Déplétion sélective des cellules microgliales du cervelet granules de cultures cellulaires utilisant la L-leucine Methyl Ester

L’objectif global de cette procédure est d’éliminer sélectivement les cellules microgliales des cultures de cellules granulaires sella. Pour ce faire, il faut d’abord cultiver une population de CGC et les stocker dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 6 % de dioxyde de carbone. La deuxième étape consiste à réaliser une solution de LME dans un milieu MEM pour obtenir une concentration finale de 150 millimolaires de LME.

La moitié suivante du milieu MEM des cultures CGC est retirée et conservée dans l’incubateur, puis les cultures CGC sont remplacées par un volume égal de milieu MEM contenant du LME et placées dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 6 % de dioxyde de carbone pendant une heure. La dernière étape consiste à laver les cultures CGC deux fois avec du préchauffage frais. MEM medium.

Remplacez le milieu de culture conservé par un volume égal de milieu frais, puis retournez les cellules dans l’incubateur pendant 24 heures avant tout traitement supplémentaire. En fin de compte, l’immunochimie et la microscopie à fluorescence sont utilisées pour montrer l’appauvrissement spécifique des cellules microgliales à partir de cultures de cellules granulaires cérébelleuses. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, telles que les effets de la microglie sur les neurones dans diverses conditions, et quelle importance ces effets ont-ils pour notre compréhension des troubles neurodégénératifs tels que la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique auront du mal car travailler avec des cultures primaires nécessite précision et rapidité. Commencez cette procédure en prélevant le cervelet de petits rats âgés de quatre à sept jours. Placez-les immédiatement dans une boîte de Pétri contenant cinq millilitres de solution A sur glace.

Retirez ensuite l’excès de solution du cervelet et placez le tissu dans le couvercle de la boîte de Pétri. Ensuite, hachez finement le tissu avec une lame de rasoir bien ajustée dans au moins trois directions différentes. Ensuite, ajoutez le mouchoir haché à la solution B.Placez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes et secouez-le doucement toutes les deux minutes.

Ajoutez ensuite 20 millilitres de solution D dans le tube pour neutraliser l’agitation de la trypsine dans la centrifugeuse à 60 5G pendant cinq minutes. Après. Videz le surnageant S en suspension dans quatre millilitres de solution CT tri. Évaluez l’échantillon 10 fois avec chacune des trois pipettes en verre flammé de diamètre décroissant jusqu’à ce que la suspension soit aussi homogène que possible.

Ensuite, ajoutez lentement et doucement quelques gouttes de cet homogénat sur le B-S-A-E-B-S-S s’il commence à couler davantage à travers le tritrate B-S-A-E-B-S-S-T et ajoutez un peu plus de solution C. L’homogénat doit reposer en une couche sur le B-S-A-E-B-S-S. Essorez-le à 100 G pendant cinq minutes et ne secouez pas. Retirez ensuite le surnageant et suspendez à nouveau le palais.

Dans un millilitre de milieu MEM, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et plaquez-les à 800 000 cellules par couverture. Glissez-y 500 microlitres de MEM après cela, placez-le dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 6 % de dioxyde de carbone. Ensuite, préparez une solution de milieu MEM contenant 10 micromolaires de l’inhibiteur du cycle cellulaire RC Pour chaque lamelle, conservez 250 microlitres de l’ancien milieu dans une plaque fraîche à 24 puits et aspirez le reste.

Ajoutez 250 microlitres de milieu MEM normal pour laver les cellules. Par la suite, ajoutez 250 microlitres d’ancien milieu dans les cellules et complétez avec 250 microlitres de milieu contenant du RSE. Dans cette procédure, ajoutez du LME pur à cinq millilitres de milieu MEM pour obtenir une concentration finale de 150 millimolaires de LME.

Remettez la solution à pH 7,4 à l’aide d’une solution à base d’acide. Ensuite, filtrez-le stérilement à l’aide d’un PES de 28 millimètres avec un filtre à seringue de 0,2 micromètre. Ensuite, diluez la solution LME à une concentration de 50 millimolaires dans un milieu MEM.

Ensuite, placez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, avec un milieu MEM normal pour les cultures témoins. Après 10 minutes, retirez 250 microlitres de milieu MEM de chaque culture CGC. Maintenez ensuite le support à 37 degrés Celsius.

Ensuite, traitez les cellules avec un milieu MEM contenant deux fois de LME ou avec un milieu MEM préchauffé sans LME Pour les cultures témoins, incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée avec 6 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Ensuite, lavez deux fois les cellules dans un milieu MEM frais préchauffé pour éliminer le milieu contenant du LME. Remplacez ensuite le milieu de culture conservé par une quantité égale de milieu MEM frais préchauffé.

Enfin, incubez les cultures dans du dioxyde de carbone humidifié à 6 % à 37 degrés Celsius pendant 24 heures avant tout traitement ultérieur. Cette figure montre les images représentatives des expériences réalisées sur des cultures CGC après le traitement avec 25 à 75 millimolaires LME pendant une heure, suivi d’un lavage L’immunochimie a été réalisée avec DPI pour la quantification du nombre total de cellules et celles présentant une morphologie apoptotique et ISO lectine B quatre pour l’identification et la quantification microgliales. Ce graphique montre la quantification des cellules présentant une morphologie apoptotique : voici les images représentatives des expériences réalisées sur des cultures CGC après avoir été traitées avec 25 millimolaires LME pendant une heure.

L’immunochimie a été réalisée avec la tubuline DAPI anti bêta trois pour l’identification des changements de densité neuronale et l’anti GFAP pour l’identification des changements de densité astrocytaire et de morphologie. Les images de contrôle négatif représentent des cultures CGC dans lesquelles les anticorps primaires ont été omis une fois maîtrisés. Cette technique peut être réalisée en environ deux heures si elle est correctement exécutée.