خضراء تشير التحوير (الجينات في المصالح، GOI) أن أعرب، الصناديق الزرقاء تشير إشارة تذييل بعديد الأدينيلات والبرتقالي أو الأزرق السهام تشير الجينات المقاومة للمضادات الحيوية من العمود الفقري البلازميد، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. ممثل النتائج لإجراء الاستنساخ والإفراج عن الجينوم HCAdV من pAdVFTC. (A) بيان من الحكومة الإسرائيلية-التعبير كاسيت من pHM5 التي كتبها PI- SCE الأول وI- سيو I هضم (انظر أيضا الخطوات 1.2- 1.5). (B) SCE الأول وI- سيو أنا على التوالي (الخطوة 1.7). (C) التحليلية Hinc II ملخص من الحيوانات المستنسخة pAdVFTC مع وبدون حكومة إسرائيل (انظر أيضا الخطوة 1.10). (D) بيان من HCAdV الجينوم تحمل الحكومة العراقية من pAdVFTC-العراقية التي لا TI هضم (الخطوة 2.2) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
. الشكل 3. رسم تخطيطي للقدرة عالية الفيروسة الغدانية التضخيم ناقلات وتنقية (A) ترنسفكأيشن DNA HCAdV وفيروس المساعد (HV) العدوى: ترنسفكأيشن من خطي الجينوم HCAdV تحمل الحكومة العراقية في خط الخلية المنتجة HCAdV (116 خلايا [4]) وسوعدوى bsequent مع HV AdNG163R-2 [4].   (B) التضخيم من HCAdV: بعد خطوات ما قبل التضخيم من خلال نقل متسلسل المحللة الخلية إلى صحن زراعة الأنسجة الجديدة وشارك إصابة مع HV، يتم الإنتاج على نطاق واسع في الثقافة 3 L تعليق (C) تنقية HCAdV: ل يتم عزل تنقية، الفيروس عن طريق تنبيذ فائق باستخدام التدرجات كلوريد السيزيوم (D) لغسيل الكلى: يتم مدال الجسيمات HCAdV تنقية ضد 2 L العازلة التخزين. HCAdV، ذات قدرة عالية ناقلات الفيروسة الغدانية. ITR، المصلي اتش 5 مقلوب محطة التكرار. Ψ، إشارة التعبئة والتغليف. HV، فيروس المساعد. وزارة الداخلية، وافر من العدوى. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4 <ر /> الشكل 4. ممثل النتائج من عملية التضخيم (A) رصد عملية ما قبل التضخيم من قبل التضخيم من الجينوم الفيروسي باستخدام QPCR (انظر أيضا القسم 3.)؛ (ب) إذا كانت الحكومة الإسرائيلية تحتوي GFP كما التحوير، يمكن رصد عملية ما قبل التضخيم بواسطة المجهر الفلورسنت. (C) نتائج التمثيلية للعملية التضخيم واسعة النطاق في قارورة الدوار examplified لترميز HCAdV GFP. وتظهر اللوحة اليسرى صورة مجهرية من المصابين 116 الخلايا من القارورة الدوار. تم نقل عينة من مستنبت والخلايا إلى 60 مم طبق زراعة الأنسجة. لاحظ أن كتل من الخلايا تضخيم مرئية. وتظهر اللوحة اليمنى نفس الصورة باستخدام المجهر الفلورسنت. وtransduced ما يقرب من 100٪ من الخلايا مع HCAdV تحمل GFP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. ممثل النتائج بعد CSCL التدرج الطرد المركزي (A) بعد إجراء التدرج خطوة (انظر أيضا الخطوة 5.5)؛ (ب) بعد التدرج المستمر (انظر أيضا الخطوة 5.7) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6. مخطط تخطيطي لإجراء المعايرة. (A) قياس الجسيمات المعدية: هي الخلايا المصابة في لوحة متعددة جيدا مع أحجام مختلفة من فيروس المنقى وجمعت كما الكريات الخلية (B) قياس س.و الجسيمات المطلقة: تشكل خلايا Unifected ليتم جمعها من قبل trypsinization والطرد المركزي متعددة جيدا. بعد إضافة إعادة تعليق فيروس تنقيته والحمض النووي الجيني معزولة. (C) عزل الحمض النووي الجيني. (D) لتحديد الفيروسية الأرقام نسخة الجينوم يتم تنفيذ PCR الكمي (ف-PCR). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الرقم 7
الرقم 7. ممثل النتائج لتوصيف إعداد ناقلات النهائي. (A) الأعداد المطلقة للجسيمات لإعداد ناقلات وفقا لبروتوكول المعروضة مع تحديد أساليب مختلفة: OD عيار تقاس الكثافة الضوئية (المادة 6)، عيار المعدية وتلوث HV تقاس QPCR (المادة 7) (B)النسبة بين مجموع الجسيمات HCAdV المعدية ومستويات التلوث HV تقاس qPCRs (المادة 7). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول المعروضة هنا يسمح تنقية ناقلات HCAdV على أساس نوع اتش 5 البشري على أساس الإجراءات الموضحة سابقا 4،12. الجينوم HCAdV داخل البلازميد pAdFTC يخلو من كل الجينات اتش ويحمل 5'- و3'- وائح الاتصالات الدولية وإشارة التعبئة والتغليف فقط. في هذه الاستراتيجية HV AdNG163R-2 4 يوفر جميع الجينات اللازمة لإنتاج فيروس فعال في العابرة. هذا يوفر سعة التعبئة والتغليف لمدة تصل إلى 35 كيلو بايت، والتي outcompetes بوضوح AdVs الجيل الأول والثاني أو الفيروسة البطيئة المستخدمة على نطاق واسع (LV) - أو الغدة الفيروسات المرتبطة بها (AAV) المتجهات القائمة. والميزة الثانية من HCAdV خاصة بالنسبة للتطبيقات في الجسم الحي هو حقيقة أنه خلافا للأول أو AdVs الجيل الثاني لأنها تكشف انخفاض مستويات السامة للخلايا المناعية والآثار الجانبية الناجمة عن التعبير عن البروتينات الفيروسية 5-8.

ومع ذلك بروتوكول الموصوفة هنا هو المزيد من الوقت والعمل المكثف من لناقلات أخرى الفيروسية مثل LV- أو AAV-ناقلات فضلا عن أول أو ثاني AdVs جيل. والعقبة الرئيسية هي استنساخ الجينات المحورة الكبيرة ونقل لاحقا إلى البلازميد إنتاج فيروس pAdV-FTC. استخدام endonucleases صاروخ موجه PI- SCE الأول وI- سيو أقدم الإدراج دقيقة وموجهة من التحوير من المكوك البلازميد pHM5، ولكن لديهم عيوب الالتصاق بقوة على الحمض النووي المشقوق. لهذا السبب الخطوات الضرورية العديد من تنظيف الفينول كلوروفورم عند إعداد plasmid- وإدراج-DNA أثناء إجراء الاستنساخ. ولذلك، بدقة بعد بروتوكول الاستنساخ شريطة أن أوصى بدقة. بعد إصدارها استنساخ الجينوم HCAdV من pAdFTC البلازميد بواسطة Not I تقييد انزيم الهضم وtransfected في وقت لاحق إلى خط الخلية المنتجة. لاحظ أن الكفاءة ترنسفكأيشن الأولية حاسمة لتحقيق التضخيم فيروس كافية. الأهم من ذلك أن بروتوكول يقدم العديد من الخطوات من الذي يمكن إعادة الإجراء في حال فشلت الخطوات اللاحقة. خلال مرحلة ما قبل التضخيم ثلث لست] يمكن تخزينها والنسخ الاحتياطي لبدء إجراء من تلك النقطة مرة أخرى أو لتقصير تكرار في حالة يحتاج الى مزيد من الفيروسات التي يتم إنتاجها.

HCAdV تحمل الجينات المحورة الكبيرة والمعقدة أو عدة أو بعض DNA ستوفير قد يكون تضخيم أبطأ مما كان متوقعا. ولذلك، من المهم أن تتبع دقيق لعملية ما قبل التضخيم قبل يزرع ثقافة تعليق في قارورة الدوار. إذا قبل التضخيم غير ناجح، يجب أن توقف الإجراءات وبدأ من البداية مرة أخرى. إذا قبل التضخيم غير فعالة، قد يكون من الضروري الركض إضافية حتى كمية الفيروس مرتفع بما يكفي لتصيب الخلايا المزروعة في 3 L الدوار قارورة. كبديل لثقافة تعليق في قارورة الدوار، 20-30 150 ملم الأطباق ثقافة الأنسجة يمكن أن تستخدم لمرور النهائي. ومع ذلك، قد يكون هذا مزيدا من الوقت والعمل المكثف.

الطبقة = "jove_content"> وخلال CSCL التدرج الطرد المركزي أنه سيكون مفيدا لتقسيم المحللة من القارورة الدوار إلى قسمين الكسور وتدور كل منها على حدة لأن هذا لن يقلل بشكل كبير التتر الفيروس. حالما يتم إنتاج HCAdV معدية بنجاح فمن السهل نسبيا لإعادة تضخيم-المخزون الفيروسي بثقافة تعليق من قارورة الدوار مع الجسيمات الفيروسية النقاء وHV-تصيب المشترك.

لقياسات QPCR gDNA يمكن أن تكون إما تنقيته عبر بروتوكول المذكورة هنا أو أي مجموعة المتاحة تجاريا لعزل gDNA من الخلايا المستزرعة. باستخدام عدة المتاحة تجاريا بروتوكول يمكن تقصير مدة يوم واحد ولكن جزء متفاوتة من النسخ HCAdV الجينوم التي تكون موجودة في الخلايا المصابة قد تفقد خلال تنقية، وهذا يتوقف على عدة المستخدمة. لذلك الجينوم HCAdV ستكون ممثلة تمثيلا ناقصا بشكل طفيف في القياسات التالية Q-PCR بالمقارنة مع الطريقة المعروضة في الخطوة 7.4).

Obtaiمجموع التتر المعدية نيد في إعداد واحد متجه النهائي المستمدة من الدوار واحد مجموعة من قارورة 1 × 10-05 أكتوبر × 10 11 الجسيمات المعدية. هذا المبلغ يكفي لإجراء العديد من التجارب في المختبر. تعتمد على الخلايا المستهدفة، أيضا العديد من التجارب المجراة في ويمكن إجراء. على سبيل المثال، لتحقيق تنبيغ الكبد كافية بعد إدارة النظامية المطلوبة 1 × 10 9 جزيئات معدية.

وباختصار، فإن tropism خلية واسعة وإمكانية لإنتاج المعدلة قفيصة اتش جنبا إلى جنب مع تحسن البيانات الشخصية سلامة HCAdV ناقلات خالية من جميع الجينات الفيروسية تقديم هذه النظام ناقلات HCAdV أداة ذات قيمة عالية للتطبيقات العلاجية الجينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I-CeuI New England Biolabs R0699S restriction digest
PI-SceI New England Biolabs R0696S restriction digest
T4 Ligase New Engand Biolabs M0202S ligation
SwaI New England Biolabs R0604S restriction digest
NotI New England Biolabs R0189S restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) New England Biolabs M0290S dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B PAN Biotech P02-015 selection of CRE expressing 116 cells
DMEM PAN Biotech P04-03590    Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle PAN Biotech P04-08500 116 cell culture medium  
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) PAN Biotech P04-36500 washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle Sigma CLS430281-24EA infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes Sigma CLS431123-36EA sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask Bellco 1965-61030 growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes Beckmann Coulter 344059 density gradient centrifugation
Ultracentrifuge Beckmann Coulter density gradient centrifugation
SW-41 rotor Beckmann Coulter density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane VWR 132129 dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes  Thermo 66383 dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli invitrogen C4040-52 transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495 midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit  Peqlab 12-3396-02 isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305 tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS) Gibco 31985-062 transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix BioRad  170-8882 q-PCR
CFX 96 C1000 touch  Biorad qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol  Carl Roth A156.1 purification of DNA
Cesium chloride Carl Roth 8627.1 density gradient centrifugation
sodium acetate 99% Carl Roth 6773.2 DNA precipitation
LB medium  Carl Roth X968.3 bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure Carl Roth 9065.5  DNA precipitation and washing
SDS 99.5% Carl Roth 2326.2 lysis  buffer
EDTA Carl Roth 8043.2 lysis  buffer
Tris-HCl 99% Carl Roth 9090.3 dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5% Carl Roth 3783.1 dialysis buffer
MgCl2 98.5% Carl Roth KK36.2 dialysis buffer
NaCl Carl Roth 3957.1 optional dialysis buffer
KH2PO4 Carl Roth 3904.2 optional dialysis buffer
sucrose Carl Roth 9286.1 optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O Carl Roth 4984.2 optional dialysis buffer
1.5-ml tubes sarstedt 72,730,005 storage of virus preparations at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10, (5), 440-447 (1999).
  2. Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25, (1), 3-11 (2014).
  3. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (24), 13565-13570 (1996).
  4. Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 8, (5), 846-852 (2003).
  5. Morral, N., et al. High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity. Hum Gene Ther. 9, (18), 2709-2716 (1998).
  6. Muruve, D. A., et al. Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo. J Virol. 78, (11), 5966-5972 (2004).
  7. Ehrhardt, A., et al. A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia. Blood. 102, (7), 2403-2411 (2003).
  8. Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects. Curr Gene Ther. 13, (5), 370-381 (2013).
  9. Mizuguchi, H., Kay, M. A. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 9, (17), 2577-2583 (1998).
  10. Mizuguchi, H., Kay, M. A. A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10, (12), 2013-2017 (1999).
  11. Ehrhardt, A., Kay, M. A. A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood. 99, (11), 3923-3930 (2002).
  12. Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nat Protoc. 4, (4), 547-564 (2009).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics