मानव Adenovirus प्रकार 5 पर आधारित उच्च क्षमता adenoviral वैक्टर की क्लोनिंग और बड़े पैमाने पर उत्पादन

Bioengineering

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Ehrke-Schulz, E., Zhang, W., Schiwon, M., Bergmann, T., Solanki, M., Liu, J., Boehme, P., Leitner, T., Ehrhardt, A. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (107), e52894, doi:10.3791/52894 (2016).

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Abstract

Introduction

जीन चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए यह वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति, ट्रांस्जीन स्वयं के द्वारा या आने वाले वायरल प्रोटीन की वजह से साइटोटोक्सिक और immunogenic दुष्प्रभाव से बचने के लिए बहुत महत्व का है। Adenovirus वैक्टर (अभिभाषक) व्यापक रूप से transgene अभिव्यक्ति 1,2 के प्रभाव की जांच करने के लिए कोशिकाओं की एक विस्तृत विविधता में विदेशी डीएनए लागू करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। अभिभाषक का सबसे उन्नत संस्करण सभी वायरल कोडिंग दृश्यों 3,4 और इस तरह कम प्रतिरक्षाजनकता और कम विषाक्तता 5-8 के साथ संयुक्त 35 केबी के लिए एक पैकेजिंग क्षमता की पेशकश की कमी उच्च क्षमता एडीनोवायरस वैक्टर (HCAdV) का प्रतिनिधित्व करती है। कारण उनके उच्च पैकेजिंग क्षमता के लिए वे एक ही वेक्टर खुराक का उपयोग बड़े या एकाधिक Transgenes के वितरण की अनुमति है। इसलिए, वे अनुसंधान समुदाय के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रतिनिधित्व करते हैं।

इसके विपरीत, ग्राम शिक्षा समिति के पहली या दूसरी पीढ़ी के अभिभाषक आसानी से वाणिज्यिक किट का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकता है कि जल्दी जीन E1 और / या E3 कमी करने के लिएटो HCAdV के जीनोम निर्माण और वायरस उत्पादन अधिक जटिल है। HCAdV जीनोम के निर्माण के लिए प्रणाली सभी वायरल कोडिंग दृश्यों और शटल प्लाज्मिड pHM5 9-12 से रहित एक HCAdV जीनोम ले जाने प्लाज्मिड pAdFTC पर आधारित है। अप करने के लिए 14 किलो कुर्सियां ​​(केबी) के हित के किसी भी जीन कई क्लोनिंग साइट मान्यता से घिरे हुए है जिसमें शटल वेक्टर pHM5 में क्लोन किया जा सकता है / घर वापस आना endonucleases की साइटों cleaving Sce मैं और मैं- Ceu आई PI- इसलिए, ब्याज की एक क्लोन जीन लगातार PI- Sce मैं और मैं- Ceu मैं द्वारा प्लाज्मिड pAdFTC में निहित HCAdV जीनोम में मौजूद ही प्रतिबंध साइटों में बाद में निर्देशित प्रविष्टि के लिए हज़म जारी किया जा सकता है। PAdFTC में PI- Sce मैं और मैं- Ceu मैं साइटों दरार के बीच स्थित ट्रांस्जीन प्रविष्टि साइट stuffer डीएनए और इस तरह के 5 'और' 3 उल्टे रूप में टर्मिनल दोहराता जीनोम पैकेजिंग के लिए आवश्यक noncoding adenoviral दृश्यों (ITRS) से घिरे हुए हैसमाप्त होता है और 5'ITR के बहाव पैकेजिंग संकेत दोनों पर। अतिरिक्त stuffer डीएनए वायरस उत्पादन के दौरान कुशल पैकेजिंग सुनिश्चित करने के लिए 27 से 36 केबी से लेकर अंतिम HCAdV जीनोम का इष्टतम आकार प्रदान करता है। PAdFTC (डाला ट्रांस्जीन के आकार पर निर्भर) अप करने के लिए 45 केबी के साथ एक बड़े प्लाज्मिड और तुलनात्मक रूप में लंबे समय के डीएनए मान्यता साइटों के साथ घर वापस आना endonucleases के उपयोग के बाद से बाध्यकारी मजबूत डीएनए, कई सफाई कदम pHM5 से ट्रांस्जीन के स्थानांतरण के दौरान आवश्यक हैं दर्शाती है pAdFTC करने के लिए। बाल काटना बलों से बचने सावधानी से निपटने की सिफारिश की है।

HCAdV जीनोम के ITRS 5'ITR के अपस्ट्रीम सीधे स्थित है और 3'ITR 12 के बहाव नहीं है कि मैं प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइटों से घिरे रहे हैं। इसलिए, HCAdV नहीं है कि मैं HCAdV निर्माता सेल लाइन में वायरल जीनोम के बाद अभिकर्मक के लिए डाइजेस्ट द्वारा जारी किया जा सकता है। ध्यान दें कि प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग नहीं है कि मैं रिलायंस एनर्जी के लिएप्लाज्मिड pAdFTC से वायरल जीनोम की आसानी डाला ट्रांस्जीन नहीं है कि मैं डीएनए मान्यता साइटों से रहित है कि निकलता है। HEK293 सेल आधारित उत्पादक कोशिकाओं (116 कोशिकाओं) स्थिरतापूर्वक Cre Recombinase व्यक्त करते हैं। वायरस प्रवर्धन के लिए 116 कोशिकाओं किन्नर 3,4 में प्रतिकृति और पैकेजिंग के लिए आवश्यक सभी अभिभाषक जीन उपलब्ध कराने के एक सहायक वायरस (एचवी) के साथ सह-संक्रमित हैं। एचवी 116 कोशिकाओं 4 में व्यक्त Cre Recombinase द्वारा वायरस प्रवर्धन के दौरान हटा दिया जाता है, जो एक floxed पैकिंग संकेत के साथ एक पहली पीढ़ी के अभिभाषक है। यह एक अक्षुण्ण पैकेजिंग संकेत युक्त मुख्य रूप से HCAdV जीनोम encapsidated कर रहे हैं कि सुनिश्चित करता है।

HCAdV की पूर्व प्रवर्धन टिशू कल्चर व्यंजन में सतहों पर हो 116 कोशिकाओं में सीरियल passaging के कदम का आयोजन किया जाता है। प्रत्येक पारित होने के बाद वायरल कणों लगातार तीन फ्रीज पिघलना कदम के संचालन से संक्रमित कोशिकाओं से जारी कर रहे हैं। कोशिकाओं की संख्या बढ़ रही है हर बीतने के साथ संक्रमित हैं साथपूर्ववर्ती पारित होने से सेल lysate का 1/3। पिछले पूर्व प्रवर्धन कदम बड़े पैमाने प्रवर्धन के लिए एक स्पिनर फ्लास्क में निलंबन में विकसित उत्पादक कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए प्रयोग किया जाता है से अंत lysate। Virions 4,12 ढाल एक सीज़ियम क्लोराइड घनत्व में ultracentrifugation प्रदर्शन से निलंबन कोशिकाओं से शुद्ध कर रहे हैं। इस प्रक्रिया के साथ खाली कणों और पूरी तरह से इकट्ठे कणों दो अलग-अलग बैंड में अलग हो रहे हैं। आगे HCAdV ध्यान केंद्रित करने के लिए एक दूसरे गैर क्रमिक ultracentrifugation कदम किया जाता है कण। इसके बाद HCAdV युक्त जिसके परिणामस्वरूप बैंड एकत्र की है और एक शारीरिक बफर के खिलाफ dialyzed है। अंतिम वेक्टर की तैयारी पूर्ण वायरल कणों, संक्रामक कणों और एचवी संदूषण के स्तर की संख्या के संबंध में विशेषता है। निरपेक्ष वायरल कणों वायरल कणों lysing और 260 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा या मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) 12 प्रदर्शन से निर्धारित किया जा सकता है। पुर की संक्रामकताified वायरस कणों संक्रमित कोशिकाओं 3 घंटा बाद संक्रमण के भीतर मौजूद qPCR मापने HCAdV जीनोम द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।

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Protocol

प्लाज्मिड pAdFTC पर आधारित संयोजक HCAdV जीनोम के 1. निर्माण

नोट: सभी प्लास्मिडों पहले 11,12 वर्णित है और अनुरोध पर उपलब्ध हैं कर दिया गया है। क्लोनिंग प्रक्रिया रेखाचित्र के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है।

  1. PHM5-भारत सरकार उत्पन्न करने के लिए, अपनी पसंद की एक क्लोनिंग रणनीति का प्रयोग, शटल प्लाज्मिड pHM5 में प्रमोटर और polyadenylation संकेत (देहात) सहित ब्याज की एक जीन (भारत सरकार) क्लोन।
    नोट: pAdFTC एक अपेक्षाकृत बड़े प्लाज्मिड है के बाद से, शास्त्रीय प्लाज्मिड तैयारी प्रोटोकॉल सिलिका झिल्ली पर आधारित हैं कि वाणिज्यिक प्लाज्मिड शुद्धि किट का उपयोग करके प्लास्मिड डीएनए की sheering से बचने के लिए सिफारिश कर रहे हैं। मैं- Ceu मैं और पीआई -Sce मैं दृढ़ता से डीएनए के लिए बाध्य है और पचा डीएनए के electrophoretic गतिशीलता बदल जाते हैं। इसलिए, एक फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और EtOH वर्षा (1.3 कदम) agarose जेल वैद्युतकणसंचलन पहले आवश्यक है।
  2. PHM की डाइजेस्ट 20 माइक्रोग्राम100 μl की कुल मात्रा में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए मैं-CeuI (10 यू) द्वारा 5-भारत सरकार और pAdFTC की 10 माइक्रोग्राम (~ 2.8 केबी + भारत सरकार ओआरएफ अनुक्रम और ~ 31kb, क्रमशः) प्लास्मिडों linearize करने के लिए।
  3. इथेनॉल (EtOH) वर्षा 13 से पीछा फिनोल के क्लोरोफॉर्म निकासी का उपयोग कर linearized प्लास्मिडों शुद्ध।
    1. क्लोरोफॉर्म: 100 फिनोल के μl जोड़ें isoamyl शराब और ट्यूब कई बार inverting द्वारा धीरे मिश्रण। 15,000 एक्स जी पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    2. एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला सोडियम एसीटेट के 20 μl (पीएच 5, 3 एम) और बर्फ के 400 μl ठंड EtOH (99.8%) जोड़ने के लिए और सख्ती निलंबन मिश्रण। 15,000 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    3. सतह पर तैरनेवाला निकालें 15,000 एक्स जी पर 2 मिनट के लिए 300 में 70% EtOH के μl और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। फिर सतह पर तैरनेवाला और हवा शुष्क डीएनए गोली निकाल दें। DH 2 ओ के 10 से 20 μl में गोली भंग यह समाधान में डीएनए पाने के लिए कठिन हो जाएगा, के रूप में भी लंबे समय से सूखा नहीं डीएनए गोली मत करो।
  4. डाइजेस्ट मैं-Ceu मैं pHM5-भारत सरकार और 1.3 कदम से pAdFTC प्लाज्मिड) -digested 50 μl की कुल मात्रा में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिबंध एंजाइम पीआई -Sce मैं (10 यू) के साथ कम से कम 3 घंटा या हे / N के लिए और बाद में मैं शुद्ध -CeuI और पीआई -Sce मैं (1.3 चरण देखें) EtOH तेज़ी से पीछा फिनोल के क्लोरोफॉर्म निकासी का उपयोग कर प्लास्मिडों पच। Nuclease मुफ्त DH 2 ओ के 20 μl में डीएनए भंग
  5. अलग pHM5 प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी (2.8 केबी) और एक प्रारंभिक agarose जेल पर (1.4 कदम से) भारत सरकार और एक वाणिज्यिक gel- का उपयोग करते हुए भारत सरकार जेल को शुद्ध और साफ-अप किट PCR-। डाइजेस्ट का एक प्रतिनिधि agarose जेल चित्रा 2A में दिखाया गया है।
  6. Dephosphorylate मैं- Ceu मैं और पीआई -Sce pAdFTC मैं पचा 25 μl की कुल मात्रा में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए बछड़ा आंतों alkaline फॉस्फेट सीआईपी (10 यू) के साथ और फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और बाद EtOH के द्वारा dephosphorylated प्लाज्मिड pAdFTC शुद्ध (1.4 कदम से) जनसंपर्कecipitation (1.3 चरण)। Nuclease मुफ्त DH 2 ओ के 20 μl में डीएनए Elute
  7. हज़म पूरा कर रहे हैं और उम्मीद टुकड़ों का आकार (सही हैं ~ linearized pAdFTC के लिए 31 केबी का विश्लेषण करने के लिए (1.6 कदम से) dephosphorylated pAdFTC प्लाज्मिड और (1.5 कदम से) शुद्ध भारत सरकार-टुकड़ा के एक विभाज्य से विश्लेषणात्मक जेल वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करना )।
    नोट: भारत सरकार के आकार transgene अभिव्यक्ति कैसेट के आकार पर निर्भर चर रहा है। बाद में बंधाव के लिए संबंधित टुकड़े के रिश्तेदार सांद्रता का अनुमान है। शुद्ध टुकड़े का एक प्रतिनिधि agarose जेल चित्रा 2B में दिखाया गया है।
  8. 400 यू टी -4 के डीएनए ligase और 1 के डालने के लिए वेक्टर के एक दाढ़ अनुपात का उपयोग 20 μl की कुल मात्रा में बंधाव प्रतिक्रिया सेट अप: 3।
    नोट: चित्रा 2 बी में दिखाया गया agarose जेल के साथ सामंजस्य में हम आम तौर पर, 6-μl वेक्टर के लिए 2 के साथ 20 μl की कुल मात्रा में 8 से 12 μl ligateडालने और 400 यू टी -4 के डीएनए ligase। डीएनए एकाग्रता कई phenolization कदम के बाद आम तौर पर कम है, के रूप में 20 μl की अंतिम मात्रा तक पहुँचने के लिए कोई अतिरिक्त एच 2 ओ जोड़ा जाना है, इसलिए है कि जितना संभव हो उतना डीएनए का उपयोग करें। EtOH वर्षा (1.3 चरण) द्वारा पीछा फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण प्रदर्शन बाद में 16 डिग्री सीओ / एन पर ligate और।
    1. Nuclease मुफ्त DH 2 हे के 15 μl में डीएनए Elute और 20 μl की कुल मात्रा में 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए प्रतिबंध एंजाइम स्वाई (10 यू) के साथ शुद्ध बंधाव प्रतिक्रिया पचाने। फिर ध्यान केंद्रित करने और EtOH वर्षा (1.3 चरण) द्वारा पीछा फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण प्रदर्शन से डीएनए शुद्ध। Nuclease मुफ्त DH 2 ओ के 10 μl में डीएनए Elute
  9. शुद्ध स्व के 2 μl रूपांतरण मैं DH10B में electroporation द्वारा बंधाव उत्पाद पचा या DH5α electrocompetent कोलाई और एम्पीसिलीन युक्त लेग पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटा से 24 के लिए चयन क्लोनप्लेट (50 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन)। 5 10 क्लोन का चयन करें और फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और बाद EtOH वर्षा (1.3 चरण) 13 से पीछा क्षारीय सेल का उपयोग कर प्लास्मिड डीएनए मिनी तैयारियों तैयार करते हैं।
  10. डीएनए टुकड़े के आकार की जाँच करने के लिए agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीछा प्लाज्मिड मिनी तैयारियों का एक विश्लेषणात्मक डाइजेस्ट प्रदर्शन करते हैं। सुझाए गए प्रतिबंध एंजाइमों उदाहरण मैं- Ceu मैं और PI- Sce मैं डालने, spe मैं या Hinc द्वितीय (चित्रा -2) जारी करने के लिए कर रहे हैं।
  11. एम्पीसिलीन युक्त लेग माध्यम में एक सही क्लोन बढ़ाना (50 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन) और किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लाज्मिड शुद्धि किट का उपयोग कर एक midi- या मैक्सी प्लाज्मिड तैयारी करते हैं।

निर्माता सेल लाइन 116 में pAdFTC प्लाज्मिड और HCAdV वैक्टर की preamplification से HCAdV-जीनोम की 2. रिलीज

  1. कदम 1.11 से क्लोन भारत सरकार युक्त pAdFTC आधारित adenoviral उत्पादन प्लाज्मिड) में 20 माइक्रोग्राम डाइजेस्टकुल> 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नहीं है कि मैं (20 यू) का उपयोग कर 100 μl की मात्रा और प्रदर्शन फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण दो बार EtOH वर्षा द्वारा पीछा किया। 20- 30 μl बाँझ DH 2 ओ में भंग
  2. जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पतला 1:10 पचा pAdFTC-भारत सरकार के डीएनए के एक विभाज्य की जाँच करें। भारत सरकार, HCAdV जीनोम (आकार: 28 36 केबी) के लिए एक दूसरे डीएनए टुकड़ा के आकार पर निर्भर करता है एक 9 KB प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी के लिए टुकड़ा और, का पता लगता है।
    नोट: यह नहीं कि मैं डाइजेस्ट का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 2 डी में प्रदर्शित किया जाता है। Linearized डीएनए कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर या -20 डिग्री सेल्सियस पर कई दिनों के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  3. प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले, सहायक वायरस AdNG163R-2 से 4 परिलक्षित किया गया है कि यह सुनिश्चित कर लें।
    नोट: pAdFTC निकाली गई HCAdV वैक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2), उचित रोकथाम और अपशिष्ट हैंडलिंग का उपयोग करें के रूप में वर्गीकृत आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों हैंबीएसएल -2 लामिना का प्रवाह डाकू के तहत व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, और काम सहित उपायों,।
  4. सदस्य ईगल माध्यम में संस्कृति 116 कोशिकाओं 10% FBS और hygromycin बी (/ एमएल 100 माइक्रोग्राम) के साथ पूरक। (पारित होने के 10 से नीचे) बीज कम बीतने वे 50- 80% confluency अगले दिन तक पहुँचने के लिए इतना है कि अभिकर्मक से पहले एक 60 मिमी टिशू कल्चर पकवान एक दिन में 116 कोशिकाओं (~ 0.4x 10 6 कोशिकाओं)।
  5. जैसे कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक या अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक अभिकर्मकों (चित्रा 3) के रूप में तरीकों का उपयोग करके 116 कोशिकाओं में कदम (2.1) से linearized HCAdV जीनोम Transfect। 16- 18 घंटा बाद अभिकर्मक, ध्यान से सेल प्रति (एक मिला हुआ क्योंकि एचवी AdNG163R -2 4 5 transducing इकाइयों को लागू करने (टीयू) के साथ कोशिकाओं 3 मिलीलीटर जोड़ने, ताजा मध्यम (सदस्य, 5% FBS) के मध्यम हटाने और संक्रमित 60 मिमी टिशू कल्चर पकवान ~ 3.2x 10 6 सेल शामिल हैं), एचवी की ~ 1.6x 10 7 टीयू जोड़ें।
    1. धीरे करने के लिए संक्रमण के बाद पहले घंटे के दौरान पकवान हर 20 मिनट के लिए कदमबराबर एचवी वितरण किया जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर संक्रमित कोशिकाओं को खेती और 5% सीओ 2। वायरस नकल की वजह से कुशल वायरस प्रवर्धन संबंधी प्रभाव (सीपीई) के मामले में मानने योग्य है (कोशिकाओं को गोल और शिथिल संलग्न या टिशू कल्चर पकवान से अलग कर रहे हैं) के बाद infection.If सीपीई मनाया जाता है 48 घंटा पहले एचवी की राशि के लिए है कम किया गया। सीपीई बाद में शुरू होता है, अधिक सहायक वायरस इस्तेमाल किया जा रहा है।
  6. संस्कृति के माध्यम का उपयोग कर संस्कृति डिश से कोशिकाओं को बंद निस्तब्धता से सतह पर तैरनेवाला 48 घंटा के बाद संक्रमण सहित हार्वेस्ट कोशिकाओं। उनकी संस्कृति माध्यम में निलंबित कर रहे हैं कि प्रकोष्ठों बीतने के 0 (P0) कहा जाता है। दो भागों में विभाजित करें P0।
    1. अलग कोशिकाओं के 0.5 मिलीलीटर 2,000 XG पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं नीचे स्पिन और सेल गोली से मध्यम हटाने से, कि बाद में प्रवर्धन प्रक्रिया की qPCR आधारित विश्लेषण के लिए जीनोमिक डीएनए (gDNA) को अलग-थलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है। आगे की प्रक्रिया जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर सेल छर्रों।
    2. 2.5 सेअलग कोशिकाओं की मिलीलीटर उनके माध्यम तीन से चार बार में resupended कर रहे हैं कि कोशिकाओं (तरल नाइट्रोजन -80 डिग्री सेल्सियस पर या में) ठंड और (एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान आरटी पर या में) विगलन द्वारा वायरल कणों जारी। यह अंश P0 के बुलाया lysate से अधिक है।
  7. FBS (10%) और hygromycin बी (100 माइक्रोग्राम / एमएल) और एचवी के साथ पूरक सदस्य माध्यम का उपयोग कर 90- 95% confluency के लिए बड़े हो रहे हैं कि 116 कोशिकाओं के साथ कि टिशू कल्चर व्यंजन सुनिश्चित निम्नलिखित passaging के कदम के लिए उपलब्ध हैं।
  8. एक 60 मिमी ऊतक के बाद से सेल (2 प्रति टीयू लागू करने एचवी जोड़ने के लिए, 3.5 मिलीग्राम के अंतिम मात्रा करने के लिए पूर्ववर्ती बीतने (कदम 2.6.2) से lysate के 2.5 मिलीलीटर के साथ ताजा मीडिया (सदस्य, 5% FBS) के 1 मिलीलीटर मिक्स 90- 95% की एक confluency पर संस्कृति पकवान ~ 3.2x 10 6 सेल शामिल हैं), एचवी की ~ 6.4x 10 6 टीयू जोड़ें। (चित्रा 3 बी)। ध्यान से 116 कोशिकाओं के एक 60 मिमी पकवान से मध्यम हटाने और कोशिकाओं को वायरल मिश्रण जोड़ें। दोहराएँ कदम 2.6) - 2.8) दो बार पास के lysates प्राप्त करने के लिएउम्र P1 और P2।
  9. ~ शामिल p2 से lysate के 2.5 मिलीलीटर के साथ 17.5 मिलीलीटर ताजा मीडिया (सदस्य, 5% FBS) मिश्रण और 80- 100% की एक confluency पर एक 150 मिमी टिशू कल्चर पकवान के बाद से सेल (2 प्रति टीयू लागू करने एचवी जोड़ने 2x 10 7 कोशिकाओं,) ~ एचवी की 4x 10 7 टीयू जोड़ें। 116 कोशिकाओं की एक 150 मिमी पकवान से मध्यम निकालें और वायरल मिश्रण के साथ कोशिकाओं को संक्रमित। 37 डिग्री सेल्सियस पर संक्रमित कोशिकाओं को खेती और 5% सीओ 2।
  10. के रूप में 2.6 चरण में वर्णित 48h के बाद संक्रमण फसल कोशिकाओं) पारित होने के पी 3 (चित्रा 3 बी) प्राप्त करने के लिए।
    1. दोहराएँ कदम 2.6) 1।
    2. Resupended कोशिकाओं से पी 3 रिहाई वायरल कणों की शेष 19.5 मिलीलीटर से तीन से चार गुना ठंड और विगलन द्वारा। यह अंश पी 3 के बुलाया lysate से अधिक है।
      नोट: वे पर्याप्त परिलक्षित कर रहे हैं जब तक कुछ वैक्टर अंततः 150 मिमी बर्तन में अतिरिक्त मार्ग आवश्यकता हो सकती है। इसलिए पूर्व प्रवर्धन प्रक्रिया के effectivity सीरियल पास दौरान निगरानी की जरूरतउम्र बढ़ने। धारा 3 (भी चित्रा -4 ए देखें) के रूप में वर्णित प्रवर्धन प्रक्रिया की qPCR आधारित विश्लेषण किया जा सकता है। हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए एक अभिव्यक्ति कैसेट ले जाने HCAdV की पूर्व प्रवर्धन आसानी से एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन (चित्रा 4 बी) का उपयोग GFP flourecscent संकेत देख द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।

मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) का उपयोग प्रवर्धन प्रक्रिया 3. निगरानी (भी चित्रा -4 ए देखें)।

  1. 2.10) संवर्धित कोशिकाओं से gDNA के अलगाव या अपनी पसंद का एक और तरीका के लिए किसी भी व्यावसायिक डीएनए अलगाव किट का उपयोग - preamplifaction (2.6 कदम) के लिए प्रत्येक पारित होने से सेल छर्रों से gDNA अलग। इष्टतम पीसीआर परिणामों के लिए संभव के रूप में नए रूप gDNA का उपयोग करें। अन्यथा gDNA तक आगे उपयोग -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. एक मानक वक्र 10 1 उपयोग करते हुए उत्पन्न qPCR विश्लेषण से संबंधित पारित होने की कोशिकाओं में मौजूद HCAdV जीनोम की संख्या निर्धारित करने के लिए </ Sup> - 10 HCAdV जीनोम में निहित भारत सरकार को ले जाने के लिए एक प्लाज्मिड की 9 प्रतियां।
  3. HCAdV जीनोम में निहित भारत सरकार के लिए विशिष्ट प्राइमरों के 400 एनएम का उपयोग qPCR लागू करने P0- पी 3 (कदम 2.6- 2.10) से gDNA का एक ही राशि का विश्लेषण करें। संबंधित qPCR रसायनों की qPCR का पालन निर्माता के निर्देशों के संचालन के लिए। इस प्रकार के रूप qPCR कार्यक्रम निर्धारित करें: पूर्व ऊष्मायन 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, 10 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्रों में प्रवर्धन, 15 एस के लिए 55 से 60 डिग्री सेल्सियस और 20 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए। मानक वक्र के आधार पर प्रतिक्रिया में HCAdV जीनोम की संख्या अंतर्वेशित जा सकता है।

निलंबन में बढ़ रहा है 116 कोशिकाओं में HCAdV वैक्टर की 4. बड़े स्केल प्रवर्धन

  1. एक 3 एल स्पिनर संस्कृति कुप्पी (चित्रा 3 बी) में 10% FBS और hygromycin बी (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) ताजा सदस्य के 900 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. 1 के साथ कम से कम 10 व्यक्ति 150 मिमी टिशू कल्चर व्यंजन से मध्यम निकालें16 कोशिकाओं 90- 100% की एक confluency पर हो गई है और 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को बंद निकलवाने ताजा पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) सदस्य एफबीएस (10%) और एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग hygromycin बी (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक। पिपेट और नीचे कई बार एक सजातीय सेल निलंबन पाने के लिए। पहले से ही) 4.1 चरण से 900 मिलीग्राम से युक्त स्पिनर फ्लास्क में सीधे कोशिकाओं स्थानांतरण।
    नोट: यह नकारात्मक निलंबन कोशिकाओं के विकास को प्रभावित कर सकता है के रूप में / trypsin EDTA का प्रयोग न करें। मध्यम को हटाने के बाद तुरंत स्पिनर फ्लास्क में कोशिकाओं को हस्तांतरण। एक समय में दो से अधिक टिशू कल्चर व्यंजन संभाल नहीं है। लंबे समय तक प्रतीक्षा समय और अधिक कठिन ताजा मीडिया को जोड़ने के बाद यह टिशू कल्चर पकवान से कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जाएगा।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में एक चुंबकीय दोषी पर इष्टतम सेल के विकास को सेते स्पिनर कुप्पी को सुनिश्चित करने और 5% सीओ 2 के लिए। कांच की सतहों के लिए कोशिकाओं की कुर्की से बचने के लिए 70 rpm के लिए चुंबकीय उत्तेजक समायोजित करें। स्पिनर संस्कृति फ्लास्क में विकसित कोशिकाओं व्यवहार्य रहे हैं कि क्या है और वे पर्याप्त मात्रा में विकसित करने के लिए है कि क्या जांच करने के लिए स्पिनर संस्कृति कुप्पी में सेल के विकास की निगरानी करें। एक 60 मिमी टिशू कल्चर पकवान बायोरिएक्टर से ताजा माध्यम हस्तांतरण 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए पहले हर बार। एक खुर्दबीन के तहत सेल आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें।
    नोट: संस्कृति के माध्यम में चल गुच्छों बनाने कोशिकाओं इष्टतम विकास और व्यवहार्यता (भी चित्रा 4C देखें) संकेत मिलता है। 24 घंटे के बाद वे टिशू कल्चर पकवान की सतह पर कालोनियों के रूप में। 30- 50% संगम इष्टतम घनत्व इंगित करता है।
  4. 24 घंटा स्पिनर संस्कृति कुप्पी की स्थापना के बाद hygromycin बी (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक ताजा मीडिया की 500 मिलीलीटर (सदस्य, 10% FBS) जोड़ें। 24 घंटा बाद में इस चरण को दोहराएँ।
  5. 72 घंटा स्पिनर संस्कृति को स्थापित करने के बाद, सेल निलंबन के 3 एल की कुल मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप hygromycin बी (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ नए सिरे से सदस्य मीडिया (10% FBS) के 1,000 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. 24 घंटा ए वी तक पहुंचने के बादआरटी पर 500 XG पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा तीन लीटर, फसल 116 निलंबन कोशिकाओं के olume। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। टिशू कल्चर हुड के नीचे खाली कर दिया स्पिनर संस्कृति कुप्पी रखें।
  7. ताजा सदस्य में Resuspend सेल छर्रों एक सजातीय सेल निलंबन पाने के लिए नीचे के बारे में 8 से 10 गुना Pipetting और 5% FBS के साथ पूरक। माध्यम की मात्रा 2.10 कदम) 2 से कि क्या lysate पर निर्भर करता है। 1 (19.5 मिलीलीटर, कदम 4.8 देखें)। विकल्प एक) या कदम 5.9 से HCAdV का एक शुद्ध वायरल शेयर) 2। (वायरल अनुमापांक पर depanding कई μl, कदम 4.8 देखें) 2।, विकल्प बी) कोशिकाओं के संक्रमण के लिए प्रयोग किया जाता है। 150 मिलीलीटर की कुल मात्रा का प्रयोग करें।
    1. एक विकल्प: एक बाँझ चुंबकीय हलचल बार या एक 250ml छोटे पैमाने स्पिनर फ्लास्क और से लैस एक 250 मिलीलीटर भंडारण की बोतल के लिए पी 3 (प्राथमिक प्रवर्धन) चरण में 4.8 से स्थानांतरण कोशिकाओं) से lysate साथ 116 निलंबन कोशिकाओं के संक्रमण के लिए के साथ कोशिकाओं के सह-संक्रमित पी 3 (कदम 2.10.2) और सेल प्रति एचवी के 2 टीयू से lysate के भीतर वायरस। 3x के घनत्व मानते हुए10 5 कोशिकाओं मिलीलीटर प्रति, कुल सेल नंबर 9x 10 8 कोशिकाओं है। इस प्रकार एचवी की 1.8x 10 9 टीयू जोड़ें।
    2. विकल्प बी: शुद्ध वायरल स्टॉक के साथ 116 निलंबन कोशिकाओं के संक्रमण के लिए, एक बाँझ चुंबकीय हलचल बार या एक 250ml छोटे पैमाने स्पिनर फ्लास्क और से लैस एक 250 मिलीलीटर भंडारण की बोतल के लिए कदम 4.8 से स्थानांतरण कोशिकाओं) 100 वायरल कणों के साथ कोशिकाओं के सह-संक्रमित (कदम 5.9 से) पूर्व में शुद्ध HCAdV 2 के सेल प्रति।)। शुद्ध HCAdV की और एचवी की 1.8x 10 9 टीयू; (6 कदम 260nm पर absorbance द्वारा मापा जाता है) इस प्रकार भौतिक अनुमापांक के अनुसार 9x 10 10 वीपी जोड़ें।
  8. 60 rpm पर 2 घंटे के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में एक चुंबकीय दोषी पर में सितम्बर 4.8.1) या 4.8.2) से सेल-वायरस मिश्रण हिलाओ और 5%। भंडारण की बोतल पूरी तरह से हवा परिसंचरण अनुमति देने के लिए बंद नहीं है कि सुनिश्चित करें।
  9. 2 घंटा के बाद संक्रमण 3 एल स्पिनर पंथ में वापस सेल वायरस मिश्रण की कुल मात्रा का स्थानांतरणUre फ्लास्क और 48 घंटा में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 2 एल की कुल मात्रा को 5% FBS के साथ पूरक ताजा पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) सदस्य मीडिया के 1,850 मिलीलीटर जोड़ने और सेते 70 आरपीएम।
  10. 500 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में आरटी पर 890x जी पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं। मध्यम निकालें और DPBS की 28 मिलीलीटर की कुल मात्रा में pelleted कोशिकाओं resuspend। एक सजातीय सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए नीचे से ऊपर पिपेट और। निलंबन पूरी तरह से जमे हुए है, यकीन है कि तरल नाइट्रोजन में या -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल वायरस निलंबन रुक। वायरस शुद्धि से शुरू होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल वायरस निलंबन स्टोर।

5. शोधन और HCAdV की डायलिसिस

  1. , सीज़ियम क्लोराइड (CsCl) ढ़ाल के लिए वायरल lysate तैयार 37 डिग्री सेल्सियस चार बार में एक पानी के स्नान में तरल नाइट्रोजन और पिघलना में कदम 4.11 से सेल-वायरस निलंबन) फ्रीज करने के लिए।
  2. आर में 8 मिनट के लिए 500 XG पर वायरल lysate अपकेंद्रित्रटी और HCAdV युक्त सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  3. Ultracentrifugation, और 31,25 जी (1.35 ग्राम / 3 सेमी के लिए), 33.5 ग्राम (1.5 ग्राम / 3 सेमी के लिए) CsCl समाधान के रूप में follows.Weigh 37.5 छ तैयार के लिए (1.25 के लिए ग्राम / सेमी 3) CsCl पाउडर का क्रमश और भरने DH 2 हे 25 मिलीलीटर के साथ।
    1. समाधान जब तक Stirr स्पष्ट और बाँझ फिल्टर समाधान हो जाता है। अंत में एक समाधान के 1 मिलीलीटर हटाने और घनत्व सही है मौसम की जांच के लिए एक ठीक पैमाने पर तौलना। 1ml क्रमश: 1.5 ग्राम, 1.35 और 1.25 ग्राम वजन चाहिए।
    2. घनत्व बहुत अधिक है बाँझ DH 2 ओ की छोटी मात्रा में (μl) की चरणबद्ध अलावा द्वारा इसे समायोजित DH 2 हे के अलावा के बाद फिर से densitiy उपाय। यदि आवश्यक हो तो अधिक DH 2 ओ जोड़ने
    3. घनत्व सही है जब तक प्रक्रिया को दोहराएँ। घनत्व बहुत कम है CsCl पाउडर की छोटी राशि जोड़कर इसे समायोजित। बाँझ फिल्टर इसे फिर से और घनत्व की जाँच करें। घनत्व बहुत अधिक है addin द्वारा इसे समायोजितछ DH का पहले वर्णित के रूप में 2 हे। घनत्व अभी भी बहुत कम जोड़ने Mor CsCl, बाँझ फिल्टर इसे फिर से और घनत्व की जांच कर रहा है। घनत्व सही है जब तक प्रक्रिया को दोहराएँ।
  4. छह स्पष्ट ultracentrifuge ट्यूबों में CsCl कदम ढ़ाल तैयार करें। ध्यान से और धीरे निम्न क्रम का उपयोग कर ट्यूबों में CsCl समाधान पिपेट: 1.5 के 0.5 मिलीलीटर ग्राम / 3 सेमी CsCl समाधान, 1.35 के 3 मिलीग्राम ग्राम / 3 सेमी CsCl समाधान और 1.25 की 3.5 मिलीग्राम ग्राम / 3 सेमी CsCl समाधान (चित्रा -2)
  5. ओवरले ~ 1.25 ग्राम / 3 सेमी CsCl परत के शीर्ष पर कदम 5.2 से मंजूरी दे दी वेक्टर तैरनेवाला की 4.5 एमएल)। अपकेंद्रित्र खाली कणों और सेल से वायरल कणों से युक्त अलग HCAdV जीनोम के लिए धीमी गति त्वरण और मंदी के साथ 226,000 XG (35,000 आरपीएम) में कम से कम 2 घंटे के लिए 12 डिग्री सेल्सियस पर रोटर (दप-41) एक स्विंग बाहर का उपयोग कर एक ultracentrifuge में ढ़ाल मलबे।
    नोट: के शीर्ष पर सेल मलबे FORMES का इष्टतम परिस्थितियों में एक फैलाना बैंडट्यूब। दो नीचे सफेद बैंड मनाया जा सकता है। निचले बैंड HCAdV (आंकड़े -2 और 5 ए) के बराबर होती है, जबकि ऊपरी बैंड खाली कणों में शामिल है।
  6. ध्यान से सेल मलबे और खाली कणों की परतों को हटाने और एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक स्वच्छ विंदुक टिप के साथ प्रत्येक ट्यूब और हस्तांतरण वायरस से कम बैंड के 1 मिलीलीटर इकट्ठा। जी एकत्र वायरस कणों के लिए / 3 सेमी CsCl समाधान और ध्यान से मिश्रण 1.35 के 24 मिलीलीटर को जोड़ें।
  7. 1.35 ग्राम / सेमी ultracentrifuge एक में 12 डिग्री सेल्सियस पर 226.000 XG (35,000 आरपीएम) पर शीर्ष और सेंट्रीफ्यूज हे / एन (18- 20 ज) के लिए 3 CsCl वायरस समाधान रोटर एक स्विंग बाहर का उपयोग कर (दप-41 के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूब भरें ) धीमी गति त्वरण और मंदी के साथ।
  8. प्रमुख निचले बैंड में मौजूद HCAdV लीजिए। एक संभावित ऊपरी बैंड खाली कणों एक पिपेट का उपयोग कर ऊपर से ऊपरी परतों को हटाने में शामिल है के रूप में तो कम बैंड यूएसआई दूर ले (आंकड़े -2 और 5 ब देखें)एक पिपेट एनजी।
  9. बफर आदान प्रदान के लिए एकत्र वायरस कणों dialyze।
    1. लंबाई में लगभग 8 सेमी की तीन बार के लिए बाँझ DH 2 हे के साथ इसे धोने: डायलिसिस ट्यूबिंग (50,000 MWCO) की एक पट्टी काट दिया। फिर एक प्लास्टिक क्लैंप के साथ डायलिसिस ट्यूबिंग के एक तरफ बंद करने और एक 1-एमएल पिपेट का उपयोग ट्यूबिंग में) कदम 5.8 से एकत्र वायरस हस्तांतरण। ट्यूबिंग के भीतर हवा बुलबुले से बचने और एक प्लास्टिक दबाना डायलिसिस closures के साथ दूसरे पक्ष पर बंद हुआ।
    2. 4 डिग्री Cwith धीमी सरगर्मी से कम 2 घंटे के लिए डायलिसिस बफर (10 मिमी Tris एचसीएल (7.5 पीएच), 10% ग्लिसरॉल और विआयनीकृत एच 2 ओ में 1 मिमी 2 MgCl) का 1 एल में dialyze। 2 डायलिसिस बफर के एल और धीमी गति से सरगर्मी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन dialyze के साथ एक्सचेंज डायलिसिस बफर। वैकल्पिक रूप से एक sucrosebuffer (140 मिमी NaCl, 5 मिमी ना 2 4 HPO x2H 2 हे, 1.5 मिमी के.एच. 2 4 पीओ और 730 मिमी सुक्रोज, पीएच 7.8) का उपयोग करें।
    3. कदम 5.9) 2 से dialyzed वायरस कणों लीजिए। 1 मिलीलीटर पी का प्रयोगipette। वांछित छोटे संस्करणों (25- 100 μl) के कई aliquots तैयार और -80 डिग्री सेल्सियस पर वायरस शुद्ध दुकान।

6. मापने ऑप्टिकल घनत्व द्वारा अंतिम HCAdV तैयारियों की शारीरिक अनुमापांक (ओवर ड्राफ्ट)

  1. Lysis बफर (10 मिमी Tris एचसीएल (7.5 पीएच) के 475 μl के साथ कदम 5.9) 2 से अंतिम वेक्टर तैयारी के 25 μl पतला, 10 मिमी EDTA (8.0 पीएच), 0.5% एसडीएस)), धीरे 20 मिनट पर के लिए हिला आर टी और अंत में 15,000 एक्स जी पर आरटी पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  2. 260 एनएम (A260) पर absorbance मूल्यों आमतौर पर कम कर रहे हैं के बाद से, सतह पर तैरनेवाला के 100 μl का उपयोग कर absorbance के चार बार मापने के लिए और चार माप का मतलब मूल्य की गणना। निम्न सूत्र का उपयोग मिलीलीटर प्रति वायरल कणों की संख्या (उपाध्यक्ष / एमएल -1) की गणना: केबी में वी.पी. / मिलीलीटर -1 = (A260 मतलब है) एक्स (20) एक्स (1.1 x 10 12) एक्स (36 केबी / HCAdV आकार )।
    नोट: पूर्ण वायरल कणों (आयुध डिपो अनुमापांक) के एक ठेठ उपज का परिणाम चित्रा 7A में दिखाए जाते हैं

7. कुल कण, qPCR द्वारा अंतिम वेक्टर तैयारी में HCAdV और एचवी प्रदूषण का स्तर की संक्रामक इकाइयों को मापने। अनुमापन प्रक्रिया की एक योजना चित्रा 6 में दिखाया गया है

  1. 6 या 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में बीज HEK293 कोशिकाओं इतना है कि कोशिकाओं के अगले दिन पर 90% confluency तक पहुँचने। संक्रामक वायरल कणों की संख्या (संक्रामक अनुमापांक) का निर्धारण करने के लिए, 1 μl और कदम 5.9 से शुद्ध वायरस के 10 μl के साथ एक दूसरे को अच्छी तरह से) के साथ एक बहु अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से एक की कोशिकाओं को संक्रमित 3।
  2. हार्वेस्ट कोशिकाओं 3 घंटे बाद संक्रमण। मध्यम निकालें और पूरे अच्छी तरह से कवर करने के लिए trypsin जोड़ें और 3 पर सेते7 डिग्री सेल्सियस और 5% 5 मिनट के लिए सीओ 2। एक विंदुक का उपयोग trypsin के साथ कोशिकाओं से निकलवाने और आरटी पर 3 मिनट के लिए 890 XG कोशिकाओं नीचे स्पिन।
  3. DPBS के 200 μl में pelleted कोशिकाओं Resuspend और नि: शुल्क (गैर-संक्रामक) वेक्टर कणों को दूर करने के लिए उन्हें अच्छी तरह से धो लें। आरटी पर 890 XG पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। ताजा DPBS के 200 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल छर्रों त्यागें।
    नोट: संक्रामक अनुमापांक का सही निर्धारण के लिए, यह उपचार और पूरी तरह से धोने trypsin द्वारा सेल सतहों से सभी गैर-संक्रामक वायरल कणों को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  4. कुल वायरल कण संख्या (संक्रामक कणों और गैर संक्रामक कणों = शारीरिक अनुमापांक) का निर्धारण करने के लिए, फसल को अपनी संस्कृति के माध्यम से एक विंदुक का उपयोग के साथ कोशिकाओं को बंद निस्तब्धता द्वारा trypsin बिना दो कुओं से HEK293 कोशिकाओं गैर संक्रमित।
  5. आरटी पर 890 XG पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन। मध्यम त्यागें और DPBS के 200 μl में pelleted कोशिकाओं resuspend। रbsequently क्रमश: सीधे कोशिकाओं को 1 μl और शुद्ध HCAdV तैयारी के 10 μl जोड़ें। GDNA अलगाव और बाद क्यू पीसीआर के लिए एक ही स्थिति को सुनिश्चित करने के लिए, पृष्ठभूमि के रूप में गैर संक्रमित कोशिकाओं का प्रयोग करें।
  6. HEK293 कदम 7.3 से ली गई कोशिकाओं) और 7.5 से gDNA पृथक)
    1. DPBS 3 सेकंड के लिए (कदम 7.3 और 7.4), के 200 μl में resuspended भंवर कोशिकाओं एसडीएस समाधान के 200 μl जोड़ें। (10 मिमी Tris एचसीएल (7.5 पीएच), 10 मिमी EDTA (8.0 पीएच), 0.5% एसडीएस) और 20 μl Proteinase कश्मीर (20 मिलीग्राम / एमएल) और भंवर निलंबन 3 सेकंड के लिए। 55 डिग्री सेल्सियस पर 12 16 घंटा सेते हैं और धीरे-धीरे हिला। तब RNase एक के 2 μl (20 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. 15,000 एक्स जी पर 2 मिनट के लिए isoamyl शराब और सेंट्रीफ्यूज: क्लोरोफॉर्म: फिनोल के 350 μl जोड़ें। एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और एक बार इस चरण को दोहराएँ
    3. एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला सोडियम एसीटेट के 50 μl (पीएच 5, 3 एम) और बर्फ के 1 मिलीलीटर ठंड EtOH (99.8%) जोड़ने और निलंबन मिश्रण। Centri15,000 XG पर 10 मिनट के लिए Fuge नमूने जीनोमिक डीएनए गोली।
    4. फिर, सतह पर तैरनेवाला हटाने 15,000 एक्स जी पर 2 मिनट के लिए 500 में 70% EtOH के μl और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला निकालें 70% EtOH के 500 μl जोड़ने और आरटी पर 30 मिनट के लिए हिला। फिर 15,000 एक्स जी पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    5. सतह पर तैरनेवाला और हवा शुष्क डीएनए गोली निकालें। यह समाधान में gDNA पाने के लिए कठिन हो जाएगा, के रूप में एक लंबे समय के लिए नहीं सूखी डीएनए छर्रों करो। DH 2 हे के 120 μl में डीएनए गोली Resuspend और मिलाते हुए, जबकि 37 डिग्री सेल्सियस पर ~ 1 घंटे के लिए सेते हैं। डीएनए समाधान चिपचिपा प्रकट होता है, 37 डिग्री सेल्सियस पर कई घंटे के लिए इसे हिला, या ~ 1 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. HCAdV जीनोम में निहित भारत सरकार को ले जाने के लिए एक प्लाज्मिड के 10 8 प्रतियां - संक्रामक HCAdV-कणों और निरपेक्ष HCAdV-कणों का निर्धारण करने के लिए, 10 1 के एक मानक वक्र उत्पन्न करते हैं।
  8. संक्रमित HEK293 ग की gDNA का एक ही मात्रा का विश्लेषण करने से कुल कणों और संक्रामक कणों का निर्धारण करेंकदम 7.3) और 7.4) से ELLs qPCR HCAdV जीनोम में निहित भारत सरकार के लिए विशिष्ट प्राइमरों के 400 एनएम का उपयोग कर लागू होते हैं।
  9. इस प्रकार के रूप पीसीआर कार्यक्रम निर्धारित करें: पूर्व ऊष्मायन 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, प्रवर्धन के लिए 10 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र, 10 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस और 20 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस में। मानक वक्र (कदम 7.7) के आधार पर, प्रतिक्रिया में adenoviral जीनोम की कुल संख्या बैठाना।
  10. निम्नलिखित फ़ॉर्म्यूलर का उपयोग कर अंतिम वेक्टर तैयारी में adenoviral जीनोम की संख्या की गणना: (HCAdV / वजन की संख्या प्रतिक्रिया में gDNA की एनजी में) एक्स (μl में वजन सभी कोशिकाओं के डीएनए की एनजी में संक्रमित डिश में / मात्रा वायरस) ।
    नोट: निरपेक्ष और संक्रामक वायरल कणों की पैदावार के लिए विशिष्ट सीमा 1x10 7 -1x10 8 वायरल कणों / μl के आसपास हैं। यहाँ से पता चला है की तुलना में दस गुना अधिक है या कम कर रहे हैं कि titers सामान्य रूप में माना जा सकता है। उच्चतर titers एक सुधार होगा। पूर्ण HCAdV खास के अनुपात के संबंध मेंलेस संक्रामक HCAdV कणों को, अनुभव पूर्ण HCAdV कणों की लगभग 5 10% संक्रामक (चित्रा 7A) कर रहे हैं कि पता चलता है।
  11. एचवी साथ संदूषण का स्तर निर्धारित करने के लिए, एचवी जीनोम में मौजूद adenoviral देर जीन 3 (एल 3) का एक हिस्सा amplifying द्वारा qPCR प्रदर्शन करते हैं। एक मानक वक्र (कदम 7.7) उत्पन्न करने के adenoviral देर जीन 3 (L3) ले जाने के एक प्लाज्मिड का प्रयोग करें।
  12. इस प्रतिक्रिया में प्राइमरों L3 की 400 एनएम लागू आगे 5'- आगा एजीसी TTA जीसीए टीसीसी GTT अधिनियम सीजीए GTT सीजी-3 'और L3 रिवर्स 5'-अता एजीसी टीटीजी कैट GTT GGT ATG कैग GAT सीजी-3' एक साथ एनएम 300 के साथ L3-विशिष्ट जांच के 5'-Fam-सीसीए सीसीसी GTG टीजीटी एसीसी TGG TGG एसीए-तमारा -3 '।
  13. इस प्रकार के रूप पीसीआर कार्यक्रम निर्धारित करें: पूर्व ऊष्मायन / सक्रियण 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, प्रवर्धन के लिए 15 सेकंड और 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्रों के दौरान। पीसीआर qPCR प्रतिक्रिया के लिए MasterMix किसी भी सार्वभौमिक जांच का प्रयोग करें। मानक वक्र (कदम 7.7) के आधार पर, में की संख्या की गणनाअंतिम वेक्टर तैयारी में fectious एचवी कणों। एचवी कणों के लिए ठेठ पैदावार के लिए (चित्रा 7A) देखें।
  14. अंत में वेक्टर तैयारी की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए एचवी संदूषण के स्तर को HCAdV के निरपेक्ष संक्रामक कणों के अनुपात की गणना।
    नोट: अब शेष एचवी के एक छोटे से हिस्से को बाहर नहीं किया जा सकता है जब तक। आमतौर पर एचवी संदूषण का प्रतिशत स्वीकार्य है जो संक्रामक कणों या उससे कम की ~ 5%, (चित्रा 7B) है। संभव के रूप में कम एचवी वांछनीय है बेशक, के रूप में वेक्टर तैयारी पशु प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, खासकर अगर।

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Representative Results

क्लोनिंग, प्रवर्धन और HCAdV तैयारियों की शुद्धि के लिए यहाँ प्रतिनिधि उदाहरण दिखाए जाते हैं। एंजाइम को पचाने के प्रतिबंध से एक क्लोनिंग रणनीति का अवलोकन (चित्रा 1) और क्लोनिंग के लिए प्रतिनिधि उदाहरण और HCAdV जीनोम की रिहाई (चित्रा 2) प्रदान की जाती हैं। पचाने मैं PI- Sce मैं और मैं- Ceu से pHM5 से भारत सरकार अभिव्यक्ति कैसेट और बाद में फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और EtOH वर्षा की रिहाई के बाद एक ठेठ प्रतिबंध पैटर्न (2A चित्रा) में दिखाया गया है (देखें भी 1.2 1.5 कदम)। आमतौर पर pHM5 प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी और भारत सरकार की अभिव्यक्ति कैसेट को इसी एक दूसरे बैंड को इसी ~ 3 केबी बैंड मनाया जा सकता है। भारत सरकार अभिव्यक्ति कैसेट युक्त बैंड तो agarose जेल से शुद्ध होता है। शुद्ध भारत सरकार अभिव्यक्ति कैसेट शुद्ध, dephosphorylated pAdVFTC के साथ मिलकर एक agarose जेल पर विश्लेषण किया है कि wसही आकार को सत्यापित करने के लिए और बाद में बंधाव (चित्रा 2 बी) के लिए अणुओं के रिश्तेदार राशि का अनुमान लगाने के PI- Sce मैं और मैं- Ceu क्रमशः मैं (1.7 कदम) के साथ पचा के रूप में। बंधाव बाद एम्पीसिलीन पर चयन कर रहे हैं मैं काटा हुआ pAdFTC और बाद में फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और EtOH वर्षा (1.9 कदम), बंधाव उत्पादों बैक्टीरिया और क्लोन के रूप में तब्दील कर रहे हैं को खत्म करने को पचाने फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और EtOH वर्षा और स्व द्वारा पीछा (कदम 1.8 देखें) LB- अगर प्लेट युक्त। आमतौर पर क्लोन की सैकड़ों करने के लिए दर्जनों 5 10 क्लोन प्लास्मिड डीएनए मिनी की तैयारी के लिए तैयार कर रहे हैं, जिसमें से प्राप्त कर रहे हैं। एक साथ नकारात्मक नियंत्रण (भी 1.10 कदम देखें) के रूप में एक खाली pAdFTC के साथ सकारात्मक और नकारात्मक क्लोन के एक विश्लेषणात्मक Hinc द्वितीय डाइजेस्ट का प्रतिबंध पैटर्न (चित्रा -2) में दिखाया गया है। यहाँ सकारात्मक क्लोन खाली pAdFTC और नकारात्मक क्लोन और एक 1.7 केबी टुकड़ा दिखाई देता है में मौजूद है कि एक 5 KB बैंड, नहीं दिखातेकि खाली pAdFTC और नकारात्मक क्लोन में मौजूद नहीं है। इस संबंधित भारत सरकार के लिए यह था क्लोनिंग सफल रहा था इंगित करता है। Midiprep के माध्यम से शुद्ध किया गया है कि एक सकारात्मक क्लोन तो pAdVFTC-भारत सरकार (2.2 कदम) से भारत सरकार को ले जाने HCAdV जीनोम जारी करने के लिए कोई तिवारी के साथ पचा गया था। अंत में कोई ती IST दो बार 116 कोशिकाओं में बाद में अभिकर्मक के लिए डीएनए के उच्च शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और EtOH वर्षा का उपयोग कर शुद्ध डीएनए पचता। कोई ती का एक छोटा सा अंश का विश्लेषण एक agarose जेल पर pAdVFTC-भारत सरकार पचा pAdFTC प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी और (भारत सरकार अभिव्यक्ति कैसेट के आकार पर निर्भर करता है) ~ अप करने के लिए 36 केबी की एक बड़ी बैंड को इसी ~ 9 केबी बैंड से पता चलता है HCAdV जीनोम (चित्रा 2 डी) के लिए इसी। प्रवर्धन और शुद्धि पाइपलाइन का एक सिंहावलोकन रेखाचित्र (चित्रा 3) दिखाया गया है। वेक्टर पूर्व प्रवर्धन प्रक्रिया की निगरानी के प्रतिनिधि उदाहरण प्रदान की जाती हैं ( (चित्रा 4 ए) दिखाया गया है। वेक्टर जीनोम की संख्या आम तौर पर पहले मार्ग दौरान descreases और दृढ़ता से बाद में मार्ग में बढ़ जाती है कि ध्यान दें। 10 6 के एक वेक्टर प्रतिलिपि संख्या - 10 7 15000 प्रति कोशिकाओं एक 3 एल स्पिनर फ्लास्क में बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए 116 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए पर्याप्त है। HCAdV वेक्टर जीनोम के भीतर भारत सरकार एक GFP अभिव्यक्ति कैसेट शामिल हैं, तो पूर्व प्रवर्धन प्रक्रिया (खंड 2) भी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी जा सकती है। प्रत्येक पारित होने के प्रतिनिधि चित्रों (चित्रा 4 बी) दिखाए जाते हैं। GFP सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या आम तौर पर पहले मार्ग के दौरान कम हो जाती है और दृढ़ता से देर से मार्ग में बढ़ जाती है कि ध्यान दें। GFP सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या से 100% तक पहुँच जाता है, वेक्टर suff परिलक्षित किया गया थाiciently एक 3 एल स्पिनर फ्लास्क में बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए 116 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए। एक HCAdV युक्त GFP अभिव्यक्ति कैसेट के बड़े पैमाने पर प्रवर्धन प्रक्रिया एक टिशू कल्चर डिश के लिए स्पिनर कुप्पी से स्थानांतरित किया गया है कि संस्कृति के माध्यम से और कोशिकाओं का सूक्ष्म विश्लेषण द्वारा नजर रखी थी। निलंबन संस्कृति में HCAdV उत्पादक कोशिकाओं की सूक्ष्म चित्र (4.4 और 4.11 कदम देखें) (चित्रा 4C) प्रदान की जाती हैं। कोशिकाओं पूर्ववर्ती सेल के विकास के लिए पर्याप्त था और कोशिकाओं को स्वस्थ हैं यह दर्शाता है कि गुच्छों में बढ़ रहे हैं कि ध्यान दें। इन कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी ~ 100% का उपयोग करते समय बायोरिएक्टर और कुशल वेक्टर उत्पादन में निलंबन कोशिकाओं के कुशल पारगमन का संकेत है, GFP सकारात्मक थे। वेक्टर कणों CsCl ultracentrifugation द्वारा मध्यम और 3 एल निलंबन संस्कृति की कोशिकाओं से शुद्ध किया गया। CsCl घनत्व ढाल ultracentrifugation का उपयोग कर HCAdV वेक्टर शुद्धि के प्रतिनिधि चित्रों (चित्रा 5) दिखाए जाते हैं। एक के बादn एक CsCl कदम ढाल का उपयोग प्रारंभिक centrifugation आमतौर पर दो बैंड मनाया जाता है। निचले बैंड डीएनए युक्त वेक्टर कणों (कदम 5.4- 5.5) (चित्रा 5 ए) के शामिल है, जबकि ऊपरी बैंड आंशिक capsids के खाली होता है। वेक्टर कणों से युक्त डीएनए बाद में (5.6 कदम) काटा और वेक्टर कणों ध्यान केंद्रित करने के लिए एक दूसरे ultracentrifugation कदम के लिए जमा कर रहे हैं। यह कदम आम तौर पर अंत में बाद में डायलिसिस (कदम 5.7- 5.8) (चित्रा 5 ब) के लिए काटा जाता है कि डीएनए युक्त वेक्टर कणों की एक एकल बैंड में यह परिणाम है। Dialyzed वेक्टर की तैयारी पूर्ण कणों, संक्रामक कणों और एचवी संदूषण की संख्या को मापने की विशेषता थे। अनुमापन प्रक्रिया (धारा 6 और 7) का एक योजनाबद्ध रूपरेखा (चित्रा 6) प्रदान की जाती है। अंतिम वेक्टर तैयारी के लक्षण वर्णन के लिए प्रतिनिधि परिणाम (चित्रा 7) दिखाए जाते हैं। बार चार्ट हैं कि ठेठ वेक्टर कण संख्या से पता चलता हैइस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रिया के द्वारा प्राप्त की। वेक्टर कणों की निरपेक्ष कणों संख्या ऑप्टिकल घनत्व (धारा 6), संक्रामक वेक्टर कणों और एचवी संदूषण द्वारा निर्धारित किया गया qPCR (धारा 7) (चित्रा 7A) द्वारा मापा गया। अनुभव आयुध डिपो अनुमापांक वायरस कणों की संख्या overestimates कि दिखाती है। आयुध डिपो द्वारा मापा निरपेक्ष वायरल कणों क्यू पीसीआर द्वारा मापा संक्रामक वायरल कणों की तुलना में 500 गुना अधिक 20 हो सकती है। दोनों क्यू पीसीआर (धारा 7) द्वारा मापा गया जब संक्रामक वेक्टर कणों आमतौर पर पूर्ण कणों के 10 5% के बीच सीमा होती है। वेक्टर तैयारी एक बहुत अच्छी गुणवत्ता की है, तो पूर्ण कणों के 20% से अधिक संक्रामक हैं। एचवी और संक्रामक HCAdV कणों (कदम 7.14) के बीच विशिष्ट अनुपात आम तौर पर संक्रामक कणों की 1-5% (चित्रा 7 बी) के बीच है। एचवी प्रतिकृति की कमी है, क्योंकि यह स्वीकार्य है। फिर भी संभव के रूप में कम एचवी संदूषण के रूप में (<संक्रामक कणों का 1%) होगाप्राथमिकता दी जानी।

आकृति 1
PAdFTC में भारत सरकार क्लोनिंग की चित्रा 1. फ़्लोचार्ट। भारत सरकार pHM5 शटल प्लाज्मिड की एमसीएस में क्लोन है। प्लास्मिड pAdFTC और pHM5-भारत सरकार मैं- Ceu मैं और PI- Sce मैं के साथ पचा और फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और EtOH तेज़ी से शुद्ध कर रहे हैं। पच pAdFTC प्लाज्मिड dephosphorylated है जबकि पचा pHM5, ब्याज की जीन (भी 1.5 कदम देखें) को शुद्ध करने के लिए एक प्रारंभिक agarose जेल पर लोड किया जाता है। इसके बाद सीआईपी इलाज pAdFTC साथ बंधाव प्रतिक्रिया और transgene अभिव्यक्ति कैसेट की स्थापना (कदम 1.8 देखें) और पूरा होने के बाद फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और EtOH तेज़ी से शुद्ध होता है। फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और EtOH वर्षा द्वारा पीछा बंधाव उत्पाद के बाद स्व मैं डाइजेस्ट डालने के बिना pAdFTC ले जाने के क्लोन के विकास को रोकता है। काले त्रिकोणों प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइटों संकेत मिलता है; ग्रे बक्से AdV5 टर्मिनल दोहराता उल्टे संकेत मिलता है (आईटीआर), Ψ के साथ चिह्नित सफेद बक्से AdV5 पैकेजिंग संकेत संकेत मिलता है, लाल तीर प्रमोटर को इंगित करता है, हरे बक्से (ब्याज की जीन, भारत सरकार) से व्यक्त किया है ट्रांस्जीन से संकेत मिलता है, नीले बक्से polyadenylation संकेत, नारंगी या नीले रंग से संकेत मिलता है तीरों प्लाज्मिड रीढ़ की एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों का संकेत मिलता है, क्रमशः। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा pAdVFTC से HCAdV जीनोम की क्लोनिंग प्रक्रिया और रिहाई के लिए 2. प्रतिनिधि परिणाम है। PI- Sce मैं और मैं- Ceu मैं डाइजेस्ट (भी 1.2 1.5 चरण देखें) द्वारा pHM5 से भारत सरकार अभिव्यक्ति कैसेट (ए) रिलीज। (बी) Sce मैं और मैं- Ceu क्रमशः मैं (1.7 कदम) के साथ पचा भारत सरकार अभिव्यक्ति कैसेट और शुद्ध, dephosphorylated pAdVFTC शुद्ध। (सी) के साथ और भारत सरकार (भी 1.10 कदम देखें) बिना pAdVFTC क्लोन की विश्लेषणात्मक Hinc द्वितीय डाइजेस्ट। कोई ती डाइजेस्ट द्वारा pAdVFTC-भारत सरकार से भारत सरकार को ले जाने HCAdV जीनोम (कदम 2.2) (डी) रिलीज में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
। उच्च क्षमता adenoviral वेक्टर प्रवर्धन और शुद्धि के लिए चित्रा 3. योजनाबद्ध आरेख (ए) HCAdV डीएनए अभिकर्मक और सहायक वायरस (एचवी) संक्रमण: HCAdV निर्माता सेल लाइन में भारत सरकार को ले जाने linearized HCAdV जीनोम के अभिकर्मक (116 कोशिकाओं [4]) और सुएचवी AdNG163R-2 के साथ bsequent संक्रमण [4]।   (बी) HCAdV का प्रवर्धन: पूर्व प्रवर्धन कदम के बाद क्रमानुसार एक नए ऊतक संस्कृति डिश के लिए सेल lysate हस्तांतरण और एचवी के साथ सह-संक्रमित करते हुए, बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक 3 एल निलंबन संस्कृति में किया जाता है (सी) HCAdV शुद्धि:। के लिए शुद्धि, वायरस सीज़ियम क्लोराइड ढ़ाल का उपयोग कर ultracentrifugation द्वारा अलग है (डी) डायलिसिस:। शुद्ध HCAdV कणों 2 एल भंडारण बफर के खिलाफ dialyzed कर रहे हैं। HCAdV, उच्च क्षमता adenoviral वेक्टर; आईटीआर, एडीनोवायरस सीरोटाइप 5 टर्मिनल दोहराने उल्टे; Ψ, पैकेजिंग संकेत; एचवी, सहायक वायरस; MOI, संक्रमण की बहुलता। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4 <br /> प्रवर्धन प्रक्रिया qPCR का उपयोग कर वायरल जीनोम की प्रवर्धन द्वारा पूर्व प्रवर्धन प्रक्रिया (ए) की निगरानी के चित्रा 4. प्रतिनिधि परिणाम (भी धारा 3 देखें);। (बी) भारत सरकार के एक transgene के रूप में GFP शामिल हैं, पूर्व प्रवर्धन प्रक्रिया फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी जा सकती है। (सी) एक स्पिनर फ्लास्क में बड़े पैमाने पर प्रवर्धन प्रक्रिया के प्रतिनिधि परिणाम HCAdV एन्कोडिंग GFP के लिए examplified। बाएं पैनल स्पिनर कुप्पी से संक्रमित 116 कोशिकाओं का एक सूक्ष्म तस्वीर दिखाता है। संस्कृति मध्यम और कोशिकाओं का एक नमूना एक 60 मिमी टिशू कल्चर डिश के लिए स्थानांतरित कर दिया गया। प्रवर्धित कोशिकाओं के झुरमुटों दिखाई दे रहे हैं कि ध्यान दें। सही पैनल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक ही तस्वीर दिखाता है। कोशिकाओं के लगभग 100% HCAdV GFP ले जाने के साथ transduced कर रहे हैं। के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 5
CsCl ढाल centrifugation के बाद चित्रा 5. प्रतिनिधि परिणाम (ए) के एक कदम ढाल (भी 5.5 कदम देखें) प्रदर्शन करने के बाद;।। निरंतर ढाल (भी 5.7 कदम को देखने के बाद) (बी) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
अनुमापन प्रक्रिया 6. योजनाबद्ध रूपरेखा चित्रा। संक्रामक कणों (ए) मापन: एक बहु अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं शुद्ध वायरस के विभिन्न संस्करणों के साथ संक्रमित और सेल छर्रों के रूप में एकत्र कर रहे हैं (बी) के मापन ओ।च पूर्ण कणों: Unifected कोशिकाओं trypsinization और centrifugation द्वारा एकत्र कर रहे हैं एक बहु अच्छी तरह के रूप में। मेजबान वायरस शुद्ध जोड़ा जाता है और जीनोमिक डीएनए अलग-थलग होने के बाद। जीनोमिक डीएनए (सी) अलगाव। (डी) एक मात्रात्मक पीसीआर (क्यू पीसीआर) किया जाता है वायरल जीनोम प्रतिलिपि संख्या यों। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा।

चित्रा 7
अंतिम वेक्टर तैयारी के लक्षण वर्णन के लिए 7. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा। (ए) के विभिन्न तरीकों के साथ निर्धारित प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुसार एक वेक्टर तैयारी के कणों की निरपेक्ष संख्या:। आयुध डिपो अनुमापांक qPCR (धारा 7) द्वारा मापा ऑप्टिकल घनत्व (धारा 6), संक्रामक अनुमापांक और एचवी संदूषण से मापा (बी)QPCRs (धारा 7) द्वारा मापा कुल संक्रामक HCAdV कणों और एचवी संदूषण स्तरों के बीच का अनुपात। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल पहले से वर्णित प्रक्रियाओं 4,12 के आधार पर मानव एडीनोवायरस प्रकार 5 पर आधारित HCAdV वैक्टर की शुद्धि के लिए अनुमति देता है। PAdFTC प्लाज्मिड भीतर HCAdV जीनोम सभी एडीनोवायरस जीन से रहित है और केवल 5'- और 3'- ITRS और पैकेजिंग संकेत किया जाता है। इस रणनीति में एचवी AdNG163R-2 से 4 ट्रांस में कुशल वायरस उत्पादन के लिए सभी आवश्यक जीन प्रदान करता है। या एडिनो जुड़े वायरस (एएवी) आधारित वैक्टर - यह एक स्पष्ट रूप से पहली और दूसरी पीढ़ी कृपया advs या व्यापक रूप से इस्तेमाल lentivirus (एल.वी.) outcompetes जो अप करने के लिए 35 केबी की पैकेजिंग क्षमता प्रदान करता है। विशेष रूप से इन विवो अनुप्रयोगों के लिए HCAdV का एक दूसरा लाभ यह है कि पहली के विपरीत या दूसरी पीढ़ी कृपया advs में वे साइटोटोक्सिक के कम स्तर और वायरल प्रोटीन 5-8 की अभिव्यक्ति के कारण immunogenic दुष्प्रभाव प्रदर्शित करने वाले तथ्य है।

फिर भी यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल अधिक का समय है औरअन्य वायरल ऐसे LV- के रूप में वैक्टर या एएवी-वैक्टर के साथ ही पहली या दूसरी पीढ़ी कृपया advs के लिए अधिक से गहन काम करते हैं। एक प्रमुख बाधा बड़े transgenes की क्लोनिंग और वायरस उत्पादन प्लाज्मिड pAdV-FTC के बाद के हस्तांतरण है। घर वापस आना endonucleases के उपयोग Sce मैं और मैं- Ceu मैं शटल प्लाज्मिड pHM5 से transgene की सटीक और निर्देशित प्रविष्टि की पेशकश PI-, लेकिन दृढ़ता से cleaved डीएनए को चिपका का नुकसान है। क्लोनिंग की प्रक्रिया के दौरान plasmid- और डालने डीएनए की तैयारी कर जब कि कारण के लिए कई फिनोल के क्लोरोफॉर्म सफाई कदम जरूरी हैं। इसलिए, कड़ाई से प्रदान की क्लोनिंग प्रोटोकॉल का पालन सख्ती से सिफारिश की है। HCAdV जीनोम क्लोनिंग नहीं है कि मैं प्रतिबंध से प्लाज्मिड pAdFTC से रिहा होने के बाद एंजाइम को पचाने और बाद में निर्माता सेल लाइन में ट्रांसफ़ेक्ट। प्रारंभिक अभिकर्मक क्षमता पर्याप्त वायरस प्रवर्धन को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि ध्यान दें। महत्वपूर्ण बात है, प्रोटोकॉल कई कदम प्रदान करता हैजिसमें से प्रक्रिया के बाद के चरणों में विफल मामले में आरंभ किया जा सकता। पूर्व प्रवर्धन के दौरान lysates के एक तिहाई फिर उस जगह से प्रक्रिया शुरू करने के लिए या एक से अधिक वायरस का उत्पादन होने की जरूरत के मामले में एक पुनरावृत्ति को छोटा करने के बैकअप के रूप में संग्रहित किया जा सकता है।

HCAdV, बड़ी जटिल या कई ट्रांसजीन या कुछ stuffer डीएनए ले जाने की उम्मीद की तुलना में धीमी amplifying हो सकता है। इसलिए, यह निलंबन संस्कृति एक स्पिनर कुप्पी में उगाया जाता है से पहले ध्यान से पूर्व प्रवर्धन प्रक्रिया का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है। पूर्व प्रवर्धन सफल नहीं है, तो प्रक्रिया बंद कर दिया और फिर से शुरू से ही शुरू किया जाना चाहिए। पूर्व प्रवर्धन अक्षम है, तो वायरस की राशि एक 3 एल स्पिनर कुप्पी में विकसित कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए काफी अधिक है, जब तक अतिरिक्त passaging के लिए आवश्यक हो सकता है। एक स्पिनर फ्लास्क में निलंबन संस्कृति के लिए एक विकल्प के रूप में, 20 150 से 30 मिमी टिशू कल्चर व्यंजन अंतिम पारित होने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बहरहाल, यह अधिक समय हो सकता है और गहन काम कर सकते हैं।

QPCR के माप के लिए gDNA यहाँ या तो उल्लेख प्रोटोकॉल या संवर्धित कोशिकाओं से gDNA के अलगाव के लिए किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के माध्यम से शुद्ध किया जा सकता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके प्रोटोकॉल एक दिन छोटा किया जा सकता है, लेकिन संक्रमित कोशिकाओं में मौजूद हैं कि HCAdV जीनोम प्रतियों की एक अलग हिस्से का इस्तेमाल किया किट पर निर्भर करता है, शुद्धि के दौरान खो दिया जा सकता है। इसलिए HCAdV जीनोम कदम 7.4 में प्रस्तुत विधि) की तुलना में जब क्यू पीसीआर माप निम्नलिखित में से थोड़ा underrepresented हो जाएगा।

Obtaiएक अंतिम वेक्टर तैयारी में नेड कुल संक्रामक titers 1 एक्स 10 10 से 5 एक्स 10 11 संक्रामक कणों को एक स्पिनर कुप्पी रेंज से निकाली गई। इस राशि से इन विट्रो प्रयोगों में कई प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है। विवो प्रयोगों में भी लक्ष्य कोशिकाओं पर निर्भर कई आयोजन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रणालीगत प्रशासन के बाद पर्याप्त जिगर पारगमन को प्राप्त करने के लिए 1 एक्स 10 9 संक्रामक कणों के लिए आवश्यक हैं।

सारांश में, विस्तृत सेल tropism और HCAdV की सुरक्षा में सुधार के प्रोफाइल के साथ एक साथ capsid संशोधित एडीनोवायरस का उत्पादन करने की संभावना सभी वायरल जीनों से रहित इन HCAdV वेक्टर सिस्टम जीन चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए एक अत्यधिक महत्वपूर्ण उपकरण प्रस्तुत करना वैक्टर।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I-CeuI New England Biolabs R0699S restriction digest
PI-SceI New England Biolabs R0696S restriction digest
T4 Ligase New Engand Biolabs M0202S ligation
SwaI New England Biolabs R0604S restriction digest
NotI New England Biolabs R0189S restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) New England Biolabs M0290S dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B PAN Biotech P02-015 selection of CRE expressing 116 cells
DMEM PAN Biotech P04-03590    Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle PAN Biotech P04-08500 116 cell culture medium  
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) PAN Biotech P04-36500 washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle Sigma CLS430281-24EA infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes Sigma CLS431123-36EA sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask Bellco 1965-61030 growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes Beckmann Coulter 344059 density gradient centrifugation
Ultracentrifuge Beckmann Coulter density gradient centrifugation
SW-41 rotor Beckmann Coulter density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane VWR 132129 dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes  Thermo 66383 dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli invitrogen C4040-52 transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495 midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit  Peqlab 12-3396-02 isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305 tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS) Gibco 31985-062 transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix BioRad  170-8882 q-PCR
CFX 96 C1000 touch  Biorad qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol  Carl Roth A156.1 purification of DNA
Cesium chloride Carl Roth 8627.1 density gradient centrifugation
sodium acetate 99% Carl Roth 6773.2 DNA precipitation
LB medium  Carl Roth X968.3 bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure Carl Roth 9065.5  DNA precipitation and washing
SDS 99.5% Carl Roth 2326.2 lysis  buffer
EDTA Carl Roth 8043.2 lysis  buffer
Tris-HCl 99% Carl Roth 9090.3 dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5% Carl Roth 3783.1 dialysis buffer
MgCl2 98.5% Carl Roth KK36.2 dialysis buffer
NaCl Carl Roth 3957.1 optional dialysis buffer
KH2PO4 Carl Roth 3904.2 optional dialysis buffer
sucrose Carl Roth 9286.1 optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O Carl Roth 4984.2 optional dialysis buffer
1.5-ml tubes sarstedt 72,730,005 storage of virus preparations at -80 °C

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References

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