फीडर मुक्त परिस्थितियों में सेंडाइ वायरस का उपयोग मानव परिधीय टी कोशिकाओं से प्रेरित स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी

Developmental Biology
 

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Kishino, Y., Seki, T., Yuasa, S., Fujita, J., Fukuda, K. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions. J. Vis. Exp. (105), e53225, doi:10.3791/53225 (2015).

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Abstract

हाल ही में, IPSCs पुनर्योजी उपचार के लिए कोशिकाओं का एक नया स्रोत के रूप में ध्यान आकर्षित किया है। पैदा IPSCs के लिए प्रारंभिक विधि आक्रामक बायोप्सी और Transgenes के रेट्रोवायरल जीनोमिक प्रविष्टि के द्वारा प्राप्त त्वचीय fibroblasts पर भरोसा किया है, इन नुकसान से बचने के लिए कई प्रयास किए गए हैं। मानव परिधीय टी कोशिकाओं IPSCs पैदा करने के लिए एक अनूठा सेल स्रोत हैं। टी कोशिकाओं से व्युत्पन्न IPSCs टी सेल रिसेप्टर (TCR) जीन की rearrangements होते हैं और विशिष्ट प्रतिजन टी कोशिकाओं का स्रोत रहे हैं। इसके अतिरिक्त, जीनोम में टी सेल रिसेप्टर पुनर्व्यवस्था व्यक्तिगत सेल लाइनों लेबल और प्रत्यारोपित और दाता कोशिकाओं के बीच भेद करने की क्षमता है। IPSCs की सुरक्षित नैदानिक ​​आवेदन के लिए, यह हानिकारक एजेंटों को नव सृजित IPSCs को प्रकाश में लाने के जोखिम को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। भ्रूण गोजातीय सीरम और फीडर कोशिकाओं स्टेम सेल संस्कृति के लिए आवश्यक हो गया है, यद्यपि यह जोखिम को कम करने के लिए संस्कृति प्रणाली से उन्हें हटाने के लिए बेहतर हैअप्रत्याशित pathogenicity की। यह पता करने के लिए, हम अपरिभाषित रोगजनकों के लिए IPSCs को प्रकाश में लाने के जोखिम को कम करने के लिए सेंडाइ वायरस का उपयोग मानव परिधीय टी कोशिकाओं से IPSCs पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की है। सेंडाइ वायरस से निपटने के उचित जैव सुरक्षा स्तर के साथ उपकरणों की आवश्यकता है, सेंडाइ वायरस संक्रमित जीनोम प्रविष्टि के बिना टी कोशिकाओं को सक्रिय, अभी तक उच्च दक्षता के साथ। इस प्रोटोकॉल में, हम सक्रिय टी सेल संस्कृति और सेंडाइ वायरस के संयोजन का उपयोग फीडर मुक्त परिस्थितियों में मानव परिधीय टी कोशिकाओं से IPSCs की पीढ़ी प्रदर्शित करता है।

Introduction

IPSCs पुनर्योजी चिकित्सा 1-3 के लिए कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण स्रोत के रूप में काफी ध्यान आकर्षित किया है। तिथि करने के लिए, IPSCs पैदा करने के लिए विविध तरीकों 4,5 सूचना दी गई है। इन के अलावा, मानव टी कोशिकाओं से उत्पन्न IPSCs क्योंकि सेल नमूना 6-8 की कम इनवेसिव विधि के विशेष हित के लिए किया गया है। इसके अतिरिक्त, टी कोशिकाओं से व्युत्पन्न IPSCs टी सेल रिसेप्टर (TCR) जीन की rearrangements होते हैं और इस प्रकार प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं 9,10 का स्रोत रहे हैं। इसलिए, टी सेल व्युत्पन्न IPSCs पैदा सुरक्षित रूप से पुनर्योजी चिकित्सा प्रगति के लिए उपयोगी है।

इस विधि अप्रत्याशित pathogenicity के जोखिम को कम करने की अवधारणा पर आधारित है। IPSCs की सुरक्षित नैदानिक ​​आवेदन के लिए यह रोगजनकों 11 के लिए जोखिम के जोखिम को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। इससे पहले स्टेम कोशिकाओं के कई संस्कृति प्रणालियों में, भ्रूण गोजातीय सीरम और फीडर कोशिकाओं आवश्यक अभिकर्मक के रूप में इस्तेमाल किया गया है12 S। IPSC पीढ़ी अप्रत्याशित pathogenicity के जोखिम को कम करने के लिए हालांकि, संस्कृति प्रणाली से इन अभिकर्मकों दोनों को हटाने के लिए बेहतर है।

साथ ही, इस विधि से मरीजों और फीडर कोशिकाओं की श्रमसाध्य तैयारी से आक्रामक सेल नमूना से बचने का लाभ दिया है। टी सेल व्युत्पन्न IPSCs पहले से ही रोग अनुसंधान 13,14 में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, क्योंकि इस विधि को भी रोगियों से रोग विशिष्ट IPSCs पैदा करने के लिए लागू है और उपयोगी है।

एक जीन वाहन के रूप में सेंडाइ वायरस (सेव) सदिश का उपयोग टी सेल reprogramming के तरीकों, के बीच उच्च दक्षता 7,16 साथ IPSCs उत्पन्न कर सकते हैं कि एक विधि है। Sev एक एकल असहाय आरएनए वायरस है और नकल के लिए एक डीएनए चरण की जरूरत नहीं है क्योंकि इसके साथ ही, IPSC पीढ़ी में इसके उपयोग मेजबान जीनोम 17-19 तोड़ने से बचा जाता है। इसलिए, हम सीरम fr में मानव परिधीय टी कोशिकाओं से IPSCs पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल की स्थापना की हैईई और Matrigel, mTeSR माध्यम का एक संयोजन का उपयोग फीडर मुफ्त की स्थिति, और सेव वैक्टर।

Protocol

1. सक्रिय मानव टी कोशिकाओं को तैयार

  1. Venipuncture से एक दाता से पूरे रक्त heparinized 10 मिलीलीटर लीजिए।
    1. Venipuncture के अग्रिम में दानदाताओं की सूचित सहमति प्राप्त करते हैं। Venipuncture योग्य और प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा किया जाना चाहिए।
    2. बाँझ उपकरण और निम्न उपयुक्त जैव सुरक्षा दिशा निर्देशों के साथ प्राप्त रक्त के नमूनों को संभाल लेना।
  2. 10 मिलीलीटर डी पीबीएस के साथ पूरे रक्त heparinized 10 मिलीलीटर पतला (-)।
  3. एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 15 मिलीलीटर Ficoll समाधान (Ficoll-Paque प्रीमियम) रखो।
  4. 1.3 चरण में Ficoll समाधान पर 1.2 चरण में तैयार 20 मिलीलीटर रक्त समाधान परत। एक बिजली विंदुक का प्रयोग, खून समाधान ट्यूब के अंदर दीवार के साथ धीरे-धीरे कदम में 1.2 रन तैयार करते हैं। रक्त समाधान और Ficoll समाधान मिश्रण करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
  5. आरटी पर 30 मिनट के लिए 400 × छ पर अपकेंद्रित्र। "" धीमी करने के लिए केन्द्रापसारक मंदी की गति सेट करें।
    नोट: centrifugation के बाद, एक सफेद पतलीपरत एक ऊपरी दूधिया प्लाज्मा परत और एक कम स्पष्ट Ficoll परत के बीच उभर रहे हैं। यह सफेद पतली परत मोनोन्यूक्लियर सेल शामिल हैं।
  6. एक 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब मोनोन्यूक्लियर सेल परत स्थानांतरण। Ficoll समाधान शामिल करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
  7. डी पीबीएस जोड़ें (-) आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 × छ पर कुल 10 मिलीलीटर की मात्रा और सेंट्रीफ्यूज को मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के लिए।
  8. सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के लिए, और आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 × छ पर सेंट्रीफ्यूज (-) डी पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  9. सतह पर तैरनेवाला त्यागें एकत्र मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को KBM502 के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ने, और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती। × 10 6 5 ओवर मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं उचित जुदाई Ficoll उपयोग करने के साथ पूरे रक्त heparinized 10 मिलीलीटर से प्राप्त किया जा सकता है।
  10. डी पीबीएस में 10 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में एक विरोधी मानव CD3 एंटीबॉडी समाधान तैयार (-)। सर्फ लेना, 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए विरोधी मानव CD3 एंटीबॉडी समाधान जोड़ेंप्रत्येक का इक्का अच्छी तरह से, और कम से कम 30 मिनट के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान सेते हैं।
  11. अच्छी तरह से प्रत्येक से विरोधी मानव CD3 एंटीबॉडी समाधान निकालें और डी पीबीएस के साथ एक बार धोने (-) कोशिकाओं को बोने के लिए सिर्फ पूर्व।
  12. KBM502 माध्यम में विरोधी मानव CD3 एंटीबॉडी लेपित 6 अच्छी तरह प्लेटों पर 2.5 × 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व पर कदम 1.9 में तैयार किया गया है कि बीज मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं। टी कोशिकाओं confluency तक पहुंचने तक मध्यम परिवर्तन के बिना 3-7 दिनों के लिए एक 5% -CO 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। इस अवधि में टी कोशिकाओं दोनों को निलंबित कर दिया और पालन कोशिकाओं रहे हैं।

सेव वैक्टर के साथ 2. संक्रमित मानव टी कोशिकाओं

  1. 3-7 दिनों संस्कृति के बाद, pipetting द्वारा मध्यम मौजूदा साथ सक्रिय टी कोशिकाओं को इकट्ठा। आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 × छ पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज को हस्तांतरण।
  2. तैरनेवाला निकालें और 1 मिलीलीटर ताजा KBM502 माध्यम जोड़ें। कोशिकाओं की गणना और एक थाली।5 × 10 6 कोशिकाओं को एक विरोधी CD3 एंटीबॉडी लेपित 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में (2 मिलीलीटर ताजा KBM502 माध्यम में)।
  3. बर्फ पर OCT3 / 4-Sev / TSΔF, Sox2-Sev / TSΔF, KLF4-Sev / TSΔF, और सी-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF की सेव समाधान गला लें।
  4. OCT3 / 4-Sev / TSΔF, Sox2-Sev / TSΔF, KLF4-Sev / TSΔF, और सी-MYC (HNL) युक्त सेव समाधान जोड़ें -SeV / TS15ΔF अलग-अलग कुओं के लिए, संक्रमण की बहुलता पर प्रत्येक (MOI) एक और 24 घंटे के लिए एक 5% -CO 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेते की।

3. मानव टी कोशिकाओं से सेव वैक्टर हटाये

  1. 24 घंटा संक्रमण के बाद, एक पिपेट से संक्रमित कोशिकाओं को इकट्ठा। पालन ​​कोशिकाओं देखते हैं, तो वे आसानी से बार-बार ऊपर और नीचे उन्हें pipetting अलग किया जा सकता है। आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 × छ पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, और सेंट्रीफ्यूज को हस्तांतरण।
  2. सेव वैक्टर युक्त सतह पर तैरनेवाला निकालें, और 2 मिलीलीटर ताजा KBM502 माध्यम जोड़ें। पूर्वी वायु कमान में replate कोशिकाओंकुओं की ज। एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए एक 5% -CO 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

एक Matrigel लेयर पर 4. reseed प्रकोष्ठों

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर (इस अध्ययन में इस्तेमाल विशिष्ट ब्रांड के लिए सामग्री सूची देखें) और DMEM / F12 के माध्यम के 10 मिलीलीटर में 0.2 मिलीलीटर भंग विगलन मैट्रिक्स जेल से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान तैयार है।
    नोट: मैट्रिक्स जेल (इस अध्ययन में इस्तेमाल विशिष्ट ब्रांड के लिए सामग्री सूची देखें) 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरी तरह thawed किया हे / एन पिघलना करने की जरूरत है। बस का उपयोग करने से पहले तक बर्फ पर रखें।
  2. 100 मिमी बर्तन में पकवान प्रति प्लेट 5 मिलीलीटर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान और कोशिकाओं को बोने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें। कम से कम दो 100 मिमी व्यंजन एक प्रयोग के लिए आवश्यक हैं।
  3. , Pipetting द्वारा सेव संक्रमित कोशिकाओं लीजिए आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 × छ पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, और सेंट्रीफ्यूज को हस्तांतरण।
  4. तैरनेवाला निकालें और 1 मिलीलीटर ताजा KBM502 माध्यम जोड़ें। सीई की संख्या की गणनाएक hemocytometer का उपयोग LLS, चरण 4.2 और थाली में तैयार 100 मिमी व्यंजन से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान निकालने 1 × 10 5 और 1 × 10 6 कोशिकाओं एक 100 मिमी तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित पर (10 मिलीलीटर ताजा mTeSR माध्यम में) व्यंजन। अंत में, कालोनियों आसानी से उठाया जाता है, जिसमें प्लेट का उपयोग करें।
  5. एक 5% -CO 2 इनक्यूबेटर हे / एन में 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान सेते हैं।
  6. 10 मध्यम बदलें मिलीलीटर हर दूसरे दिन mTeSR मध्यम मांस।
    नोट: संक्रमण के बाद लगभग 20-30 दिन, बारीकी से भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) के समान है कि कालोनियों में दिखाई देगा।

5. टी सेल व्युत्पन्न IPSCs विस्तार

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर (इस अध्ययन में इस्तेमाल विशिष्ट ब्रांड के लिए सामग्री सूची देखें) और DMEM / F12 के माध्यम के 10 मिलीलीटर में 0.2 मिलीलीटर भंग विगलन मैट्रिक्स जेल से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान तैयार है।
  2. प्लेट 1 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान की मिलीग्राम और पर के लिए आरटी पर छोड़कालोनियों चुनने से पहले कम से कम 30 मिनट।
  3. MTeSR माध्यम के 20 μl के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली भरें प्रति अच्छी तरह से।
  4. एक 20 μl पिपेट का उपयोग stereomicroscope के तहत ESCs जैसे लगते हैं कि कालोनियों का चयन करें।
    नोट: चित्रा 1 बी में दिखाया गया है ESCs और IPSCs की कालोनियों गोल और फ्लैट हैं।
  5. 5.3 चरण में mTeSR मध्यम से भरा 96 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरण चयनित कालोनियों।
  6. एक 200 μl पिपेट का उपयोग stereomicroscope के तहत छोटे गुच्छों में कॉलोनी को तोड़ने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट और ध्यान से अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए mTeSR माध्यम के 200 μl जोड़ें। 5.2 में अच्छी तरह से तैयार से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान निकालें और mTeSR मध्यम 2 मिलीलीटर के साथ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में प्रत्येक कॉलोनी डाल प्रति अच्छी तरह से।
  7. 2 करने के लिए मध्यम बदलें मिलीलीटर हर दूसरे दिन mTeSR मध्यम मांस।

6. टी सेल व्युत्पन्न IPSCs बनाए रखें

टी सेल व्युत्पन्न IPSCs बनाए रखा जा सकताऔर मानव IPSCs और मानव ESCs के लिए के रूप में एक ही तकनीक का उपयोग कर संग्रहीत। IPSC कालोनियों बड़े होते जाने के बाद, उसी प्रक्रिया को दोहराने से बड़े बर्तन में उन्हें विस्तार।

  1. हर 1-2 दिनों mTeSR मध्यम बदलें।
  2. कालोनियों मिला हुआ हो जब हर 5-7 दिनों की, मानव IPSCs और निर्माता के निर्देशों के अनुसार मानव ESCs के लिए हदबंदी समाधान का उपयोग कर पारित होने कोशिकाओं।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग, उपयोगकर्ताओं स्थिरतापूर्वक मानव परिधीय टी कोशिकाओं से IPSCs उत्पन्न करने में सक्षम हैं। । कई मार्ग के बाद पता नहीं थे कई दाता मामलों और सेव बीच में सेल reprogramming की दक्षता का 0.005% 16 चित्रा 1 ए टी पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल के एक योजनाबद्ध सेल व्युत्पन्न पता चलता है - सेव और Matrigel के साथ टी कोशिकाओं से IPSC पीढ़ी लगभग 0.002% से पता चला Matrigel और mTeSR माध्यम का उपयोग कर फीडर मुक्त परिस्थितियों में IPSCs। लगभग 20-30 दिनों सेव साथ संक्रमण के बाद, IPSC कालोनियों उनकी ईएससी कॉलोनी की तरह आकारिकी (चित्रा 1 बी) द्वारा मान्यता प्राप्त हैं। Immunofluorescence धुंधला ठेठ pluripotent सेल मार्कर की अभिव्यक्ति का पता चला (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, टीआरए 1-60, और टीआरए-1-81) टी सेल व्युत्पन्न IPSCs में फीडर मुक्त परिस्थितियों (चित्रा 1 सी) के तहत उत्पन्न।

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चित्रा 1. (ए): इस अध्ययन में फीडर मुक्त परिस्थितियों में reprogramming टी कोशिकाओं के लिए प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध। (ख): फीडर मुक्त परिस्थितियों में रक्त नमूना लेने के बाद 27 दिन पर एक ठेठ ईएससी तरह IPSC कॉलोनी। (सी):। टी सेल व्युत्पन्न IPSCs में एएलपी धुंधला और pluripotency और सतह मार्करों के लिए immunofluorescence धुंधला (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, टीआरए 1-60, और टीआरए-1-81) फीडर मुक्त परिस्थितियों में उत्पन्न करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा या का खुलासा करने के हितों के परस्पर विरोधी है।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए चिकित्सा की कीयो विश्वविद्यालय के स्कूल से Yoshiko Miyake, सायाका Kanaami, Chihana फुजिता, Miho यामागुची, Natsuko Henmi, और री Ohno धन्यवाद। इस काम आंशिक रूप से स्वास्थ्य अनुसंधान के परिणामों के व्यावहारिक उपयोग में तेजी लाने के लिए एक अनुसंधान एवं विकास सिस्टम सहायता कार्यक्रम, और पुनर्योजी चिकित्सा की प्राप्ति के लिए राजमार्ग कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque PREMIUM GE Healthcare 17-5442-02
Purified NA/LE mouse anti-human CD3 BD Pharmingen 555336
Bovine albumin fraction V solution Gibco 15260-037
mTeSR1 medium kit STEM CELL 5850 Warm at room temperature before use
Dissociation Solution ReproCELL RCHETP002
D-PBS(–) Wako 045-29795
SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 DNAVEC DV-0303c Thaw on ice before use
100-mm tissue culture dish Falcon 353003
96-well tissue culture plate Falcon 353078
6-well tissue culture plate Falcon 353046
15 ml Centrifuge Tube Greiner Bio-One 188271
50 ml Centrifuge Tube Greiner Bio-One 227261

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References

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