Name: Déplétion sélective des cellules microgliales du cervelet granules de cultures cellulaires utilisant la L-leucine Methyl Ester (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Découvrez la déplétion sélective des microglies dans les cultures de cellules granuleuses cérébelleuses utilisant le L-leucine methyl ester. Cette méthode permet d'étudier les interactions microglie-neurone dans les maladies neurodégénératives.

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Cette recherche a été soutenue par une bourse de doctorat d’Aims2Cure, Royaume-Uni, et une bourse de doctorat UCL Impact Award à JMP et une bourse de doctorat en renforcement des capacités du MRC en démence à JMP.

Toutes les expériences décrites ici ont été effectuées en conformité avec le Royaume-Uni Animaux (Scientific Procedures) la loi de 1986. 1. Préparation des Instruments, Culture Media, et Plats <ol><li> Préparer deux ciseaux laboratoire en acier inoxydable de dissection et deux pinces de laboratoire en acier inoxydable. Autoclave tous les instruments et les placer dans une culture hotte O / N sous la lumière ultraviolette (UV) pour la stérilisation. </li><li> Ajouter 500 ml de (MEM) du milieu de culture de médias essentiel minimum (10% Foetal Bovine Serum [FBS], 20 mM de KCl, 25 mM de NaHCO 3, 30 mM de D-glucose, 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et 6 pg / ml d&#39;ampicilline) et stériliser par filtration. Stocker à 4 ° C pendant des mois. </li><li> Préparer 24 plaques de culture puits contenant 14 mm, numéro 1 épaisseur lamelles. Autoclaver les lamelles et manteau à 100 mg / L poly-d-lysine (PDL) comme décrit précédemment 3. la lumière UV stériliser O / N. </li></ol> 2. Préparation des solutions CCG Culture <ol><li> Préparer &quot;solution A &#39;(100 ml) dans l&#39;autoclave, la lumière UV traiter, dH 2 O stérile contenant 250 mg de glucose, 300 mg de sérum-albumine bovine [SAB], 955 mg de solution saline tamponnée au phosphate [PBS] (Ca 2+ et Mg + gratuit), et 1 ml de 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O. </li><li> Préparer &quot;solution B&quot; (10 ml) contenant 1 ml de 5 mg / ml de trypsine dilués dans 9 ml de solution A. </li><li> Préparer &quot;solution C&quot; (10 ml) contenant 1000 unités de DNase, 0,5 mg d&#39;inhibiteur de trypsine de soja, 100 ul de 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O, on le dilue à 10 ml avec la solution A. </li><li> Préparer &quot;solution D &#39;(20 ml) contenant 3,2 ml de solution C, on le dilue à 20 ml avec la solution A. </li><li> Préparer solution saline équilibrée (EBSS) solution de BSA / EBSS contenant Earle, 25 mM de NaHCO 3, 3 mM de MgSO 4 · 7H 2 O, et4% de BSA, pH 7,4, comme décrit précédemment 3. </li><li> Préparer LME en ajoutant pur LME dans 5 ml de milieu de culture MEM pour donner une concentration finale de mM LME 150, revenir la solution à pH 7,4 en utilisant un pH-mètre de paillasse, et stériliser par filtration au moyen d&#39;un sulfone de polyéther de 28 mm (PES) de 0,2 um de la seringue filtre. </li></ol> 3. Culture des CGCs <ol><li> Recueillir cerebella de rats âgés de 4-7 jours comme décrit précédemment 3. Placez immédiatement en boîte de Pétri contenant 5 ml de solution A sur la glace. </li><li> Décanter la solution en excès de tissu cerebella et le placer dans le plat couvercle Petri. </li><li> Hacher finement le tissu avec une lame de rasoir bien flambé dans au moins trois directions différentes. </li><li> Ajouter le tissu haché à la solution B (rincez boîte de Pétri avec une solution pour assurer le tissu limitée est perdue) et placer dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 5 min. Agiter doucement toutes les deux minutes. </li><li> Ajouter la solution D (20 ml) au tube de neutraliser la trypsine, et le tremblement centrifuge à 65 g pendant 5 min. </li><li> Verser le surnageant. </li><li> Remettre en suspension dans 4 ml de solution C. Triturez puits (environ 10 fois chacun) avec trois pipettes en verre flammées de diamètre décroissant, jusqu&#39;à ce que la suspension est aussi homogène que possible. </li><li> Lentement et doucement ajouter quelques gouttes de ce homogénat en haut de la BSA / EBSS. Si elle commence à couler à travers la BSA / EBSS, triturer plus et / ou ajouter un peu plus de solution C. Le broyât devrait siéger dans une couche au-dessus de la BSA / EBSS. Ne secouez pas. Tourne à 100 g pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant et remettre le culot (soft) dans 1 ml de milieu MEM. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et la plaque à 800 000 cellules / lamelle dans 500 pi de milieu MEM. Placer dans un incubateur à 37 ° C avec 6% de CO 2. </li><li> Changer le support le lendemain (24-36 h après la préparation). Ajouter une solution de milieu MEM contenant 10 uM de l&#39;inhibiteur de cycle cellulaire arabinofuranosyl cytidine (AraC). <ol><li> Pour chaquelamelle, conserver 250 pi de l&#39;ancien milieu dans une plaque bien fraîche 24, aspirer le reste, ajouter 250 pi de milieu MEM normale et aspirer cette solution pour laver les cellules, puis ajouter les 250 pi de vieux médium vers les cellules et l&#39;appoint avec 250 ul de milieu contenant de l&#39;AraC. Remarque: Les cellules peuvent être utilisés à partir de 6 jours in vitro (DIV). </li></ol></li></ol> 4. appauvrissant sélectivement les cellules microgliales (effectuée à 6 DIV) <ol><li> Ajouter LME pur à 5 ml d&#39;une aliquote distincte de milieu MEM pour donner une concentration finale de 150 mM LME. </li><li> Retourner la solution à pH 7,4 et stériliser par filtration au moyen d&#39;un sulfone de polyéther de 28 mm (PES) de filtre seringue de 0,2 um. </li><li> Diluer la solution à une concentration de 50 mM (2 x LME) dans du milieu MEM et placer dans un bain d&#39;eau à 37 o C pendant 10 min avec du milieu MEM normale pour les cultures témoins. </li><li> Retirer la moitié (250 pi), le milieu MEM à partir de cultures de la CCG et de conserver à 37 ° C. </li><li> Traiter les cellulesavec du milieu MEM contenant 2 x LME (250 pi), soit dilué à 1: 1 pour obtenir une concentration de 25 mM de puits, ou avec un milieu préchauffé MEM sans LME (250 pi) pour les cultures témoins. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 6% de CO 2 pendant 1 heure. </li><li> Laver les cellules deux fois dans un milieu frais préchauffé MEM pour supprimer les médias LME contenant, puis remplacer le milieu de culture conservé et un volume égal de milieu frais préchauffé MEM dans les puits correspondants. </li><li> Cultures Retour à l&#39;incubateur (humidifié avec 6% de CO 2 à 37 ° C) et laisser reposer pendant 24 heures avant toute nouvelle administration. </li></ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable%2C+yet+not+extraordinary%2C+human+brain+as+a+scaled-up+primate+brain+and+its+associated+cost%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost.</a> PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).</li>
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<li>Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+release+activators+of+neuronal+proliferation+mediated+by+activation+of+mitogen-activated+protein+kinase%2C+phosphatidylinositol-3-kinase%2FAkt+and+delta-Notch+signalling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades.</a> J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).</li>
<li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures%3A+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).</li>
<li>Kumamaru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+clodronate+selectively+eliminates+microglia+from+primary+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures.</a> J Neuroinflamm. 9, 116(2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les étapes les plus importantes pour assurer l&#39;élimination sélective de succès de la microglie du CCG et / ou des cultures mixtes sont: 1) le maintien d&#39;une culture de la CCG stérile et en bonne santé; 2) le filtre de stérilisation contenant un milieu LME et renvoyer la solution à pH 7,4; 3) en gardant les médias CCG non répartis et LME contenant les médias à 37 ° C pour éviter un choc thermique; et 4) travaillant rapidement pour réduire le temps cellules sont maintenues à l&#39;extérieur de l&#39;i...

Le cerveau humain comprend environ 85 milliards de neurones et un autre de 85 milliards de cellules non-neuronales, y compris les cellules gliales 1. Pour la plus grande partie des 100 dernières années, les neuroscientifiques ont porté principalement sur la population de cellules neuronales, croyant cellules gliales d&#39;être un peu plus de cellules de soutien passives qui ont fourni un soutien structurel pour les neurones - d&#39;où l&#39;étymologie grecque de «cellules gliales» traduit en anglais «colle». Récemment, cependant, il est devenu de plus en plus évident que les interactions neuronales-gliales peuvent être beaucoup plus fondamentale pour les aspects fondamentaux de la neurobiologie, neurophysiologie, et de la genèse et la progression de nombreuses maladies neurodégénératives. Cellules granulaires du cervelet (SCGC), la population neuronale homogène le plus abondant dans le cerveau humain, dominent le cervelet et représentent plus de 90% de ses constituants cellulaires. En conséquence, ces cellules ont été largement utilisées in vitro comme un système modèle pour til étude du développement neuronal, la fonction et la pathologie 2-6. Cependant, les cultures de la CCG contiennent encore microglie et d&#39;autres cellules gliales dans des proportions sans doute importantes. En conséquence, les données de la CCG affichant putative réponses neuronales directs à différents traitements de cellules peuvent en fait se produire - en partie ou en totalité - de la réponse secondaire indirecte des cellules gliales voisines dans la culture. Afin d&#39;évaluer cela, nous avons éliminé sélectivement microgliale de la CCG cultures neuronales à l&#39;aide d&#39;ester méthylique de L-leucine (LME). LME est un agent lysomotropic l&#39;origine utilisé pour détruire sélectivement les macrophages 7, et a depuis été utilisé pour épuiser aussi sélectivement la microglie de neurones, des astrocytes, et les cultures mixtes gliales 8,9,10. LME est intériorisée par les macrophages et les microglies, dans laquelle il provoque des perturbations lysosomale et l&#39;apoptose subséquente 13,14. Les macrophages et les cellules microgliales sont caractéristiquement riche dans les lysosomes, les obligeant à être particulièremenrly vulnérables lors de l&#39;exposition à un traitement LME. Ce protocole fournit un moyen puissant, pourtant simple et facile de déterminer la contribution de la microglie dans des expériences utilisant d&#39;autres systèmes de culture neuronales / gliales CGC et.

<table><tbody><tr><td>Forceps&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td>L’extrémité incurvée facilite l’ablation du cervelet</td></tr><tr><td>Ciseaux de micro-dissection</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146</td><td>La pointe droite et acérée facilite la dissection des rongeurs P4-7.</td></tr><tr><td>Chlorhydrate d’ester méthylique de L-leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7517-19-3</td><td></td></tr><tr><td>solution EBSS&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7510-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27964-99-4</td><td>Couvre-couche 1 jour avant l’utilisation</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine de soja&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6414</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-ED1 de la souris&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab31630</td><td></td></tr></tbody></table>

déplétion sélective des cellules microgliales du cervelet granules de cultures cellulaires utilisant la l-leucine methyl ester

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Les microglies, les cellules immunocompétentes résidentes du SNC, jouent des rôles multidimensionnels dans la modulation et le contrôle de la fonction neuronale, ainsi que dans la médiation de l’immunité innée. Les modèles de culture cellulaire primaire de rongeurs ont considérablement fait progresser notre compréhension des interactions neuronales-gliales, mais ce n’est que récemment que des méthodes permettant d’éliminer spécifiquement la microglie des cultures mixtes ont été utilisées. L’une de ces techniques – décrite ici – est l’utilisation de l’ester méthylique de L-leucine, un agent lysomotrope qui est internalisé par les macrophages et la microglie, dans lequel il provoque une perturbation lysosomale et une apoptose ultérieure13,14. Les expériences utilisant l’ester méthylique de L-leucine ont le pouvoir d’identifier la contribution de la microglie à l’environnement cellulaire environnant dans diverses conditions de culture. À l’aide d’un protocole optimisé dans notre laboratoire, nous décrivons comment éliminer la microglie de la culture cellulaire de granules cérébelleux de rongeurs P5. Cette approche permet d’évaluer l’impact relatif de la microglie sur les données expérimentales, ainsi que de déterminer si les microglies jouent un rôle neuroprotecteur ou neurotoxique dans des modèles de culture de maladies neurologiques, telles que les accidents vasculaires cérébraux, la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson.

La capacité de cette technique à éliminer sélectivement la microglie à partir de cultures mixtes CCG et / ou repose sur la capacité ultérieure de l&#39;investigateur d&#39;identifier avec précision la microglie et différencier à partir de leurs cellules voisines. Ceci peut être réalisé en utilisant une cellule fabricant spécifique de la microglie, comme isolectine-B4, comme illustré sur la figure 1. Comme le montre la figure 2, aucun changement observable à des astrocytes et de la densi...

La microglie peut influencer les neurones et autres glies en culture par divers mécanismes autonomes non cellulaires. Ici, nous présentons un protocole pour appauvrir sélectivement la microglie à partir de cultures neuronales primaires. Cette méthode a le potentiel d’élucider le rôle des interactions microgliales-neuronales, avec des implications pour les maladies neurodégénératives où la neuroinflammation est une caractéristique caractéristique.

Déplétion sélective des cellules microgliales du cervelet granules de cultures cellulaires utilisant la L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

L'objectif général de cette procédure est d'éliminer de manière sélective les cellules microgliales des cultures de cellules granulaires du sillon. Cette étape est réalisée en premier lieu en cultivant une population de cellules granulaires du sillon (cgcs) et en les maintenant dans un incubateur à 37 °C avec 6 % de dioxyde de carbone. La deuxième étape consiste à préparer une solution de LME dans du milieu MEM afin d'obtenir une concentration finale de 150 millimolaire de LME.La moitié suivante du milieu MEM provenant des cultures de CGC est retirée et conservée dans l’incubateur, puis les cultures de CGC sont remplacées par un volume équivalent de LME contenant du milieu MEM et placées dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 6 % de dioxyde de carbone pendant une heure. La dernière étape consiste à laver les cultures de CGC deux fois avec du milieu MEM préalablement réchauffé.Remplacer le milieu de culture conservé par un volume équivalent de milieu frais, puis remettre les cellules dans l’incubateur pendant 24 heures avant tout traitement supplémentaire. Enfin, l’immunochimie et la microscopie à fluorescence sont utilisées pour montrer l’élimination spécifique des cellules mic

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La vidéo montre une technique permettant d’isoler la microglie du cortex d’un cerveau de souris adulte. Tout d’abord, le cortex subit une segmentation et une homogénéisation pour éliminer les neurones et autres cellules gliales, préservant ainsi la microglie. Ensuite, la suspension cellulaire est exposée à des microbilles magnétiques anti-myéline et à un champ magnétique, séparant efficacement les cellules microgliales et myéloïdes des débris de myéline et des cellules contenant de la myéline.

Isolement de la microglie du cortex d’un cerveau de souris adulte

Cette vidéo montre la technique d’isolement et de culture des neurones granulaires cérébelleux primaires de souris. Les cellules sont traitées avec un antimétabolite pour éliminer les cellules gliales proliférantes et produire une culture pure de neurones granulaires cérébelleux.

Isolement et culture de neurones granulaires cérébelleux primaires de souris

Cette vidéo présente une technique d’élimination sélective de la microglie à partir d’une culture neuronale primaire de rat. Les neurones granulaires cérébelleux sont traités avec un antimétabolite pour éliminer les cellules gliales proliférantes. De plus, ils sont traités avec des agents ciblant les lysosomes pour épuiser la microglie de la culture.

Élimination sélective de la microglie d’une culture de neurones granulaires cérébelleux de rat

Cette vidéo montre l'isolement et la culture de cellules progénitrices neurales cérébelleuses à partir du cervelet d'un petit souris. Les progéniteurs des neurones granulaires cérébelleux sont isolés et purifiés par adhésion différentielle, éliminant efficacement les astrocytes. Ces progéniteurs cultivés se différencient ensuite en neurones granulaires cérébelleux.

Isolement et culture de progéniteurs de neurones granulaires cérébelleux murins

Cette vidéo présente un protocole d’extraction de cellules microgliales à partir de lésions démyélinisantes dans le cerveau de souris à l’aide du tri cellulaire magnétique. Le protocole consiste à disséquer le tissu cérébral lésé contenant des cellules microgliales, à traiter le tissu avec des enzymes spécifiques pour obtenir une suspension unicellulaire et à utiliser des billes magnétiques spécifiques des récepteurs microgliaux pour isoler les cellules microgliales.

Isolement de la microglie à partir de lésions démyélinisantes du cerveau de souris à l’aide du tri cellulaire activé par magnétoscopie

Cette vidéo décrit la génération d’un modèle de lésion neuronale à l’aide d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les neurones primaires du cervelet de souris. Il détaille le processus d’induction du stress oxydatif par l’ajout de fortes concentrations de peroxyde d’hydrogène. L’exposition aux ROS provoque des cassures de brins d’ADN et une instabilité génomique. De plus, l’oxydation des protéines cellulaires altère leurs fonctions, tandis que la peroxydation lipidique compromet l’intégrité...

Modélisation de la mort neuronale induite par les espèces réactives de l’oxygène dans les neurones des granules cérébelleux de souris

Une des clés de réussite de l'enquête de la biologie de la microglie est la préservation de la microglie immunofunction ex vivo lors de l'isolement de tissu du SNC. Isoler la microglie par les résultats serrant rotatifs dans des cultures de cellules de grande pureté et immunofonctionnel évaluée par imagerie de fluorescence, immunocytochimie, et ELISA activation de la microglie suivante avec le lipopolysaccharide stimuli pro-inflammatoires (LPS) et Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolation des corticale microglie avec immunophénotype préservée et fonctionnalité De murins nouveau-nés

Ce protocole décrit comment mesurer avec précision la viabilité neuronale à l'aide de la diurétate de fluorescéine (FDA) et de la double coloration à l'iodure de propidium (PI) dans des neurones de granules cérébelleux cultivés, une culture neuronale primaire utilisée comme modèle in vitro dans les recherches en neuroscience et neuropharmacologie.

Évaluation de la viabilité neuronale à l&#39;aide de diacétate de fluorescéine-iodure de propidium Double coloration dans la culture du neurone de granulé céréalier

Ce protocole décrit une méthode simple pour isoler et cultiver les neurones de granule cérébral de souris primaire (SCT) de petits 6-7 jours vieux, transduction efficace du SCT pour la perte et gain d’études de fonction et modélisation excitotoxicité neuronale induite par le NMDA, la mort cellulaire induite par la basse-potassium, lésions de l’ADN et le stress oxydatif en utilisant le même modèle de culture.

Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.

Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule

Nous présentons ici un protocole pour isoler et purifier la microglie primaire dans des modèles animaux de maladies démyélinisantes, en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne.

Isolement de la microglie primaire de souris par tri cellulaire activé magnétiquement dans des modèles animaux de démyélinisation

Découvrez la déplétion sélective des microglies dans les cultures de cellules granuleuses cérébelleuses utilisant le L-leucine methyl ester. Cette méthode permet d'étudier les interactions microglie-neurone dans les maladies neurodégénératives.

Déplétion sélective des cellules microgliales du cervelet granules de cultures cellulaires utilisant la L-leucine Methyl Ester

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