Déplétion sélective des cellules microgliales du cervelet granules de cultures cellulaires utilisant la L-leucine Methyl Ester

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Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J. Vis. Exp. (101), e52983, doi:10.3791/52983 (2015).

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Abstract

Introduction

Le cerveau humain comprend environ 85 milliards de neurones et un autre de 85 milliards de cellules non-neuronales, y compris les cellules gliales 1. Pour la plus grande partie des 100 dernières années, les neuroscientifiques ont porté principalement sur la population de cellules neuronales, croyant cellules gliales d'être un peu plus de cellules de soutien passives qui ont fourni un soutien structurel pour les neurones - d'où l'étymologie grecque de «cellules gliales» traduit en anglais «colle». Récemment, cependant, il est devenu de plus en plus évident que les interactions neuronales-gliales peuvent être beaucoup plus fondamentale pour les aspects fondamentaux de la neurobiologie, neurophysiologie, et de la genèse et la progression de nombreuses maladies neurodégénératives. Cellules granulaires du cervelet (SCGC), la population neuronale homogène le plus abondant dans le cerveau humain, dominent le cervelet et représentent plus de 90% de ses constituants cellulaires. En conséquence, ces cellules ont été largement utilisées in vitro comme un système modèle pour til étude du développement neuronal, la fonction et la pathologie 2-6.

Cependant, les cultures de la CCG contiennent encore microglie et d'autres cellules gliales dans des proportions sans doute importantes. En conséquence, les données de la CCG affichant putative réponses neuronales directs à différents traitements de cellules peuvent en fait se produire - en partie ou en totalité - de la réponse secondaire indirecte des cellules gliales voisines dans la culture. Afin d'évaluer cela, nous avons éliminé sélectivement microgliale de la CCG cultures neuronales à l'aide d'ester méthylique de L-leucine (LME). LME est un agent lysomotropic l'origine utilisé pour détruire sélectivement les macrophages 7, et a depuis été utilisé pour épuiser aussi sélectivement la microglie de neurones, des astrocytes, et les cultures mixtes gliales 8,9,10. LME est intériorisée par les macrophages et les microglies, dans laquelle il provoque des perturbations lysosomale et l'apoptose subséquente 13,14. Les macrophages et les cellules microgliales sont caractéristiquement riche dans les lysosomes, les obligeant à être particulièremenrly vulnérables lors de l'exposition à un traitement LME. Ce protocole fournit un moyen puissant, pourtant simple et facile de déterminer la contribution de la microglie dans des expériences utilisant d'autres systèmes de culture neuronales / gliales CGC et.

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Protocol

Toutes les expériences décrites ici ont été effectuées en conformité avec le Royaume-Uni Animaux (Scientific Procedures) la loi de 1986.

1. Préparation des Instruments, Culture Media, et Plats

  1. Préparer deux ciseaux laboratoire en acier inoxydable de dissection et deux pinces de laboratoire en acier inoxydable. Autoclave tous les instruments et les placer dans une culture hotte O / N sous la lumière ultraviolette (UV) pour la stérilisation.
  2. Ajouter 500 ml de (MEM) du milieu de culture de médias essentiel minimum (10% Foetal Bovine Serum [FBS], 20 mM de KCl, 25 mM de NaHCO 3, 30 mM de D-glucose, 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et 6 pg / ml d'ampicilline) et stériliser par filtration. Stocker à 4 ° C pendant des mois.
  3. Préparer 24 plaques de culture puits contenant 14 mm, numéro 1 épaisseur lamelles. Autoclaver les lamelles et manteau à 100 mg / L poly-d-lysine (PDL) comme décrit précédemment 3. la lumière UV stériliser O / N.

2. Préparation des solutions CCG Culture

  1. Préparer "solution A '(100 ml) dans l'autoclave, la lumière UV traiter, dH 2 O stérile contenant 250 mg de glucose, 300 mg de sérum-albumine bovine [SAB], 955 mg de solution saline tamponnée au phosphate [PBS] (Ca 2+ et Mg + gratuit), et 1 ml de 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O.
  2. Préparer "solution B" (10 ml) contenant 1 ml de 5 mg / ml de trypsine dilués dans 9 ml de solution A.
  3. Préparer "solution C" (10 ml) contenant 1000 unités de DNase, 0,5 mg d'inhibiteur de trypsine de soja, 100 ul de 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O, on le dilue à 10 ml avec la solution A.
  4. Préparer "solution D '(20 ml) contenant 3,2 ml de solution C, on le dilue à 20 ml avec la solution A.
  5. Préparer solution saline équilibrée (EBSS) solution de BSA / EBSS contenant Earle, 25 mM de NaHCO 3, 3 mM de MgSO 4 · 7H 2 O, et4% de BSA, pH 7,4, comme décrit précédemment 3.
  6. Préparer LME en ajoutant pur LME dans 5 ml de milieu de culture MEM pour donner une concentration finale de mM LME 150, revenir la solution à pH 7,4 en utilisant un pH-mètre de paillasse, et stériliser par filtration au moyen d'un sulfone de polyéther de 28 mm (PES) de 0,2 um de la seringue filtre.

3. Culture des CGCs

  1. Recueillir cerebella de rats âgés de 4-7 jours comme décrit précédemment 3. Placez immédiatement en boîte de Pétri contenant 5 ml de solution A sur la glace.
  2. Décanter la solution en excès de tissu cerebella et le placer dans le plat couvercle Petri.
  3. Hacher finement le tissu avec une lame de rasoir bien flambé dans au moins trois directions différentes.
  4. Ajouter le tissu haché à la solution B (rincez boîte de Pétri avec une solution pour assurer le tissu limitée est perdue) et placer dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 5 min. Agiter doucement toutes les deux minutes.
  5. Ajouter la solution D (20 ml) au tube de neutraliser la trypsine, et le tremblement centrifuge à 65 g pendant 5 min.
  6. Verser le surnageant.
  7. Remettre en suspension dans 4 ml de solution C. Triturez puits (environ 10 fois chacun) avec trois pipettes en verre flammées de diamètre décroissant, jusqu'à ce que la suspension est aussi homogène que possible.
  8. Lentement et doucement ajouter quelques gouttes de ce homogénat en haut de la BSA / EBSS. Si elle commence à couler à travers la BSA / EBSS, triturer plus et / ou ajouter un peu plus de solution C. Le broyât devrait siéger dans une couche au-dessus de la BSA / EBSS. Ne secouez pas. Tourne à 100 g pendant 5 min.
  9. Retirer le surnageant et remettre le culot (soft) dans 1 ml de milieu MEM.
  10. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et la plaque à 800 000 cellules / lamelle dans 500 pi de milieu MEM. Placer dans un incubateur à 37 ° C avec 6% de CO 2.
  11. Changer le support le lendemain (24-36 h après la préparation). Ajouter une solution de milieu MEM contenant 10 uM de l'inhibiteur de cycle cellulaire arabinofuranosyl cytidine (AraC).
    1. Pour chaquelamelle, conserver 250 pi de l'ancien milieu dans une plaque bien fraîche 24, aspirer le reste, ajouter 250 pi de milieu MEM normale et aspirer cette solution pour laver les cellules, puis ajouter les 250 pi de vieux médium vers les cellules et l'appoint avec 250 ul de milieu contenant de l'AraC.
      Remarque: Les cellules peuvent être utilisés à partir de 6 jours in vitro (DIV).

4. appauvrissant sélectivement les cellules microgliales (effectuée à 6 DIV)

  1. Ajouter LME pur à 5 ml d'une aliquote distincte de milieu MEM pour donner une concentration finale de 150 mM LME.
  2. Retourner la solution à pH 7,4 et stériliser par filtration au moyen d'un sulfone de polyéther de 28 mm (PES) de filtre seringue de 0,2 um.
  3. Diluer la solution à une concentration de 50 mM (2 x LME) dans du milieu MEM et placer dans un bain d'eau à 37 o C pendant 10 min avec du milieu MEM normale pour les cultures témoins.
  4. Retirer la moitié (250 pi), le milieu MEM à partir de cultures de la CCG et de conserver à 37 ° C.
  5. Traiter les cellulesavec du milieu MEM contenant 2 x LME (250 pi), soit dilué à 1: 1 pour obtenir une concentration de 25 mM de puits, ou avec un milieu préchauffé MEM sans LME (250 pi) pour les cultures témoins.
  6. Incuber les cellules à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 6% de CO 2 pendant 1 heure.
  7. Laver les cellules deux fois dans un milieu frais préchauffé MEM pour supprimer les médias LME contenant, puis remplacer le milieu de culture conservé et un volume égal de milieu frais préchauffé MEM dans les puits correspondants.
  8. Cultures Retour à l'incubateur (humidifié avec 6% de CO 2 à 37 ° C) et laisser reposer pendant 24 heures avant toute nouvelle administration.

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Representative Results

La capacité de cette technique à éliminer sélectivement la microglie à partir de cultures mixtes CCG et / ou repose sur la capacité ultérieure de l'investigateur d'identifier avec précision la microglie et différencier à partir de leurs cellules voisines. Ceci peut être réalisé en utilisant une cellule fabricant spécifique de la microglie, comme isolectine-B4, comme illustré sur la figure 1. Comme le montre la figure 2, aucun changement observable à des astrocytes et de la densité neuronale et la morphologie ont été enregistrés par rapport à chaque groupe de traitement principale. Fait important, aucun changement significatif de la morphologie neuronale ou astrocytaire ont été observés lorsque les cultures ont été traitées avec LME seule, supportant une action spécifique de la microglie du composé. La figure 3A montre aucun changement observable de la densité des astrocytes et de la morphologie de rongeur primaire astrocyte culture 12, mais le fait afficher une perte de la microglie contaminantes. Sur la figure 3B, comme dans A, aucun changement dans astrocyte densité et la morphologie ont été observés; Cependant, une perte de contaminer nombre microglie et réactivité a été observée. Pour une brève description de l'immunocytochimie (ICC) protocole utilisé dans ce manuscrit, s'il vous plaît voir la référence 11.

Figure 1
Figure 1: Caractérisation de traitement LME du CGC. (A) Des images représentatives de immunocytochimie (ICC) expériences effectuées sur des cultures de la CCG après le traitement avec mM LME 25-75 pendant 1 heure, suivi par lavage-off. ICC a été réalisée avec DAPI (bleu) pour la quantification du nombre total de cellules et ceux présentant une morphologie apoptotique, et isolectine-B4 (IB 4) (vert) pour l'identification et la quantification de la microglie. La barre d'échelle = 30 um. (B) La quantification des cellules présentant une morphologie apoptotique, définie comme la condensation de la chromatine nucléaire (barres grises;% desnombre total de cellules dans le champ) et le nombre total de microgliale, en tant que pourcentage des niveaux de contrôle (barres vertes). T les-tests de Student non apparié ont été effectuées entre les contrôles pertinents et un traitement spécifique de la LME; * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; n = 3. (soit 3 répétitions indépendants).

Figure 2
Figure 2: Caractérisation des effets de traitement 25 mM LME sur les neurones et les astrocytes dans les cultures de la CCG. Groupe d'images représentatives des expériences de la CPI effectuées sur les cultures de la CCG après le traitement avec 25 mM LME pendant 1 heure. CPI a été effectuée avec du DAPI (bleu), anti-β-tubuline III (vert) pour l'identification de changements dans la densité neuronale et anti-GFAP (rouge) pour l'identification de changements dans la densité et la morphologie astrocytaire. Contrôle négatif (CTR ve) images représentent des cultures de la CCG dans lequel la antibodie primaires ont été omises. La barre d'échelle = 30 um.

Figure 3
Figure 3: Une caractérisation plus poussée de l'efficacité du traitement 25 mM LME à l'élimination de la microglie à partir de cultures astrocytes. (A) Groupe d'images représentatives des expériences de la CPI réalisées sur des cultures primaires d'astrocytes après pré-traitement avec 25 mM LME pendant 1 heure. CPI a été effectuée avec du DAPI (bleu), anti-GFAP (rouge) pour l'identification de changements dans la densité et la morphologie des astrocytes, et anti-ED1 (vert) pour l'identification de numéro microgliale. (B) Des images représentatives des expériences de la CPI réalisées sur des cultures primaires d'astrocytes après traitement avec LPS (1 ug / ml) pendant 24 heures suivantes pré-traitement avec 25 mM LME pendant 1 heure. CPI a été effectuée comme décrit dans A, mais avec anti-GFAP (vert) et anti-iNOS (rouge) pour identifier activé microglia. Contrôle négatif (CTR images -ve) représentent les cultures de la CCG dans lequel les anticorps primaires ont été omises. La barre d'échelle = 30 um.

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Discussion

Les étapes les plus importantes pour assurer l'élimination sélective de succès de la microglie du CCG et / ou des cultures mixtes sont: 1) le maintien d'une culture de la CCG stérile et en bonne santé; 2) le filtre de stérilisation contenant un milieu LME et renvoyer la solution à pH 7,4; 3) en gardant les médias CCG non répartis et LME contenant les médias à 37 ° C pour éviter un choc thermique; et 4) travaillant rapidement pour réduire le temps cellules sont maintenues à l'extérieur de l'incubateur.

Nous avons utilisé 25 mM LME à épuiser la microglie de nos cultures CCG - une concentration préalablement optimisé dans notre laboratoire. Néanmoins, certains microglies demeurent dans la culture après traitement LME, que certains croient pourrait refléter une population de différenciée, la microglie non-prolifération. En effet, Hamby et al. (2006) ont constaté que mM LME 50-75 a été nécessaire pour éliminer la microglie de haute densité astrocytes monocouches 13. Nous avons également montré précédemment que dans pur c microglialeULTURES, mM LME 10 était suffisant pour tuer tous les microglies, mais seulement avec un temps d'incubation de 24 h 14.

Des méthodes alternatives pour débarrasser les modèles de culture de cellules de la microglie contamination sont récemment venus à la lumière. Crocker et al. (2008) a démontré une nouvelle approche pour éliminer les microglies provenant de cultures d'astrocytes par la promotion de cellules souches neurales (NSC) différenciation en astrocytes en postnatal (P0-P2) 15 souris. Ils ont constaté que cette technique a complètement éliminé les microglies provenant des cultures, bien que les mécanismes sous-jacents aux phénomènes sont inconnus. . En outre, Kumamaru et al (2012) ont utilisé liposomale clodronate - un biophosphonate connu pour induire l'apoptose dans les macrophages - pour éliminer la microglie dans les cultures primaires d'astrocytes de souris P3 16. Ce composé fonctionne d'une manière similaire et au même niveau d'efficacité que LME; si les auteurs font valoir que la LME peut être toxique pour les astrocytes sous certaines conditionsen raison de sa diffusion libre dans les cellules astrocytes - perturbant la capacité d'adhésion - 13 clodronate liposomale représente une méthode améliorée pour épuiser les microglies de la culture. Cependant, nous avons constaté que 25 mM LME n'a aucun effet sur la viabilité ou la prolifération des astrocytes.

Le protocole décrit ici utilise une concentration spécifique de la LME pour éliminer sélectivement les microglies provenant de cultures de neurones enrichi de CGC. Cela représente une approche expérimentale puissante de déterminer l'influence de la microglie sur les neurones dans diverses conditions, et continue de fournir des données importantes pour les chercheurs de l'enquête sur le rôle de la neuro-inflammation dans les troubles neurologiques.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps  Sigma-Aldrich F4142 The curved end facilitates removal of the cerebellum 
Micro-dissecting scissors Sigma-Aldrich S3146 Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection 
L-leucine methyl ester hydrochloride Sigma-Aldrich 7517-19-3
EBSS solution  Sigma-Aldrich E7510-500 ml
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich 27964-99-4 Coat coverslips 1 day before use 
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
DNase Sigma-Aldrich D5025
Soybean trypsin inhibitor  Sigma-Aldrich T6414
Mouse anti-ED1 antibody  Abcam ab31630

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References

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  16. Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).

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