Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme * These authors contributed equally

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Yan, X., Harvey, B. K. Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP. J. Vis. Exp. (103), e53199, doi:10.3791/53199 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Endoplazmik retikulum (ER) konsantrasyonu yaklaşık sitoplazmik kıyasla daha fazla 5000 misli, hücre içi kalsiyum üst düzeyde bulunmaktadır. ER kalsiyum üzerinde sıkı kontrol protein katlanması, modifikasyonu ve insan ticareti için zorunludur. ER kalsiyum düzensizlikler katlanmamış protein karşılığının bir üç uçlu ER stres tepkisi mekanizmasının aktivasyonu ile sonuçlanan ve hastalıkların çok çeşitli patogenezine katkıda bulunabilir. Hastalık başlangıcı ve ilerlemesi sırasında ER kalsiyum değişiklikleri izleme yeteneği pratikte prensipte önemli, ama zor olduğunu. Kalsiyum bağımlı floresan boyalar ve proteinler gibi izleme ER kalsiyum yönelik güncel yöntemler arasında, ancak bu araçlar, in vivo çalışmalar için uygun değildir, hücrelerde ER kalsiyum dinamiklerinin kazanmasını sağlamıştır. Bizim laboratuvar Gaussia lusiferaz karboksi-terminalinde bir modifikasyon yanıt olarak raportör salgılanmasını sağladığını göstermiştirER kalsiyum tükenmesi. In vitro ve in vivo uygulamaları bir lusiferaz göre, salgılanan ER kalsiyum izleme proteini (SERCaMP) kullanmak için yöntemler burada tarif edilmiştir. Bu video ER kalsiyum boyuna izlenmesi için karaciğer enjeksiyonları, glukozit-SERCaMP, kan toplama ve işleme farmakolojik manipülasyon ve tahlil parametrelerini vurgulamaktadır.

Introduction

Endoplazmik retikulum (ER) 1 sinyalizasyon protein katlanması, protein salgılanması, lipid homeostazı ve intraselüler dahil olmak üzere birçok hücresel kapasitelerde çalışır. Normal ER işlevine Merkez ~ 5000 kez luminal kalsiyum konsantrasyonlarını sitoplazma 2-4 bulunanlar sürdürmektedir. Bu enerji yoğun bir süreç Sarko / endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA), ER içine kalsiyum iyonlarını hareket eden bir pompa tarafından düzenlenir. ER kalsiyum bir akış esas olarak riyanodin (RyR) ve inositol trifosfat (IP3R) reseptörleri tarafından aracılık eder. Birçok ER işlemler kalsiyum bağımlı olduğundan, mağaza kesintiye ER stres ve sonuçta hücre ölümüne neden olabilir.

ER, kalsiyum disregülasyon, kardiyomiyopati, diyabet de dahil olmak üzere, Alzheimer hastalıkları gözlenmiştir, ve Parkinson 5. Bu hastalıkların ilerleyen doğası nedeniyle, bir sebep-sonuç yeniden çizmek için zorlu olmuşturER kalsiyum deposunda patogenezi ve değişiklikler arasında lationship. Teknolojilerin bir dizi boyalar ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Geçiş) dahil ER kalsiyum dinamikleri, anlayışımızda önemli gelişmeler için izin vermiş. Ca2 + bağlandığmda floresanstaki artış, düşük afinite kalsiyum boyalar, kalsiyum 6 konsantrasyonu yüksek olan hücre içi bölmelere incelemek için hücrelere yerleştirilebilir. Böyle D1ER ve Catcher olarak geçiş, subsellüler lokalizasyonu 7-9 daha hassas kontrolü ile kalsiyum dalgalanmaların izlenmesi için izin verir. Son zamanlarda, geçiş bölgesinin bir başka sınıfı olarak adlandırılır kalsiyum ölçüm organel tutulmuş protein göstergeleri (CEPIA) 10 tarif edilmiştir. Genetik ve birleştiren üçüncü bir yaklaşım küçük moleküllü kimya hedeflenen esteraz boya yükleme bir ester bazlı kalsiyum boya 11 (ER hedeflenen) genetik olarak kodlanmış karboksilesteraz kullanır (TED).

Afor ikenementioned yaklaşımlar da floresan akut ölçümlerle aracılığıyla ER kalsiyum dinamikleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir, doğal güçlü ve zayıf yönleri vardır. Bununla birlikte, çoğu zaman, hastalığın ilerlemesini araştırmak için gerekli boyuna çalışmalar için uygun değildir. Zaman genişletilmiş süreler boyunca kalsiyum dinamiklerini izlemek için bir yöntem oluşturulması amacıyla, biz tespit ve salgılanan ER kalsiyum izleme proteinleri (SERCaMPs) 12 oluşturmak için bir protein modifikasyonu geliştirdi.

SERCaMP defalarca ER kalsiyum deposu sorgulamak için minimal invaziv bir yaklaşım sağlayarak, diğer yöntemlerle ilişkili çeşitli sınırlamalar circumvents. Daha önce karboksi-terminal peptit ASARTDL (alanin-serin-alanin-arginin-treonin-aspartik asit-leucine) ER-retensiyon teşvik etmek için yeterli olduğunu göstermiştir; Bununla birlikte, ER kalsiyum düşüşler neden olan koşullar altında, peptid dizisi, artık ER localizatio muhafaza edebilmektedirn ve protein 13 salgılanır. SERCaMP teknoloji temelinde bir salgılanmış proteininin karboksi-terminalinde salgılanması dolayısıyla ER kalsiyum disregülasyonun 12 sağlam bir raportör oluşturma ER kalsiyum azalması ile tetiklenir, bu durumda (örneğin, lusiferaz Gaussia veya glukozit) için ASARTDL bir ek alım düzenidir. Transgenik yöntemlerle glukozit-SERCaMP ekspresyonu ER Kalsiyum homeostazında bir göstergesi olarak glukozit aktivitesindeki değişikliklerin analiz edilmesi için hücre kültür aracı ve plazma da dahil olmak üzere, biyolojik sıvıları sağlar. Yöntem, in vitro ve in vivo olarak ER kalsiyum deposunda progresif değişiklikler uzunlamasına çalışma için uygulamalar vardır. Aşağıdaki protokol ER kalsiyum homeostazını incelemek için glukozit merkezli SERCaMP kullanmak için genel bir taslak olarak yazılır, ama protokol alternatif raportör SERCaMPs için bir rehber olarak hizmet verebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vitro Tahlili: 1. Bir Kararlı SH-SY5Y Hücre Line algılama SERCaMP Yayın

  1. Levha SH-SY5Y-glukozit-ASARTDL (SERCaMP) doku kültürü içinde yüzey alanının cm2 başına 150.000 hücre plakaları işlemden geçirildi. 96 oyuklu plakalar için, örneğin, 50,000 hücre, oyuk başına (Şekil 1A) tohum. DMEM (yüksek glukoz, GlutaMAX, piruvat) +,% 10 büyükbaş hayvan büyüme serumu + 1 x penisilin / streptomisin SH-SY5Y hücreleri büyütün.
    1. 15 kez (Şekil 1B) kadar Passage hücreleri. Yüksek geçit numarası test edilmemiştir.
    2. % 5.5 CO2 ile 37 ° C 'de nemlendirilmiş inkübatör hücreleri dönün ve gece boyunca inkübe edilir.
  2. Deneysel tedavi (ler) önce, iyi bir opak kültür süpernatant 5 ul aktararak her biri için bir temel numune toplamak 96 plaka duvarlı. Toplama önce, hafifçe her tarafta plaka dokunun ve degrade etkileri önlemek için girdap. Yapışkan bir s ile opak plaka Sealenzimatik analiz zamanına kadar 4 ° C'de ealing tabaka ve saklayın.
    Not: Salgılanmış glukozit-SERCaMP hücre kültür ortamı içinde çok kararlıdır. Daha önce glukozit aktivitesinin yaklaşık% 5-10 (SH-SY5Y hücreleri üzerinde inkübe) 37 ° C'de 12 bir 72 saat inkübe edildikten sonra kaybolur bildirilmiştir.
  3. ER kalsiyum tükenmesi incelemek için arzu edildiği gibi (örneğin çevre, farmakolojik, genetik manipülasyonlar) hücreleri davranın. Hızla atmosferik CO 2 de oluşacak pH değişiklikleri olarak (kontrollü inkübatör dışında) çevre ortama uzun maruz kalmaktan kaçının. Uzun süreli manipülasyonlar gerekli ise, pH değeri 14 stabilize edilmesi için, 20 mM kültür ortamına HEPES ekleyin. Kültür ortamında 15 HEPES kullanırken ışığa maruz kalmaktan kaçının.
    1. Pozitif kontrol: SH-SY5Y hücrelerinde deneyler için 4-6 saat boyunca 100 nM thapsigargin (Tg) ya da 50 uM siklopiazonik asit (CPA) ve hücreleri tedavi edin. Diğer hücre hatlarında maksimal tepkisi uzun inkubasyon ya da farklı yoğunlaştırma gerektirebilirBileşiklerin, yerel yönetim bu.
    2. Negatif kontrol: Ebeveyn SH-SY5Y hücrelerinin topla kültür ortamı. Deneyimlerimize göre, bu deneyde arka plan lüminesans stabil SH-SY5Y-glukozit-SERCaMP hücreleri bazal salgılama az% 0.05.
  4. Adım 1.2'de belirtildiği gibi, istenen zaman noktalarında toplayın ve klimalı ortamın mağaza 5 ul örnekleri.
  5. Bölüm 5'te belirtildiği gibi orta enzimatik aktivitesini değerlendirmek.
  6. Immunoblot veya lüminesans deneyi ile hücre içi glukozit inceleyin.
    1. 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl,% 0.25 sodyum deoksikolat, 1 mM EDTA,% 1 NP40 içeren değiştirilmiş RIPA tamponunda lize hücreleri ve proteaz inhibitörleri: immünoblot için. 0,20 um PVDF membrana SDS-poliakrilamid jeli ve transfer ayrı. (: 2000 seyreltme 1) gece boyunca 4 ° C'de glukozit antikor ile membran inkübe edin. Seçim tespiti ayıraç için kullanıcı tanımlı protokole göre sekonder antikor inkübasyon ve membran yıkar gerçekleştirin.
    2. Nedeniylelüminesans tahlil (Şekil 2): buz üzerinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin:
      1. Bir doku kültürü plakasının gözeneklerine tüm orta çıkarın ve soğuk 200 ul PBS ile yıkayın.
      2. Her bir oyuğa 50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl,% 1 NP40 ihtiva eden liziz tamponu ve proteaz inhibitörlerinin 75 ul ekle.
      3. 20 dakika boyunca 4 ° C'de bir orbital çalkalayıcı (120 rpm) üzerine plaka döndürün.
      4. Yavaşça yukarı ve çok kanallı pipet kullanarak hava kabarcıkları kaçınarak aşağı lizat pipetle. Opak plaka lizat 5 ul aktarın ve Bölüm 5'te belirtildiği gibi lüminesans değerlendirmek.

İn Vitro Tahlili: 2. SERCaMP ölümsüzleştirilmiş Hücreler geçici transfeksiyonu

Not: geçici transfeksiyon prosedürleri hücresel strese neden olabilir ve daha sonraki glukozit-SERCaMP yanıtı künt olduğunu gözlemledik. Aşağıdaki yaklaşım transfeksiyon eff en aza indirmek için geliştirildi SH-SY5Y hücrelerinde ects. Alternatif hücresi soyları (transfeksiyon reaktifi seçimi de dahil olmak üzere), bu prosedürün optimize edilmesi gerekli olabilir. Mümkün olduğunda, bu sırasıyla Bölüm 1 ve 3 de tarif kararlı hücre kuşaklarının ya da viral transdüksiyon yöntemleri kullanmak tavsiye edilir.

  1. 4 x 10 6 hücre, bir 100 mm çanak Levha SH-SY5Y hücreleri. Bu bulaşık transfeksiyon prosedürü izleyerek yaklaşık 300 kuyu (96 oyuklu plaka formatı) tohum yeniden için yeterli olacaktır.
  2. Xfect plazmid DNA 20 ug (kodlayan glukozit-SERCaMP) ile reaktif ve Xfect reaktifi 6 ul Transfect hücreleri. Büyük veya daha küçük kültür hazneleri göre ölçekli DNA and Xfect reajanı.
  3. 48 saat boyunca inkübatör hücreleri dönün.
  4. Hücreleri tripsinize edin ve oyuk başına 60,000 hücre olacak şekilde 96 oyuklu plakalara reseed. Bölüm 1'de özetlenen sonraki adımları izleyin.

İn Vitro Tahlili: 3. Viral vektör aracılı İfade glukozit-SERCaMP

tert "> Not: Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörü ambalaj 16 ve arıtma için 12 ve lentivirüs üretimi 13, daha önce rapor edilmiştir.

  1. Titer glukozit-SERCaMP AAV aşağıdaki primerler ve problar kullanılarak: ileri primer, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; ters primer, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; Prob (5'-6-FAM / BHQ-3'-1 etiketli) kantitatif PCR için, 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 '.
    1. Glukozit içeren bir plazmid linnerleştirilmesi ve spin-kolon (örn Machery-Nagel NucleoSpin Jel ve PCR temizleme) kullanılarak DNA'nın saflaştırılması ile standart eğri hazırlayın. Kütle merdiven birlikte bir agaroz jeli üzerinde ayırarak DNA nicelleştirmektedir. PBS içinde 10 fg / ml aralığındadır 100 ug / DNA 1:10 dilüe. Plazmidin molekül ağırlığına dayalı olarak her bir konsantrasyonunda, glukozit plazmid DNA'nın kopya / ml hesaplanır.
    2. PBS AAV stokları seyreltin (uygun seyreltme bağlı olacaktırViral hazırlama parametreleri ve) ampirik olarak belirlenir.
    3. 94 ° C 20 sn ×, 95 ° C x 5 dakika ve 41 çevrim için, 60 ° C x 1 dak:, aşağıdaki koşullar kullanılarak, gerçek zamanlı PCR sistemi içinde PCR reaksiyonu. Ml standart eğri kullanılarak / kopya hesaplayın.
  2. Bir p24 Lenti-X, hızlı titre kiti ile titre lentivirüs. Buz üzerinde lentiviral alikotları çözülme ve SH-SY5Y ortamında p24 proteini kontrol sulandırmak.
    1. Standart eğrinin (: 20,000 ya da 1: 100.000 örneğin 1) düşecek şekilde lentivirüs sulandırmak. Gerekli seyreltme faktörü lentiviral hazırlık parametrelere göre değişir ve ampirik olarak tespit edilmelidir. Sonraki tüm adımlar için üreticinin talimatlarına uyun.
  3. 96 gözlü plakalara plakası hücreleri. SH-SY5Y hücreleri için, Bölüm 1'de belirtilen kaplama prosedürleri takip edilebilir. Fare birincil kortikal nöronlarda için, hücreler izole edilir ve uygun bir şekilde kaplanmış plakalar, bir üzerine ekildi olmalıdırs, daha önce tarif edilen 16. 1x B27 ve 500 uM L-glutamin ile takviye edilmiş ortam içinde Neurobasal sıçan birincil kortikal nöronlar koruyun. Her gün yarım orta alışverişi yapın.
  4. Virüs hücreleri nakletmek. Gaussia lusiferaz güçlü bir sinyal sağlar viral transdüksiyon hedefi, düşük düzeyde ekspresyonunu elde etmektir.
    1. AAV transdüksiyon SH-SY5Y hücreleri: kaplama ertesi gün transdüse. AAV seyreltme tamponu (PBS + 0.5mm MgCl2) 6.0 x 10 7 vg / ul AAV sulandırmak. (, Yaklaşık 6000 arasında MOI 3.0 x 10 8 vg) 96 oyuklu bir plaka (Şekil 3A) oyuk başına seyreltilmiş AAV 5 ul ekleyin. Viral vektör atık inaktive% 10 çamaşır suyu kullanın.
    2. Sıçan primer kortikal nöronların AAV transdüksiyon: kaplama sonrası 6-8 gün transduce. AAV seyreltme tamponu 4.0 x 10 6 vg / ul AAV sulandırmak. Seyreltilmiş AAV'nin 5 ul ekleyin (2.0 x 10 7 VG, İçişleri Bakanlığı, yaklaşık 350) oyuk başına96 gözenekli bir plaka (Şekil 3B). Optimal MOI diğer hücre tipleri için ampirik bir şekilde tespit edilmelidir. Viral vektör atık inaktive% 10 çamaşır suyu kullanın.
    3. SH-SY5Y hücrelerinin lentiviral transdüksiyon: kaplama ertesi gün transdüse. Hank dengeli tuz çözeltisi içinde (konsantrasyon titerleme kiti kullanılarak belirlenen) 20 pg / ml için, p24 lentivirüs seyreltin. 100 ul hacimde 96 oyuklu bir plakanın (1.250.000 lentiviral parçacıklara eşdeğerdir p24 100 ug, veya ~ 1250 IFUs) oyuk başına seyreltilmiş virüs 5ul ekleyin. Büyük biçimleri için buna göre ölçeklendirin. Viral atık inaktive% 10 çamaşır suyu kullanın.
  5. Ortamının bir ön-işleme örneği toplamak ve deneysel tedavi 48 saat (SH-SY5Y) ya da transdüksiyon sonra 5-7 gün (sıçan primer kortikal nöronlar) başlar.

Vivo SERCaMP Tahlili 4.

Not: herhangi bir hayvan prosedürleri kurum aracılığıyla uygun onay almak için emin olun gerçekleştirmeden önce. Hepsihayatta kalma ameliyatlar yeterli anestezi ile steril koşullar altında yapılması için vardır. Aşağıda açıklanan tüm prosedürler onaylanmış ve NIH ACUC kurallarına uygundur oylandı.

  1. Otoklav cerrahi aletler cerrahi başlatmak için önce (121 ° C, 30 dakika sterilizasyon, 20 dakika kuruma süresi). Hemen tüm prosedürler ve önceki otoklav aşağıdaki bir ultrasonikatör tüm enstrümanları temizleyin. Sağkalım ameliyat sırasında steril koşullar koruyun. Birden hayvanları gerektiren ameliyatlar için,% 70 alkol, ultrasonicate ve boncuk sıçanlarda arasında sterilize ile cerrahi aletler silin. Gerekli aletleri Malzeme Listesine bakınız.
  2. Ameliyat için, sıçan hazırlayın. Burada Erkek Sprague-Dawley (180-200 g) kullanın.
    1. Ksilazin (8 mg / kg) ve ketamin (/ kg ile 80 mg), intraperitonal enjeksiyonlar izledi 3 dakika boyunca (4-5% Isoflurane 1000 cc / dakika verilir) gaz izofluran kullanılarak sıçan anestezisi. Kurumasını kornealar korumak için oftalmik merhem sürün. Bkuyruk veya ayak tutam aşağıdaki çekme refleksi eksikliği gösterdiği gibi sıçan kez Eğin cerrahi derin anestezi olduğunu.
    2. Biraz orta karın bölgesine kaburga (düşük göğüs bölge) altında karın bölgesini tıraş. Cerrahi parkı% 70 alkol ve Betadinede fırçalayın alternatif üç kez, fırçalayın. Steril cerrahi örtüler ile steril cerrahi alanda yatar pozisyonda sıçan yerleştirin.
  3. 7,6 x 10 9 vg / ml (son konsantrasyon) 'daki AAV-glukozit-SERCaMP seyreltilir. Tersine tüp iyice karıştırın.
    Not: viral konsantrasyon aralığı (Şekil 4) değişebilir.
    1. Pipet steril kap içine seyreltildi AAV 105 ul. Bir şırınga içine virüs toplamak için 30 iğne kullanın.
  4. AAV-glukozit-SERCaMP karaciğer ortaya çıkarmak ve enjekte etmek ameliyat.
    1. Önceki karın bir kesi yapmadan, insizyon alanı% 0.25 bupivakain uygulayın. Bir neşter kullanılarak, göğüs kafesinin altında yatay bir kesi (ap yapmakproximately 2-3 cm). Hipodermis gelen bağ dokusu ayırmak için disseke künt.
    2. Karaciğer sağ lobunu medial açığa karın kası kesti.
      Not: Diğer loblar son uygulamaya göre enjekte edilebilir.
    3. Cerrahi mikroskop altında hayvan koyun ve görüş alanında karaciğer sağ lobunu medial almak için ayarlayın. Medial lob parankimi içine virüs enjekte; 3 ayrı siteler, site başına yaklaşık 33 ul.
      Not: Tüm enjeksiyon hacminin teslim edilmesini sağlamak için enjeksiyonu takiben 5-10 saniye dokuda iğne bırakın.
    4. Ayrı ayrı karın kas ve cilt sütür ve pamuk uçlu aplikatör kullanarak Neosporin ekleyin. Bilinç kazanmış ve sıçan dik pozisyonunu koruyabiliyor kadar bir iyileşme odasında sıçan yerleştirin. Sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar sıçan (ler) gözetimsiz bırakmayın. Ev tek başına kesi iyileşene kadar ve dikişler (7-14 gün) kaldırılmıştır.
  5. 4-7 gün enjeksiyonundan sonra kuyruk kan toplama başlayın. Etiketleme ve ön tartarak kan alma tüpleri hazırlayın. Her tüpe 50 ul heparin (1000 U / ml) eklenir.
  6. (1000 cc / dak teslim% 4-5 İsofluranın) 3 dakika boyunca izofluran anestezi odasına yerleştirin sıçan. (500 cc / dak teslim% 2-3 İsofluranın) burun konisi odasından ve yerden sıçan çıkarın. Kuyruk pi aşağıdaki çekme refleksi eksikliği ile gösterildiği gibi kan toplama sıçan derinden uyuşturulduktan sonra başlayabilirnch.
    1. Steril makas kuyruk (1-2 mm) kesilerek ucu kullanarak ve önceden doldurulmuş heparin tüp içine damla damla kan toplamak. Heparin oranı (> 100 ul kan / 50 ul heparin) 1 kan: hacim 2'den büyük ulaşana kadar kan toplayın. Kan alma hacimleri deneysel tasarım dayalı olarak ayarlanabilir. Kanamayı durdurmak için kuyruk kanamayı durdurucu pudra uygulamak için ıslak pamuk aplikatör kullanın.
    2. 4 ° C'de saklayın kan tüpleri sonraki örneklerin toplanması durumunda. Koleksiyonlar arasında sterilize etanol pedi ve boncuk ile makas silin.
    3. Toplama tüpleri tartılır ve 2 elde heparin ile ayarlayın: 1 oranını (kan: heparin). Bu adım, her bir örnek (Tablo 1) 'de heparin miktarını normale olacaktır.
    4. Santrifüj tüpleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2000 x g'de. Lusiferaz deneyi (bölüm 5) zamanına kadar -80 ° C taze tüp ve saklamak için yüzer (plazma) aktarın.
      Not: 72 saat kadar önce, enzimatik deney için 4 ° C'de numunelerin depolama 'ye sahiptirlüminesans (Şekil 5A) üzerinde inimal etkisi. Plazma numunelerinin 3 kadar donma-çözülme döngüsünden lüminesans üzerinde etki göstermemiştir (Şekil 5B) sahiptir.
  7. Thapsigargin uygulama (pozitif kontrol):
    1. 2.5 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar etanol içinde seyreltilerek thapsigargin hazırlayın. Alt karın içine 1 mg / kg ip thapsigargin enjekte edilir.
      Not: thapsigargin trombine bağlı platelet pıhtılaşmasını 17 artar ve daha zor kuyruk kan alma yapabilir.
  8. Gaussia lusiferaz deneyi:
    1. Buz üzerinde plazma örnekleri çözülme.
      Uzunlamasına çalışmalarda, çözülme için ve (alt tabakanın tek hazırlık kullanarak) aynı gün tüm timepoint örnekleri için ışıldama tahlil gerçekleştirin: Not.
    2. Opak duvarlı plaka transfer plazma 10 ul ve kesit her bir plazma numunesinin 5. Çalışma 3-4 teknik çoğaltır tarif edildiği gibi enzimatik aktivitesini ölçmek.
  9. Euthanasibir
    Not: SERCaMP teknolojinin avantajı monitör ER kalsiyum uzunlamasına yeteneğidir. Deneysel parametreleri ve son nokta analizleri bağlı hayvanlar son nokta analizleri için uygun ve kurumsal ACUC kurallarına uygun önlemler ötenazi edilmelidir.

5. Lüminesans Deneyi

  1. 20 mM (3 ml metanol, 10 N HCI 30 ul) ile asitleştirildi, metanol içinde bir bileşik seyreltilmesiyle coelenterazine (CTZ) stok çözelti hazırlayın. -80 ° C tek kullanımlık alikotları ve mağaza hazırlayın.
  2. Deney gününde çalışan alt-tabakanın hazırlanması.
    1. In vitro değerlendirmeler için, örneğin, PBS içinde 8 uM koelenterazin seyreltik PBS, 25 ml 20 mM CTZ stokunun 10 ul (Şekil 6A, B).
    2. İn vivo deneyler için, PBS içinde 100 uM, 500 mM askorbik asit, 5 mM NaCl koelenterazin seyreltin.
  3. En az 30 dakika süreyle inkübe edin hazırlanan CTZtahlili başlamadan önce oda sıcaklığında karıştırılmıştır.
    Not: hazırlanması sonra ilk 30 dakika boyunca hızlı bir şekilde alt-tabaka çürüme çalışma vardır Bu adım genellikle Gaussia lusiferaz analizleri dahildir. Bizim sistemde (Şekil 6C) bu etkiyi gözlenen değil; Biz tahlil üzerinde hiçbir olumsuz etkisi bulduk gibi ancak, biz sık sık kuluçka aşamasını içerir.
  4. İzleme biyolüminesans edebilen bir alt-tabaka enjektör ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanarak. Substrat ile Başbakan hatları.
    Not: hatları üzerinden, ilk alt-tabaka bozunmaya eğilimli olabilir. Erken örnekleri için yapay olarak düşük okumaları önlemek için deneysel örnekleri ölçümünden önce (okuyucu boş bir levha yüklenmesi) 20-30 boş kuyu enjekte edilir.
  5. , Kuyunun içine substrat 100 ul enjekte 5 saniye boyunca orta hız sallamak ve ışık emisyon ölçümü. Biotek Sinerji II plaka okuyucu için, (0.5 sn boyunca (in vitro örnekleri) ve 5 saniye ışık emisyonu entegreokuma adımı için in vivo örnekleri). İdeal tahlil performansı için plaka okuyucu parametrelerini optimize.
    Not: (diğer lusiferazlarm gözlenen kinetik kızdırma karşılaştırıldığında) hızlı sinyal çürümesi ile Gaussia lusiferaz sergiler flaş kinetiği. Glukozit flaş kinetiği örnekleri arasında, orta bileşimin kontrol edilmesinin önemini vurgular hücre kültür ortamı (Şekil 7A) serum etkilenir. Nedeniyle alt tabaka (flaş kinetik) eklendikten sonra lüminesans hızlı çürüme, enjekte ve tüm örnekler için üniform olmalıdır adımları okumak arasında zaman. Plaka okuyucu (biz 5 sn sallamak adımı kullanmak gibi) ve bu iyi okumak sabit bekleme süresi, bir kuyunun alt tabakayı enjekte ayarlanmalıdır. Alt-tabaka, aynı anda tüm oyuklara ilave edilebilir sürece okumadan önce bütün bir plaka alt-tabakanın eklenmesi önemli bir sorun teşkil etmektedir. Bir enjektör kullanılabilir durumda değilse, sorunu kısmen alt-tabaka addin arasında 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırılarak atlatılabiliryon ve ölçüm (Şekil 7B) (böylece bozulma eğrisinin dik parçası kaçınarak).
  6. , Enjeksiyon Tekrar bekleme süresi ve iyi plaka üzerinde her adımları okuyun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Glukozit-SERCaMP yöntemi dışı sıvılar örnekleyerek ER kalsiyum homeostasisin değerlendirilmesi için izin verir. Birkaç kontrol sonuçların yorumlanmasını geliştirmek için deney tasarımı dahil edilebilir. İlk olarak, (C-terminali ASARTDL veya "glukozit-Resim Tag" olmayan, örneğin glukozit) kurucu salgılanmış habercinin kullanılması salgı yoluna (global hücresel sekresyon) ve transgen ekspresyonu üzerindeki deneysel tedavilerin etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Örneğin, glukozit-SERCaMP ve glukozit-No Etiket hem hücre dışı düzeylerinde artış belirsiz bir sonuç olarak düşünülebilir. Seçenek olarak ise, glukozit-Resim Etiket karşılık karşılık gelen bir eksikliği ile glukozit-SERCaMP salgılanmasında bir artış, bir ER, kalsiyum bağımlı olay (Şekil 8) destekler. Parçalama gerekli olduğu gibi, bu, tek bir zaman noktasında sınırlıdır, ancak ER kalsiyum tükenmesine karşılık olarak glukozit-SERCaMP salgılanması ayrıca, hücre içi glukozit ölçülerek değerlendirilebilir. Int (her bir kuyucuk için hesaplanan) hücre içi oranı (Şekil 2B) artırır: Bu kademeli salgılanan olarak racellular glukozit-SERCaMP, ER, kalsiyum tükenmesine karşılık olarak azalacak ve hücre dışı. Hücre-dışı: hücre içi oranı transgen ekspresyonu değişiklikleri kontrol etmek için yararlıdır.

ER kalsiyum deposu farmakolojik modülatörler yeni paradigmalar SERCaMP sürümü ER kalsiyum katkısını teyit etmek için kullanılabilir. Dantrolen bir RyR antagonisti azaltmak ya da Tg (Şekil 8B) yanıt olarak SERCaMP salınımını inhibe gereken ER kalsiyum, stabilize bilinmektedir. ER Kalsiyum fluksunu (örneğin Xestospongin C, 4-kloro-m-kresol) SERCaMP kullanılarak yeni deneysel paradigmalarda etkileyen ek bileşikleri test etmek için, mümkün olduğunda tavsiye edilir. Bu çalışmalar genellikle in vivo zorlu, ancak doku kültürü modelleri mukabil uygun olabilir.

"> Glukozit-esaslı SERCaMP kullanılarak in vitro çalışmalar için, kontrol (lar) a göre bireysel plakalar yanıt hesaplamak için tavsiye edilir. 'Tedaviye bağlı' yanıtı (kontrole karşı nispi yanıt değişiklikleri takip ederek timecourse üzerinde değerlendirilebilir arası plaka karşılaştırmaları). Bu. timepoints (Şekil 6C) arasında ham değerlerindeki değişikliklerden yol açabilir substratın çürümesi, sayesinde bir plaka içinde göreli karşılaştırmalar yapma, birden fazla plakalar arasındaki ham sayıları karşılaştırmak için tavsiye edilmez, bu etkiyi en aza indirir (Şekil 6D). bir in vitro Tg kaynaklı SERCaMP salma deney için veri analizi bir örneği, Şekil 9'da sunulmuştur.

Glukozit-SERCaMP kullanılarak in vivo çalışmalarda, veri kendi "ön-muamele" kontrol olarak hizmet veren her bir hayvan ile, her bir hayvan için ayrı ayrı belirlenmelidir. Bu Transgen del değişkenliğin hesaba gereklidirivery ve hayvanların (Şekil 4A) arasında ikafe.

SERCaMP tepkilerin büyüklüğü hücrelerinin bazal sağlığı ile ilgili olup, doğrudan doğruya bir araştırmacı tarafından kontrol edilebilir birçoğu faktörler, çeşitli etkilenecektir. Maksimal SERCaMP yanıt için, bazal ER kalsiyum hemostazını lehine koşullarını optimize etmek zorunludur. Bu tohum hücreleri en uygun yoğunlukta ve düşük viral titreleri kullanarak içerir. Farklı hücre ve doku tipi ampirik olarak tespit edilmelidir ek gereksinimler, sahip olabilir.

Figür 1
Şekil 1:. Kararlı SH-SY5Y hücre çizgisi tohum yoğunluğu ve geçiş sayısı hususlar (A) SH-SY5Y-glukozit-SERCaMP hücreleri çeşitli yoğunluklarda tohumlandı ve 40 saat süre ile inkübe edildi. Salgılanmış glukozit-SERCaMP 300 nM Tg O ile muamele edildikten sonra 4 saat ölçüldür araç kontrolü (ortalama ± SD, n = 6). Glukozit-SERCaMP salgılamada thapsigargin-bağlı artış, her hücre yoğunluğu için endikedir. Kanal adedi 2 ve 15 (B), SH-SY5Y-glukozit-SERCaMP hücreleri thapsigargin kaynaklı salgılanması için incelendi. Hücreler, 2 saat ya da 4 saat süre ile, 100 nM Tg ile muamele edildi ve araçla tedavi edilmiş kontrol salgılanan glukozit aktivitesi normalize edilmiştir (ortalama ± SD, n = 4, geçit faktörünün anlamlı bir etkisi, 2-yollu ANOVA). Kesikli çizgi y = 1. belirten bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2:. Hücre içi glukozit-SERCaMP ölçümü için enzimatik deney (A) hücre içi ve (B), hücre dışı enzimatik aktivitesi, glukozit sıçan primer cor değerlendirildi(AAV-glukozit-SERCaMP ile transduse) kortikal nöronlar. Altı gün transdüksiyon sonra, hücreler 4 saat boyunca 60 nM thapsigargin ile tedavi edildi. Glukozit-ASARTDL ortamı içinde biriktikçe, hücre içi düzeyleri karşılık gelen düşüş gözlenir. (C) hücre dışı bir oranı: hücre içi glukozit aktivitesi, her bir oyuk için hesaplanabilir.

Şekil 3,
Şekil 3:. SH-SY5Y hücrelerinde ve primer kortikal nöronlar sıçan için thapsigargin kaynaklı yanıt karşı AAV-glukozit-ASARTDL titresi (A) SH-SY5Y hücreleri, oyuk başına 5 x 10 4 hücre 96 oyuklu plakalara tohumlandı ve yapışmaya bırakılmış gece boyunca karıştırılmıştır. Hücreler, 48 saat boyunca inkübe edilir ve daha sonra 300 nM Tg veya araç ile muamele edilmiş, enfeksiyonun belirtilen çokluğu (MOI) transdüse edilmiştir. Lüminesans 8 saat sonra ortam maddesinde ölçümlenir (ortalama ± SEM, n = 3) ilave edildi. * P <0.05, multiple t-testi (Holm-Sidak düzeltme). (B) Sıçan birincil kortikal nöronlar (transdüksiyon anda kuyu yaklaşım başına 60.000 hücreleri kullanılarak hesaplanan) belirtilen İçişleri Bakanlığı AAV-glukozit-ASARTDL ile DIV8 üzerinde transdüse bulundu. (N = ortalama ± SEM 6) beş gün transdüksiyon sonra hücreler, 100 nM Tg ile muamele edildi ve ortam içinde araç kontrolü ve lüminesans 8 saat sonra ölçülmüştür. * P <0.05, çok sayıda t-testi (Holm-Sidak düzeltme).

Şekil 4,
Şekil 4:., Viral titreleri aralığında intrahepatik enjeksiyonunu takiben kan içine glukozit-SERCaMP serbest thapsigargin kaynaklı (A) Ham lüminesans değerleri sıçanlardan (n = 8), intrahepatik, farklı AAV-glukozit-ASARTDL titrelerle enjekte edildi. Thapsigargin (1 mg / kg) enjeksiyonu (i.p.) 12. Kan belirtilen zaman noktalarında toplandı ve -80 & # sıcaklıkta saklanmıştır günde uygulanmıştır176; analiz zamanına kadar C. (B) Sıçanlarda thapsigargin kaynaklı SERCaMP yanıt (n = 8), AAV-glukozit-ASARTDL çeşitli miktarlarda eksprese gösteren paneli A Normalleştirilmiş lüminesans değerleri.

Şekil 5,
Şekil 5:. Taşıma ve (in vivo) glukozit-SERCaMP plazma numunelerinin muhafaza (A) Plazma, intrahepatik (n = 10) glukozit-SERCaMP eksprese edilen sıçanlardan alınan bölümlere ayrıldı ve deneyler zamanına kadar -80 ° C'de saklandı. Tüpler -80 ° C ila uzaklaştırılmış ve önceden lüminesans ölçümü belirtilen süre boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilmiştir (ortalama ± SD). Glukozit enzim aktivitesi üzerindeki plazma örneklerinin birden fazla donma / çözülür (B) etkileri. Plazma örnekleri, belirtilen sayıda tabi tutuldu (n = 10) intrahepatik AAV-glukozit-SERCaMP eksprese edilen sıçanlardan alınandonma-çözülme döngüleri ve lüminesans için tahlil (ortalama ± SD).

Şekil 6,
Şekil 6:. Glukozit-SERCaMP deneyleri için coelenterazine alt-tabakanın hazırlanması (A) kültür ortamı 5 saat süre ile 300 nM Tg (veya taşıyıcı kontrol) ile muamele SH-SY5Y-glukozit-SERCaMP hücre serilerinin toplanmıştır. Orta glukozit aktivitesi (ortalama ± SD, n = 6) koelenterazin PBS + çeşitli konsantrasyonlarda enjekte edilerek değerlendirildi. Araç thapsigargin kaynaklı etkisinin değerlendirilmesi için her bir taban konsantrasyonda tedavi kontrolü için panel A (B) ışık yayılması değerlerinin normalize edilmiştir. Birkaç saat içinde (C) Yüzey çürüme. Rekombinant glukozit (0,1 ng ya da 0.02 ng), bilinen bir miktarda lüminesans (ortalama ± SD, n = 4), bir alt tabakanın hazırlanması sonra birkaç saat boyunca ölçülmüştür. (D) iken rekombinant için ham ışıldamaGlukozit çürüme substrat nedeniyle zamanla azaldığı, örneklerde kat farkı (lüminesans ile belirlendiği gibi) muhafaza edilmiştir.

Şekil 7,
Şekil 7:. Glukozit / CTZ reaksiyon kinetiği ile ilgili glukozit-SERCaMP deneyleri için Hususlar (A) kültür ortamı glukozit / CTZ sinyalinin çürüme değiştirir. Glukozit-SERCaMP ihtiva eden süpernatan 5 ul PBS ve kültür ortamının farklı oranlarda karıştırılmıştır. Alt-tabaka 100 ul (PBS + 500 mM askorbik asidin 15 uM CTZ) tabloda gösterildiği gibi seyreltilmiş örnek, 50 ul ilave edildi. Işık emisyonu 15 dakika boyunca izlendi. (B) orta 5 ul SH-SY5Y-glukozit-ASARTDL hücreleri ve 100 ul substrat (PBS + 5 mM NaCI, 8 uM CTZ) toplanan ilave edildi. Lüminesans üzerinde alt-tabakanın (T = 0) ve her 30 saniyede bir ilave hemen sonra ölçüldü 15 dakika (± SD, n = 12) elbette. Veri çürüme oranını değerlendirmek için önceki 30 sn aralığında yüzde sinyal göreceli olarak çizilir. Içerlek ham lüminesans verileri gösterir.

Şekil 8
Şekil 8:. Glukozit salgılanması üzerindeki 100 nM thapsigargin ER kalsiyum tükenmesi Farmakolojik doğrulama (A) Etki glukozit-ASARTDL ve glukozit-No Etiket kontrolü için muayene (ortalama ± SD, n = 6) oldu. (B) dantrolen (RyR antagonisti) ER kalsiyum stabilize Tg kaynaklı SERCaMP salınımını inhibe eder. Hücreler, 30 dakika ya da 100 nM thapsigargin ilave edilmeden önce 16 st için dantrolen belirtilen konsantrasyonları ile önceden muamele edilmiştir. Orta glukozit aktivitesi 4 saat sonra (ortalama ± SD, n = 6) ölçüldü.

99fig9.jpg "/>
Şekil 9:. Glukozit-SERCaMP tahlil için Mock temsilcisi sonuçları (bireysel plakalar okuma arasındaki zaman aralığına bağlı) dökümünü substrat nedeniyle tedavi değerler plakalar arasında azalabilir aracı, unutmayın. Bu etkinin hesaba katmak için, tedavinin belirli etkisi her plaka için bağımsız hesaplanır ve bu oran plakalar arasındaki karşılaştırılır.

Tarih Sıçan Boru kütlesi (mg) Heparin hacmi (mi) Heparin yoğunluğu (g / ml) Heparin kütlesi (mg) Tüp + heparin (mg) Kütle Kan alımından sonra toplam kütlesi (mg) Toplanan kan kütlesi (mg) Yoğunluk, kan (g / ml) Hesaplanan hacim kan (ul) 2 için gereken heparin hacmi: 1 oranı Spin önce eklemek için ek heparin ml
01.01.15 SD Erkek 1135,9 50 1,117 55,83 1191,73 1317,70 125,97 1.05 119,97 59.98 9.98

Tablo 1:. SERCaMP çalışmaları için kan toplama günlüğü Kan toplama tablosu örneği.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, in vitro vurgular ve glukozit-SERCaMP in vivo programı ER kalsiyum tükenmesi izlemek için. SERCaMP oluşturmak için protein modifikasyonu, diğer raportör protein 12 genelleme gibi görünüyor olsa da, biz diğer lusiferazlarm 18 oranla sağlam (200-1,000 kat daha büyük) biyoparlaklık için Gaussia lusiferaz seçti. Primer sıçan kortikal nöronlarında, SH-SY5Y hücrelerinin ve sıçan karaciğer teslim glukozit-SERCaMP virüsünün 100 katı doz aralığında tespit thapsigargin kaynaklı glukozit-SERCaMP boşaltma sergiler (Şekil 3 ve 4). Daha önce glukozit-ASARTDL ifade eden dengeli transfekte edilmiş bir hücre hattı üretilmesini tarif 5 x 10 4 etiketlenmemiş hücrelerden oluşan bir popülasyon olarak birkaç 20 gibi hücreler yanıtı 12 kaynaklı bir thapsigargin rapor göstermiştir. Burada kararlı hücre çizgisi sürekli 15 pasajlar, çoğu analyz dışarı Tg kaynaklı yanıtı rapor göstermektedirzamanla muhabir sürekli ifade kabiliyetini etkilemez belirten ed ER kalsiyum tükenmesi yanıt (Şekil 1) piyasaya sürülecek. Verilerimiz salgılandığı zaman glukozit-SERCaMP esas olarak ER kalsiyum tükenme bir zamana kadar, bir hücrenin ER içinde tutulur işaret etmektedir. "Normal" koşullarda, bazal ER kalsiyum homeostasis 12 kurulmasını sağlayan bir düşük bazal sekresyon vardır. Thapsigargin göre ER kalsiyum azalması ters yönlerde, hücre içi ve hücre dışı lüminesans değişim seviyeleri izlenerek. Bu sensör (Şekil 2) kararlı durum dağılımında bir değişim gösteren bir oran olarak ifade edilebilir. SERCaMP salma KDEL reseptör ifadesi 12 ile modüle gibi Önemli bir şekilde, salınım büyüklüğü hücre tipine bağlı olarak değişebilir. Diğer alternatif KDEL gibi karboksi-terminal sekanslar ile 'ASARTDL' ikame maxi elde etmek için gerekli öngörürBelirli bir hücre veya doku türü mal SERCaMP cevabı.

In vitro değerlendirmeler için, hücre dışı glukozit-SERCaMP seviyeleri nedeniyle salgılanan raportör stabilitesine zamanla birikir; Biz 72 saat 12 sonra aktivitesinde yaklaşık% 5-10 azalma bildirdi. Bunun gibi, ER Kalsiyum homeostazında bir farmakolojik ya da genetik meydan başlatmadan önce ortam değiştirme sensörü birikimi nedeniyle arka plan sinyalini azaltmak gerekli olabilir. Bunun aksine, in vivo olarak glukozit-SERCAMP yarılanma ömrü plazmada sinyali gösteren 3,5-4,7 dakika 12 kan sirkülasyonuna dahil raportör bir son serbest temsil eder. Kan, ex vivo ve plazma işlenen sonra, ancak, glukozit-SERCaMP (Şekil 5) çok kararlı.

Tanımlanan metot için, orta veya plazma enzimatik deneylerinden önce opak, 96 kuyucuklu plakalara transfer edilir. Glukozit merkezli muhabiri kullanırken iki önemli faktör dikkates enzimin flaş kinetik ve coelenterazine substratın dökümü bulunmaktadır. Enjektörler ile donatılmış plaka okuyucu iyi substrat ilavesi ve lüminesans ölçümleri arasındaki zaman normalleştirmek için glukozit enzimatik deneyler çalıştırmak için uygundur. Koelenterazin kimyasal özellikleri Yüzey hazırlandıktan sonra farklı zamanlarda ölçülen ham lüminesans değerlerini karşılaştırarak engellemektedir çürümeye için bu eğilimli olun. Deneylerin süresi (Şekil 9) üzerinden takip edilecek kontrol ve deney numuneleri arasındaki göreli farkı sağlayan, ancak, korunur (Şekil 6) numuneler arasındaki farklılıkları katlayın.

Ilerleyici hastalık araştırılırken, in vivo olarak ER kalsiyum dalgalanmaları izleme yeteneği avantajlıdır. Floresan boyalar sitoplazmik gibi diğer yöntemler, in vitro çalışmalar akut için uygun olsa da, bir SERCaMP raportör boyuna ER kalsiyum izleme sağlamak için ilk. Our protokolü AAV-glukozit-SERCaMP doğrudan karaciğer enjeksiyonları özetliyor. Biz enjeksiyon sonrası 56 gün süreyle tartışmasız hayvanların dolaşımda glukozit-SERCaMP sürekli seviyelerini tespit (son timepoint şimdiye kadar test) ve daha uzun deneyler 12 mümkündür tahmin var. AAV vektörleri, çap olarak yaklaşık 20 nm kalınlığında, boyut olarak küçük, ve en az biyo-güvenlik şartları 19 oluşturmaktadır. Çift kollu bir DNA'ya AAV tek sarmallı genomunun dönüşüm aşmak için, AAV-SERCaMP bir AAV serotip-1 çift-şeritli vektörün 20 olarak paketlenmiştir. AAV serotip-1 etkin bir sıçan ciğeri 19,21 transdüse gösterilmiştir; Ancak, bizim enjeksiyon tekniğinin uyarı vücut boyunca, diğer dokulara gitmek virüs potansiyelidir. Vektör ile doğrudan karaciğer içine enjekte edildi, ancak sunulan olarak metodolojisi SERCaMP Yayım kaynağını ayırt edemez ve bu nedenle karaciğer dışındaki dokularda glukozit-SERC katkı olasıdıramp sinyali. Gelecek genetik manipülasyonlar doku türlerini hedef ifadeyi sınırlayacaktır. Örneğin, doku-spesifik Cre sürücü hatları plazma örnekleme yoluyla ER kalsiyum doku-spesifik izlenmesi için izin verecek bir Kre-bağımlı glukozit-SERCaMP ile geçti.

Açıklanan in vivo tekniği muhabiri sağlam yapısı nedeniyle düşük viral titreleri kullanır. Glukozit-SERCaMP sürüm 7.6 x 10 9 VG (Şekil 4) 7,6 x 10 7 VG bir viral aralığından tespit edilebilir. Bu aralık karaciğer 19 ateşböceği lusiferaz-tabanlı viral enjeksiyonları kullanarak önceki çalışmalarında bildirilen göre 4-400 kat daha düşüktür. Daha yüksek konsantrasyonlarda, aşırı yüksek transgen 22 hayvanın bir bağışıklık tepkisi olasılıkla zaman içinde tespit ifadesi bir kayıp gözlendi. Virüsün yüksek titreleri mümkün olduğunda dolayı sinyal kaybı ihtimalinin artması kaçınılmalıdır. Anlatılandan daha düşük titreler vermeye adresen test edilmiştir. Bu protokol, karaciğer içine, AAV-glukozit-SERCaMP enjeksiyonları özetlemektedir; Benzer yaklaşımlar diğer doku tipleri için uygun teoride vardır. Örneğin viral konsantrasyon ve serotip gibi hususların diğer dokularda yeterli bir ekspresyon için optimize edilmelidir.

Nedeniyle muhabir sağlam doğası, kanda (100-150 ul) küçük hacimleri deneyler boyunca tekrarlanan koleksiyonları için izin kuyruk kupürleri alınabilir. Bu, taban seviyelere dönüş ardından thapsigargin idaresi (Şekil 4) sonra yüksek düzeylerde gözlenen thapsigargin, cevaben glukozit-SERCaMP sürümü boyuna karakterizasyonu için yararlı oldu. Kan toplama aşağıdaki plazma örneklerinin doğru kullanımı da önemlidir. Bu nedenle, biz SERCaMP önceden enzimatik deney (Şekil 5) ile 72 saat kadar 4 ° C'de saklandı plazmada stabil olduğunu göstermiştir. Ayrıca, plazma numuneleri en az üç dondurma / t geçirebilenışıma üzerinde minimal etkisi (Şekil 5) ile ha çevrimleri. Uygulamada, -80 ° C 'de, tüm numuneler, enzim tahlili değerlendirmek önce gereksiz donma-erime döngülerinden kaçınmak ve aynı zamanda bir deney için tüm örnekler analiz saklayın.

ER kalsiyum tükenmesi çeşitli hastalıkların patogenezinde rol oynar. Genellikle hücresel fonksiyonları engeller ve katlanmamış protein karşılığının (EPD) aktivasyonuna yol açan bir üst etkinlik olduğu düşünülmektedir. UPR homeostatik koşulları 5 yeniden kurmak için ER tarafından istihdam adaptif yanıttır. ER stres Kronik devletleri sonuçta hücre ölümüne yol açan, homeostazı geri UPR kapasitesini aşar. ER stresi ve ER kalsiyum disregülasyon tip 1 diyabet, diyabetik nefropati, nörodejeneratif hastalıklar, kardiyovasküler dieases 5 gibi hastalıklarda görülür. Kalsiyum disregülasyon ve hastalık patogenezinde arasındaki ilişki, ancak, diffic olduğunuULT tasvir etmek. SERCaMP teknolojisi böylece hastalığın gelişimi ve ilerlemesinde içgörü sağlayarak, bir hayvanın ömrü boyunca bu süreci izlemek için bir potansiyele sahiptir. Ayrıca, önlemek veya düzeltmek için ER kalsiyum disregülasyon SERCaMP kullanımı yoluyla değerlendirilebilir tasarlanmış potansiyel tedavilerin değerlendirilmesi. Son olarak, glukozit-SERCaMP salma meydana gelir hastalıkların belirlenmesi mühendislik ve hastalık ayarlı gen terapisi için bir araç olarak SERCaMPs olarak salgılanan terapötik proteinleri veya peptidleri kullanılmaları için olanak sunar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tubes Fisher  02-682-550
10% NP-40 solution  Pierce 28324 for intracellular GLuc assays
1 ml luer-lok syringes Fisher 14-823-30
200 microliter filter tips Rainin RT-L200F
3-0 surgical sutures Fisher NC9598192
30 G needles Fisher Scientific 14-821-13A 
Adhesive microplate sealing sheets Thermo AB-0558
Alcohol prep pads Fisher 22-246-073
Anesthesia Auto Flow System E-Z Anesthesia EZ-AF9000
Animal recovery chamber Lyon Vet ICU-912-004
B27 supplement Life Technologies 17504-044
Betadine solution Fisher NC9386574
Bleach Clorox n/a
Bovine growth serum Thermo SH30541.03
Coelenterazine, Native Regis Technologies 1-361204-200
Cotton tipped applicators Puritan 806-WC
Cutting needles 3/8 circle sutures WPI 501803
Digital ultrasconic cleaner Fisher Scientific FS60D
DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate Life Technologies 10569-010
DNA mass ladder Life Technologies 10496-016
Gaussia luciferase (recombinant protein) Nanolight 321-100
Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) New England Biolabs E8023S 1:2,000 (WB)
Germinator 500 CellPoint Scientific DS-401
Gluc assay plates (96 well, opaque) Fisher 07-200-589
Hank's balanced salt solution Life Technologies 14175-095
Heparin Allmedtech 63323-276-02
Isoflurane Butler Schein 29404
Ketamine Henry Schein 995-2949
Kwik Stop Styptic powder Butler Schein 5867
L-glutamine Sigma G8540
Methanol Fisher a452-4
Microfuge 22R Centrifuge Bekman Colter 368831
Neosporin Fisher 19-898-143
Neurobasal medium Life Technologies 21103049
Nikon Stereoscope Nikon SMZ745T
Nucleospin Gel and PCR Cleanup Machery-Nagel 740609
P200 pipet Rainin L-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kit Clontech 632200
PCR film seal Fisher AB0558
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-122
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
ReFresh Charcoal Filter canister E-Z Anesthesia EZ-258
Scalpel blades, #10 Fine Science tools Inc 10010-00
SD rats 150-200 g Charles River Rats rats ordered at 150-200 g.  Surgery 5 days after arrival
Small animal ear tags National Band and Tag co 1005-1
Sterile surgical drapes Braintree Scientific SP-MPS
Synergy 2 plate reader BioTek n/a
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
Thapsigargin Sigma T9033 harmful to human health
Virapower lentiviral packaging mix Life Technologies K4975-00
Xfect Transfection reagent Clontech 631318
Xylazine Valley Vet 468RX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426, (6968), 891-894 (2003).
  2. Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38, (3-4), 303-310 (2005).
  3. Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473, (7348), 528-531 (2011).
  4. Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10, (8), 763-773 (2010).
  5. Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (6), (2011).
  6. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, (3), 143-151 (2008).
  7. Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
  8. Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (39), 16265-16270 (2011).
  9. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (50), 17404-17409 (2004).
  10. Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
  11. Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44, (4), 386-399 (2008).
  12. Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25, (18), 2828-2839 (2014).
  13. Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288, (6), 4209-4225 (2013).
  14. Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130, (1), 305-310 (1969).
  15. Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21, (5), 282-287 (1985).
  16. Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372, (1), 24-34 (2008).
  17. Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70, (6), 1024-1029 (1993).
  18. Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, (4), 582-591 (2009).
  19. Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19, (4), 411-417 (2012).
  20. Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10, (26), 2105-2111 (2003).
  21. Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13, (6), 1085-1092 (2006).
  22. Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23, (6), 399-413 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics