소뇌 과립 세포 배양에서 미세 아교 세포의 선택적 고갈 L - 류신 메틸 에스테르를 사용하여

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Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J. Vis. Exp. (101), e52983, doi:10.3791/52983 (2015).

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Abstract

Introduction

인간의 두뇌는 추정 850 억 뉴런 및 아교 세포를 포함 하나 85000000000 다른 비 신경 세포를 포함한다. 영어로 번역 '아교 세포'의 따라서 그리스 어원 - 신경 과학자가 신경 세포 인구에 주로 초점을 맞추고있다 지난 100 년간의 큰 부분을 위해, 아교 세포를 믿는 것은 뉴런 구조 지원을 제공하는 수동적 인 지원 세포보다 조금 더 할 수 '접착제'. 최근에, 그러나, 신경 - 아교 상호 작용이 신경 생물학, 신경 생리학, 많은 신경 퇴행성 질환의 기원과 진행의 기본 측면에 훨씬 더 근본적인 될 수 있다는 것을 점점 더 분명되고있다. 소뇌 과립 세포 (CGCs), 인간의 두뇌에서 가장 풍부한 균일 신경 인구는 소뇌를 지배하고 세포 구성 성분의 90 % 이상을 차지한다. 따라서, 이러한 세포는 t위한 모델 시스템으로 in vitro에서 광범위하게 사용되어왔다그는 신경 발달, 기능, 병리 2-6의 연구.

그러나, CGC의 문화는 여전히 논란의 여지 상당한 비율의 미세 아교 세포 및 기타 아교 세포가 포함되어 있습니다. 그 결과, 추정되는 다른 세포 치료법에 직접 신경 반응을 표시 CGC 데이터가 실제로 발생할 수 - 부분적 또는 전체로 - 배양에서 신경교 이웃 간접 보조 응답으로부터. 이를 평가하기 위해, 우리는 선택적으로 L-류신 메틸 에스테르 (LME)의 도움으로 CGC의 연결을 문화에서 미세 아교를 제거. LME 원래 선택적 식세포 7을 파괴하는데 사용 lysomotropic 에이전트이며, 이후 선택적 신경, 성상 세포, 및 신경 교세포의 혼합 배양에서 8,9,10 미세 아교 세포를 고갈하는 데 사용되어왔다. LME는 리소좀 파쇄 및 후속 13,14 아폽토시스를 유발하며, 대 식세포와 미세 아교 세포에 의해 내재화된다. 대 식세포와 미세 아교 세포는 그들이 particula로 발생 리소좀에서 특징적으로 풍부LME 처리에 노출시 RLY 취약합니다. 이 프로토콜은 CGC 및 다른 신경 / 아교 세포 배양 시스템을 이용한 실험에서 미세 아교 세포의 기여를 확인 할 수있는 강력하면서도 간단하고 쉬운 방법을 제공합니다.

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Protocol

여기에 설명 된 모든 실험은 영국의 동물 (과학적인 절차) 1986 년 법에 따라 수행 하였다.

악기, 문화 미디어, 그리고 요리 1. 준비

  1. 두 스테인레스 스틸 실험실 해부 가위와 두 개의 스테인레스 스틸 실험실 집게를 준비합니다. 문화 후드 O의 모든 악기와 장소를 압​​력솥 / N 살균 자외선 (UV) 빛 아래.
  2. 최소 필수 매체 (MEM) 배지 (500 mL로 10 % 태아 소 혈청 [FBS, 20 mM의 KCl을 25 mM의 NaHCO3를, 30 mM의 D- 글루코오스, 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 6 μg의 / ㎖ 암피실린) 및 필터 소독. 달 동안 4 ℃에서 보관하십시오.
  3. 14mm, 번호 1 두께 된 커버를 포함하는 24 잘 배양 플레이트를 준비합니다. 이전에 3 설명한 바와 같이 100 ㎎ / ℓ 폴리 D 라이신 (PDL)의 커버 슬립과 코트를 압력솥. 자외선은 O / N을 소독.

CGC 문화 솔루션 2. 준비

  1. 처리 된 오토 클레이브, UV 광, 멸균 DH에서 '용액 A'(100 ㎖)를 준비 포도당 250 ㎎, 소 혈청 알부민 [BSA] 300 mg을 인산염 완충 염수 [PBS (칼슘 및 955 ㎎을 함유하는 2 O 마그네슘) + 무료, 3.8 %의 1 ml의 황산 4 · 7H 2 O
  2. A. 용액 9 ㎖에 희석 / ㎖ 트립신 5 mg을 1 ㎖를 함유하는 '용액 B'(10 ㎖)를 준비
  3. '용액 C'1000 유닛의 DNase, 대두 트립신 억제제의 0.5 ㎎, A. 용액 10 mL로 희석하여 3.8 % 황산 · 7H 2 O 100 ㎕를 함유하는 (10 ㎖)를 준비
  4. A. 용액으로 20 ㎖로 희석 용액 3.2 ml의 C를 함유 '용액 D'(20 ㎖)를 준비
  5. · 7H 2 O EBSS, 25 mM의 NaHCO3를, 3 mM의 황산을 포함 BSA / 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS) 솔루션을 준비하고,4 % BSA, pH를 7.4으로 이전에 3을 설명했다.
  6. 150 mM의 LME의 최종 농도를 수득 MEM 배지 5 ㎖에 순수한 LME 추가하여 LME 준비 벤치 탑 pH 미터를 사용하여 pH를 7.4까지 용액을 복귀하고, 필터는 28mm의 폴리 에테르 설폰 (PES), 0.2 μm의 주사기를 사용하여 소독 필터.

3. CGCs을 배양

  1. 이전에 3 설명한대로 4-7 일 된 쥐 새끼에서 소뇌를 수집합니다. 얼음에 5 ml의 솔루션을 포함하는 배양 접시에 바로 배치합니다.
  2. 페트리 접시 뚜껑에 소뇌와 장소 조직에서 과잉 솔루션을 붓고.
  3. 적어도 세 개의 서로 다른 방향에서 잘 골조 면도날 미세 조직을 잘라.
  4. 5 분 동안 37 ℃에서 물을 욕조에 솔루션 (손실 제한 조직을 위해 솔루션 페트리 접시를 씻어) B와 장소에 다진 조직을 추가합니다. 분의 부드럽게 모든 커플을 흔들어.
  5. 트립신, 흔들림 센트를 중화하기 위해 튜브에 용액 D (20 ml)에 추가5 분 동안 65 XG에 rifuge.
  6. 상층 액을 붓는다.
  7. 현탁액 가능한 균질해질 때까지, 직경을 감소시키는 세 골조 유리 피펫으로 잘 용액 C. 씹다 4 ㎖ (약 10 회)에 재현 탁.
  8. 천천히 부드럽게 BSA / EBSS 위에이 균질 몇 방울을 추가합니다. 이 BSA / EBSS를 통해 싱크 시작하면, 더 씹다 및 / 또는 균질는 BSA / EBSS의 상단에 레이어에 앉아 있어야 좀 더 솔루션 C를 추가 할 수 있습니다. 흔들지 마십시오. 5 분 동안 100 XG 스핀.
  9. 상층 액과 MEM 배지 1 ㎖에 재현 탁 펠릿 (소프트)를 제거합니다.
  10. MEM 배지 500 μL에 80 만 셀 / 커버 슬립에서 혈구와 플레이트를 사용하여 세포를 계산합니다. 6 % CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터에있는 장소.
  11. 매체에게 다음 날 (준비 후 24 ~ 36 시간)을 변경합니다. 세포주기 억제제 아라 비노 푸라 노실 시티 딘 (ARAÇ) 10 μM을 함유하는 MEM 배지 용액을 제조.
    1. 각각커버 슬립은 다시 세포와 정상까지 오래된 매체의 250 μl를 추가, 신선한 24 웰 플레이트에서 기존 매체의 250 μl를 유지 나머지를 대기음, 정상 MEM 배지 250 μl를 추가 한 다음, 세포를 씻어이 대기음 ARAÇ 함유 매체의 250 μL와.
      참고 : 세포는 체외 (DIV)에서 육일에서 사용할 수 있습니다.

4. 선택적으로 미세 아교 세포 고갈 (6 DIV에서 수행)

  1. 150 mM의 LME의 최종 농도를 수득 MEM 배지 별개 분취 량 5 ml의 순수한 LME 추가.
  2. pH 7.4의 용액으로 돌아가서 필터 28mm 폴리 에테르 술폰 (PES), 0.2 μm의 주사기 필터를 이용하여 멸균.
  3. 제어 배양 정상적인 MEM 배지와 함께 10 분 동안 37 O C에서 수욕 MEM 배지 자리에 50 mM의 (2 × LME)의 농도로 용액을 희석.
  4. 반 (250 μL) CGC의 문화 MEM 배지를 제거하고 37 ℃에서 유지한다.
  5. 취급 세포또는 제어 문화에 대한 LME없이 미리 예열 MEM 배지 (250 μL) 25 mm의 잘 농도를주는 1 : 즉, 2 × LME (250 μL)를 포함하는 MEM 배지로 1 희석.
  6. 1 시간 동안 6 % CO 2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 세포를 배양한다.
  7. 두번 신선한 미리 예열 MEM 배지에서 세척 세포 LME - 함유 배지를 제거하고 배양 배지를 유지 및 해당 웰 신선한 미리 예열 MEM 매체의 동일 부피를 대체한다.
  8. (37 ° C에서 6 % CO 2 가습) 인큐베이터에 문화를 반환하고 추가 처리하기 전에 24 시간 동안 나머지 둡니다.

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Representative Results

선택적으로 CGC 및 / 또는 혼합 된 문화에서 미세 아교 세포를 제거하기 위해이 기술의 능력을 정확하게 파악하고 자신의 주변 세포에서 미세 아교 세포를 분화하는 연구자의 후속 능력에 의존한다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 이것은, 예컨대 동종 렉틴-B4 같이, 소교 특정 셀 머신을 사용하여 달성 될 수있다.도 2에서 설명한 바와 같이, 성상 세포 및 신경 세포의 밀도 및 형태로 관측 변경은 각 주 치료 그룹에 대해 기록되지 않았다. 배양액 화합물 소교 특정 동작을 지원 단독 LME로 처리했을 때 중요한 신경 또는 성상 세포 형태의 유의 한 변화는 관찰되지 않았다.도 3a는 성상 세포 밀도 및 기본 설치류 성상 세포 배양 (12)로부터 형태에서 관측 변화를 도시하지 않지만 수행 오염 된 미세 아교 세포의 손실을 표시합니다. 그림 (b)에서와 같이, 변경없이 astrocy에테 밀도와 형태가 관찰되었다; 그러나, 소교 번호 및 반응성 오염의 손실이 관찰되었다. 이 원고에 사용되는 면역 세포 (ICC) 프로토콜에 대한 간략한 설명은, 11 참조 참조하시기 바랍니다.

그림 1
그림 1 : CGCs의 LME 치료의 특성. 면역 세포에서 (A) 대표 이미지 (ICC) 실험 세척 오프 한 다음, 1 시간 동안 25 ~ 75 mM의 LME와 치료 후 CGC 문화에서 수행. ICC는 소교 식별 및 정량화 총 세포 수의 정량 DAPI (파란색)와 그 표시 형태 사멸 및 동종 렉틴-B4 (IB 4) (녹색)으로 수행 하였다. 스케일 바는 30 μm의 =. 핵 염색질 응축으로 정의 세포 사멸 형태, (회색 막대를 표시 세포의 (B) 정량,의 %제어 레벨 (녹색 막대)의 백분율로서 필드 전체 세포 수) 및 총 소교 번호. 짝이 학생의 T는 -tests은 관련 컨트롤과 LME의 특정 치료 사이에 수행되었다; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; N = 3 (즉, 3 독립적 인 반복).

그림 2
그림 2 : CGC 문화에서 신경 세포와 성상 세포에 25 mM의 LME 치료의 효과의 특성. 1 시간 동안 25 mM의 LME와 치료 후 CGC 문화에서 수행 ICC 실험에서 대표 이미지 패널. ICC는 성상 세포 밀도 및 형태의 변화를 식별 DAPI (청색) 신경 세포 밀도와 항 GFAP (적색)의 변화를 식별하기 위해, 안티 - III-β 튜 불린 (녹색)로 수행 하였다. 음성 대조군 (- 제가 CTR) 이미지 CGC 문화를 나타내고 기본 antibodieS는 생략되었다. 스케일 바는 30 μm의 =.

그림 3
도 3 : 성상 세포 배양 물로부터 제거 된 미세 아교 세포의 25 mM의 LME 처리의 효율성의 추가의 특성화. 1 시간 동안 25 mM의 LME으로 전처리 한 후 일차 성상 세포 배양 물에서 수행 ICC 실험 대표 화상 (A) 패. ICC는 성상 세포 밀도 및 형태, 및 소교 번호의 식별을위한 안티 ED1 (녹색)의 변화를 식별 DAPI (청색), 항 GFAP (적색)로 수행 하였다. (B) 1 시간 25 mM의 LME와 전처리 다음 24 시간 동안 LPS (1 μg의 / ml)로 처리 한 후 차 성상 세포 배양에서 수행 ICC 실험에서 대표 이미지. 활성화 마이크로 그램을 식별 할뿐만 항 GFAP (녹색) 및 항은 iNOS (적색)에 기술 된 바와 같이 수행 하였다 ICCLIA. 일차 항체가 생략 된 것을 특징으로 음성 대조군 (- 제가 CTR) 이미지 CGC 문화를 대표한다. 스케일 바는 30 μm의 =.

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Discussion

가장 중요한 단계는 CGC에서 미세 아교 세포의 성공적인 선택적 제거를 보장하기 위해 및 / 또는 혼합 된 문화가있다 : 1) 멸균 및 건강한 CGC 문화를 유지하는 단계; 2) 필터 LME 함유 배지를 살균하여 pH 7.4 용액을 복귀; 3) 유지 CGC 미디어를 유지하고 37 미디어 LME이 함유 열 충격을 방지하기 위해 C를 °; 4) 세포를 배양기 밖에 유지되는 시간을 줄이기 위해 빨리 작동.

이전에 우리의 실험실에서 최적화 된 농도 - 우리는 우리의 CGC 문화에서 미세 아교 세포를 고갈 25 mM의 LME을 사용했다. 그럼에도 불구하고, 일부 미세 아교 세포는 여전히 일부는 차별화 된, 비 증식 미세 아교 세포의 인구를 반영 할 수 믿고 LME 처리를, 다음 문화에 남아 있습니다. 실제로, Hamby et al. (2006)은 50 ~ 75 mM의 LME는 고밀도 성상 세포 단일 층 (13)에서 미세 아교 세포를 제거하는 데 필요한 것을 발견했다. 우리는 또한 이전에 같이 순수한 미세 아교 C에 해당 한ultures 10 mM의 LME 모든 미세 아교 세포를 죽일 충분하지만 24 시간 배양 시간 (14)이었다.

미세 아교 세포 오염의 세포 배양 모델을 제거하는 다른 방법도 최근에 빛에왔다. 크로커 외. (2008) (P0-P2) 마우스 (15) 출생의 성상 세포로 신경 줄기 세포 (NSC)의 분화를 촉진하여 성상 세포 배양에서 미세 아교 세포를 제거하는 새로운 접근 방식을 보여 주었다. 그들은 현상의 기초가되는 메커니즘은 알 수 있지만이 기술은 완전히, 문화에서 미세 아교 세포를 제거 것으로 나타났습니다. . 또한 Kumamaru (2012) 리포좀을 사용 클로드 - 대 식세포에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 biophosphonate을 - P3 마우스 (16)로부터 일차 성상 세포 배양 물에 미세 아교 세포를 제거하기 위해. 이 화합물은 유사한 방식으로 LME과 같은 효능 동일한 수준에서 작동; 저자는 LME가 특정 조건에서 성상 세포에 독성이있을 수 있다고 주장하지만성상 세포 접착 능력 (13)을 방해 - -으로 인해 세포에 자유의 확산에 리포좀 클로드 문화에서 미세 아교 세포를 고갈 할 수있는 개선 된 방법을 나타냅니다. 우리는, 그러나, 25 mM의 LME 더 성상 세포의 생존 또는 증식에 영향을 미치는 것을 발견.

본원에 기술 된 프로토콜은 선택적 CGCs의 신경 세포가 풍부한 배양 된 미세 아교 세포에서 제거하기 LME의 특정 농도를 사용한다. 이것은 다양한 조건 하에서 뉴런에 미세 아교 세포의 영향을 결정하기 위해 실험적인 강력한 접근 방식을 나타내고, 신경 질환에서 신경 염증의 역할을 조사하고 연구에 중요한 데이터를 제공하기 위해 계속된다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps  Sigma-Aldrich F4142 The curved end facilitates removal of the cerebellum 
Micro-dissecting scissors Sigma-Aldrich S3146 Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection 
L-leucine methyl ester hydrochloride Sigma-Aldrich 7517-19-3
EBSS solution  Sigma-Aldrich E7510-500 ml
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich 27964-99-4 Coat coverslips 1 day before use 
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
DNase Sigma-Aldrich D5025
Soybean trypsin inhibitor  Sigma-Aldrich T6414
Mouse anti-ED1 antibody  Abcam ab31630

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References

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