基于人类腺病毒5型高容量腺病毒载体的克隆及规模化生产

Bioengineering

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Ehrke-Schulz, E., Zhang, W., Schiwon, M., Bergmann, T., Solanki, M., Liu, J., Boehme, P., Leitner, T., Ehrhardt, A. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (107), e52894, doi:10.3791/52894 (2016).

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Abstract

Introduction

用于基因治疗应用是非常重要的,以避免细胞毒性和免疫原性的副作用引起的病毒蛋白质的表达,转基因本身或者由传入的病毒蛋白。腺病毒载体(腺病毒)被广泛用于将外源DNA成多种细胞的研究转基因表达1,2的影响。进阶最先进的版本是由高容量腺病毒载体(HCAdV)缺少所有的病毒编码序列3,4,从而提供包装容量高达35 KB加上低免疫原性和低毒性5-8来表示。由于其高的包装容量它们允许输送的使用单一载体剂量大或多个转基因。因此,它们代表了研究界的宝贵工具。

在对比第一或第二代腺病毒缺乏早期基因的E1和/或E3,可以使用商业试剂盒可容易地制造,vec的器的基因组结构和病毒产生HCAdV的更为复杂。该系统为HCAdV基因组的结构是基于质粒pAdFTC携带HCAdV基因组缺乏所有病毒编码序列和穿梭质粒pHM5 9-12中 。的高达14千碱基(kb的)任何感兴趣的基因可以被克隆到穿梭载体pHM5其中多克隆位点被识别侧翼/裂解归巢内切核酸酶位点PI- SCE我和I- CEU I.因此,感兴趣的克隆的基因可以通过连续的PI-SCE我和I- CEU我被释放消化用于随后定向插入到存在于包含于质粒pAdFTC的HCAdV基因组中的相同限制性位点。在pAdFTC位于PI- SCE I和I-CEU I切割位点之间的转基因插入位点是由填塞DNA和所需的基因组的包装,如5'和3'末端反向重复的非编码腺病毒序列(ITRS)侧翼在端部和5'ITR下游的包装信号两者。额外填充的DNA提供了最后的HCAdV基因组范围从27到36 KB的最优规模,以确保病毒在生产过程中高效的包装。因为pAdFTC是一个大质粒高达45千字节(依赖于插入的转基因的大小)和归巢核酸内切酶具有同等的长DNA识别位点的使用具有强DNA结合,从pHM5传递转基因的过程中几个净化步骤是必要的到pAdFTC。小心处理,避免剪切力的建议。

所述HCAdV基因组的的ITR由直接位于5'ITR的上游和3'ITR 12的下游Not I限制性内切酶识别位点侧接。因此,HCAdV可以通过的Not I消化用于随后转染的病毒基因组进入HCAdV生产者细胞系被释放。需要注意的是限制性内切酶的使用余为相对便于从质粒pAdFTC病毒基因组,则表示插入转基因是缺乏的Not I DNA识别位点。在HEK293细胞根据生产细胞(116细胞)稳定表达Cre重组酶。对于病毒扩增116细胞被共感染辅助病毒(HV)提供所需要的复制和包装的反式 3,4-所有的AdV基因。高压是第一代腺病毒与被在病毒扩增通过Cre重组酶表达116细胞4移除的两侧装接loxP的包装信号。这确保了含有完整包装信号主要HCAdV基因组包被。

预放大的HCAdV的通过进行在116细胞连续传代步骤上生长在组织培养皿的表面进行的。每次传代后的病毒颗粒通过导电三个连续的冻融步骤释放从感染细胞。随着每一个通道增加细胞数量被感染三分之一从前面的传代细胞裂解物。最后溶解物从最后预扩增步骤用于感染在转瓶中大规模扩增中悬浮生长生产细胞。病毒颗粒从悬浮液中的细胞通过在氯化铯密度梯度4,12进行超速离心纯化。与此过程空粒子和完全组装颗粒分离成两个不同的频带。进一步浓缩HCAdV颗粒进行第二非渐进超速离心步骤。接着含有HCAdV所得频带被收集和透析生理缓冲液。最终载体制剂的特征在于相对于绝对病毒颗粒,感染颗粒和高压污染水平的数字。绝对的病毒颗粒可以通过裂解病毒颗粒,并测量260nm处的吸光度或通过进行定量实时PCR(qPCR的)12来确定。在PUR的感染性指明分数病毒颗粒可通过感染细胞3小时后感染内本的qPCR测量HCAdV基因组来确定。

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Protocol

重组HCAdV基因组的构建1.基于所述质粒pAdFTC

注:所有质粒先前已被描述11,12和可应要求提供。克隆过程图1中示意性示出。

  1. 克隆感兴趣的基因(GOI),包括启动子和聚腺苷酸化信号(pA的)插入穿梭质粒pHM5,使用选择的克隆策略,​​以产生pHM5-GOI。
    注意:由于pAdFTC是一个比较大的质粒,古典质粒制备协议建议,以避免所述质粒DNA的切向通过使用基于二氧化硅膜商业质粒纯化试剂盒。 I-CEU和PI -Sce我强烈地绑定到DNA,改变消化DNA的电泳迁移率。因此,酚 - 氯仿提取和EtOH沉淀(步骤1.3)的琼脂糖凝胶电泳之前是必需的。
  2. 摘要20微克PHM的5-GOI和10 pAdFTC微克由I-CeuI(10U)3小时,在37℃在100微升的总体积来线性质粒(〜2.8kb的+ GOI ORF序列和〜31KB,分别)。
  3. 净化用苯酚-氯仿提取,随后乙醇(EtOH)沉淀13线性质粒。
    1. 加入100微升酚:氯仿:异戊醇并颠倒管数次​​轻轻混匀。离心机在15000×g下2分钟。
    2. 将上清液转移到新的管中,加入20微升乙酸钠(pH 5,3 M)和400微升冰冷的乙醇(99.8%)和剧烈混合悬浮液。离心机以15,000×g下10分钟。
    3. 除去上清,加入300微升70%乙醇的离心2分钟,在15,000×克。然后取出上清,空气干燥DNA沉淀。溶解沉淀于10〜20微升卫生署2 O的不干燥DNA沉淀太久,因为这将是很难得到的DNA溶液中。
  4. 摘要I-CEU我消化的 pHM5-GOI和来自步骤1.3 pAdFTC质粒)至少3小时或O / N用限制酶的PI -Sce我(10U)在37℃在50μl的总体积,并随后纯化我-CeuI PI -Sce I消化用苯酚-氯仿提取,随后乙醇沉淀质粒(见步骤1.3)。在20μl不含核酸酶的dh 2 O溶解DNA
  5. 使用商业凝胶 - 分离pHM5质粒骨架(2.8千)和所述GOI(来自步骤1.4)上的制备性琼脂糖凝胶和凝胶纯化所述GOI和PCR-清理试剂盒。摘要的代表性琼脂糖凝胶于图2A。
  6. 去磷酸化I-CEU 和PI -Sce消化的pAdFTC(来自步骤1.4)用小牛肠碱性磷酸酶(CIP 10 U)1小时,在37℃,在25微升的总体积和由酚-氯仿提取和随后的EtOH纯化脱磷酸化的质粒pAdFTC PRecipitation(步骤1.3)。于20μl不含核酸酶的dh 2 O洗脱的DNA
  7. 从脱磷酸化pAdFTC质粒(来自步骤1.6)和纯化GOI-片段(来自步骤1.5)的等分试样进行分析凝胶电泳分析消化是否齐全,预期的片段的大小是正确的(〜31 kb的为线性pAdFTC )。
    注意:根据所述转基因表达盒的大小所述GOI的大小是可变的。估计为随后连接各个片段的相对浓度。纯化的片段的代表性琼脂糖凝胶示于图2B。
  8. 设置在20微升用400单位的T4 DNA连接酶和载体插入的1的摩尔比总体积的连接反应:3。
    注意:在一致性2B所示的琼脂糖凝胶我们通常结扎在20微升与2-总体积至6微升矢量,8-至12微升插入和400单位的T4 DNA连接酶。当DNA浓度通常低后几个酚处理步骤,使用尽可能多的DNA尽可能从而不需要额外 H 2 O具有被添加到达到20微升最终体积。结扎在16℃的CO / N和随后进行酚 - 氯仿提取,随后乙醇沉淀(步骤1.3)。
    1. 洗脱的DNA在15微升不含核酸酶的dh 2 O和消化用限制 SwaⅠ(10U)2小时的纯化的连接反应物在25℃下在20微升的总体积。然后浓缩和纯化的DNA,通过进行苯酚 - 氯仿提取,随后乙醇沉淀(步骤1.3)。于10μl不含核酸酶的dh 2 O洗脱的DNA
  9. 变换2微升纯化的SWA的I消化连接产物通过电穿孔到DH10B或DH5α电感受态E.大肠杆菌和在含有氨苄青霉素的LB选择克隆为16至24小时,在37℃下板(50毫克/ ml氨苄青霉素)。选择5- 10个克隆,并使用碱裂解随后酚-氯仿提取,随后乙醇沉淀(步骤1.3)13制备质粒DNA迷你制剂。
  10. 执行的质粒微型制剂接着进行琼脂糖凝胶电泳来检查DNA片段的大小分析摘要。建议的限制酶是例如I- CEU I和PI-SCE予释放插入件, 的Spe I或Hinc II位 图2C)。
  11. 扩增正确克隆在含氨苄青霉素的LB培养基(50毫克/毫升氨苄青霉素),并执行使用任何可商购的质粒纯化试剂盒midi-或马克西质粒制备。

在生产者细胞系116 2.本次发布HCAdV,基因组从pAdFTC质粒和HCAdV载体的前置放大的

  1. 消化20微克的pAdFTC为基础的腺病毒载体的生产步骤1.11含有克隆GOI)的100微升使用的Not I(20单位)的总体积在37℃下为> 2小时,进行酚-氯仿提取,随后乙醇沉淀两次。溶于20〜30微升无菌卫生署2 O.
  2. 通过凝胶电泳检查1:10稀释消化pAdFTC-GOI-DNA的等分试样。一个9 kb的片段的质粒骨架,并根据所述GOI的第二DNA片段的基因组HCAdV(尺寸:28- 36kb的)的尺寸是可检测的。
    注意: 不是我消化的一个代表性的例子显示在图2D。线性DNA可以储存数天,在4℃或在-20℃下几个星期。
  3. 在继续本协议,确保辅助病毒AdNG163R-2已经被放大4。
    :细胞转染pAdFTC衍生HCAdV载体分类为生物安全水平2(BSL-2),请使用适当的控制和废物处理遗传修饰的生物体措施,其中包括个人防护装备,并在BSL-2层流罩的工作。
  4. 培养116细胞中的MEM Eagle培养基补充有10%FBS和潮霉素B(100微克/毫升)。种子低传代(下面通路10)116细胞(〜0.4倍10 6个细胞)在60毫米组织培养皿之一转染前一天,使它们达到50-80%汇合的第二天。
  5. 通过使用方法,如磷酸钙转染或其它市售的转染试剂图3A)转染入从116细胞的步骤(2.1)线性化HCAdV基因组中。 16- 18小时转染后,小心地用高压AdNG163R-2 4 5施加传感单元(TU)除去培养基,加入3 ml的新鲜培养基(MEM,5%FBS)和感染细胞每细胞(自汇合60毫米组织培养皿中含有〜3.2X 10 6个细胞 ,加入约1.6倍10 7 HV的TU)。
    1. 感染后的第一个小时期间轻轻移动盘,每20分钟确保平等高压配电。培养感染的细胞于37℃和5%的CO 2。的情况下引起的病毒复制效率的病毒扩增的细胞病变效应(CPE)(细胞围捕和松散地附接或从组织培养皿分离的)被观察到的48小时后的CPE infection.If观察较早高压的量有被减少。如果CPE以后开始,更辅助病毒已被使用。
  6. 收获细胞,包括上清液48小时感染后通过使用该培养基的培养皿冲洗掉细胞。是悬浮在其培养基中细胞被称为0代(P0)。分裂P0分成两部分。
    1. 为0.5毫升脱离的细胞的降速细胞3分钟,在2000×g离心并从细胞沉淀介质,即稍后用于对基于定量PCR扩增过程的分析分离基因组DNA(gDNA的)。商店的细胞沉淀在-20℃直至进一步处理。
    2. 从2.5毫升分离的细胞通过冷冻(在-80℃或在液氮中)和解冻(室温或在37℃的水浴),它们resupended在其平台的三至四倍的细胞释放的病毒颗粒。该馏分比P0的叫做裂解物。
  7. 确保组织培养皿与116细胞使用MEM培养基补充有FBS(10%)和潮霉素B(100微克/毫升)和高压生长至90-95%汇合可用于下列传代步骤。
  8. 拌1毫升新鲜的培养基(MEM,5%FBS)中,用2.5从前面的通道(步骤2.6.2)至3.5毫升的最终体积的裂解物的毫升,加高压施加2 TU每个细胞(因为一个60mm组织培养皿在90〜95%汇合包含〜3.2X 10 6个细胞 ,加入约6.4倍10 6 HV的TU)。 图3B)。小心地取出从116的细胞的60mm培养皿的培养基和病毒的混合物添加到细胞中。重复步骤2.6) - 2.8)两次获得合格裂解液年龄P1和P2。
  9. 混合17.5 ml的新鲜培养基(MEM,5%FBS)与从P2裂解物的2.5毫升添加HV施加2 TU每个细胞(因为在150毫米组织培养皿在80〜100%汇合含有〜2×10 7个细胞,补充〜高压的4倍10 7 TU)。从116的细胞的150毫米培养皿中取出培养基,并感染细胞与病毒的混合物。培养感染的细胞于37℃和5%的CO 2。
  10. 在步骤2.6所描述的48小时后的感染细胞收获),以获得通道P3(图3B)。
    1. 重复步骤2.6)1。
    2. 从剩余的19.5 ml的从resupended细胞P3释放病毒颗粒通过冷冻和解冻的三到四倍。该馏分比P3的叫做裂解物。
      注意:有些载体,最终可能需要额外的通道150毫米培养皿中,直到它们被充分放大。因此需要在串行通要监视的预扩增过程的有效性老化。可以如第3(也参见图4A)中所述进行的扩增过程的基于定量PCR分析。预放大HCAdV携带绿色荧光蛋白(GFP)的表达盒可以很容易地通过观察使用荧光显微镜图4B)将GFP flourecscent信号进行评估。

3.监测采用定量实时PCR(定量PCR)扩增过程中(参见图4A)。

  1. 使用任何商业DNA提取试剂盒从培养细胞中分离基因组DNA,或者选择另一种方法2.10) - 从细胞沉淀从preamplifaction(步骤2.6)的每个通道隔离基因组DNA。为了达到最佳的PCR结果用基因组DNA尽可能新鲜。否则的gDNA可以储存在-20℃直至进一步使用。
  2. 以产生标准曲线,使用10 1确定HCAdV基因组中存在的各通道的通过qPCR分析细胞数</ SUP> - 10的质粒携带GOI中所含的基因组HCAdV 9份
  3. 从P0- P3(步骤2.6- 2.10)施加的qPCR使用中所含的基因组HCAdV特异性引物对所述GOI 400nM的分析的gDNA的量相同。为进行后续的qPCR制造商的各自的qPCR化学品的指令。在95℃下进行10分钟,扩增在95℃40个循环保持10秒,55-60℃15秒和72℃20秒预孵育:将定量PCR程序如下。在标准曲线的基础在反应HCAdV基因组的数目可以被内插。

HCAdV载体在116细胞4大规模扩增成长中的悬浮

  1. 加900个毫升预热(37℃)新鲜的MEM补充了10%FBS和潮霉素B(100μg/ ml的)到一个3升旋动培养瓶( 图3B)。
  2. 从至少10个人150毫米组织培养皿1移除介质16细胞生长于90- 100%汇合并冲洗掉细胞用10毫升新鲜预热(37℃)的MEM补充有FBS(10%),并用血清吸管潮霉素B(100微克/毫升)。移液器上下数次以获得均匀的细胞悬浮液。直接转移到细胞已经包含900毫升步骤4.1)的旋转烧瓶。
    注:请不要使用胰蛋白酶/ EDTA,因为它可能会产生负面悬浮细胞的生长影响。去除剂后立即转移细胞进入旋转烧瓶。不要同时处理两个以上的组织培养皿。加入新鲜培养基越难后的等待时间越长,将是脱离了组织培养皿的细胞。
  3. 为了确保最佳的细胞生长温育转瓶在磁力搅拌器上在组织培养箱24小时,在37℃和5%的CO 2。调整磁力搅拌器在70rpm,以避免细胞附着到玻璃表面上。 监测细胞生长在旋转培养瓶中检​​查在旋转培养瓶中生长的细胞是否可行以及是否长到足够量。前加入新鲜的介质转印2 ml的从生物反应器至60毫米组织培养皿中的每个时间。观察显微镜下的细胞形态。
    注:细胞形成团块漂浮在培养基中表示最佳生长和活力(参见图4C)。 24小时后,它们形成的组织培养皿的表面上的菌落。 30〜50%汇合表示最佳密度。
  4. 24小时建立旋转培养瓶中后加入500毫升新鲜的培养基(MEM,10%FBS),补充有潮霉素B(100微克/毫升)。 24小时后重复此步骤。
  5. 72小时建立旋转培养后,加入1,000ml中新鲜MEM培养基(10%FBS)以潮霉素B(100μg/ ml的),得到的3升的细胞悬浮液的总体积。
  6. 到达AV后24小时olume的三升,收获116悬浮细胞离心,在500×g离心在RT 10分钟。弃去上清液。保持组织培养罩下的空旋转培养瓶中。
  7. 在新鲜的MEM重悬细胞沉淀通过上下抽吸约8-10倍,以获得均匀的细胞悬浮液补充了5%FBS中。培养基的体积取决于是否裂解物来自步骤2.10)2。 (19.5毫升,见步骤4.8)1。选项​​a)或纯化的病毒原料HCAdV的来自步骤5.9)2。 (几微升depanding上病毒滴度,参见步骤4.8)2。,选项b)的用于细胞的感染。使用150毫升的总体积。
    1. 选项​​:对于116悬浮细胞与来自P3(初级扩增)从步骤4.8传递细胞)裂解物感染到250ml存储瓶配备有无菌磁搅拌棒或250ml的规模小旋转烧瓶和共感染细胞与从P3(步骤2.10.2),而每个单元HV 2 TU裂解物内的病毒。假设3倍的密度10 5个细胞每ml,总细胞数为9倍10 8个细胞。因此,添加HV的1.8倍10 9 TU。
    2. 选项​​B:对于116悬浮细胞用纯化病毒原料的感染,从步骤4.8传输单元),以250毫升的存储瓶配备有无菌磁搅拌棒或250ml的规模小旋转烧瓶和共感染细胞与100病毒颗粒每前身纯化HCAdV(来自步骤5.9)2的细胞)。因而添加9倍10 10 VP根据实际滴度;纯化HCAdV的和HV的1.8倍10 9 TU(通过260nm吸光度测定的步骤6)。
  8. 搅拌从九月4.8.1)或4.8.2)在磁力搅拌器上,在组织培养箱中的细胞-病毒混合物在37℃和5%CO 2的2小时,在60转。确保储存瓶没有完全关闭,让空气流通。
  9. 2小时后感染的细胞 - 病毒混合物的总体积转移回3升喷丝崇拜URE烧瓶并加入一千八百五十零毫升新鲜预热(37℃)MEM培养基补充有5%FBS的至2升的总体积和孵化在组织培养培养箱中于37℃和5%CO 2的48小时,在70转。
  10. 收获细胞离心以890x克在500毫升离心管10分钟,在RT。除去培养基和悬浮沉淀的细胞在28 ml的的DPBS的总体积。吸液管上下,得到均匀的细胞悬浮液。冷冻细胞 - 病毒悬​​浮液在液氮中或在-80℃下确保该悬浮液被完全冻结。存储单元格的病毒悬浮液在-​​80℃下,直到启动病毒纯化。

5.纯化及HCAdV透析

  1. 为了制备病毒裂解物为氯化铯(铯)梯度,冷冻细胞病毒悬浮液从步骤4.11)在液氮中解冻的水浴中在37℃下的四倍。
  2. 离心病毒裂解物在500×g离心为R 8分T和收集含有HCAdV上清。
  3. 对于超速离心准备氯化铯的解决方案,follows.Weigh37.5克(1.5克/厘米3)33.5克(1.35克/厘米3),和31.25克(1.25克/厘米3)氯化铯粉分别填写与卫生署2 O至25ml。
    1. Stirr直到解决方案变得清晰和无菌过滤器的解决方案。最后除去各1mL溶液中,并权衡对判罚尺度来请检查是否密度是正确的。 1毫升应分别体重1.5克,1.35和1.25克
    2. 如果密度太高它通过逐步加入无菌的dh 2 O的小体积(微升)调整除了 ​​卫生署2 O后再次测量densitiy。如果需要添加更多的卫生署2 O.
    3. 重复上述步骤,直到密度是正确的。如果密度太低,它通过加入少量的氯化铯粉末的调整。无菌过滤一遍,检查密度。如果密度太高它由插件调整摹卫生署如前所述2 O。如果密度仍然过低添加铁道部CSCL,无菌过滤一遍,检查密度。重复上述过程,直到密度是正确的。
  4. 在六个明确超速离心管准备氯化铯一步梯度。小心并使用以下顺序慢慢吸管的CsCl溶液到管:0.5毫升1.5克/厘米3的CsCl溶液,将3ml 1.35克/厘米3的CsCl溶液和3.5毫升1.25克/厘米3的CsCl溶液图2C) 。
  5. 叠加〜来自步骤5.2 4.5 ml的清零矢量上清液)在1.25克/厘米3的CsCl层的顶部。离心机使用摆式转子(SW-41)在12℃至少2小时在超速离心机的梯度在226000×g离心(35000转)与慢加速和减速到含有从空粒子和细胞的病毒颗粒分开HCAdV基因组杂物。
    注:细胞碎片形目之上在最佳条件下一个扩散带管中。下面两个白色的条带,可以观测到。上部频带包含空粒子而较低频带等于HCAdV( 图2C和 图5A)。
  6. 小心除去细胞碎片和空颗粒的层,并收集1 ml的从每个管并转移病毒用干净的移液管尖端的低频带进入无菌50ml管中。加起来24毫升1.35克/厘米3的CsCl溶液向收集的病毒粒子和仔细混匀。
  7. 填充离心管1.35克/厘米使用摆式转子3的CsCl病毒溶液顶端和离心机O / N(18- 20小时)在226000×g离心(35000转)在12℃在超速离心机(SW-41 )用慢加速和减速。
  8. 收集存在于所述突出的较低频带的HCAdV。作为一个潜在的上带包含空颗粒从顶部取出上层用吸管( 见图2C 5B)然后拿走低频段USI纳克吸管。
  9. 透析收集的病毒颗粒缓冲区交换。
    1. 切断透析管(截留分子量:50,000)的条带约8厘米的长度,用无菌的dh 2 O洗三次。然后关闭透析管的一侧使用塑料夹具和来自步骤5.8传送所收集的病毒)插入使用1毫升吸移管管道。避免管道内的气泡,并关闭它的另一侧用塑料钳透析封。
    2. 透析在1升透析缓冲液(10mM的Tris-HCl(pH7.5)中,10%甘油和1mM MgCl 2的,在去离子H 2 O)2小时的,在4℃Cwith缓慢搅拌。交换透析缓冲液2升透析缓冲液和透析O / N在4℃下缓慢搅拌。可替换地使用一个sucrosebuffer(140毫摩尔NaCl,5mM的 Na 2 HPO 4 X2H 2 O,1.5mM磷酸二氢钾和730毫蔗糖,pH值7.8)。
    3. 收集来自步骤5.9)2透析的病毒颗粒。使用1毫升对ipette。制备期望的小体积(25-100微升)的多个等份并储存纯化的病毒在-80℃下。

6.测量的最终HCAdV准备通过光密度的实际滴度(OD)

  1. 稀释25微升最终载体制备的来自步骤5.9)2与475微升裂解缓冲液(10mM的Tris-HCl(pH值7.5),10mM EDTA的(pH值8.0),0.5%SDS)),轻轻摇动20分钟在RT和最后离心在室温2分钟,以15,000×克。
  2. 因为在260nm(A260)的吸光度值通常较低,使用100微升的上清液测定吸光度四次并计算四次测量的平均值。计算每毫升的病毒颗粒的数目(VP /毫升-1)使用下面的公式:以kb VP /毫升-1 =(平均A260)×(20)×(1.1×10 12)×(36千字节/ HCAdV大小)。
    注:绝对病毒颗粒(OD效价)的一个典型的收率的结果示于图7A

7.测量总颗粒,在最终载体制备通过qPCR的HCAdV和高压污染程度的感染单位。在滴定过程的方案,如图6所示

  1. 种子HEK293细胞在6或12孔组织培养板,使细胞达到第二天90%汇合。以确定感染性病毒颗粒的数目(感染滴度),感染1细胞以及在多孔板1微升和第二阱与10微升纯化的病毒从步骤5.9)3。
  2. 收获细胞3小时后感染。除去培养基并加入胰蛋白酶以覆盖整个井和孵化在37℃和5%的CO 2 5分钟。冲洗掉细胞与胰蛋白酶用吸管和降速细胞在890×g离心3分钟,在室温。
  3. 重悬沉淀的细胞中加入200μl的DPBS和彻底清洗,以除去游离的(非感染性)载体颗粒。离心3分钟,在890×g离心在RT。丢弃在200μl的新鲜的DPBS的上清,重悬细胞沉淀。
    注意:对于精确测定感染滴度的,关键的是通过胰蛋白酶处理,并充分洗涤以除去由细胞表面的所有非感染性病毒颗粒。
  4. 确定总病毒颗粒数目(感染性粒子和非感染性颗粒=物理效价),收获来自两个孔未感染的HEK293细胞未经胰蛋白酶冲洗掉细胞用吸管其培养基。
  5. 降速细胞3分钟,在890×g离心在RT。丢弃的媒体,重悬沉淀的细胞在200微升的DPBS。苏bsequently 1微升和10微升纯化HCAdV制备的直接添加到细胞。使用非感染的细胞作为背景,以确保基因组DNA的分离和后续的Q-PCR相同的条件。
  6. 从步骤7.3衍生HEK293细胞)和7.5隔离的gDNA)
    1. 悬浮在200微升DPBS(步骤7.3和7.4)为3秒,旋涡细胞加入200μl的SDS溶液。中(10mM的Tris-HCl(pH值7.5),10mM EDTA的(pH值8.0),0.5%SDS)和20μl蛋白酶K(20毫克/毫升)和涡旋悬浮持续3秒。孵育12-16小时,在55°C和摇晃缓慢。然后加入2微升RNA酶A(20毫克/毫升),并育30分钟,在37℃。
    2. 添加350微升酚:氯仿:异戊醇,离心以15,000×g下2分钟。上清转移到一个新的管和重复此步骤一次
    3. 将上清液转移到新的管中,加入50微升乙酸钠(pH 5,3M)和1ml冰冷的乙醇(99.8%),混合悬浮液中。 CENTRI在15000×g离心样品夫格10分钟沉淀基因组DNA。
    4. 然后除去上清液,加入500μl70%乙醇,离心2分钟,以15,000×g的。去除上清,加入500微升70%乙醇的并摇晃30分钟在RT。然后离心以15,000×g下2分钟。
    5. 去除上清,风干DNA沉淀。不干燥DNA沉淀很长一段时间,因为这将是更难获得基因组DNA溶液。重悬在120微升卫生署2 O的DNA沉淀,孵育约1小时,在37℃振荡。如果DNA溶液出现粘稠,摇晃了好几个小时,在37°C,或者在孵育55℃〜1小时。
  7. 以确定感染性HCAdV颗粒和绝对HCAdV粒子,生成的10 1的标准曲线-质粒携带GOI的10 8拷贝包含在HCAdV基因组中。
  8. 通过分析HEK293感染C型相同的基因组DNA量的测定总颗粒和感染颗粒从步骤7.3)和7.4)ELLS申请使用的包含在HCAdV基因特异性引物用于定量PCR GOI 400纳米。
  9. 为10分钟,扩增40个循环的95℃下10秒,55℃,10秒和72℃20秒,在95℃预孵育:将PCR程序如下。在标准曲线(步骤7.7)的基础上,内插在反应腺病毒基因组的总数量。
  10. 使用下列公式推计算在最终的载体制备的腺病毒基因组的数目:(的HCAdV /重量数量中的gDNA在反应纳克)×(在微升重量在所有细胞DNA的纳克在受感染的培养皿/体积病毒) 。
    注:典型的范围绝对和感染性病毒颗粒的产量大约1×10 7 -1×10 8病毒颗粒/微升。滴度,比这里显示10倍更高或更低的可以被认为是正常的。更高的滴度将是一个进步。相对于绝对HCAdV partic的比率莱斯传染性HCAdV颗粒,经验表明,绝对HCAdV颗粒的约5- 10%的感染性图7A)。
  11. 为了确定污染程度与高压,通过放大的腺病毒晚期基因(L3)存在于HV基因组的一部分进行定量PCR。使用质粒携带腺病毒晚期基因3(L3),以产生标准曲线(步骤7.7)。
  12. 在该反应中应用引物L3的400nM的正向5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3'和L3反向5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3'一起300nM的的L3特异性探针5'-FAM-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-TAMRA-3'。
  13. 在40个循环的95℃15秒和60℃1分钟,10分钟,扩增在95℃下预温育/活化:将PCR程序如下。使用任何通用探针PCR mastermix的定量PCR反应。在标准曲线(步骤7.7)的基础上,计算出的在数传染性HV颗粒在最终载体制备。看图7A),用于高压颗粒典型产量。
  14. 最后计算HCAdV的向HV污染水平绝对感染性颗粒的比率来评价矢量制剂的质量。
    注:直到现在剩余高压的一小部分不能被排除。一般高压污染的百分比是传染性颗粒或更小的〜5%,这是可以接受的( 图7B)。当然作为HV尽可能少是理想的,特别是如果载体制备将被用于动物实验。

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Representative Results

示出被用于克隆,扩增和HCAdV制剂的纯化这里代表性实例。克隆策略的通过限制酶消化的概述( 图1)和用于克隆的代表性例子和HCAdV基因组的释放被提供( 图2)。从pHM5所述GOI表达盒由PI-SCE I和I-CEU我消化和随后的苯酚-氯仿提取和EtOH沉淀释放后的典型限制图谱(参见步骤1.2- 1.5)所示图2A)。通常对应于所述pHM5质粒骨架和对应于所述GOI的表达盒的第二频带的〜3kb的频带可以观察到。含有GOI表达盒的带,然后从琼脂糖凝胶纯化。纯化的GOI-表达盒在琼脂糖凝胶上与纯化,脱磷酸化pAdVFTC一起分析使得w作为消化的PI-SCE I和I-CEU我分别(步骤1.7),以验证正确的大小,并估计分子随后连接图2B)的相对量。结扎后(参见步骤1.8),接着酚-氯仿抽提,乙醇沉淀和SWA我消化,以消除未切割pAdFTC和随后的苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀(步骤1.9),连接产物转化到细菌和克隆在氨苄青霉素选择含有LB-琼脂平板上。通常几十到几百个克隆的获得,从中5- 10克隆质粒DNA迷你制剂制备。的正和负的克隆分析Hinc II位消化的与空pAdFTC作为阴性对照(也参见步骤1.10)一起的限制性图谱示图2C)。这里阳性克隆不显示5kb的频带,也就是存在于空pAdFTC和阴性克隆和一个1.7 kb的片段出现即不存在于空pAdFTC和阴性克隆。对于此相应的伊拉克政府这表明塔克隆成功。已通过中提被纯化阳性克隆,然后用 TI消化释放HCAdV基因组从pAdVFTC-GOI(步骤2.2)承载着印度政府。最后 TI消化的DNA IST纯化用两倍苯酚-氯仿提取和EtOH沉淀,以确保所述DNA用于随后转染到116细胞的高纯度。消化pAdVFTC-GOI的 TI的一小部分分析在琼脂糖凝胶上显示了对应于pAdFTC质粒骨架和高达〜36 kb的(取决于所述GOI的表达盒的大小)大的带一〜9 1kb条带对应于HCAdV基因组图2D)。扩增和纯化管道的概述示意性示出图3)。设置在载体预扩增过程的监测的代表性实例( (图4A)。请注意,载体基因组的数量在第一通道通常descreases并大大增加在以后的段落。 10 6的载体拷贝数- 10 7每15000细胞足以感染116细胞对于大规模生产在一个3升转瓶中。如果HCAdV载体基因组内所述GOI含有GFP的表达盒中,预扩增过程(部分2),也可通过荧光显微镜监测。每个通道的代表画面显示图4B)。需要注意的是GFP阳性细胞的数量在第一通道通常降低,并且大大增加在晚期传代。如果GFP阳性细胞的数量达到〜100%,该载体扩增SUFFiciently感染在一个3升转瓶中116细胞对于大规模生产。含HCAdV GFP表达盒的大规模扩增过程是由培养基和细胞的显微镜分析被从旋转瓶到组织培养皿转移监测。细胞产生HCAdV悬浮培养的显微照片(见步骤4.4和4.11)提供( 图4C)。需要注意的是细胞生长在团块,表明前述细胞生长充分,细胞健康。当使用这些细胞的荧光显微镜〜100%为GFP阳性,说明悬浮细胞在生物反应器和有效载体的生产效率的转导。载体颗粒​​从介质和3升悬浮培养的细胞用CsCl超速离心纯化。用氯化铯密度梯度超速离心的HCAdV矢量纯化的代表性图片示图5)。之后N使用一个铯一步梯度离心初期通常两个频段观察。上部频带包含空部分衣壳而下部带由包含DNA载体颗粒(步骤5.4- 5.5)(图5A)的。含载体颗粒的DNA随后收获(步骤5.6)和汇集为一个第二超速离心步骤以浓缩载体颗粒。此步骤通常 ​​导致含有DNA载体颗粒的单一条带被最后收获用于随后透析(步骤5.7- 5.8)(图5B)。透析载体制备物特征在于,测量绝对颗粒,感染颗粒和高压污染的数量。滴定过程(第6和7)的纲要提供( 图6)。为最终载体制剂的表征代表性的结果示图7)。条形图显示了典型的载体颗粒数由在这个协议中描述的方法获得的。载体颗粒的绝对颗粒数是由光密度(第6节),感染性载体颗粒和高压污染确定通过qPCR(第7节)(图7A)进行测定。经验表明,该外径滴度高估病毒颗粒的数目。由OD测量的绝对的病毒颗粒可以是20-比通过q-PCR测量感染性病毒颗粒更高的500倍。感染性载体颗粒usally范围绝对颗粒之间5- 10%时两者都通过Q-PCR(部分7)进行测定。如果向量制备具有非常良好的质量,绝对的颗粒的20%以上都具有传染性。 HV和传染性HCAdV颗粒(步骤7.14)之间的典型比率通常在感染性颗粒的1-5%(图7B)的范围内。这是可以接受的HV是复制缺陷。然而如以下HV污染尽可能(<感染性颗粒的1%)将是优选的。

图1
图1流程图克隆所述GOI成pAdFTC的。所述GOI克隆到pHM5穿梭质粒的所述MCS。质粒pAdFTC和pHM5-GOI消化利用I- CEU I和PI-SCE I和通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀纯化。将消化pHM5被装载在一个制备性琼脂糖凝胶纯化感兴趣的基因(也参见步骤1.5),而消化pAdFTC质粒脱磷酸化。接着用CIP处理的pAdFTC连接反应和转基因表达盒被设置(见步骤1.8)和完成后纯化通过苯酚 - 氯仿提取和乙醇沉淀。连接产物然后进行苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀的随后SWA我消化防止克隆携带pAdFTC而不插入物生长。黑三角度表示限制性酶识别位点;灰色框表示病毒Adv5反向末端重复序列(ITR),标有Ψ白框表示病毒Adv5包装信号,红色箭头表示子,绿框表明转基因(基因的利益,伊拉克政府)来表示,蓝框表示聚腺苷酸化信号,橙色或蓝色箭头表示质粒骨架的抗生素抗性基因,分别。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图从pAdVFTC的HCAdV基因的克隆过程和释放2.代表性成果。 )发布的GOI表达盒从pHM5通过PI-SCE我和I- CEU我消化(参见步骤1.2〜1.5)。(B) PI-SCE I和I-CEU我分别(步骤1.7)。(C)的 pAdVFTC克隆具有和不具有GOI(也参见步骤1.10)的解析Hinc II位摘要。在HCAdV基因组携带印度政府从pAdVFTC,印度政府通过 TI摘要(步2.2),(四)发行请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.示意图为高容量腺病毒载体的扩增和纯化甲)HCAdV DNA转染和辅助病毒(HV)感染:线性HCAdV基因组携带GOI插入HCAdV生产者细胞系的转染(116细胞[4])和苏bsequent感染与HV AdNG163R-2 [4]。   (B)的 HCAdV的扩增:在预扩增步骤通过串行转移细胞裂解物,以一个新的组织培养皿和共感染以高压,大规模生产是在一个3升悬浮培养进行(C)的 HCAdV纯化:对于纯化,病毒是通过超速离心用氯化铯梯度中分离(D)透析:纯净HCAdV颗粒透析2升的存储缓冲器。 HCAdV,高容量腺病毒载体; ITR,腺病毒血清型5末端反向重复; Ψ,包装信号; HV,辅助病毒; MOI,感染复数。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4 <登记/> 扩增过程 (A)中通过使用qPCR病毒基因组的扩增的预扩增过程的监测 图4 代表性的结果 (还参见部分3);(B)如果所述GOI包含GFP为转基因,预扩增过程可以通过荧光显微镜监测。(C)的大规模扩增过程的在旋转烧瓶代表性结果例示为用于HCAdV编码GFP的。左边的面板显示感染116细胞从旋转瓶的显微照片。培养基和细胞的样品转移到60毫米组织培养皿中。需要注意的是放大的细胞团块可见。右图显示同样的画面使用荧光显微镜。几乎100%的细胞被转导与HCAdV携带绿色荧光蛋白。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
氯化铯梯度离心后,图5。代表性的成果 (A)进行分级梯度(参见步骤5.5)后;(B)连续梯度(参见步骤5.7)后, 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
图滴定过程6.纲要。 (A)测定感染性颗粒的:在多孔板的细胞被感染不同体积的纯化的病毒并收集细胞沉淀(B)的测量O操作。˚F绝对颗粒:Unifected细胞形成多井通过胰蛋白酶消化和离心收集。之后再悬浮纯化的病毒,并将基因组DNA是孤立的,基因组DNA(C)隔离 。(四)要量化定量PCR(Q-PCR)进行病毒基因组拷贝数。 请点击此处查看这是一个更大的版本数字。

图7
图为最终载体制备表征代表性的成果。 (A)的根据不同的方法来确定所呈现的协议的载体制备的颗粒的绝对数量:由通过qPCR(第7节)测量光密度(第6节),感染效价和高压污染测定OD滴度(B)的通过qPCRs(第7条)测得的总感染HCAdV颗粒和HV污染水平之间的比率。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

这里介绍的协议允许根据基于先前描述的方法4,12人腺病毒5型HCAdV矢量纯化。在pAdFTC质粒内的基因组HCAdV是缺乏所有腺病毒基因和仅携带5'-和3'-的ITR和包装信号。在这一战略的HV AdNG163R-2 4提供了所有必要的基因的高效病毒生产反式 。这提供了一个包装容量高达35 KB,这显然outcompetes第一代和第二代副词或广泛使用的慢病毒(LV) - 或腺相关病毒(AAV)为基础的载体。 HCAdV的特别适用于体内应用的第二个优点是,在相对 ​​于第一或第二代ADVS它们显示细胞毒性水平降低和免疫原性引起的副作用病毒蛋白5-8的表达这一事实。

然而这里描述的方案是更多的时间和工作密集比其他病毒载体,如LV-或AAV-矢量以及第一或第二代ADVS。一个主要的障碍是大转基因的克隆和随后转移到病毒产生质粒pAdV-FTC。使用归巢核酸内切酶PI-SCE我和I- CEU我提供的穿梭质粒pHM5转基因的精确和定向插入,但有强烈坚持在切割的DNA的缺点。由于这个原因,克隆过程期间制备plasmid-并插入-DNA时许多苯酚 - 氯仿净化步骤是必要的。因此,严格按照规定的克隆协议是严格建议。之后克隆HCAdV基因组被从质粒pAdFTC释放Not I限制性酶消化,并随后转染到所述生产者细胞系。需要注意的是最初的转染效率是实现足够的病毒扩增是至关重要的。重要的是,该协议提供几个步骤从该程序可重新启动的情况下后续步骤失败。在预扩增的裂解物的三分之一可存储为备份重新开始从该点过程或缩短的重复的情况下更病毒需要来生产。

HCAdV携带大型,复杂或几个转基因或某些填充DNA可能会放大慢于预期。因此,关键的是要仔细遵循预扩增过程之前悬浮培养物生长在一个旋转烧瓶。如果预放大不成功,程序应该停止和再次开始启动。如果预放大效率低,附加的传代可能是必要的,直至病毒的量高到足以在感染的3L旋转瓶中生长的细胞。如在旋转烧瓶的替代悬浮培养,20至30 150毫米组织培养皿中可以使用的最后通道。然而,这可能是更多的时间和工作密集的。

对于定量PCR测量的gDNA可以通过这里提到的协议或任何市售试剂盒的gDNA从培养细胞中分离纯化。通过使用市售的试剂盒的协议可被缩短之一天但HCAdV基因组拷贝的存在于受感染的细胞的变化的部分可以在纯化期间被丢失,这取决于所用的试剂盒。因此HCAdV基因组会略有代表性不足的时候相比,在步骤7.4提出的方法)以下的Q-PCR测量。

Obtai在一最后的载体制备奈德总感染性滴度衍生自一种旋转烧瓶范围从1×10 105×10 11感染性颗粒。这个量足以在体外实验进行多方面的。 体内实验依赖于靶细胞,也可以几个进行。例如,对于全身给药后获得足够的肝转导1×10 9个感染性颗粒是必需的。

综上所述,宽细胞嗜性和产生衣壳修饰的腺病毒一起HCAdV的改进的安全性的可能性矢量缺乏所有病毒基因呈现这些HCAdV载体系统用于基因治疗应用的高度有价值的工具。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I-CeuI New England Biolabs R0699S restriction digest
PI-SceI New England Biolabs R0696S restriction digest
T4 Ligase New Engand Biolabs M0202S ligation
SwaI New England Biolabs R0604S restriction digest
NotI New England Biolabs R0189S restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) New England Biolabs M0290S dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B PAN Biotech P02-015 selection of CRE expressing 116 cells
DMEM PAN Biotech P04-03590    Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle PAN Biotech P04-08500 116 cell culture medium  
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) PAN Biotech P04-36500 washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle Sigma CLS430281-24EA infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes Sigma CLS431123-36EA sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask Bellco 1965-61030 growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes Beckmann Coulter 344059 density gradient centrifugation
Ultracentrifuge Beckmann Coulter density gradient centrifugation
SW-41 rotor Beckmann Coulter density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane VWR 132129 dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes  Thermo 66383 dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli invitrogen C4040-52 transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495 midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit  Peqlab 12-3396-02 isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305 tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS) Gibco 31985-062 transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix BioRad  170-8882 q-PCR
CFX 96 C1000 touch  Biorad qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol  Carl Roth A156.1 purification of DNA
Cesium chloride Carl Roth 8627.1 density gradient centrifugation
sodium acetate 99% Carl Roth 6773.2 DNA precipitation
LB medium  Carl Roth X968.3 bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure Carl Roth 9065.5  DNA precipitation and washing
SDS 99.5% Carl Roth 2326.2 lysis  buffer
EDTA Carl Roth 8043.2 lysis  buffer
Tris-HCl 99% Carl Roth 9090.3 dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5% Carl Roth 3783.1 dialysis buffer
MgCl2 98.5% Carl Roth KK36.2 dialysis buffer
NaCl Carl Roth 3957.1 optional dialysis buffer
KH2PO4 Carl Roth 3904.2 optional dialysis buffer
sucrose Carl Roth 9286.1 optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O Carl Roth 4984.2 optional dialysis buffer
1.5-ml tubes sarstedt 72,730,005 storage of virus preparations at -80 °C

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