El agotamiento selectivo de la microglía de cerebeloso gránulos Cultivos Celulares El uso de L-leucina metil éster

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Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J. Vis. Exp. (101), e52983, doi:10.3791/52983 (2015).

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Abstract

Introduction

El cerebro humano comprende un estimado de 85 mil millones de neuronas y otras 85 mil millones de células no neuronales incluyendo glia 1. Para la mayor parte de los últimos 100 años los neurocientíficos se han centrado principalmente en la población de células neuronales, creyendo células gliales a ser poco más que las células de apoyo pasivos que proporcionan soporte estructural para las neuronas - de ahí la etimología griega de 'glia' traducida al Inglés como "pegamento". Recientemente, sin embargo, se ha vuelto cada vez más evidente que las interacciones neuronales glial pueden ser mucho más fundamental a los aspectos básicos de la neurobiología, la neurofisiología, y la génesis y progresión de muchas enfermedades neurodegenerativas. Células granulares del cerebelo (CGC), el más abundante población neuronal homogénea en el cerebro humano, dominan el cerebelo y constituyen más del 90% de sus componentes celulares. En consecuencia, estas células se han utilizado ampliamente in vitro como un sistema modelo para tque estudian el desarrollo neuronal, la función y patología 2-6.

Sin embargo, los cultivos de CGC aún contienen microglia y otra glía en proporciones posiblemente significativas. Como resultado, los datos CGC que muestran supuestamente respuestas neuronales directos a diferentes tratamientos con células pueden, de hecho surgir - en parte o en total - a partir de la respuesta secundaria indirecta de la glía vecino en el cultivo. Para evaluar esto, hemos eliminado selectivamente microglial de CGC cultivos neuronales con la ayuda de éster metílico de L-leucina (LME). LME es un agente lysomotropic originalmente usado para destruir selectivamente los macrófagos 7, y desde entonces ha sido utilizado también para agotar selectivamente microglia desde neural, astrocitos, y los cultivos gliales mixtos 8,9,10. LME es internalizado por los macrófagos y microglia, en el que se provoca la interrupción lisosomal y la posterior apoptosis 13,14. Los macrófagos y microglia son característicamente rico en lisosomas, haciendo que sea particularly vulnerables a la exposición a un tratamiento de LME. Este protocolo proporciona una forma potente, pero simple y fácil de determinar la contribución de la microglia en experimentos que utilizan CGC y otros sistemas de cultivos neuronales / gliales.

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Protocol

Todos los experimentos descritos en este documento se realizaron de acuerdo con las Unido Animales Unidas (procedimientos científicos) Act de 1986.

1. Preparación de instrumentos, medios de cultivo, y platos

  1. Prepare dos tijeras de disección de laboratorio de acero inoxidable y dos pinzas de laboratorio de acero inoxidable. Autoclave todos los instrumentos y lugar en una campana de cultivo O / N bajo la luz (UV) ultravioleta para la esterilización.
  2. Hacer 500 ml de (MEM) medio de cultivo medio esencial mínimo (10% de suero bovino fetal [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCO 3, 30 mM D-glucosa, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 g / ml de estreptomicina y 6 mg / ml de ampicilina) y esterilizar filtro. Almacenar a 4 ° C durante meses.
  3. Preparar 24 placas de cultivo de pocillos que contenían 14 mm, número 1 cubreobjetos espesor. Autoclave los cubreobjetos y capa en 100 mg / L de poli-D-lisina (PDL) como se describe previamente 3. Luz UV esterilizar O / N.

2. Preparación de Soluciones CGC Cultura

  1. Preparar 'solución A' (100 ml) en autoclave, luz UV tratada, dH 2 O estéril que contiene 250 mg de glucosa, 300 mg de albúmina de suero bovino [BSA], 955 mg de solución salina tamponada con fosfato [PBS] (Ca 2+ y Mg + gratis), y 1 ml de 3,8% MgSO4 · 7H 2 O.
  2. Preparar 'solución B' (10 ml) que contiene 1 ml de 5 mg / ml de tripsina diluido en 9 ml de solución A.
  3. Preparar 'solución C' (10 ml) que contienen 1,000 unidades de ADNasa, 0,5 mg de inhibidor de tripsina de soja, 100 l de 3,8% MgSO4 · 7H 2 O, se diluyó a 10 ml con solución A.
  4. Preparar 'solución D' (20 ml) que contiene 3,2 ml de solución C, se diluyó a 20 ml con solución A.
  5. Prepare la solución de BSA / Earle solución salina equilibrada (EBSS) que contiene EBSS, 25 mM NaHCO3, 3 mM MgSO4 · 7H 2 O, y4% de BSA, pH 7,4, como se ha descrito previamente 3.
  6. Preparar LME añadiendo puro LME en 5 ml de medio de cultivo MEM para dar una concentración final de 150 mM LME, devolver la solución a pH 7,4 usando un medidor de pH de sobremesa, y el filtro de esterilizar usando un poliéter sulfona 28 mm (PES) 0,2 micras jeringa filtro.

3. El cultivo de las CGC

  1. Recoger cerebelo 4-7 días de edad crías de rata como se describe anteriormente 3. Coloque inmediatamente en placa de Petri que contiene 5 ml de la solución A en hielo.
  2. Vierta el exceso de solución de cerebelo y el lugar del tejido en el plato tapa Petri.
  3. Picar finamente tejido con una cuchilla de afeitar así flameado-en al menos tres direcciones diferentes.
  4. Añadir tejido picado a la solución B (enjuague placa de Petri con solución para asegurar el tejido limitada se pierde) y colocar en baño de agua a 37 ° C durante 5 min. Agite suavemente cada par de minutos.
  5. Añadir solución D (20 ml) al tubo para neutralizar la tripsina, agitar y cientorifuge a 65 xg durante 5 min.
  6. Retirar el sobrenadante.
  7. Resuspender en 4 ml de solución C. Se tritura pocillos (aproximadamente 10 veces cada uno) con tres pipetas de vidrio flameado de diámetro decreciente, hasta que la suspensión es tan homogénea como sea posible.
  8. Lenta y suavemente añadir unas gotas de este homogeneizado en la parte superior de la BSA / EBSS. Si comienza a hundirse a través de la BSA / EBSS, triturar más y / o añadir un poco más de la solución C. El homogeneizado debe sentarse en una capa en la parte superior de la BSA / EBSS. No agite. Girar a 100 xg durante 5 min.
  9. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet (suave) en 1 ml de medio MEM.
  10. Contar las células utilizando un hemocitómetro y placa a 800.000 células / cubreobjeto en 500 l de medio MEM. Coloque en una incubadora a 37 ° C con 6% de CO 2.
  11. Cambie el medio al día siguiente (24 a 36 horas después de la preparación). Hacer una solución de medio MEM que contiene 10 M del ciclo celular citidina arabinofuranosil inhibidor (AraC).
    1. Para cadacubreobjetos, retener 250 l de medio de edad en una placa de 24 frescos, aspirar el resto, añadir 250 l de medio normal MEM y aspirar este para lavar las células, a continuación, añadir los 250 l de medio de edad de nuevo a las células y recarga con 250 l de medio que contenía AraC.
      Nota: Las células se pueden usar desde los 6 días in vitro (DIV).

4. selectiva que agotan la microglía (realizado a las 6 DIV)

  1. Añadir LME pura a 5 ml de una alícuota separada de medio MEM para dar una concentración final de 150 mM LME.
  2. Devolver la solución a pH 7,4 y esterilizar utilizando un filtro de poliéter sulfona 28 mm (PES) filtro de 0,2 micras jeringa.
  3. Diluir la solución a una concentración de 50 mM (2 x LME) en medio MEM y colocar en un baño de agua a 37 ° C durante 10 minutos, junto con medio normal MEM para cultivos de control.
  4. Retire la mitad (250 l) el medio MEM a partir de cultivos de CGC y retener a 37 ° C.
  5. Tratar a las célulascon medio MEM que contiene 2 x LME (250 l), es decir, diluido 1: 1 dando una concentración bien de 25 mM, o con medio de pre-calentado MEM sin ​​LME (250 l) para los cultivos de control.
  6. Se incuban las células a 37 ° C en una atmósfera húmeda con un 6% de CO 2 durante 1 hora.
  7. Lavar las células dos veces en medio precalentado fresca MEM para eliminar medios LME-que contienen, y luego reemplazar el medio de cultivo retenido y un volumen igual de medio precalentado fresca MEM a los pocillos correspondientes.
  8. Culturas Regreso a la incubadora (humidificado con 6% de CO 2 a 37 ° C) y dejar reposar durante 24 horas antes de cualquier tratamiento adicional.

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Representative Results

La capacidad de esta técnica para eliminar selectivamente microglia de CGC y / o cultivos mixtos se basa en la posterior capacidad del investigador para identificar y diferenciar microglia de sus células circundantes con precisión. Esto se puede lograr usando una máquina de célula microglial-específico, como isolectina-B4, como se ilustra en la Figura 1. Como se demuestra en la Figura 2, no se registraron cambios observables a los astrocitos y la densidad y morfología neuronal con respecto a cada grupo de tratamiento principal. Es importante destacar que se observó ningún cambio significativo en la morfología neuronal o astrocytic cuando los cultivos fueron tratados con LME solo, apoyando una acción-microglial específica del compuesto. La Figura 3A muestra no hay cambios observables en la densidad y morfología de astrocitos de roedor primario cultura astrocito 12, pero hace mostrar una pérdida de microglia contaminantes. En la Figura 3B, como en A, no hay cambios en astrocydensidad de TE y la morfología se observaron; sin embargo, se observó una pérdida en la contaminación número microglial y reactividad. Para una breve descripción del protocolo inmunocitoquímica (CPI) que se utiliza en este manuscrito, por favor, véase la referencia 11.

Figura 1
Figura 1: Caracterización del tratamiento LME de CGC. (A) Imágenes representativas de inmunocitoquímica (CPI) experimentos realizados en cultivos de CGC después del tratamiento con 25-75 mM LME durante 1 hora, seguido de lavado con. ICC se realizó con DAPI (azul) para la cuantificación del número de células totales y los que presentan la morfología apoptótica, y isolectina-B4 (IB 4) (verde) para la identificación y cuantificación microglial. La barra de escala = 30 micras. (B) Cuantificación de células que presentan la morfología apoptótica, definida como condensación de la cromatina nuclear (barras grises;% denúmero total de células en el campo) y el número total de microglial, como un porcentaje de los niveles de control (barras verdes). T de Student pruebas Unpaired se realizaron entre los controles correspondientes y un tratamiento específico de LME; * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; n = 3. (es decir, 3 repeticiones independientes).

Figura 2
Figura 2: Caracterización de los efectos de tratamiento 25 mM LME sobre las neuronas y astrocitos en cultivos de CGC. Panel de imágenes representativas de los experimentos realizados ICC en cultivos de CGC después del tratamiento con 25 mM LME durante 1 hr. ICC se realizó con DAPI (azul), anti-β-III-tubulina (verde) para la identificación de cambios en la densidad neuronal y anti-GFAP (rojo) para la identificación de cambios en la densidad y morfología astrocytic. Control negativo imágenes (CTR -ve) representan culturas CGC en el que el antibodie primarias fueron omitidos. La barra de escala = 30 micras.

Figura 3
Figura 3: Además de la caracterización de la eficacia del tratamiento 25 mM LME en la eliminación de microglia partir de cultivos de astrocitos. (A) Panel de imágenes representativas de los experimentos realizados ICC en cultivos de astrocitos primarios después del pre-tratamiento con 25 mM LME durante 1 hr. ICC se realizó con DAPI (azul), anti-GFAP (rojo) para la identificación de cambios en la densidad y morfología astrocytic, y anti-ED1 (verde) para la identificación del número de microglial. (B) Imágenes representativas de los experimentos realizados ICC en cultivos de astrocitos primarios después del tratamiento con LPS (1 mg / ml) durante 24 hr siguientes pre-tratamiento con LME 25 mM durante 1 hora. ICC se realizó como se describe en A, pero con anti-GFAP (verde) y anti-iNOS (rojo) para identificar microg activadolia. Control negativo imágenes (-ve CTR) representan culturas CGC en el que los anticuerpos primarios fueron omitidos. La barra de escala = 30 micras.

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Discussion

Los pasos más importantes para garantizar la eliminación selectiva de éxito de la microglia de CGC y / o cultivos mixtos son: 1) el mantenimiento de una cultura CGC estéril y saludable; 2) Filtro de esterilizar el medio que contiene LME-y devolver la solución a pH 7,4; 3) mantenimiento de los medios de comunicación CGC retenidas y LME-que contiene los medios de comunicación a 37 ° C para evitar el choque térmico; y 4) que trabajan rápidamente para reducir el tiempo las células se mantienen fuera de la incubadora.

Utilizamos 25 mM LME para agotar la microglía de nuestras culturas CGC - una concentración óptima previamente en nuestro laboratorio. No obstante, algunos microglia aún permanecen en la cultura después del tratamiento de la LME, que algunos creen que podría reflejar una población de diferenciada, microglia no proliferativas. De hecho, Hamby et al. (2006) han encontrado que 50 a 75 mM LME estaba obligado a eliminar la microglía de monocapas de astrocitos de alta densidad de 13. También hemos demostrado anteriormente que en pura c microglialultures, mM LME 10 fue suficiente para matar a todos los microglia, pero sólo con un tiempo de incubación de 24 horas 14.

Los métodos alternativos para librar modelos de cultivo celular de contaminar microglia han salido recientemente a la luz. Crocker et al. (2008) demostró un enfoque novedoso para eliminar microglia a partir de cultivos de astrocitos mediante la promoción de células madre neurales (NSC) la diferenciación en astrocitos en postnatal (P0-P2) 15 ratones. Ellos encontraron que esta técnica elimina completamente microglia partir de los cultivos, aunque los mecanismos subyacentes a los fenómenos son desconocidos. . Además, Kumamaru et al (2012) utilizaron clodronato liposomal - un biophosphonate conocido para inducir la apoptosis en macrófagos - para eliminar microglia en cultivos de astrocitos primarios de ratones P3 16. Este compuesto funciona de manera similar y en el mismo nivel de eficacia como LME; aunque los autores argumentan que como LME puede ser tóxico para los astrocitos bajo ciertas condicionesdebido a su difusión gratuita en las células - interrumpiendo astrocito capacidad de adhesión 13 - clodronato liposomal representa un método mejorado para agotar la microglía de la cultura. Nosotros, sin embargo, encontramos que 25 mM LME no tiene ningún efecto sobre la viabilidad o la proliferación de astrocitos.

El protocolo descrito en el presente documento utiliza una concentración específica de LME para eliminar selectivamente microglia a partir de cultivos de neuronas enriquecido de CGCs. Esto representa un enfoque experimental poderosa para determinar la influencia de la microglia en las neuronas en diversas condiciones, y continúa para proporcionar datos importantes para los investigadores que investigan el papel de la neuroinflamación en los trastornos neurológicos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps  Sigma-Aldrich F4142 The curved end facilitates removal of the cerebellum 
Micro-dissecting scissors Sigma-Aldrich S3146 Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection 
L-leucine methyl ester hydrochloride Sigma-Aldrich 7517-19-3
EBSS solution  Sigma-Aldrich E7510-500 ml
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich 27964-99-4 Coat coverslips 1 day before use 
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
DNase Sigma-Aldrich D5025
Soybean trypsin inhibitor  Sigma-Aldrich T6414
Mouse anti-ED1 antibody  Abcam ab31630

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References

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