Undersøgelse af Synaptic Tagging / Capture og Cross-capture hjælp Akut hippocampusskiver fra Gnavere

Neuroscience
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Shetty, M. S., Sharma, M., Hui, N. S., Dasgupta, A., Gopinadhan, S., Sajikumar, S. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J. Vis. Exp. (103), e53008, doi:10.3791/53008 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) for National University of Singapore.

1. Fremstilling af kunstig cerebrospinalvæske (ACSF)

  1. Forbered ACSF bestående af (i mM) 124 NaCl, 3,7 KCI, 1,0 MgSO4 .7H 2 O, 2,5 CaCl2 .2H 2 O, 1,2 KH 2 PO 4, 24,6 NaHCO3 og 10 D-glucose. Sikre pH af ACSF er mellem 7,2-7,4, når boblet til mætning med 95% O2 og 5% CO 2-blanding (carbogen). 21. Brug denne ACSF for både dissektion forberedelse skive og til perfusion i de elektrofysiologiske optagelser.
    BEMÆRK: Brug rent apparater til måling og holde ACSF. Brug af urene apparat kan føre til uklare opløsninger eller dannelse af bundfald. Brug demineraliseret vand til alle forberedelserne.
  2. Forbered en 2 L 10x ACSF lager eksklusive NaHCO3 MgSO4 .7H 2 0 (4,92 g), CaCl2 .2H 2 0 (7,56 g), KH 2 PO 4 (3,28 g) og gå op til et volumen på 2 L. omrøres kontinuerligt i mindst 30 minutter under anvendelse af en magnetisk omrører for at sikre, at alle reagenser opløses. Opbevar bestanden i 4 ° C og brug inden for 2 uger.
  3. Forud for dissektion og eksperimenter, fortyndes ACSF materiel i en målekolbe sammen med tilsætning af de nødvendige mængder af NaHCO3 og D-glucose. For 1 L løsning, fortyndes 100 ml af bestanden til 1 l efter tilsætning 2,07 g NaHCO3 og 1,802 g D-glucose. Det ACSF bør være en klar opløsning fri for bundfald eller uopløste partikler.
  4. Cool omkring 200-300 ml ACSF på is, der skal anvendes under dissektion. Sørg for, at ACSF bruges til dissektion er mellem 2-4 ° C. Bruge den resterende ACSF for electrophysiological forsøg. Boble alle ACSF løsninger til mætning med carbogen (5% CO2, 95% O2) kontinuerligt. Mens venter på ACSF at køle, forberede dissektion området og skive kammer.

2. Fremstilling af grænsefladekammer

BEMÆRK: Et interface hjernen skive kammer, der anvendes til inkubation af skiverne og opretholde dem under elektrofysiologiske optagelser (figur 2B), består af to kamre. Det nedre kammer indeholder destilleret vand, der holdes ved 32 ° C ved en temperaturregulator og kontinuerligt gennemboblet med carbogen.

  1. Tænd temperaturregulatoren og forudindstillet det ved 32 ° C. Vask det øverste kammer i 10 til 15 min ved at køre destilleret vand gennem tilstrømningen slange. Sørg for, at det øverste kammer er ren, før du placerer nettet. Kontroller at vandstanden i bundkammeret er omkring 70% fyldt med destilleret vand.
  2. Placernet i det øvre kammer for at tilvejebringe en hvileflade for skiver (figur 2C). Juster udstrømningen slangen for at sikre, at opløsningen niveau er tilstrækkeligt befugtning hele området af nettet. Placer låget over nettet for at opretholde en fugtig carbogen atmosfære i det øverste kammer.
  3. Hastigheden til 1 ml / min. Oprethold denne strømningshastighed gennem udsnittet inkubationsperiode og forsøget. Start carbogenating frisklavet 1x ACSF og fordybe indstrømningen slangen ind i ACSF. Tillad 20 min til ACSF at være mættet med carbogen og for det øvre kammer til at blive fyldt med det.

3. Fremstilling af akut hippocampusskiver

BEMÆRK: dissektion protokol består af (1) Fjernelse af hjernen fra dyret i koldt ACSF og (2) Isolering og udskæring af hippocampus. For at neuroner forblive levedygtige, isolere og anbringe hjernen i koldt ACSF hurtigt og fuldføre heleprocessen, herunder udskæring indenfor 3-5 min.

  1. Fjernelse af hjernen i koldt ACSF
    1. Lægge ud dissektion værktøjer på den måde, der er vist i figur 1A. Arranger de værktøjer i den rækkefølge brug at lette dissektion proces. Før du starter, skal du sikre alle dissektion værktøjer er klar.
    2. Monter et barberblad, renses med ethylacetat, absolut ethanol og destilleret vand, på den manuelle vævshakker (figur 1B), fastgør den fast og sikre, at den skærende kant er jævnt justeret. Test hakke et stykke filterpapir for at sikre, at bladet sidder godt fast. Indstil glidende Vernier mikrometer til sin udgangsstilling.
    3. Aflive dyret ved hjælp af kuldioxid (CO2) i en induktion kammer og halshugge med bandage saks eller Guillotine. Brug en iris saks, fjerne hud og pels over kraniet. Lave et snit gennem den bageste for at fjerne brainstem.Make et lille snit langs the højre side af kraniet og en længere snit til venstre.
      ADVARSEL! Kun lave et lille snit på den side, der anvendes til forsøgene for at undgå at beskadige det. Når du sætter saksen, så sørg for at den kraft, er opad for at undgå skader på hjernen.
    4. Fjern forsigtigt kraniet med en knogle rongeur startende fra venstre til højre side af kraniet til at afsløre cortex. Et tyndt lag af dura kan også ses. Fjern forsigtigt de frontale plader med rongeur. Fjerne det meste af dura sammen med de forreste plader.
      ADVARSEL! Pas på, at dura ikke skære gennem hjernevæv.
    5. Fjern de resterende dura, hvis nogen, specielt i overgangen mellem cortex og cerebellum med den flade ende af en spatel. For trin 3.1.5 og 3.1.6, opretholde presset opad dvs væk fra hjernen at undgå at beskadige det. Ved hjælp af spatel, forsigtigt scoop hjernen i en petriskål fyldt med koldt og carbogenated ACSF (2-4 ° C), placed på en aluminium køleblok.
  2. Isolering af hippocampus
    1. Ved hjælp af en skalpel et lige snit til fjernelse af cerebellum og en anden cut at fjerne den forreste del af hjernen (ca. en fjerdedel). Lav en lavvandet snit langs midterlinjen.
    2. Fjern forsigtigt cortex med en segl scaler, startende fra midterlinjen til at afsløre den dorsale hippocampus. Fjern laget af cortex over hippocampus. Brug fingrene eller vinklede pincet til at støtte hjernen. Lav et lille snit til hippocampus kommissur. Fjern forsigtigt hippocampus med segl scaler startende fra dorsale hippocampus hjælp rullende bevægelser.
      ADVARSEL! Være blid at undgå at strække og rive hippocampus.
    3. Fjern eventuelle cortex og bindevæv omkring den isolerede hippocampus med segl scaler.
  3. Skiveskæring hippocampale væv og overførsel af skiver på grænsefladekammer
    1. Læg et stykke ACSF-gennemblødt filtrerpapir (Grad 1, 30 mm) på udskæring fase af den manuelle pålægsmaskine. Skovl og placere hippocampus væv på filtrerpapiret. Flyt filtrerpapiret at tilpasse hippocampus ved en korrekt orientering i forhold til bladet af slicer så hippocampus skæres i en vinkel på ca. 70 ° til fimbria.
    2. Dup overskydende opløsning omkring hippocampus væv med et foldet filtrerpapir (Grade 1, 85 mm), der forlader hippocampus let fugtig. Start skæring hippocampus tværs. Skive og kassér væv fra den yderste ende af hippocampus, hvor udsnittet morfologi er ikke klart.
    3. Skær resterende væv i 400 um tykke skiver. Saml hippocampus skiver forsigtigt fra bladet med en børste med bløde børster hjælp blide aflæse bevægelser og placere skiverne i en lille bæger fyldt med koldt carbogenated ACSF. Udføre trinene 3.3.1-3.3.3 så hurtigt som muligt, da den hippocampale væv udsættes for luft.
      BEMÆRK: Generelt to tredjedele af hippocampus er skåret, og 4-6 skiver med klar morfologi kan tilberedes.
    4. Overfør skiverne forsigtigt på nettet i skive kammer med en ren plastik Pasteur-pipette med en bred spids (lavet ved at skære væk 2-3 cm af spidsen). Justere omhyggeligt positionen af ​​skiverne på nettet ved hjælp af en lille sprøjte med en bøjet spids. Placer skiverne på en måde, der letter elektrode placering og optagelse. Kontroller, at skiverne er tilstrækkeligt omgivet af ACSF men er ikke neddykkede eller flydende (Figur 2C-D). Dæk kammeret og inkuber skiver i 2-3 timer.
      BEMÆRK: pyramideformet cellelag i de sunde skiver bør vise nogle gennemsigtighed.

4. Registrering af CA3-CA1 Synaptiske Responses

BEMÆRK: elektrofysiologi set-up anvendes til Feltspænding optagelse er vist i figur 2A. En Faradag bur er stærkt anbefales, hvis den elektriske forstyrrelser er herre efter korrekt jordforbindelse af de elektriske indstillinger. Mange forskellige typer af neddykkede og interface-kamre er kommercielt tilgængelige. Dog er interface-kamre foretrukket som skiver udviser mere robuste synaptiske reaktioner i dem.

  1. Placering af elektroder
    1. Tænd for elektriske apparater (stimulatorer og forstærkere), der skal anvendes. Mount og sikre stimulerende og registrering elektroder i plexiglas indehaverne af mikromanipulatorer.
      BEMÆRK: Vi bruger monopolære, lak-belagte, rustfrit stål elektroder af 5 MQ modstand til både stimulerende og optagelse formål.
    2. Før brug, skal du indsætte disse elektroder inde i trukket glas kapillærer og sikkert med epoxy lim udsætte kun lille del af elektroden spids (Figur 2E). Det giver styrke til de ellers slanke elektroder og er med til at sikre dem fast i electrode indehavere.
    3. Styret under mikroskop placere stimulerende elektrode (r) i stratum radiatum af CA1-området til at stimulere Schaffer kollaterale de fibre og registreringselektroden i apikale dendritiske region CA1 at optage field-EPSP (fEPSP) responser.
      BEMÆRK: Nærmer væskeoverfladen ovenfor udsnittet med elektroderne giver en lyd, der hjælper med at lokalisere hurtigt overfladen af ​​udsnittet (forudsat, er forstærkeren tilsluttet en højttaler).
    4. I synaptiske tagging og capture eksperimenter, i overensstemmelse med behovet for eksperimentet position to eller tre stimulerende elektroder (S1, S2 eller S3) på hver side af registreringselektroden at stimulere to eller flere uafhængige, men overlappende indgange. Placer stimulerende og optagelse elektroder omkring 200 um fra hinanden.
    5. Hvis det er nødvendigt, at finde en anden elektrode i stratum pyramidale lag til optagelse population spike (figur 3A) .Når bådeelektroder har rørt skive, ved hjælp af erhvervelse software, giver en test stimulation til at sikre en korrekt fEPSP signal.
      BEMÆRK: Vi anvender bifasisk, konstant-aktuelle pulser (impuls varighed 0,1 ms / halv-bølge) for test stimulering.
    6. Når en ordentlig fEPSP signal opnås, sænk forsigtigt elektroderne omkring 200 um dyb hjælp Flot spil knopper af manipulatorer. Tillad 20 min til skiverne til at komme sig. Test sti uafhængighed med en parret-puls lettelse protokol 27,28.
  2. Input-output relation
    1. Bestem input-output-forhold (afferent stimulation vs fEPSP hældning) for hver indgang ved at måle hældningen værdi på en afstand af strømstyrker. Udfør denne mellem 20 uA til 100 uA. Derefter indstille stimulering intensitet for hver indgang for at opnå 40% af den maksimale fEPSP hældning. Hold denne konstant under hele forsøget.
    2. Efter 15-20 min, starte optagelsen grundlinjen. Overvåg fEPSP hældning nøje i denne periode og nulstille stimulus intensitet, hvis hældningen svinger mere end 10% fra den indstillede værdi, og starte en ny baseline. Optag mindst 30 min eller 1 time stabil basislinje, før du fortsætter.
      BEMÆRK: testen eller baseline stimulation, bruger vi fire fejer på 0,2 Hz bifasisk konstante strømpulser (0,1 msek pr polaritet) givet hver 5 min. En gennemsnitlig hældning på disse fire svar derpå betragtes som en gentagelse. Signalerne filtreres og forstærkes af en differentialforstærker, digitaliseres ved hjælp af en analog-til-digital konverter og overvåges online med specialfremstillet software.
  3. Induktion af LTP / LTD hjælp stimuleringsprotokoller
    BEMÆRK: Både LTP og LTD er blevet klassificeret som tidlig og sen-LTP / LTD baseret på kravene i proteinsyntese; sidstnævnte kræver oversættelse og / eller transskription for sin sene vedligeholdelse [til gennemsyn se 4]. En række elektrisk stimulering paradigmer kan specifically inducerer de forskellige former for LTP og LTD.
    1. WTET: 100 Hz, 21 tofasede konstante strømpulser (0,2 ms per fase).
    2. STET: Tre byger af 100 pulser for et sekund (100 Hz) hver 10 min (Pulse bredde 0,2 msek per fase).
    3. 900 byger over en 15 min varighed. 1 burst består af 3 pulser (0,2 msek bredde) med en interpulse interval på 50 ms (20 Hz). Den inter burst intervallet er 1 sek (samlet antal pulser 2.700).

5. Rensning af Slice Afdeling og perfusionssystem

  1. Efter optagelsen er overstået, indsamle de hippocampale skiver til yderligere biokemiske analyser ellers kassere korrekt. Sluk for carbogen udbud og temperatur controller. Vask carbogen bobler i destilleret vand.
  2. Rengør nettet grundigt med en børste og destilleret vand. Vask riggen for 15-20 min med destilleret vand ved en højere strømningshastighed. En gang i 3-4 dage, ændre destilleret vand inedre kammer af kammeret og også rent kammeret regelmæssigt med 3% hydrogenperoxidopløsning for at undgå svampevækst.

Representative Results

Den beskrevne metode er blevet anvendt til at undersøge langvarige former af LTP / LTD og dens associative interaktioner, såsom synaptiske tagging og på tværs af opsamling fra akutte hippocampus skiver af voksne rotter. 23 Denne teknik har vist sig effektiv til forsøg med både rotter (Wistar) og en række musestammer 30,31. Metodikken er blevet anvendt med succes til stabile LTP optagelser af op til 8-12 timer. 32

Den 'tag' sæt af den svage tetanization af en indgang (S1) indfanger "Prps 'induceret af den stærke tetanization af et andet uafhængigt, men overlappende input (S2, figur 3B, udfyldte cirkler) og derved omdanne den ellers rådnende form af LTP (tidlig -LTP) i S1 i en langvarig on (figur 3B, åbne cirkler) (Til sammenligning af tidlig-LTP induceret af WTET se 20,33). De Prps taget til fange af den svagetetanization sæt tag behøver ikke nødvendigvis at komme fra STET-induceret sen-LTP, men kan også leveres af SLFS-induceret sen-LTD. Denne type af positive associativ vekselvirkning mellem LTP og LTD er benævnt »cross-tagging / capture". Den WTET-induceret tidlig LTP i S1 bliver forstærket til sent-LTP (figur 3C, åbne cirkler) ved at opfange de Prps leveres af SLFS-induceret sen-LTD i S2 (figur 3C, fyldt cirkler). Statistisk signifikant potentiering eller depression blev opretholdt i S1 og S2 i begge tilfælde i forhold til sin egen baseline (Wilcoxon test P <0,05).

For tag-PRP interaktion forekommer, er den tidsmæssige rækkefølge af de to begivenheder (svag-før-strong / strong-før-svag) er ikke afgørende, så længe tidsvinduet mellem de to begivenheder forbliver inden for intervallet 30-60 minutter. Det ville være klogt at inkludere en tredje, uafhængige, men overlappende synaptisk isætte og bruge det som en baseline-kontrol for at overvåge stabiliteten af ​​optagelser. De elektriske stimulering protokoller, der anvendes til at fremkalde efterløns- og sene former af LTP / LTD skal valideres i single-input eksperimenter for konsistens og pålidelighed, før du bruger dem i STC eksperimenter. Vi vil også gerne understrege vigtigheden af ​​skive forberedelse metode beskrevet i protokollen, da succesen af ​​disse eksperimenter er stærkt afhængig af kvaliteten af ​​skiverne.

Figur 1
Figur 1. (A) Værktøjer, der anvendes i dissektion af hippocampus: (a) Bandage Scissors (b) Iris saks (c) Bone rongeur (d) Tynd spatel, (e) Skalpel nummer 11 (f) Sickle scaler (g) Soft -bristle malerpensel (h) Plastic Pasteur-pipette (i) filtrerpapir (85mm) (j) filtrerpapir (30mm) (k) Bægerglas (l) Aluminium køling blokke til at passe petriskål og bægre(m) petriskål. (B) Manuel vævshakker. (a) Platform (b) Skæring arm med blad-holder (c) Vernier mikrometer, opløsning 10 mikrometer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Elektrofysiologi set-up for field-potentiale optagelser bestående af (a) stimulatorer (b) en differentialforstærker (c) en analog-til-digital-konverter (d) oscilloskop (e) computer med erhvervelse software (f) Vibrations- resistent bordplade (g) mikroskop med> 4x forstørrelse (h) grænseflade hjerne-slice kammer (i) en perfusion system til ACSF og carbogen levering (j) temperaturregulator (k) en belysningskilde (l) manipulatorer med elektrodeholdere. (B) Grænseflade hjerne-slicekammer. (C) & (D) Hippocampale skiver i grænsefladen kammeret. (E) Rustfrit stål elektrode forseglet i et glas kapillar. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. (A) Skematisk repræsentation af en tværgående hippocampalt snit og elektroden placering for området potentiale optagelse: I denne repræsentation er to stimulerende elektroder (S1 og S2) er anbragt i stratum radiatum af CA1-området for at stimulere to uafhængige, men overlappende synaptiske input onto CA1 pyramidale neuroner. To ekstracellulære optageelektroder, en til at optage felt-EPSP (excitatorisk postsynaptisk potentiale) fra den apikale dendritiske rum og en anden for at optage somatisk population spike fra pyramideformede cellerorganer, er placeret i stratum radiatum og stratum pyramidale henholdsvis. CA1- Cornu ammonis region 1, CA3- Cornu ammonis region 3, DG-tandede gyrus, SC- Schäffer sikkerhedsstillelse fibre, S1- stimulerende elektrode 1, S2-stimulerende elektrode 2. (B) Svag før stærk paradigme for at studere STC: Svag tetanization (WTET) påføres S1 (åbne cirkler) til at inducere tidlig LTP efterfulgt af en stærk tetanization (STET), i S2 (udfyldte cirkler) på 30 minutter for at inducere sent-LTP. Den tidlige-LTP i S1 bliver forstærket til sent-LTP viser tagging og fange interaktion (n = 6) (C) Svag før stærk paradigme for at studere på tværs af tagging:. Tidlig-LTP er induceret af WTET i S1 (åbne cirkler) efterfulgt ved induktion af sene LTD i S2 (udfyldte cirkler) ved hjælp af SLFS efter 30 min. I S1 er den tidlige LTP forvandlet til sent-LTP varig 6 timer viser cross-tagging og capture (n = 6). Enkelt pil repræsenterer svag tetanization ansøgt om at fremkalde tidlig LTP. Triplet af pile repræsentererstærke tetanization til induktion sent-LTP. Den brudte pil repræsenterer tidspunkt hvor SLFS blev anvendt på repræsentative synaptiske input til at inducere sene LTD. Fejl søjler indikerer SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Akut hippocampale udsnit er en fremragende model til undersøgelse af LTP og andre funktionelle plasticitetsegenskaber processer såsom STC og cross-capture. Det bevarer en stor del af det laminare strukturelle netværk af hippocampus kredsløb, giver præcise Elektrodeplaceringerne og tilbyder ved siden af, en åben platform til hurtig neurofarmakologiske manipulation uden blod-hjerne-barrieren.

Denne artikel beskriver den metode for udarbejdelse af levedygtige akutte hippocampusskiver fra unge voksne rotter og bruge dem til at undersøge STC og cross-tagging. Tidligere forskning har understreget, at køn og alder af de dyr, er vigtige faktorer at overveje til brug i elektrofysiologi undersøgelser. 27,28 Derfor unge voksne dyr med fuldt udtrykt voksne receptor funktioner (Wistar hanrotter i alderen 5-7 uger) anvendes. 23 Asymmetries i forbindelserne mellem venstre og højre hippocampus er blevet bemærket i gnavere 29 ogDer er rapporteret om store forskelle i NMDA-receptor-ekspression samt 34. Vi har anvendt den rigtige hippocampus for at være i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser LTP. 23,32 imidlertid en af hippocampusen kan anvendes, så længe sammenhæng opretholdes.

Som i enhver protokol, er det meget vigtigt at udføre isolering og udskæring procedurer hurtigt, men pas på, at vævet ikke er strakt, beskadiget, gjort tør eller hypoksisk. Variationerne i pH, temperatur og ioniske sammensætning af løsninger kan have dybtgående virkning på levedygtigheden af ​​skiverne og resultaterne. Derfor bør undgås sådanne variationer. Det er blevet observeret, at glutamat receptor-afhængig frigivelse calcium forekommer under fremstillingstrinnene irreversibelt kan påvirke proteinsyntese i nervevæv 35,36, 37. Brug af manuel væv skæremaskiner kan bidrage til at minimere dette ved at tillade, at processen kan gennemføres meget hurtigt sammenlignet med VIbraslicers. Men mange laboratorier også effektivt at bruge vibraslicers med de nødvendige forholdsregler for at bevare skive levedygtighed. En anden vigtig faktor at overveje, er den lange inkubationstid, før du starter forsøgene. Det er blevet bemærket at være virkelig afgørende at opnå stabilitet i metaboliske statslige og kinaseaktivering niveauer i skiver efter forstyrrelse forårsaget under forberedelse 23. Sådan stabilitet er nødvendig for konsistens i de lange optagelser. Vi igen understrege på denne iagttagelse og foreslå den lange inkubation timer på omkring 3 timer.

En række stimuleringsparametre vides at inducere LTP, men de molekylære mekanismer fremkaldt i hvert fald ikke være den samme (for oversigt se 38). Dette kan påvirke holdbarheden og andre egenskaber ved LTP, som til gengæld kan påvirke resultaterne af synaptiske tagging og capture eksperimenter. Derfor er det vigtigt at validere stimulation paradigmer og karakteristikaaf den fremkaldte LTP under betingelserne for den udøvende laboratoriet og vedligeholde konsistens.

Vi generelt anser ikke eksperimenter med meget store præsynaptiske fiber flugtninger og med maksimal fEPSPs mindre end 0,5 mV og forsøg med væsentlige ændringer i fiberen volley under optagelserne også afvises. Endvidere, mens de udfører to-pathway eller tre-pathway eksperimenter, er det vigtigt at sikre pathway uafhængighed. Dette kan udføres med en parret-puls lettelse protokol 28.

En ulempe af grænsefladen registreringssystemer er dannelsen af ​​kondens dråber på elektroderne i de lange optagelse timer på grund af den temperatur og luftfugtighed forskelle mellem kammeret og omgivelserne. Disse dråber skal nøje blottet fra tid til anden. Ellers kan dråberne dryppe ned på skiver og forårsage forstyrrelser eller endda tab af signaler. Vi plejer tackle dette by dygtigt blotting dråberne styret under mikroskop under anvendelse af en slank filtrerpapir væge, uden at røre elektroderne. Imidlertid ville den bedste løsning være at bruge en centraliseret varmesystem, såsom ETC system udviklet af University of Edinburgh forskere.

På en afsluttende bemærkning, en række metoder eksisterer i de laboratorier over hele verden, der anvendes til fremstilling af hippocampusskiver til forskellige eksperimentelle formål. Hver af proceduren giver nogle fordele i forhold til den anden. Man skal omhyggeligt optimere minut detaljer af protokollen, der passer til formålet med forsøget. Vi håber, at denne artikel hjælper med at forbedre nogle aspekter af metoden til at studere sent associative processer såsom STC og cross-capture.

Disclosures

Åben adgang til denne video artikel er sponsoreret af Cerebos Pacific Limited.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I. Dissection Tools
1. Bandage scissors KLS Martin, Germany 21-195-23-07
B-Braun/Aesculap, Germany LX553R
2. Iris scissors B-Braun/Aesculap, Germany BC140R,
BC100R
3. Bone rongeur World Precision Instruments (WPI), Germany 14089-G
4. Scalpel World Precision Instruments (WPI), Germany; 500236-G
B-Braun/Aesculap, Germany
BB73
5. Scalpel blade#11 B-Braun/Aesculap, Germany BB511
6. Sickle scaler KLS Martin, Germany 38-685-00
7. Angled forceps B-Braun/Aesculap, Germany BD321R
8. Anesthetizing/Induction chamber MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon AS-01-0530-LG
II. ACSF component chemicals
1. Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
2. Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20) Sigma-Aldrich M1880
4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) Sigma-Aldrich C3881
5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
6. Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6) Sigma-Aldrich G7021
III. Electrophysiology Instruments
1. Microscope Olympus, Japan Model SZ61
2. Temperature Controller Scientific Systems Design Inc. Canada PTC03
3. Differential AC Amplifier AM Systems, USA Model 1700
4. Isolated Pulse Stimulator AM Systems, USA Model 2100
5. Oscilloscope Rhode & Schwarz HM0722
6. Digital-Analog Converter Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK CED-Power 1401-3
7. Interface Brain Slice Chamber Scientific Systems Design Inc. Canada BSC01
8. Tubing Pump Ismatec, Idex Health & Science, Germany REGLO-Analog
9. Carbogen Flowmeter Cole-Parmer 03220-44
10. Fiber Light Illuminator Dolan-Jenner Industries Fiber Lite MI-150
11. Micromanipulators Marzhauser Wetzlar, Germany 00-42-101-0000 (MM-33)
00-42-102-0000 (MM-32)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
  2. Siegelbaum, S. A., Kandel, E. R. Learning-related synaptic plasticity: LTP and LTD. Current Opinion in Neurobiology. 1, 113-120 (1991).
  3. Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual review of neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  4. Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: An Embarrassment of Riches. Neuron. 44, 5-21 (2004).
  5. Krug, M., Lossner, B., Ott, T. Anisomycin blocks the late phase of long-term potentiation in the dentate gyrus of freely moving rats. Brain research bulletin. 13, 39-42 (1984).
  6. Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin blocks an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain research. 452, 57-65 (1988).
  7. Otani, S., Marshall, C. J., Tate, W. P., Goddard, G. V., Abraham, W. C. Maintenance of long-term potentiation in rat dentate gyrus requires protein synthesis but not messenger RNA synthesis immediately post-tetanization. Neuroscience. 28, 519-526 (1989).
  8. Frey, U., Frey, S., Schollmeier, F., Krug, M. Influence of actinomycin D, a RNA synthesis inhibitor, on long-term potentiation in rat hippocampal neurons in vivo and in vitro. The Journal of physiology. 490, (3), 703-711 (1996).
  9. Nguyen, P. V., Kandel, E. R. A macromolecular synthesis-dependent late phase of long-term potentiation requiring cAMP in the medial perforant pathway of rat hippocampal slices). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 3189-3198 (1996).
  10. Manahan-Vaughan, D., Kulla, A., Frey, J. U. Requirement of translation but not transcription for the maintenance of long-term depression in the CA1 region of freely moving rats. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 8572-8576 (2000).
  11. Frey, U., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385, 533-536 (1997).
  12. Frey, U., Morris, R. G. Weak before strong: dissociating synaptic tagging and plasticity-factor accounts of late-LTP. Neuropharmacology. 37, 545-552 (1998).
  13. Redondo, R. L., Morris, R. G. Making memories last: the synaptic tagging and capture hypothesis. Nature reviews. Neuroscience. 12, 17-30 (2011).
  14. Martin, K. C., Kosik, K. S. Synaptic tagging -- who's it? Nature reviews. Neuroscience. 3, 813-820 (2002).
  15. Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging: implications for late maintenance of hippocampal long-term potentiation. Trends in neurosciences. 21, 181-188 (1998).
  16. Martin, K. C. Synaptic tagging during synapse-specific long-term facilitation of Aplysia sensory-motor neurons. Neurobiology of learning and memory. 78, 489-497 (2002).
  17. Shires, K. L., Da Silva, B. M., Hawthorne, J. P., Morris, R. G., Martin, S. J. Synaptic tagging and capture in the living rat. Nature communications. 3, (2012).
  18. Ramachandran, B., Frey, J. U. Interfering with the actin network and its effect on long-term potentiation and synaptic tagging in hippocampal CA1 neurons in slices in vitro. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12167-12173 (2009).
  19. Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Identification of compartment- and process-specific molecules required for 'synaptic tagging' during long-term potentiation and long-term depression in hippocampal CA1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 5068-5080 (2007).
  20. Sajikumar, S., Navakkode, S., Sacktor, T. C., Frey, J. U. Synaptic tagging and cross-tagging: the role of protein kinase Mzeta in maintaining long-term potentiation but not long-term depression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 5750-5756 (2005).
  21. Redondo, R. L., et al. Synaptic Tagging and Capture: Differential Role of Distinct Calcium/Calmodulin Kinases in Protein Synthesis-Dependent Long-Term Potentiation. The Journal of Neuroscience. 30, 4981-4989 (2010).
  22. Sajikumar, S., Frey, J. U. Late-associativity, synaptic tagging, and the role of dopamine during LTP and LTD. Neurobiology of learning and memory. 82, 12-25 (2004).
  23. Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Current Opinion in Neurobiology. 15, 607-613 (2005).
  24. Villers, A., Ris, L. Improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation. Journal of visualized experiments : JoVE. (2013).
  25. Pohle, W., Reymann, K., Jork, R., Malisch, R. The influence of experimental conditions on the morphological preservation of hippocampal slices in vitro. Biomedica biochimica acta. 45, 1145-1152 (1985).
  26. Reymann, K. G., et al. The duration of long-term potentiation in the CA1 region of the hippocampal slice preparation. Brain research bulletin. 15, 249-255 (1985).
  27. Sajikumar, S., Korte, M. Different compartments of apical CA1 dendrites have different plasticity thresholds for expressing synaptic tagging and capture. Learning & Memory. 18, 327-331 (2011).
  28. Li, Q., et al. Making Synapses Strong: Metaplasticity Prolongs Associativity of Long-Term Memory by Switching Synaptic Tag Mechanisms. Cerebral Cortex. 24, 353-363 (2014).
  29. Sajikumar, S., Frey, J. U. Anisomycin inhibits the late maintenance of long-term depression in rat hippocampal slices in vitro. Neuroscience Letters. 338, 147-150 (2003).
  30. Ishikawa, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. Diversity of neuropsin (KLK8)-dependent synaptic associativity in the hippocampal pyramidal neuron. The Journal of physiology. 589, 3559-3573 (2011).
  31. Ishikawa, Y., Horii, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. Neuropsin (KLK8)-dependent and -independent synaptic tagging in the Schaffer-collateral pathway of mouse hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 843-849 (2008).
  32. Sajikumar, S., Morris, R. G. M., Korte, M. Competition between recently potentiated synaptic inputs reveals a winner-take-all phase of synaptic tagging and capture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 12217-12221 (2014).
  33. Navakkode, S., Sajikumar, S., Frey, J. U. The type IV-specific phosphodiesterase inhibitor rolipram and its effect on hippocampal long-term potentiation and synaptic tagging. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 7740-7744 (2004).
  34. Kohl, M. M., et al. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nature. 14, 1413-1415 (2011).
  35. Frey, U., Huang, Y. Y., Kandel, E. R. Effects of cAMP Simulate a Late Stage of LTP in Hippocampal CA1 Neurons. Science. 260, 1661-1664 (1993).
  36. Erdogdu, G., Uto, A., Hossmann, K. -A. The effect of global ischemia and recirculation of rat brain on protein synthesis in vitro. Metab Brain Dis. 8, 199-206 (1993).
  37. Djuricic, B., Berger, R., Paschen, W. Protein synthesis and energy metabolism in hippocampal slices during extended (24 hours) recovery following different periods of ischemia. Metab Brain Dis. 9, 377-389 (1994).
  38. Park, P., et al. NMDA receptor-dependent long-term potentiation comprises a family of temporally overlapping forms of synaptic plasticity that are induced by different patterns of stimulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369, 20130131 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics