Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity Adenovirusvektoren Auf der Grundlage des humanen Adenovirus Typ 5

Bioengineering

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Ehrke-Schulz, E., Zhang, W., Schiwon, M., Bergmann, T., Solanki, M., Liu, J., Boehme, P., Leitner, T., Ehrhardt, A. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (107), e52894, doi:10.3791/52894 (2016).

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Abstract

Introduction

Für gentherapeutische Anwendungen ist es von großer Bedeutung ist es, zytotoxische und immunogene Nebenwirkungen durch die Expression von viralen Proteinen, das Transgen selbst oder von ankommenden viralen Proteine ​​zu vermeiden. Adenovirus-Vektoren (AdV) werden häufig verwendet, um Fremd-DNA in eine Vielzahl von Zellen einzuführen, um die Auswirkungen der Expression des Transgens 1,2 zu untersuchen. Das am weitesten fortgeschrittene Version von AdV wird durch Hochleistungs-Adenovirus-Vektoren (HCAdV) fehlen alle viralen kodierenden Sequenzen 3,4 und damit eine Verpackungskapazität von bis zu 35 kb bei geringer Immunogenität und geringe Toxizität 5-8 bietet vertreten. Aufgrund ihrer hohen Verpackungsleistung sie ermöglichen Lieferung von großen oder mehreren Transgenen unter Verwendung eines einzelnen Vektordosis. Daher stellen sie ein wertvolles Instrument für die Forschungsgemeinschaft.

Im Gegensatz zu der ersten oder zweiten Generation AdV fehlen die frühen Gene E1 und / oder E3, die leicht mit kommerziellen Kits hergestellt werden können, vector Genom Bau und die Virusproduktion von HCAdV ist komplexer. Das System für die Konstruktion von HCAdV Genomen auf dem Plasmid pAdFTC Tragen eines HCAdV Genom frei von alen viralen kodierenden Sequenzen und dem Shuttle-Plasmid PHM5 9-12 basieren. Jedes Gen von Interesse von bis zu 14 Kilobasen (kb) in den Shuttle-Vektor PHM5 in dem die Mehrfach-Klonierungsstelle von Erkennungs flankiert kloniert / Spaltstellen der Homing-Endonukleasen PI- Sce I und I-Ceu I. Daher kann ein geklontes Gen von Interesse durch aufeinanderfolgende PI- Sce I und I-Ceu I freigesetzt werden verdaut für eine nachfolgende gerichtete Insertion in die gleichen Restriktionsstellen in dem Genom HCAdV im Plasmid enthaltenen pAdFTC vorhanden. In pAdFTC das Transgen Insertionsstelle zwischen dem PI- Sce I und I- Ceu I-Stellen-Spaltung entfernt wird von Füll-DNA und nicht-kodierenden Sequenzen zur adenoviralen Genoms eine Verpackung, wie beispielsweise die 5'- und 3'-Inverted Terminal Repeats (ITRs) flankiertan beiden Enden und dem Verpackungssignal stromabwärts des 5'ITR. Die zusätzliche Füll-DNA bietet eine optimale Größe der endgültigen HCAdV Genoms reicht von 27 bis 36 kb, um eine effiziente Verpackung während der Virusproduktion zu gewährleisten. Seit pAdFTC ist ein großes Plasmid mit bis zu 45 KB (abhängig von der Größe der eingefügten Transgen) und die Verwendung des Homing-Endonukleasen mit vergleichsweise langen DNA-Erkennungsstellen zeigt eine starke DNA-Bindung, mehrere Bereinigungsschritte sind notwendig, während der Übertragung des Transgens aus PHM5 um pAdFTC. Sorgfältiger Umgang Vermeidung von Scherkräften wird empfohlen.

Die ITRs des Genoms HCAdV durch Not I-Restriktionsenzym-Erkennungsstellen unmittelbar vor der 5'ITR und stromabwärts des 3'ITR 12 flankiert. Daher kann HCAdV durch Not I zur anschließenden Transfektion des viralen Genoms in das HCAdV Erzeugerzelllinie zu verdauen freigegeben. Man beachte, dass die Verwendung der Restriktionsenzym NotI für relLeichtigkeit des viralen Genoms aus dem Plasmid pAdFTC impliziert, dass das eingefügte Transgen frei von Not I DNA-Erkennungsstellen. Die HEK293-Zelle basierend Produzentenzellen (116 Zellen) stabil Cre-Rekombinase auszudrücken. Für Virusamplifikation 116 Zellen mit einem Helfervirus (HV), allen AdV-Gene für die Replikation und Verpackung in trans 3,4 benötigt koinfiziert. Die HV ist eine der ersten Generation AdV mit einem floxed Verpackungssignal, das während der Virus Verstärkung durch Cre-Rekombinase in 116-Zellen exprimiert 4 entfernt wird. Dies stellt sicher, dass überwiegend HCAdV Genome, die eine intakte Verpackungssignal eingekapselt werden.

Vorverstärkung des HCAdV durch serielle Passagierung leitenden Schritte in 116-Zellen auf Oberflächen in Gewebekulturschalen gezüchtet geführt. Nach jedem Durchgang viraler Partikel aus infizierten Zellen durch drei aufeinander folgende Durchführung Gefrier-Auftau-Stufen freigegeben. Mit jedem Durchgang immer mehr Zellen mit infiziert1/3 Zelllysat aus dem vorhergehenden Durchgang. Schließlich Lysat aus dem letzten Pre-Verstärkungsschritt wird verwendet, um Produzentenzellen in Suspension in einer Spinnerflasche für große Verstärkung gewachsen zu infizieren. Virionen werden aus den Zellen in Suspension durch Ausführen Ultrazentrifugation in einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten 4,12 gereinigt. Mit dieser Vorgehensweise leere Teilchen und komplett montiert Partikel werden in zwei verschiedene Bänder getrennt. Weiter zu konzentrieren die HCAdV Partikel eine zweite nicht-schrittweise Ultrazentrifugation durchgeführt wird. Anschließend wird die resultierende Bande, die das HCAdV wird gesammelt und gegen einen physiologischen Puffer dialysiert. Endvektor Präparate bezüglich der Zahlen der absoluten Viruspartikel, infektiösen Partikeln und HV Kontamination aus. Absolutviruspartikel durch Lyse Viruspartikel und Messen der Absorption bei 260 nm oder durch Durchführen quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) 12 bestimmt werden. Infektiosität des purified Viruspartikel können durch qPCR Mess HCAdV in infizierten Zellen 3 h nach der Infektion vorhanden Genomen bestimmt werden.

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Protocol

1. Konstruktion von rekombinanten HCAdV Genome auf der Grundlage der Plasmid pAdFTC

Hinweis: Alle Plasmide wurden zuvor 11,12 beschrieben und sind auf Anfrage erhältlich. Das Klonierungsverfahren ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt.

  1. Klonen eines Gens von Interesse (GOI) einschließlich Promotor und Polyadenylierungssignal (PA) in das Shuttle-Plasmid PHM5, unter Verwendung einer Klonierungsstrategie der Wahl, um PHM5-GOI generieren.
    Hinweis: Da pAdFTC ist ein relativ großes Plasmid werden klassische Plasmidpräparation Protokolle empfohlen sheering der Plasmid-DNA unter Verwendung von kommerziellen Plasmid-Reinigungskits, der auf Silica basierende Membranen sind zu vermeiden. I- Ceu I und PI -Sce I stark an die DNA binden und ändern die elektrophoretische Beweglichkeit der verdauten DNA. Daher wird eine Phenol-Chloroform-Extraktion und EtOH Niederschlag (Schritt 1.3), bevor Agarosegelelektrophorese erforderlich.
  2. Digest 20 ug pHM5-IR und 10 ug pAdFTC von I-CeuI (10 U) für 3 h bei 37 ° C in einem Gesamtvolumen von 100 ul zu linearisieren Plasmide (~ 2,8 kb + GOI ORF-Sequenz und ~ 31kb, beziehungsweise).
  3. Reinige linearisierte Plasmide mit Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von Ethanol (EtOH) Niederschlag 13.
    1. Fügen Sie 100 ul Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol und vorsichtig Umdrehen des Röhrchens mehrmals. Zentrifuge für 2 min bei 15.000 x g.
    2. Den Überstand in ein neues Röhrchen werden 20 & mgr; l Natriumacetatpuffer (pH 5, 3 M) und 400 & mgr; l eiskaltem EtOH (99,8%) und mischen Suspension kräftig. Zentrifuge für 10 min bei 15.000 x g.
    3. Entfernen des Überstands werden 300 ul 70% EtOH und zentrifugieren für 2 min bei 15.000 x g. Dann entfernen Überstand und der Luft trocknen DNA-Pellet. Das Pellet in 10 bis 20 & mgr; l dH 2 O. Trocknen Sie keine DNA-Pellet zu lang ist, wie es wird schwieriger sein, DNA in Lösung zu erhalten.
  4. Digest I-Ceu I -digested PHM5-IR und pAdFTC Plasmid aus Schritt 1.3) für mindestens 3 h oder O / N mit dem Restriktionsenzym PI -Sce I (10 U) bei 37 ° C in einem Gesamtvolumen von 50 ul und anschließend reinigen I -CeuI und PI -Sce verdauten Plasmide mit Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von EtOH Niederschlag (siehe Schritt 1.3). Aufzulösen DNA in 20 ul nucleasefreiem dH 2 O.
  5. Separate PHM5 Plasmidrückgrat (2,8 kb) und die indische Regierung (aus Schritt 1.4) auf einem präparativen Agarose-Gel und Gel-Reinigung der indischen Regierung mit einem handelsüblichen Gel- und PCR clean-up-Kit. Eine repräsentative Agarosegel der Digest wird in 2A gezeigt.
  6. Dephosphorylieren I- Ceu I und PI -Sce-verdaute pAdFTC (aus Schritt 1.4) mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase CIP (10 U) für 1 h bei 37 ° C in einem Gesamtvolumen von 25 ul und reinige dephosphorylierte Plasmid pAdFTC durch Phenol-Chloroform-Extraktion und anschließende EtOH precipitation (Schritt 1.3). Eluieren der DNA in 20 ul Nuklease-freien dH 2 O
  7. Zuführen analytische Gelelektrophorese von einem Aliquot des dephosphorylierten pAdFTC Plasmid (aus Stufe 1.6) und das gereinigte GOI-Fragment (aus Stufe 1.5) zu analysieren, ob verdaut abgeschlossen sind und die Größen der erwarteten Fragmente korrekt ist (sind ~ 31 kb für linearisierte pAdFTC ).
    Hinweis: Die Größe des GOI ist variabel in Abhängigkeit von der Größe der Transgen-Expressionskassette. Schätzung der relativen Konzentrationen der jeweiligen Fragmente für die anschließende Ligation. Eine repräsentative Agarosegel von gereinigten Fragmente ist in 2B gezeigt.
  8. Richten Sie die Ligationsreaktion in einem Gesamtvolumen von 20 ul mit 400 U T4 DNA-Ligase und ein molares Verhältnis von Vektor zu der ein 1: 3.
    HINWEIS: In Übereinstimmung mit der in 2B gezeigten Agarosegel ligieren wir in der Regel in einem Gesamtvolumen von 20 ul mit 2- bis 6-ul Vektor, 8- bis 12 & mgr;Einfügen und 400 U T4 DNA-Ligase. Da die DNA-Konzentration ist in der Regel günstig nach mehreren Phenolisierung Schritte Verwenden soviel DNA wie möglich, so dass kein zusätzliches H 2 O zugegeben werden muss das Endvolumen von 20 ul zu erreichen. Ligation bei 16 ° CO / N und anschließend durchzuführen Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von EtOH Niederschlag (Schritt 1.3).
    1. Eluieren der DNA in 15 ul nucleasefreiem dH 2 O und verdauen die gereinigte Ligationsreaktion mit dem Restriktionsenzym SwaI (10 U) für 2 Stunden bei 25 ° C in einem Gesamtvolumen von 20 ul. Dann konzentrieren und zu reinigen DNA, indem Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von EtOH Niederschlag (Schritt 1.3). Eluieren der DNA in 10 ul Nuklease-freien dH 2 O
  9. Transformations 2 ul des gereinigten SwaI verdaut Ligierungsprodukt durch Elektroporation in DH10B oder DH5a elektrokompetente E. coli und wählen Sie Klonen für 16 bis 24 Stunden bei 37 ° C auf Ampicillin-haltigen LBPlatten (50 mg / ml Ampicillin). Wählen 5- 10 Klone und bereiten Plasmid-DNA-Mini-Präparationen mit alkalische Lyse, gefolgt von Phenol-Chloroform-Extraktion und anschließende Ausfällung EtOH (Schritt 1.3) 13.
  10. Durchführen eines analytischen Verdaus von Plasmid-Mini-Präparationen, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese, um die Größe der DNA-Fragmente zu prüfen. Empfohlene Restriktionsenzyme sind beispielsweise I- Ceu I und PI- Sce I Lösen des Einsatzes, Spe I oder HincII (2C).
  11. Verstärken einer korrekten Klons in ampicillinhaltigem LB-Medium (50 mg / ml Ampicillin) und führen eine MIDI- oder Maxi Plasmidpräparation mit einem beliebigen im Handel erhältlichen Plasmid-Reinigungskits.

2. Veröffentlichung HCAdV-Genome von pAdFTC Plasmide und Vorverstärkung der HCAdV Vektoren in der Producer Zelllinie 116

  1. Verdauen 20 ug des pAdFTC-basierten Adenovirus-Produktion Plasmid, das das geklonte GOI aus Schritt 1.11) inein Gesamtvolumen von 100 & mgr; l mit Not I (20 U) bei 37 ° C für> 2 h und durchzuführen, Phenol-Chloroform-Extraktion durch EtOH Fällung zweimal gefolgt. Lösen sich in 20 bis 30 & mgr; l sterilem dH 2 O
  2. Überprüfen eines Aliquots 1:10 verdaut pAdFTC-GOI-DNA durch Gelelektrophorese. A 9 kb-Fragment für das Plasmidgerüst und, abhängig von der Größe des GOI, eine zweite DNA-Fragment für die HCAdV Genoms (Größe: 28- 36 kb) nachweisbar.
    HINWEIS: Ein repräsentatives Beispiel für das Not I-Verdau ist in Figur 2D dargestellt. Linearisierte DNA kann für mehrere Tage bei 4 ° C oder bei -20 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.
  3. Bevor mit dem Protokoll fortfahren, stellen Sie sicher, dass das Helfervirus AdNG163R-2 verstärkt worden 4.
    Hinweis: Zellen mit pAdFTC abgeleitet HCAdV Vektoren transfiziert sind genetisch veränderter Organismen als Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2), wenden Sie sich bitte korrekte Rückhaltung und Entsorgung verwenden klassifiziertMaßnahmen, einschließlich der persönlichen Schutzausrüstung, und arbeiten unter BSL-2 Laminarströmungshauben.
  4. Kultur 116-Zellen in MEM-Eagle Medium mit 10% FBS und Hygromycin B (100 ug / ml) ergänzt. Seed Niedergang (unten Durchgang 10) 116-Zellen (~ 0,4x 10 6 Zellen) in einem 60 mm-Gewebekulturschale einen Tag vor der Transfektion, so dass sie 50- 80% Konfluenz am nächsten Tag zu erreichen.
  5. Transfektion linearisiert HCAdV Genoms aus Schritt (2.1) in 116-Zellen unter Verwendung von Methoden, wie Calciumphosphat-Transfektion oder anderen im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien (3A). 16- 18 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie vorsichtig das Medium, 3 ml frisches Medium (MEM, 5% FBS) und infizieren Zellen mit dem HV AdNG163R-2 4 Anwendung 5 Wandlereinheiten (UE) pro Zelle (seit einer konfluenten 60 mm Gewebekulturschale enthält ~ 3.2x 10 6 Zellen, fügen ~ 1.6x 10 7 TU von HV).
    1. Bewegen vorsichtig das Gericht alle 20 min während der ersten Stunde nach der Infektion zudie Gleichverteilung HV. Kulti infizierten Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2. Im Falle eines effizienten Virusamplifikation zytopathischen Effekts (CPE) durch die Virusreplikation verursachte beobachtbare (Zellen werden aufgerundet und lose befestigt oder gelöst von der Gewebekulturschale) wird 48 Stunden nach der infection.If CPE beobachtet wird zuvor die Menge des HV hat reduziert werden. Wenn CPE beginnt später mehr Helfervirus verwendet werden.
  6. Ernten der Zellen einschließlich der Überstand 48 h nach der Infektion durch Spülen von den Zellen aus der Kulturschale mit dem Kulturmedium. Zellen, die in ihrem Kulturmedium suspendiert sind, werden Durchgang namens 0 (P0). Split P0 in zwei Fraktionen.
    1. 0,5 ml der abgelösten Zellen zentrifugieren Sie die Zellen 3 Minuten lang bei 2.000 xg und entfernen Medium vom Zellpellet wird später zur Isolierung von genomischen DNA (gDNA) zum qPCR basierten Analyse des Amplifikationsverfahrens verwendet wird. Speicher Zellpellets bei -20 ° C bis zur Weiterverarbeitung.
    2. Von 2,5ml der abgelösten Zellen setzen virale Partikel durch Einfrieren (bei -80ºC oder in flüssigem Stickstoff) und Auftauen (bei RT oder in einem 37 ° C Wasserbad) die Zellen, die in ihrem Medium drei bis vier Mal resuspendiert werden. Diese Fraktion ist als genannte Lysat von P0.
  7. Sicherzustellen, dass die Gewebekulturplatten mit 116-Zellen, die auf 90- 95% Konfluenz mit MEM-Medium mit FBS (10%) und Hygromycin B (100 ug / ml) und HV ergänzt angebaut werden, sind für die folgenden Schritte Passagieren zur Verfügung.
  8. Mischen 1 ml frischem Medium (MEM, 5% FBS) mit 2,5 ml des Lysats von dem vorhergehenden Durchgang (Schritt 2.6.2) bis zu einem Endvolumen von 3,5 ml, so HV Aufbringen 2 TU pro Zelle (da ein 60-mm-Gewebe Kulturschale bei einer Konfluenz von 90- 95% enthält ~ 3.2x 10 6 Zellen, fügen ~ 6.4x 10 6 TU von HV). (3B). Das Medium aus einem 60 mm-Schale von 116 Zellen vorsichtig entfernen und fügen Sie die Virus Mischung zu den Zellen. Wiederholen Sie Schritt 2.6) - 2,8) zweimal, um Lysaten Pass zu erhaltenAltersstufen P1 und P2.
  9. Mischungs 17,5 ml frisches Medium (MEM, 5% FBS) mit 2,5 ml des Lysats von P2 und fügen HV Aufbringen 2 TU pro Zelle (da eine 150 mm-Gewebekulturschale mit einer Konfluenz von 80- 100% enthält ~ 2 x 10 & sup7; Zellen, fügen ~ 4x 10 7 TU des HV). Entfernen Sie das Medium aus einem 150 mm-Schale von 116-Zellen und Zellen infizieren mit dem Virusmischung. Kulti infizierten Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2.
  10. 48h nach der Infektion Ernten der Zellen, wie in Schritt 2.6 beschrieben), um Durchgang P3 (3B) zu erhalten.
    1. Wiederholen Sie Schritt 2.6) 1.
    2. Aus der verbleibenden 19,5 ml P3 Freisetzung viralen Partikel aus den Zellen resuspendiert durch Einfrieren und Auftauen drei bis viermal. Diese Fraktion ist als genannte Lysat von P3.
      Hinweis: Einige Vektoren können eventuell zusätzliche Passagen in 150 mm-Schalen benötigen, bis sie ausreichend verstärkt. Daher Effektivität der Vorverstärkung Prozess muss in der Serien Pass überwacht werdenAltern. qPCR basierte Analyse der Verstärkungsprozess kann, wie in Abschnitt 3 (siehe auch 4A) beschrieben, durchgeführt werden. Vorverstärkung HCAdV Durchführung eine Expressionskassette für das grün fluoreszierende Protein (GFP) kann leicht durch die Beobachtung der GFP flourecscent Signals unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (4B) ausgewertet werden.

3. Überwachung der Verstärkungsprozess mit Quantitative-Real Time PCR (qPCR) (siehe auch 4A).

  1. Isolieren gDNA aus Zellpellets aus jedem Durchgang des preamplifaction (Schritte 2.6) - 2,10) unter Verwendung von jeder kommerziellen DNA Isolation Kit zur Isolierung von gDNA aus kultivierten Zellen oder ein anderes Verfahren der Wahl. Für eine optimale PCR-Ergebnisse verwenden gDNA so frisch wie möglich. Andernfalls gDNA kann bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.
  2. Zur Bestimmung der Anzahl von HCAdV Genome in den Zellen des jeweiligen Durchgang durch qPCR-Analyse vorhanden Generieren Sie eine Standardkurve unter Verwendung von 10 1 </ sup> - 10 9 Kopien eines Plasmid, das die indische Regierung im HCAdV Genom enthalten.
  3. Analysieren die gleiche Menge von gDNA P0- P3 (Schritt 2.6- 2.10) Anwenden qPCR unter Verwendung von 400 nM der Primer, die spezifisch für das GOI in der HCAdV Genom enthalten. Für die Durchführung von qPCR Folgeherstellerangaben des jeweiligen qPCR Chemikalien. Gesetzt den qPCR Programm wie folgt: Vorinkubation bei 95 ° C für 10 min, Amplifikation in 40 Zyklen von 95 ° C für 10 s, 55- 60ºC für 15 s und 72 ° C für 20 s. Auf der Basis der Standardkurve die Anzahl der HCAdV Genomen in der Reaktion kann interpoliert werden.

4. Large Scale Amplifikation von HCAdV Vektoren in 116-Zellen in Suspension wachsen

  1. Add 900 ml vorgewärmtem (37 ° C) frisches MEM mit 10% FBS und Hygromycin B (100 ug / ml) ergänzt in einen 3 l Spinner-Kulturflasche (3B).
  2. Entfernen Sie Medium aus mindestens 10 einzelnen 150 mm-Gewebekulturschalen mit 116 Zellen bei einer Konfluenz von 90- 100% gewachsen und wegzuspülen Zellen mit 10 ml frischem vorgewärmtem (37 ° C) MEM, das mit FBS (10%) und Hygromycin B (100 ug / ml) unter Verwendung einer serologischen Pipette ergänzt. Pipette nach oben und unten mehrere Male, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten. Übertragen Sie Zellen direkt in die Spinnerflasche bereits 900 ml von Schritt 4.1 enthalten).
    Hinweis: Verwenden Sie keine Trypsin / EDTA, wie es kann sich negativ Wachstum von Suspensionszellen beeinflussen. Nach dem Entfernen des Mediums unmittelbar übertragen Zellen in die Spinnerflasche. Mehr als zwei Gewebekulturschalen Fassen Sie zu einem Zeitpunkt. Je länger die Wartezeit nach der Zugabe von frischem Medium, desto schwieriger wird es sein, die Zellen von der Gewebekulturschale abgelöst.
  3. Um ein optimales Zellwachstum Inkubat Spinnerflasche auf einem Magnetrührer in einem Gewebekultur-Inkubator für 24 h bei 37 ° C zu gewährleisten und 5% CO 2. Einstellen der Magnetrührer auf 70 rpm, um die Befestigung der Zellen an den Glasoberflächen zu vermeiden. Überwachung des Zellwachstums in Spinnerkulturflasche zu untersuchen, ob Zellen in Spinnerkulturflaschen gezüchtet lebensfähig sind und ob sie ausreichende Mengen wachsen. Jedes Mal vor der Zugabe von frischem Medium Transfer 2 ml aus dem Bioreaktor zu einer 60 mm Gewebekulturschale. Beachten Zellmorphologie unter dem Mikroskop.
    Hinweis: Die Zellen bilden Klumpen schwebend in dem Kulturmedium anzuzeigen optimales Wachstum und Rentabilität (siehe auch 4C). Nach 24 h bilden Kolonien auf der Oberfläche der Gewebekulturschale. 30- 50% Konfluenz zeigt optimale Dichte.
  4. 24 Stunden nach der Einrichtung des Spinnerkulturflasche fügen 500 ml frisches Medium (MEM, 10% FBS) mit Hygromycin B (100 ug / ml) ergänzt. 24 Stunden später diesen Schritt wiederholen.
  5. 72 h nach dem Einrichten der Spinner-Kultur, fügen 1.000 ml frisches MEM-Medien (10% FBS) mit Hygromycin B (100 ug / ml), was zu einem Gesamtvolumen von 3 l Zellsuspension.
  6. 24 Stunden nach Erreichen avolume von drei Litern, der Ernte 116 Suspensionszellen durch Zentrifugation für 10 min bei 500 × g bei RT. Überstand verwerfen. Halten Sie die geleert Spinnerkulturflasche unter der Gewebekultur Kapuze.
  7. Resuspendieren Zellpellets in frischem MEM mit 5% FBS ergänzt durch Auf- und Abpipettieren ca. 8- 10-mal, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten. Das Volumen des Mediums abhängig, ob Lysat aus Schritt 2.10) 2. (19,5 ml, siehe Schritt 4.8) 1. Option a) oder einer gereinigten viralen Bestand an HCAdV aus Schritt 5.9) 2. (mehrere ul depanding auf Virustiter, siehe Schritt 4.8) 2., Option b) ist für Infektion der Zellen verwendet. Verwenden Sie ein Gesamtvolumen von 150 ml.
    1. Option A: Zur Infektion von 116 Zellen in Suspension mit Lysat von P3 (Primärverstärkungs) Übertragungszellen aus Stufe 4.8) in einen 250 ml-Vorratsflasche mit einer sterilen magnetischen Rührstab oder einem 250ml kleinen Spinnerflasche und ausgestattet co-infizieren Zellen mit dem Virus innerhalb des Lysats von P3 (Schritt 2.10.2) und 2; TU HV pro Zelle. Unter der Annahme einer Dichte von 3x10 5 Zellen pro ml ist die Gesamtzellzahl 9x 10 8 Zellen. So fügen 1.8x 10 9 TU der HV.
    2. Option B: Zur Infektion von 116 Zellen in Suspension mit gereinigtem Virus-Lager, Übertragungszellen aus Stufe 4.8) in einen 250 ml-Vorratsflasche mit einer sterilen magnetischen Rührstab oder einem 250ml kleinen Spinnerflasche und ausgestattet co-infizieren Zellen mit den 100 Virusteilchen pro Zelle früher gereinigt HCAdV (aus Schritt 5.9). 2). Somit fügen 9x 10 10 VP nach physikalischen Titer (durch Extinktion bei 260 nm gemessen, Schritt 6) des gereinigten HCAdV und 1,8x 10 9 TU des HV.
  8. Rühren die Zell-Virus-Mischung SEP 4.8.1) bzw. 4.8.2) in auf einen Magnetrührer in der Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 für 2 Stunden bei 60 Umdrehungen pro Minute. Stellen Sie sicher, dass die Vorratsflasche nicht vollständig geschlossen ist, um die Luftzirkulation zu ermöglichen.
  9. 2 h nach der Infektion und das gesamte Volumen der Zell-Virus-Gemisch wieder in den 3 l Spinner Kulture eingewogen und 1.850 ml frischem vorgewärmtem (37 ° C) MEM-Medium mit 5% FBS, zu einem Gesamtvolumen von 2 l und Inkubation im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 für 48 Stunden bei 70 Umdrehungen pro Minute.
  10. Ernten der Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 890x g bei RT in 500 ml-Zentrifugenröhrchen. Entfernen des Mediums und Resuspendieren pelletierten Zellen in einem Gesamtvolumen von 28 ml DPBS. Pipette nach oben und unten, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten. Frieren Sie das Zell-Virus-Suspension in flüssigem Stickstoff oder bei -80 ° C, sicherzustellen, dass die Suspension vollständig gefroren. Bewahren Sie die Zell-Virus-Suspension bei -80 ° C bis zum Start der Virusreinigung.

5. Dialyse von HCAdV

  1. Um Viruslysat für Cäsiumchlorid (CsCl) Gradienten vorzubereiten, Gefriert Zell-Virus-Suspension aus Schritt 4.11) in flüssigem Stickstoff und Auftauen im Wasserbad bei 37 ° C viermal.
  2. Zentrifugieren Sie die Viruslysat bei 500 · g für 8 Minuten bei RT und sammeln den Überstand, der die HCAdV.
  3. Für Ultrazentrifugation vorzubereiten CsCl-Lösungen als follows.Weigh 37,5 g (1,5 g / cm 3), 33,5 g (1,35 g / cm 3) und 31,25 g (1,25 g / cm 3) von CsCl Pulver jeweils und füllen mit dH 2 O auf 25 ml.
    1. Umrühren, bis die Lösung klar wird und Sterilfilter die Lösungen. Schließlich entfernen 1 ml jeder Lösung und wiegen Sie es auf einer feinen Skala, um zu überprüfen, ob die Dichte korrekt ist. 1 ml sollten 1,5 g, 1,35 und 1,25 g bzw. zu gewichten.
    2. Wenn die Dichte zu hoch einstellen durch schrittweise Zugabe von kleinen Mengen (& mgr; l) von sterilem dH 2 O. Nach Zugabe von dH 2 O messen die Density erneut. Evtl. dH 2 O
    3. Wiederholen Sie den Vorgang, bis Dichte korrekt ist. Wenn die Dichte zu niedrig einstellen durch Zugabe einer kleinen Menge CsCl Pulver. Sterilfilter es wieder und die Dichte zu überprüfen. Ist die Dichte zu hoch ist, stellen Sie ihn durch Add-g dH 2 O, wie oben beschrieben. Wenn die Dichte ist immer noch zu niedrig erneut hinzufügen mor CsCl, Sterilfilter ist und überprüfen Sie die Dichte. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Dichte korrekt ist.
  4. Bereiten CsCl Stufengradienten in sechs klar Ultrazentrifugenröhrchen. Vorsichtig und langsam pipettieren CsCl-Lösungen in die Rohre mit Hilfe der folgenden Reihenfolge: 0,5 ml von 1,5 g / cm 3 CsCl-Lösung, 3 ml von 1,35 g / cm 3 CsCl-Lösung und 3,5 ml von 1,25 g / cm 3 CsCl-Lösung (2C) .
  5. Overlay ~ 4,5 ml gelöscht Vektorüberstand aus Schritt 5.2) auf der Oberseite der 1,25 g / cm 3 CsCl-Schicht. Centrifuge die Gradienten in der Ultrazentrifuge unter Verwendung eines Schwenkrotor (SW-41) bei 12 ° C für mindestens 2 h bei 226.000 xg (35.000 rpm) mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung zu trennen HCAdV-Genom Viruspartikel aus leeren Teilchen und Zellen enthält, Trümmer.
    HINWEIS: Unter optimalen Bedingungen eine diffuse Bande von Zelltrümmern Formen auf der Oberseitedie Rohre. Unten zwei weiße Streifen beobachtet werden kann. Das obere Band enthält leere Partikel während der untere Band ist gleich der HCAdV (2C und 5A).
  6. Entfernen Sie vorsichtig die Schichten der Zelltrümmer und leeren Partikel und sammeln Sie 1 ml der unteren Bänder aus jedem Röhrchen und Transfer-Virus mit einem sauberen Pipettenspitze in eine sterile 50-ml-Tube. Sie können bis zu 24 ml von 1,35 g / cm 3 CsCl-Lösung, um den gesammelten Viruspartikel und sorgfältig mischen.
  7. Füllen Zentrifugenröhrchen mit 1,35 g / cm 3 CsCl-Virus-Lösung an die Spitze und Zentrifugen O / N (18- 20 h) bei 226.000 xg (35.000 rpm) bei 12 ° C in einer Ultrazentrifuge unter Verwendung eines Schwenkrotor (SW-41 ) mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung.
  8. Sammeln Sie die in der prominenten Unterband vorhanden HCAdV. Als eine potenzielle obere Band enthält leere Partikel zu entfernen oberen Schichten von oben mit einer Pipette (siehe 2C und 5B), dann nehmen die untere Bande using einer Pipette.
  9. Dialysiere die gesammelten Viruspartikel für Pufferaustausch.
    1. Schneiden Sie einen Streifen von Dialyseschlauch (MWCO: 50.000) von etwa 8 cm in der Länge, waschen Sie es mit sterilem dH 2 O dreimal. Dann schließen eine Seite der Dialyseschlauch mit einer Kunststoffschelle und übertragen der gesammelten Virus aus Stufe 5.8) in die Rohrleitung unter Verwendung einer 1 ml-Pipette. Vermeiden Sie Luftblasen im Schlauch und schließen Sie es auf der anderen Seite mit einer Kunststoffschelle Dialyseschließungen.
    2. Dialysieren in 1 l Dialysepuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% Glycerin und 1 mM MgCl 2 in entionisiertem H 2 O) für 2 h bei 4 ° Cmit langsamem Rühren. Wechseldialysepuffer mit 2 l Dialysepuffer dialysiert und O / N bei 4 ° C unter langsamem Rühren. Alternativ eine sucrosebuffer (140 mM NaCl, 5 mM Na 2 HPO 4 × 2H 2 O, 1,5 mM KH 2 PO 4 und 730 mM Saccharose, pH 7,8).
    3. Sammeln dialysierte Viruspartikeln aus Schritt 5.9) 2. Verwendung einer 1 ml pipette. Vorbereiten mehrerer Aliquote der gewünschten kleinen Volumina (25- 100 ul) und speichert gereinigten Virus bei -80 ° C.

6. Messung der physikalischen Titer von Final HCAdV Vorbereitungen der optischen Dichte (OD)

  1. Verdünnen von 25 ul der endgültigen Vektorpräparation aus Schritt 5.9) 2 mit 475 ul Lysepuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS)), leicht geschüttelt für 20 Minuten bei RT und schließlich zentrifugiert werden für 2 Minuten bei RT bei 15.000 x g.
  2. Da die Absorptionswerte bei 260 nm (A260) in der Regel niedrig sind, zu messen Absorption viermal mit 100 ul des Überstands und berechnen Mittelwert der vier Messungen. Berechnen Sie die Anzahl der Viruspartikel pro ml (vp / ml -1) mit der folgenden Formel: vp / ml -1 = (Mittelwert A260) x (20) x (1,1 x 10 12) x (36 kb / HCAdV Größe in KB ).
    Anmerkung: Die Ergebnisse einer typischen Ausbeute von absolute Viruspartikel (OD-Titer) in 7A gezeigten

7. Mess gesamten Teilchen, infektiöse Einheiten des HCAdV und HV-Kontamination in der Schluss Vector Vorbereitung von qPCR. Ein Schema der Titration wird in 6 gezeigt

  1. Samen HEK293-Zellen in 6 oder 12-Well-Gewebekulturplatten so, dass die Zellen bis zu 90% Konfluenz am nächsten Tag. Um die Anzahl von infektiösen Viruspartikeln (infektiöse Titer) zu bestimmen, zu infizieren Zellen einer Vertiefung in einer Platte mit mehreren Vertiefungen mit 1 & mgr; l, und eine zweite gut mit 10 ul gereinigtem Virus aus Stufe 5.9) 3.
  2. Ernten Sie die Zellen 3 Stunden nach der Infektion. Entfernen Sie Medium und fügen Trypsin, das ganze gut abdecken und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2 für 5 min. Wegzuspülen die Zellen mit Trypsin mit einer Pipette und Spin-down werden die Zellen bei 890 g für 3 min bei RT.
  3. Resuspendieren der pelletierten Zellen in 200 ul DPBS und waschen Sie sie gründlich, um freie (nicht-infektiösen) Vektorpartikel zu entfernen. Zentrifugieren für 3 min bei 890 · g bei RT. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellets in 200 ul frisches DPBS.
    Anmerkung: Für eine genaue Bestimmung der infektiösen Titer, ist es entscheidend, alle nicht-infektiöse Viruspartikel aus den Zelloberflächen durch Trypsinbehandlung und gründliches Waschen zu entfernen.
  4. Um die Gesamtviruspartikel Nummer (infektiöse Partikel und nicht infektiösen Partikel = physikalische Titer) zu bestimmen, der Ernte nicht infizierten HEK293-Zellen von zwei Brunnen ohne Trypsin durch Spülen von den Zellen, die mit ihrem Kulturmedium mit einer Pipette.
  5. Spin down die Zellen für 3 min bei 890 × g bei RT. Entsorgen Sie die mittleren und resuspendieren pelletierten Zellen in 200 ul DPBS. Subsequently hinzuzufügen 1 ul und 10 ul gereinigt HCAdV Zubereitung direkt auf die Zellen. Verwenden Sie nicht infizierten Zellen als Hintergrund, um die gleichen Bedingungen für gDNA Isolierung und anschließende q-PCR zu gewährleisten.
  6. Isolieren gDNA aus HEK293-Zellen aus den Schritten 7.3 abgeleitet) und 7.5)
    1. Wirbelzellen in 200 ul DPBS (Schritt 7.3 und 7.4) für 3 sec, resuspendiert werden 200 ul SDS-Lösung. (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS) und 20 ul Proteinase K (20 mg / ml), vortexen Suspension für 3 sec. Inkubieren 12- 16 Stunden bei 55 ° C und schüttelt langsam. Dann fügen Sie 2 ul RNAse A (20 mg / ml) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
    2. Mit 350 & mgr; l Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol und zentrifugieren für 2 min bei 15.000 x g. Den Überstand in ein neues Röhrchen und wiederholen Sie diesen Schritt einmal
    3. Den Überstand in ein neues Röhrchen werden 50 & mgr; l Natriumacetatpuffer (pH 5, 3 M) und 1 ml eiskaltem EtOH (99,8%) und mischen Suspension. Centrifuge Proben für 10 Minuten bei 15.000 xg pelletiert genomischer DNA.
    4. Dann entfernen Sie den Überstand, 500 & mgr; l 70% EtOH und Zentrifuge für 2 min bei 15.000 x g. Entfernen Sie den Überstand, 500 & mgr; l 70% EtOH und schütteln für 30 min bei RT. Dann zentrifugieren für 2 min bei 15.000 x g.
    5. Entfernen Sie den Überstand und der Luft trocknen DNA-Pellet. Trocknen Sie keine DNA-Pellets für eine lange Zeit, da es wird schwieriger sein, gDNA in Lösung zu erhalten. Resuspendieren der DNA-Pellet in 120 & mgr; l dH 2 O und Inkubation für ca. 1 h bei 37 ° C unter Schütteln. Wenn DNA-Lösung erscheint viskose, schütteln Sie sie für mehrere Stunden bei 37 ° C, oder Inkubation bei 55 ° C für ca. 1 Std.
  7. Um infektiöse HCAdV-Teilchen und absolute HCAdV-Partikel zu bestimmen, zu erzeugen, eine Standardkurve von 10 1 - 10 8 Kopien eines Plasmids, welches das GOI in der HCAdV Genom enthalten.
  8. Bestimmen Sie Gesamtpartikel und infektiösen Partikel durch die Analyse der gleichen Mengen an gDNA von infizierten HEK293 cEllen von Schritt 7.3) und 7.4) gelten qPCR mit 400 nM von Primern spezifisch für die indische Regierung im HCAdV Genom enthalten.
  9. Stellen Sie die PCR-Programm wie folgt: Vorinkubation bei 95 ° C für 10 min, Amplifikation in 40 Zyklen von 95 ° C für 10 sec, 55 ° C für 10 sec und 72 ° C für 20 sec. Auf der Basis der Standardkurve (Schritt 7.7), zu interpolieren, die Gesamtzahl von adenoviralen Genomen in der Reaktion.
  10. Berechnung der Anzahl von adenoviralen Genomen in der endgültigen Vektorpräparation mit dem folgenden Formel: (Anzahl der HCAdV / Gewicht in ng gDNA in der Reaktion) x (Gewicht in ng DNA aller Zellen in der infizierten Platte / Volumen Virus in ul) .
    HINWEIS: Der typische Bereich für absolute und infektiöse Viruspartikel Renditen liegen bei 1x10 7 -1x10 8 Viruspartikel / ul. Titer, die das Zehnfache höher oder niedriger als hier gezeigt, sind als normal angesehen werden. Höhere Titer eine Verbesserung wäre. In Bezug auf das Verhältnis der absoluten HCAdV particles, um Infektions HCAdV Partikel zeigt die Erfahrung, dass etwa 5- 10% der absoluten HCAdV Partikel infektiös sind (7A).
  11. Um die Kontamination mit HV zu bestimmen, führen qPCR durch Verstärken einen Teil des adenoviralen späten Gen 3 (L3) in der HV-Genom vorhanden. Verwenden ein Plasmid, das das adenovirale späte Gen 3 (L3), um eine Standardkurve (Schritt 7,7) zu erzeugen.
  12. Bei dieser Umsetzung anwenden 400 nM der Primer L3 vorwärts 5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3 'und L3 umgekehrter 5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3' zusammen mit 300 nM des L3-spezifischen Sonde 5'-Fam-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-Tamra-3 '.
  13. Stellen Sie die PCR-Programm wie folgt: Vorinkubation / Aktivierung bei 95 ° C für 10 min, während der Amplifikation 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 sec und 60 ° C für 1 min. Verwenden Sie eine universelle Sonde PCR Mastermix für die qPCR Reaktion. Auf der Basis der Standardkurve (Schritt 7.7), die Berechnung der Anzahl der inInfektions HV Partikel in der endgültigen Vektor Vorbereitung. Siehe (7A) für typische Ausbeuten für HV-Teilchen.
  14. Schließlich wird das Verhältnis der absoluten infektiösen Teilchen HCAdV HV Kontaminationsniveaus, um die Qualität der Vektorpräparation zu beurteilen.
    Hinweis: Bis jetzt ein kleiner Teil der verbleibenden HV kann nicht ausgeschlossen werden. In der Regel der Anteil der HV Kontamination ~ 5% der infektiösen Partikel oder weniger, was akzeptabel ist (7B). Natürlich weniger als HV wie möglich wünschenswert ist, insbesondere wenn der Vektorpräparation wird für Tierversuche verwendet werden.

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Representative Results

Hier repräsentative Beispiele für die Klonierung, Amplifikation und Reinigung von HCAdV Zubereitungen gezeigt. Ein Überblick über die Klonierungsstrategie (Abbildung 1) und repräsentative Beispiele für das Klonen und die Freisetzung des HCAdV Genom durch Restriktionsenzymverdau vorgesehen sind (Figur 2). Eine typische Restriktionsmuster nach dem Lösen der GOI-Expressionskassette aus PHM5 von PI- Sce I und I Ceu ich verdauen und anschließender Phenol-Chloroform-Extraktion und EtOH Niederschlag (siehe auch Schritte 1.2- 1.5) wird angezeigt (Abbildung 2A). Typischerweise ein ~ 3 kb Bande, die dem PHM5 Plasmidgerüst und eine zweite Bande, die die Expressionskassette des GOI kann beobachtet werden. Die Bande, die das GOI-Expressionskassette wird dann aus dem Agarosegel gereinigt. Das gereinigte GOI-Expressionskassette auf einem Agarosegel zusammen mit dem gereinigten, dephosphoryliert pAdVFTC analysiert, dass wwie bei PI- Sce I und I Ceu I bzw. (Schritt 1.7) verdaut, um die richtige Größe zu überprüfen und die relative Menge von Molekülen für die anschließende Ligation (2B) zu schätzen. Nach der Ligation (siehe Schritt 1.8), gefolgt von Phenol-Chloroform-Extraktion und EtOH Niederschlag und Swa I zu verdauen, um ungeschnittene pAdFTC und anschließender Phenol-Chloroform-Extraktion und EtOH Niederschlag (Schritt 1.9), Ligationsprodukte werden in Bakterien und Klone verwandelt Beseitigung werden auf Ampicillin enthaltende LB- Agarplatten. Gewöhnlich Dutzende bis Hunderte von Klonen erhalten, von dem 5 bis 10-Klone werden für die Plasmid-DNA-Mini-Präparationen hergestellt. Eine Restriktionsmuster eines analytischen HincII Verdau von positiven und negativen Klone zusammen mit einem leeren pAdFTC als negative Kontrolle (siehe auch Schritt 1.10) angezeigt wird (2C). Hier positiven Klonen keinen 5-kb-Bande, die in leeren pAdFTC und negative Klone und eine 1,7 kb-Fragment erscheint vorliegt zeigendas ist nicht in der leeren pAdFTC und negativen Klonen vorhanden. Aus diesem jeweiligen GOI zeigt dies tha Klonen erfolgreich war. Ein positiver Klon, der hat über Midiprep gereinigt wurde dann mit Nr tI verdaut, um das HCAdV-Genom trägt die indische Regierung von pAdVFTC-GOI (Schritt 2.2) freizugeben. Endlich keine tI verdaut ist gereinigt zweimal mit Phenol-Chloroform-Extraktion und EtOH Ausfällung hohe Reinheit der DNA für die spätere Transfektion in 116-Zellen zu gewährleisten DNA. Analyse eines kleinen Bruchteil der Nr tI verdaut pAdVFTC-GOI auf einem Agarosegel eine ~ 9-kb-Bande, entsprechend der pAdFTC Plasmidgerüst und eine große Band von bis zu ca. 36 kb (abhängig von der Größe des GOI-Expressionskassette) entsprechend dem HCAdV Genoms (2D). Ein Überblick über die Amplifikation und Reinigung Pipeline ist schematisch dargestellt (Figur 3). Repräsentative Beispiele für die Überwachung des Vektorvordekodierstufe Amplifikationsverfahren bereitgestellt werden ( (4A). Man beachte, daß die Anzahl der Vektorgenome descreases gewöhnlich während der ersten Durchgänge und eine erhebliche Steigerung in späteren Passagen. Ein Vektor-Kopienzahl von 10. JUNI - 10. Juli pro 15000 Zellen reicht aus, um 116-Zellen für die Produktion in großem Maßstab in einem 3 l Spinner-Flasche zu infizieren. Wenn der indischen Regierung im HCAdV Vektorgenom enthält eine GFP-Expressionskassette kann die Vorverstärkung Prozess (Abschnitt 2) auch durch Fluoreszenzmikroskopie überwacht werden. Repräsentative Bilder von jedem Durchgang werden angezeigt (4B). Man beachte, dass die Zahl der GFP-positiven Zellen während der ersten Durchgänge abnimmt Regel und stark vergrößert im späten Passagen. Wenn die Anzahl der GFP-positiven Zellen erreicht ~ 100%, wurde der Vektor amplifiziert ausriciently bis 116 Zellen für die Produktion in großem Maßstab zu infizieren, in einem 3 l Spinner-Flasche. Das groß angelegte Verstärkungsprozess eines HCAdV enthält GFP-Expressionskassette wurde durch mikroskopische Analyse von Kulturmedium und Zellen, die aus der Spinnerflasche auf eine Gewebekulturschale überführt wurde überwacht. Mikroskopische Bilder von Zellen, HCAdV in Suspensionskultur (siehe Schritt 4.4 und 4.11) vorgesehen sind (4C). Beachten Sie, dass die Zellen in Klumpen anzeigt, dass die vorstehenden Zellwachstum ausreichend war und die Zellen gesund sind wächst. Bei Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie ~ 100% dieser Zellen wurden GFP positive Angabe effiziente Transduktion von Zellen in Suspension in dem Bioreaktor und effiziente Vektorproduktion. Vektorpartikel wurden aus dem Medium und Zellen des 3 l Suspensionskultur durch CsCl-Ultrazentrifugation gereinigt. Repräsentative Bilder der HCAdV Vektor Reinigung mittels CsCl-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation gezeigt (Abbildung 5). Nach einern anfänglichen Zentrifugation unter Verwendung eines CsCl Stufengradienten in der Regel zwei Banden beobachtet. Das obere Band enthält leere Teil Kapside während das untere Band ist aus DNA, die Vektorpartikel (Schritt 5.4- 5.5) (5A) besteht. Anschließend werden DNA-Vektorpartikeln, enthaltend geerntet (Schritt 5.6) und für eine zweite Ultrazentrifugation, um die Vektorpartikel konzentrieren gepoolt. Dieser Schritt resultiert in der Regel in einem einzigen DNA-Bande enthaltende Vektorpartikel, die schließlich für eine nachfolgende Dialyse (Schritt 5.7- 5.8) (5B) geerntet wird. Wurden dialysiert Vektorpräparationen, indem die Zahl der absolut Teilchen infektiösen Partikeln und HV Kontamination aus. Eine schematische Darstellung der Titration Verfahren (Abschnitt 6 und 7) vorgesehen ist (Abbildung 6). Repräsentative Ergebnisse für die Charakterisierung der endgültigen Vektorpräparation dargestellt (Abbildung 7). Das Balkendiagramm zeigt typische Vektorpartikel Zahlen, die sindnach dem Verfahren, das in diesem Protokoll beschrieben erhalten wird. Absolute Partikel Zahl der Vektorpartikel wurden durch optische Dichte (Abschnitt 6), infektiöse Vektorpartikel und HV Kontamination ermittelt wurden von qPCR (Abschnitt 7) (7A) gemessen. Die Erfahrung zeigt, dass die OD-Titer überschätzt die Zahl der Viruspartikel. Absolut viralen Partikel durch OD mess 20- sein 500mal höher als infektiöse virale Partikel durch Q-PCR gemessen. Infektiöse Vektorpartikel usally bewegen sich zwischen 5 bis 10% der absoluten Teilchen, wenn beide von q-PCR (Abschnitt 7) gemessen. Wenn die Vektorpräparation hat eine sehr gute Qualität, mehr als 20% der absoluten Partikel sind ansteckend. Das typische Verhältnis zwischen HV und Infektions HCAdV Teilchen (Schritt 7.14) liegt üblicherweise im Bereich zwischen 1-5% der infektiösen Partikel (7B). Dies ist akzeptabel, die HV replikationsdefizient ist. Dennoch, da weniger HV Verunreinigungen wie möglich (<1% von infektiösen Partikeln) würdevorzuziehen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Flussdiagramm der Klonierung des GOI in pAdFTC. Die indische Regierung wird in die MCS des PHM5 Shuttle-Plasmid kloniert. Plasmide pAdFTC und PHM5-GOI sind mit I- Ceu I und PI- Sce I verdaut und durch Phenol-Chloroform-Extraktion und EtOH-Fällung gereinigt. Die verdaute PHM5 auf einem präparativen Agarosegel geladen, um das Gen von Interesse (siehe auch Schritt 1.5) zu reinigen, während das verdaut pAdFTC Plasmid wird dephosphoryliert. Anschließend wird die Ligationsreaktion mit CIP-behandelten pAdFTC und die Transgen-Expressionskassette wird (siehe Schritt 1.8) gesetzt und nach Beendigung durch Phenol-Chloroform-Extraktion und EtOH-Fällung gereinigt. Die anschließende Swa I Verdau des Ligationsprodukts, gefolgt von Phenol-Chloroform-Extraktion und EtOH Ausfällung verhindert das Wachstum von Klonen Durchführung pAdFTC ohne Insert. Schwarz-TriWinkel zeigen Restriktionsenzymerkennungsstellen; graue Kästchen zeigen AdV5 inverted terminal repeats (ITR), weiß-Boxen mit Ψ markiert anzuzeigen AdV5 Verpackungssignal, rote Pfeil zeigt Promotor zeigen grünen Kästen Transgen (Gen von Interesse, GOI) exprimiert werden soll, zeigen blauen Boxen Polyadenylierungssignal, orange oder blau Pfeile zeigen Antibiotikaresistenzgenen des Plasmidrückgrat sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse für die Klonierung und die Freigabe der HCAdV Genom von pAdVFTC. (A) Veröffentlichung GOI-Expressionskassette aus PHM5 von PI- Sce I und I Ceu I Digest (siehe auch Schritte 1.2- 1.5). (B) Sce I und I Ceu I bzw. (Schritt 1.7) verdaut. (C) Analytische HincII-Spaltung von pAdVFTC Klone mit und ohne GOI (siehe auch Schritt 1.10). (D) Die Freigabe der HCAdV-Genom trägt die indische Regierung von pAdVFTC-GOI durch Keinen tI Digest (Schritt 2.2) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
. Abbildung 3. Schematische Darstellung für eine hohe Kapazität adenoviralen Vektor Amplifikation und Reinigung (A) HCAdV DNA-Transfektion und Helfervirus (HV) Infektion: Transfektion von linearisierte HCAdV Genom trägt die indische Regierung in die HCAdV Produzenten-Zelllinie (116-Zellen [4]) und subsequent Infektion mit dem HV AdNG163R-2 [4].   (B) Die Amplifikation HCAdV: Nach der Vorverstärkung Schritte durch serielles Übertragen Zelllysat auf ein neues Gewebekulturschale und Co-Infizieren mit HV, großtechnische Produktion befindet sich in einem 3 L Suspensionskultur durchgeführt (C) HCAdV Reinigung:. Für Reinigung wird das Virus durch Ultrazentrifugation isoliert, wobei Cäsiumchloridgradienten (D) Dialyse:. Gereinigtes HCAdV Partikel gegen 2 L Lagerungspuffer dialysiert. HCAdV hoher Kapazität adenoviralen Vektor; ITR, Adenovirus-Serotyp 5 invertierte terminale Wiederholungs; Ψ, Verpackungssignal; HV, Helfervirus; MOI Multiplizität der Infektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4 <br /> Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse der Verstärkungsprozess (A) Überwachung der pre-Verstärkungsprozess durch Amplifikation von viralen Genomen mit qPCR (siehe auch Abschnitt 3);. (B) Wenn die indische Regierung enthält GFP als ein Transgen, die Pre-Verstärkungsprozess kann durch Fluoreszenzmikroskopie überwacht werden. (C) Repräsentative Ergebnisse der Großverstärkungsprozess in einer Spinnerflasche beispielhaft dargestellt für HCAdV Kodierung GFP. Die linke Tafel zeigt eine mikroskopische Bild von infizierten 116-Zellen aus der Spinnerflasche. Eine Probe des Kulturmedium und die Zellen wurden auf eine 60 mm-Gewebekulturschale überführt. Beachten Sie, dass Klumpen von Zellen verstärkt sichtbar sind. Das rechte Bild zeigt das gleiche Bild unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Fast 100% der Zellen mit HCAdV Durchführung GFP transduziert. Bitte klicken Sie hier, umvergrößern Version dieser Figur.

Figur 5
Abbildung 5. Repräsentative Ergebnisse nach CsCl-Zentrifugation (A) Nach dem Durchführen eines Stufengradienten (siehe auch Schritt 5.5);.. (B) Nach dem kontinuierlichen Gradienten (siehe auch Schritt 5.7) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Schematische Darstellung der Titration. (A) Messung der infektiösen Partikel: Zellen in einem Multi-Well-Platte werden mit unterschiedlichen Mengen an gereinigtem Virus infiziert und als Zellpellets gesammelt (B) Messung o.f absolute Teilchen: Unifected Zellen bilden eine vielen Vertiefungen werden durch Trypsinierung und Zentrifugation gesammelt. Nach der Resuspension gereinigt Virus (C) Isolierung genomischer DNA hinzugefügt und genomische DNA isoliert.. (D), um virale Genom Kopienzahlen eine quantitative PCR (q-PCR) durchgeführt wird, zu quantifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Abbildung.

Figur 7
Abbildung 7. Repräsentative Ergebnisse zur Charakterisierung der endgültigen Vektor Vorbereitung. (A) Absolute Anzahl von Teilchen aus einem Vektor-Zubereitung gemäß der vorgelegten Protokoll bestimmt mit verschiedenen Methoden:. OD-Titer durch die optische Dichte (Abschnitt 6), infektiöse Titer und HV Kontamination durch qPCR (Abschnitt 7) gemessen (B)Verhältnis zwischen Gesamtinfektions HCAdV Teilchen und HV Kontamination durch qPCRs (Abschnitt 7) gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die hier vorgestellte Protokoll erlaubt die Reinigung von HCAdV Vektoren auf Basis menschlichen Adenovirus Typ 5 basierend auf zuvor beschriebene Verfahren 4,12. Die HCAdV Genom innerhalb der pAdFTC Plasmid ist frei von allen Adenovirusgene und nur trägt die 5'- und 3'-ITR und das Verpackungssignal. In dieser Strategie die HV AdNG163R-2 4 stellt alle notwendigen Gene, die für eine effiziente Virusproduktion in trans. Dies bietet eine Verpackungskapazität von bis zu 35 kb, was eindeutig outcompetes ersten und zweiten Generation ADVS oder die weit verbreitete Lentivirus (LV) - oder adenoassoziierte Virus (AAV) basierenden Vektoren. Ein zweiter Vorteil der HCAdV insbesondere für in vivo Anwendungen ist die Tatsache, dass im Gegensatz zu der ersten oder zweiten Generation ADVS sie reduzierten Pegeln von zytotoxischen und immunogene Nebenwirkungen durch die Expression von viralen Proteinen 5-8 verursacht anzuzeigen.

Dennoch ist die hier beschriebene Protokoll ist mehr Zeit undarbeitsintensiv als für andere virale Vektoren wie LV- oder AAV-Vektoren sowie der ersten oder zweiten Generation ADVS. Ein Haupthindernis ist die Klonierung von großen Transgene und die anschließende Übertragung auf die Virusproduktion Plasmid PADV-FTC. Die Verwendung von Homing-Endonukleasen PI- Sce I und I Ceu Ich biete präzise und gerichtete Insertion des Transgens aus der Shuttle-Plasmid PHM5, haben aber den Nachteil, stark Festhalten an der gespaltenen DNA. Aus diesem Grund viele Phenol-Chloroform Reinigung Schritte sind notwendig, bei der Herstellung von Plasmid-DNA-und legen Sie während der Klonierung. Daher rigoros nach der vorgesehenen Klonen Protokoll wird dringend empfohlen. Nach Klonieren des HCAdV Genom wird aus dem Plasmid pAdFTC durch Not I-Restriktionsenzym verdaut freigesetzt und anschließend in den Produktionszelllinie transfiziert. Beachten Sie, dass anfängliche Transfektionseffizienzen sind von entscheidender Bedeutung für die Erreichung ausreichender Virusamplifikation. Wichtig ist, bietet das Protokoll mehrere Schritteab dem dieses Verfahren können bei nachfolgenden Schritte nicht neu gestartet werden. Während Vorverstärkung ein Drittel der Lysate kann als Backup gespeichert, um das Verfahren von diesem Punkt erneut zu starten oder um eine Wiederholung, falls mehr Virus produziert werden muss verkürzt werden.

HCAdV Durchführung großer, komplexer oder mehreren Transgenen oder bestimmte Füll-DNA kann Verstärken langsamer als erwartet. Daher ist es wichtig, sorgfältig beobachten Vorverstärkung Prozess vor Suspensionskultur wird in einem Rotationskolben gezüchtet. Wenn Vorverstärkung nicht erfolgreich ist, sollte das Verfahren gestoppt und gestartet werden wieder von vorne. Wenn Vorverstärkung ineffizient ist, können zusätzliche Passagierung erforderlich sein, bis die Virusmenge ist hoch genug, um die Zellen in einen 3 l-Rührkolben gewachsen infizieren. Als Alternative zu einer Suspensionskultur in einer Spinner-Flasche, kann 20 bis 30 150 mm-Gewebekulturplatten für die letzte Durchgang verwendet werden. Dies kann jedoch mehr Zeit und Arbeit intensiv.

Für qPCR Messungen gDNA kann entweder über die hier genannten Protokolls oder einer im Handel erhältlichen Kits zur Isolierung von gDNA aus kultivierten Zellen gereinigt werden. Durch Verwendung kommerziell erhältlicher Kit kann das Protokoll einen Tag verkürzt werden, aber eine variierende Abschnitt der HCAdV Genomkopien, die in infizierten Zellen vorhanden sind, können während der Reinigung verloren gehen, abhängig von der Kit verwendet wird. Daher HCAdV Genome werden in folgenden Q-PCR-Messungen im Vergleich zu der in Schritt 7.4 vorgestellte Methode) leicht unterrepräsentiert zu sein.

ObtaiNed Gesamt infektiöse Titer in einem letzten Vektorpräparation von einer Spinnerflasche Bereich von 1 x 10 10 bis 5 × 10 11 infektiöse Partikel abgeleitet ist. Diese Menge reicht in vitro Experimente zahlreiche durchzuführen. Abhängig von den Zielzellen, die auch mehrere in vivo-Experimente durchgeführt werden. Beispielsweise für nach systemischer Verabreichung Erreichen einer ausreichenden Leber Transduktion 1 x 10 9 infektiöse Partikel erforderlich.

Zusammenfassend ist die breite Zelltropismus und die Möglichkeit, Kapsid-modifizierte Adenovirus zusammen mit der verbesserten Sicherheitsprofil von HCAdV produzieren Vektoren frei von allen viralen Gene machen diese HCAdV Vektorsystem ein sehr wertvolles Werkzeug für gentherapeutische Anwendungen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I-CeuI New England Biolabs R0699S restriction digest
PI-SceI New England Biolabs R0696S restriction digest
T4 Ligase New Engand Biolabs M0202S ligation
SwaI New England Biolabs R0604S restriction digest
NotI New England Biolabs R0189S restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) New England Biolabs M0290S dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B PAN Biotech P02-015 selection of CRE expressing 116 cells
DMEM PAN Biotech P04-03590    Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle PAN Biotech P04-08500 116 cell culture medium  
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) PAN Biotech P04-36500 washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle Sigma CLS430281-24EA infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes Sigma CLS431123-36EA sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask Bellco 1965-61030 growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes Beckmann Coulter 344059 density gradient centrifugation
Ultracentrifuge Beckmann Coulter density gradient centrifugation
SW-41 rotor Beckmann Coulter density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane VWR 132129 dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes  Thermo 66383 dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli invitrogen C4040-52 transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495 midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit  Peqlab 12-3396-02 isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305 tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS) Gibco 31985-062 transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix BioRad  170-8882 q-PCR
CFX 96 C1000 touch  Biorad qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol  Carl Roth A156.1 purification of DNA
Cesium chloride Carl Roth 8627.1 density gradient centrifugation
sodium acetate 99% Carl Roth 6773.2 DNA precipitation
LB medium  Carl Roth X968.3 bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure Carl Roth 9065.5  DNA precipitation and washing
SDS 99.5% Carl Roth 2326.2 lysis  buffer
EDTA Carl Roth 8043.2 lysis  buffer
Tris-HCl 99% Carl Roth 9090.3 dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5% Carl Roth 3783.1 dialysis buffer
MgCl2 98.5% Carl Roth KK36.2 dialysis buffer
NaCl Carl Roth 3957.1 optional dialysis buffer
KH2PO4 Carl Roth 3904.2 optional dialysis buffer
sucrose Carl Roth 9286.1 optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O Carl Roth 4984.2 optional dialysis buffer
1.5-ml tubes sarstedt 72,730,005 storage of virus preparations at -80 °C

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References

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  3. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (24), 13565-13570 (1996).
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